KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
Simas Vaitkevičius
Metanolinių baikalinės kalpokės ekstraktų analizė
(Magistrinis darbas) Darbo vadovai: prof. V. Briedis doc. A. MaruškaKaunas,
2009
2
Padėka
Už idėjas, paramą ir palaikymą bei darbo organizavimą Kauno medicinos universiteto Farmacijos fakulteto dekanui, prof. Vitaliui Briedžiui.
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, materialinę bazę ir visokeriopą pagalbą atliekant magistrinio darbo „Metanolinių baikalinės kalpokės ekstraktų analizė“ tyrimus Vytauto Didžiojo universiteto Gamtos mokslų fakulteto Biochemijos ir biotechnologijų katedros vedėjui doc. habil. dr. Audriui Maruškai, katedros kolektyvui ir doktorantams.
Už tyrime naudotą vaistinę augalinę baikalinės kalpokės žaliavą VDU Kauno botanikos sodo Vaistinių augalų sektoriaus vedėjai dr. Onai Ragažinskienei.
Magistrinį darbą remia:
Lietuvos valstybinio mokslo ir studijų fondo remiamas ir VDU Kauno botanikos sodo Vaistinių augalų mokslo sektoriaus mokslininkų vykdomas projektas „Flavonoidų kiekio įvertinimas Scutellaria baikalensis Georgi žaliavoje“.
3
Turinys
Santrumpų sąrašas ... 4
1. ĮVADAS ... 5
Darbo tikslai ir uždaviniai ... 6
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 7
2.1. Baikalinė kalpokė ... 7
2.2. Baikalinės kalpokės farmakologinės savybės ... 8
2.3. Flavonoidai ... 10
2.4. Flavonoidų ekstrakcija... 11
2.5. Flavonoidų analizės metodai ... 11
2.6. Oksidacinis stresas ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ... 13
EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 15
3. Tyrimų objektas ir metodika ... 15
3.1. Medžiagos ir tirpikliai ... 15
3.2. Augalinė žaliava ir ekstraktų gamyba ... 15
3.3. Baikalinės kalpokės ekstraktų analizė spektrofotometriniu metodu ... 16
3.4. Baikalinės kalpokės ekstraktų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 17
4. Darbo rezultatai ir jų aptarimas ... 19
4.1. Baikalinės kalpokės ekstraktų kietafazės ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 19
4.2. Baikalinės kalpokės ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 20
4.3. Baikalinės kalpokės ekstraktų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 22
4.3.1. ESC sąlygų optimizavimas ... 22
4.3.2. Flavonoidų identifikacija ... 23
4.3.3. Flavonoidų kiekio nustatymas ESC metodu baikalinės kalpokės ekstraktuose ... 25
4.3.4. Baikalinės kalpokės antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ESC metodu ... 26
5. IŠVADOS ... 29
Literatūra ... 30
Santrauka ... 33
4
Santrumpų sąrašas
UV – ultravioletinė spinduliuotė;
GABA-A – γ-aminosviesto rg. A tipo receptorius; RNR – ribonukleino rūgštis;
DNR – deoksiribonukleorūgštis;
CYP1A2 – citochromo P450 izofermentas 1A2; KFE – kietafazė ekstrakcija;
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
C-18, RP-18 – silikagelinio sorbento tipas, turintis prijungtas oktadecilnes grupes; DAD – diodų matricos detektorius (angl. Diode array detector);
λ – bangos ilgis;
MS – masių spektrometrija;
CoQ – kofermentas Q-10, ubichinonas; DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas;
ABTS - 2,2‘-azino-bis (3-etilbenztiazolino-6-sulfoninės rūgšties) radikalas; TFA – trifluoracto rūgštis;
JAV – Jungtinės Amerikos valstijos; SSN – santykinis standartinis nuokrypis.
5
1. ĮVADAS
Vaistažolės – patys pirmieji vaistai. Nuo seno jos vartojamos liaudies medicinoje nuovirų, užpilų, pavilgų gamybai, inhaliacijoms ir kt. Žoliniai vaistiniai preparatai veikia švelniau ir yra mažiau kenksmingi, tad kelia pacientų, gydytojų ir vaistininkų bei mokslininkų susidomėjimą. Vien per 2001-2006 metus buvo publikuota daugiau kaip 300 straipsnių vaistiniuose augaluose randamų medžiagų identifikavimo ir kiekybinės analizės tema. Daugumoje jų aptariamas ir flavonoidų kokybinis ir kiekybinis nustatymas [1].
Flavonoidai – didelė polifenolinių junginių šeima, pasižyminti stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, plačiu antimikrobiniu ir farmakologiniu veikimu. Jie tyrinėjami įvairiais chromatografiniais metodais, iš kurių dažniausiai taikoma atvirkščių fazių efektyvioji skysčių chromatografija.
Šiame darbe tyrinėjama baikalinė kalpokė (Scutellaria baikalensis, Georgi) – vienas plačiausiai tradicinėje Rytų medicinoje vartojamų vaistinių augalų. Džiovintose jos šaknyse aptinkama daugiau kaip 30 flavonoidų (pagrindiniai: baikalinas, baikaleinas ir vogoninas), kurie ir sąlygoja farmakologinį poveikį [2]. Iš Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodo Vaistinių augalų mokslo sektoriaus gauta vaistinė žaliava, pagaminti metanoliniai ekstraktai, juose spektrofotometriniais metodais nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis, antioksidacinis aktyvumas. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu stengtasi identifikuoti pagrindinius baikalinės kalpokės flavonoidus, nustatyti jų kiekius ir įvertinti atskirų junginių antioksidacinį aktyvumą.
6
Darbo tikslai ir uždaviniai Darbo tikslas:
Atlikti baikalinės kalpokės metanolinių ekstraktų analizę spektrofotometriniu ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.
Darbo uždaviniai:
1. Optimizuoti baikalinės kalpokės metanolinių ekstraktų kietafazės ekstrakcijos sąlygas, siekiant padidinti flavonoidų išgavą ir paruošti bandinius chromatografinei analizei.
2. Atlikti bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio bei antioksidacinio aktyvumo spektrofotometrinę analizę metanoliniuose baikalinės kalpokės ekstraktuose, įvertinant augalo vegetacijos tarpsnio įtaką.
3. Atlikti kokybinę ir kiekybinę apigenino-7-glikozido, baikalino, baikaleino ir skutelarino analizę metanoliniuose baikalinės kalpokės ekstraktuose, panaudojant efektyviąją skysčių chromatografijos sistemą.
4. Nustatyti atskirų flavonoidų įtaką bendram ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui
7
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Baikalinė kalpokė
Baikalinė kalpokė (lot. Scutellaria baicalensis, Georgi; angl. Baikal skullcap) priklauso lūpažiedžių (lot. Labiatae) šeimai. Tai daugiametis žolinis augalas, užaugantis iki 15-30 cm aukščio. Turi vertikalią šaknį su trumpu išsišakojusiu šakniastiebiu (1 pav.), iš kurio išauga keletas keturbriaunių stiebų. Lapai priešiniai, bekočiai ar su trumpais koteliais, siauri lancetiški, iki 4 cm ilgio, kraštas lygus. Žiedai pažastiniai, išsidėstę vienašaliuose kekiniuose žiedynuose (2 pav.). Taurelė dvilypė, violetinė, plaukuota. Vainikėlis dvilypis, mėlynos ar violetinės spalvos. Ant viršutinės lūpos yra klostelė, vadinama šalmeliu ar kalpoku (lot. scutellum). Vaisius – riešutėlis. Baikalinė kalpokė žydi liepos – rugpjūčio mėnesiais [3 – 5].
Augalas auga saulėtuose kalnų šlaituose, sausoje smėlėtoje dirvoje. Paplitęs Japonijoje, Kinijoje, Korėjoje, Mongolijoje, Rusijoje.
Vaistinė augalinė žaliava: dažniausiai naudojamos šaknys, bet gali būti naudojama antžeminė augalo dalis, ūgliai. Šaknis ruda, lūžio vietoje šviesiai geltonos spalvos.
Baikalinė kalpokė kaupia flavonoidus (3 pav.) (baikaliną, baikaleiną, vogoniną, vogonozidą, apigeniną, hispiduliną, liuteoliną, skutelariną, skutelareiną, oroksiliną A, oroksilozidą, skutevuliną, chriziną), amino rūgštis, eterinius aliejus (kariofileną, terpineolį, β-humuleną), raugines medžiagas, dervas, šaknyse yra krakmolo [2, 5, 8 – 11].
2 pav. Baikalinės kalpokės žiedai [7]. 1 pav.Baikalinės kalpokės šaknis [6].
8
3 pav. Baikalinės kalpokės pagrindiniai kaupiami flavonoidai *12+.
2.2. Baikalinės kalpokės farmakologinės savybės
Baikalinė kalpokė Rytų medicinoje naudojama daugiau kaip 3000 metų. Ji pasižymi plačiu farmakologiniu poveikiu, kuris daugiausia priklauso nuo flavonoidų [9, 10]:
Priešuždegiminis poveikis (baikalinas, baikaleinas ir vogoninas). Baikalinas inhibuoja chemokinus žmogaus leukocitų ląstelėse, slopina jų biologines funkcijas, slopina uždegimo simptomus. Ciklookisgenazės 2, NO sintazės ir leukocitų adhezijos inhibavimas bei antioksidacinės flavanoidų savybės taip pat gali paaiškinti priešuždegiminį baikalinės kalpokės poveikį.
Antifibrotinis ir hepatoprotekcinis poveikis. Mažina hepatocitų ir žvaigždinių kepenų ląstelių oksidacinį stresą, stabdo hepatominių ląstelių gyvybinį ciklą ir sukelia jų apoptozę, inhibuoja lipidų peroksidaciją ir fibrozinius pokyčius kepenyse.
Antioksidacinis poveikis. Apsaugo liposomų membranas nuo UV spindulių sukeltos
oksidacijos. Baikalino antioksidacinis veikimas remiasi superoksido radikalų inaktyvacija, o baikaleino – ksantinoksidazės inhibavimu. Ksantino oksidazės inhibitoriai naudojami gydant hepatitą ir smegenų navikus.
9 Antialerginis poveikis. Liuteolinas ir baikaleinas mažina histamino išsiskyrimą iš
bazofilų ir mastocitų,
Neuroprotekcinis aktyvumas. Baikalinas sušvelnina dėl cerebralinės išemijos atsiradusių gliutamo ir aspartamo rūgščių koncentracijos padidėjimą. Vogonino neuroprotekcinis poveikis pasireiškia mikroglijų aktyvacijos slopinimu (slopina uždegiminius procesus).
Poveikis į širdies ir kraujagyslių sistemą. Baikaleinas mažina padidėjusį, bet nekeičia normalus kraujospūdžio, slopina trombocitų agregaciją, efektyviai mažina trigliceridų kiekį kraujyje, inhibuodamas angiotenziną II, mažina kraujagyslių rezistentiškumą ir gerina glomerulų filtraciją. Vogoninas inhibuoja monocitų chemotaksinį baltymą-1 (MCP-1), taip slopinamas uždegimas ir aterosklerozė. Baikalinės kalpokės ekstraktas sukelia periferinę vazodilataciją.
Raminantis poveikis. Vogoninas, baikalinas ir baikaleinas panašiai kaip
benzodiazepinai sąveikauja su GABA-A receptoriais, taip mažindami susijaudinimą, bet nesukeldami mieguistumo ir miorelaksacijos.
Antimikrobinis poveikis. Ekstraktai pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš kai kuriuos ligų sukėlėjus, pvz.: Salmonella typhimurium, antivirusinėmis savybėmis (slopina hepatito C viruso RNR replikaciją, slopina žmogaus imunodeficito I tipo viruso proteazes), baikaleinas pasižymi fungistatiniu poveikiu prieš kai kurias
Candida albicans, Cryptococcus neoformans ir Pityrosporum ovale padermes.
Priešvėžinis poveikis. Stimuliuoja granulocitų kolonijas stimuliuojantį faktorių, reguliuoja citozinų sekreciją, skatina navikinių ląstelių apoptozę, proliferaciją, mažina chemoterapijos žalą DNR.
Galimos sąveikos su vaistais:
Baikalinės kalpokės flavonoidai slopina CYP1A2 izofermentą, taip slopindami ir kai kurių vaistų, pvz.: paracetamolio, varfarino, teofilino, metabolizmą.
Mažina ciklosporino koncentraciją kraujo plazmoje.
Vartojant antikoaguliantus, didina kraujavimo pavojų.
Baikalinės kalpokės preparatai kontraindikuotini vartojant interferoną, nes gali sukelti ūmų plaučių uždegimą.
10 2.3. Flavonoidai
Flavonoidai yra polifenoliniai junginiai, kurių struktūros pagrindą sudaro 2-fenilbenzopirono žiedas. Jie egzistuoja aglikonų ir glikozidų pavidalu. Aglikonai sunkiai tirpsta vandenyje, geriau organiniuose tirpikliuose (eteryje, etilacetate, spirite). Flavonoidai, savo struktūroje turintys vieną ar kelias cukrų molekules, vadinami glikozidais. Jie gerai tirpsta vandens ir alkoholių mišiniuose, blogai – chloroforme, eteryje, benzole. O-glikozidų cukrų molekulės dažniausiai būna prijungtos prie aglikono dalies per OH grupes C3 ar C7 padėtyse, tuo tarpu C-glikozidų cukrų molekulės būna prijungtos prie aglikono anglies atomų C6 ar C8 padėtyse. Pagal anglikono struktūrą (4 pav.) flavonoidai skirstomi į grupes, iš kurių pagrindinės yra [1, 3, 13]:
Flavonai. Turi dvigubą jungtį tarp C2 ir C3 (liuteolinas, apigeninas, baikaleinas, skutelareinas).
Flavononai. Neturi dvigubos
jungties tarp C2 ir C3
(eridioktiolis, likviritigeninas, naringinas, hesperetinas).
Flavonoliai. Turi dvigubą jungtį tarp C2 ir C3 bei OH grupę prie C3 (kvercetinas, rutinas, morinas).
Izoflavonai. Fenilo grupė prijungta prie C3, o ne prie C2 (genisteinas, formononetinas, daidzinas).
Antocianidinai. Pagrindą sudaro benzopirilio katijonas, turi dvigubas jungtis tarp deguonies atomo 1 padėtyje ir C2 bei tarp C3 ir C4.
Flavonoidai yra plačiai paplitę gamtoje. Geriausiai ištirtos astrinių (Asteraceae), lūpažiedžių (Labiatae) ir rūtinių (Rutaceae) šeimos [14]. Nurodomas įvairus šių junginių skaičius – nuo 2500 [3] iki 6500 [1, 13]. Augaluose flavonoidai yra atsako į oksidacinį stresą ir infekcijas mechanizmų dalis, suteikia žiedams spalvą, dalyvauja pritraukiant vabzdžius *1+.
11 2.4. Flavonoidų ekstrakcija
Flavonoidų ekstrakcijai dažniausiai naudojama skysčių ekstrakcija metanoliu ar etanoliu, įvairių koncentracijų jų tirpalais su vandeniu, kartais acetonitrilo ir acetono vandeniniais tirpalais. Mažai poliški flavonoidai (pvz.: izoflavonai, flavononai, metilinti flavonai ir flavonoliai) yra ekstrahuojami chloroformu, dichloretanu, dietileteriu ar etilacetatu, tuo tarpu flavonoidų glikozidai ir labiau poliški aglikonai – alkoholiais bei alkoholių ir vandens mišiniais [14]. Flavonoidai gali būti ekstrahuojami ir Soksleto *1+ bei superkritinių skysčių metodais *15+, tačiau tai daroma gana retai.
Iš alkoholinių ekstraktų flavonoidai gali būti išgryninami cheminės hidrolizės būdu, juos nusodinant sunkiaisiais metalais ar naudojant kietafazę ekstrakciją [1, 13].
Cheminė hidrolizė atliekama parūgštintą hidrochlorine ar metano rūgštimi ekstraktą šildant 80-100°C temperatūroje, esant organiniam tirpikliui, pavyzdžiui, etanoliui. Kaitinant rūgštinėje aplinkoje atsiskiria glikozidų cukrų molekulės ir laisvi aglikonai pereina į organinį tirpiklį. Tokiu pat principu paremta ir fermentinė hidrolizė, tik šiuo atveju cukrų molekulės atsiskiria dėl β-gliukuronidazės ar β-gliukozidazės poveikio [1].
Fenoliniai junginiai, turintys hidroksilo grupes orto padėtyje sudaro nuosėdas, tad aglikonai gali būti išskiriami iš ištraukų juos nusodinant švino druskomis. Vėliau jų nuosėdos gali būti suardomos sieros vandenilio tirpalu [13].
Kietafazė ekstrakcija (KFE) – tai atskyrimo metodas, naudojamas tirpalams ar ekstraktams koncentruoti ir gryninti [16, 17]. Fenoliniams junginiams dažniausiai naudojami oktadecilsilano sorbentai ir bandinio parūgštinimas *1+. Organinių analičių sulaikymas iš polinių tirpiklių (pvz. vandens) kietafazės ekstrakcijos šerdelės sorbente vyksta dėl traukos jėgų tarp organinių analičių nepolinių grupių ir alkilo ar arilo funkcinių grupių sorbente. Ši sąveika dažnai vadinama van der Valso ar dispersijos jėgomis. Analitės desorbuojamos nepoliniu tirpikliu, kuris suardo minėtas sąveikas [18].
2.5. Flavonoidų analizės metodai
Fenoliniams junginiams kiekybiškai įvertinti bei juos identifikuoti gali būti naudojama plonasluoksnė chromatografija su densitometrija, dujų chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, bet dažniausiai šiuo tikslu taikoma efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)[1, 12, 18]. Flavonoidų analizei plačiausiai naudojamos atvirkščių fazių kolonėlės, užpildytos oktadecilsilano sorbentu (C-18). Jomis flavonoidų glikozidai yra eliuojami anksčiau nei aglikonai,
12
o daugiau hidroksilo grupių turintys flavonoidai anksčiau, nei mažiau šių grupių turintys junginiai. Kaip judrios fazės tirpikliai naudojami acetonitrilo ir vandens arba metanolio ir vandens mišiniai. Į juos pridedama rūgštinių modifikatorių, kurie slopina nejudrios fazės silanolinių grupių disociaciją ir fenolinių hidroksilo grupių jonizaciją bei padeda gauti simetriškesnes chromatogramų smailes [14].
1 lentelėje pateikiamos analizuotoje literatūroje aprašytų baikalinės kalpokės flavonoidų analizės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu sąlygos.
1 lentelė. Baikalinės kalpokės analizės sąlygos ESC metodu.
Analizės sąlygos Kolonėlė ir
detektorius
Nustatyti flavonoidai
Šaltinis
Metanolio-0,05% acto rg. vandeninis tirpalas (41:59), tekėjimo greitis 1ml/min.
200 mm × 4,6 mm, 10 µm. DAD.
Baikalinas, vogonozidas.
[19]
Metanolinis 1% acto rg. tirpalas (tirpiklis A) – vandeninis 1% acto rg. tirpalas (tirpiklis B), gradientinis režimas: 0–15 min., 25–55% A; 15–18 min., 55–70% A; 18–26 min., 70% A; 26–28 min., 70–25% A. Tekėjimo greitis 1 ml/min. C-18, 250 mm × 4,6 mm, 5 µm. UV detektorius (λ=280 nm). Baikaleinas, vogoninas, oroksilinas. [20]
0,1% fosforo rg. (tirpiklis A) – acetonitrilas (tirpiklis B), gradientinis režimas: 0-14 min. 10-35% B, 14-20 min. 35% B, 35-40 min. 55% B, 40-40,1 min. 55-10% B; tekėjimo greitis 0,8 ml/min. C-18, 150 mm × 4,6 mm, 5,0 µm. UV detektorius (λ=277 nm). Baikalinas, baikaleinas ir vogoninas. [21]
0,1% vandeninis skruzdžių rg. tirp. (tirpiklis A), acetonitrilas su 0,1% skruzdžių rg (tirpiklis B). Bandinys 5 µl. Gradientinis režimas: 0-2 min. 30% B, 2-6 min. 30-60% B, 6-11 min. 60-85% B, 11-11,25 min. 85-99% B, 11,25-12,25 min. 99% B, 12,25-12,50 min. 99-30% B, 12,50-16 min. 30% B. Tekėjimo greitis 0,4 ml/min. C-18, 100 mm × 2,1 mm, 3,5 µm. DAD ir MS. Skutelareinas, baikaleinas, apigeninas, vogoninas, chrizinas, skutelarinas, baikalinas. [12]
0,001M fosforo rg. (tirpiklis A), acetonitrilas (tirpiklis B). Gradientinis režimas: 0-10 min. 20% B, 10-40 min. 20-25% B, 40-80 min. 25-60% B. C-18, 250 mm × 4,6 mm, 5,0 µm. UV detektorius (λ=270 nm). Baikalinas, baikaleinas, skutelareinas, chrizinas. [22]
13
Iš 1 lentelės matyti, kad baikalinės kalpokės ekstraktų analizei dažniausiai naudojamos C-18 kolonėlės, metanolio arba acetonitrilo ir parūgštinto vandens judrios fazės, gradientinis analizės režimas, UV detektoriai, detekcija atliekama 254-280 nm ilgio banga, esant 0,4-1,0 ml/min. tekėjimo greičiui.
2.6. Oksidacinis stresas ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas
Organizme, dėl vidinių (pvz.: uždegimų, aktyvios peroksidacijos peroksisomose, aktyvios fagocitozės, metabolinių reakcijų ir kt.) ir išorinių (rūkymas, UV ar radiacinė spinduliuotė, aplinkos užterštumas, ozonas ir kt.) veiksnių įtakos susidaro aktyvios deguonies formos (2 lentelė) [23, 24]. Oksidacinis stresas - tai procesas, kurio metu susidarę laisvieji radikalai atakuoja ląsteles ir sukelia dažnai negrįžtamus pakitimus [25].
2 lentelė. Aktyvios deguonies formos *21+.
Pavadinimas Formulė
Laisvieji radikalai
Hidroksiradikalas OH•
Superoksido radikalas O2-•
Azoto oksido radikalas NO•
Lipidų peroksidų radikalai LOO•
Neradikalai
Vandenilio peroksidas H2O2
Singletinės būsenos deguonis 1O2
Hipochlorito rūgštis HOCl
Ozonas O3
Organizmas turi apsaugos nuo aktyvių deguonies formų sistemą, kurią sudaro [23, 24]:
Antioksidaciniai fermentai (superoksido dismutazė, katalazė, glutationo
peroksidazė ir reduktazė).
Pereinamųjų metalų jonus jungiantys baltymai (feritinas, ceruloplazminas,
metalotioneinai).
Mažos molekulinės masės laisvųjų radikalų gaudyklės (tokoferoliai (vitaminas E ir jo dariniai), karotenoidai (vitaminas A ir jo dariniai, likopenas), ubichinonas (CoQ), L-askorbo rūgštis (vitaminas C), šlapimo rūgštis, flavonoidai).
Sutrikus organizmo apsaugai nuo aktyvių deguonies formų, pažeidžiamos struktūrinės organizmo makromolekulės – baltymai, lipidai, angliavandeniai ir DNR. Tai sukelia ląstelių pažeidimus, mutacijas, fermentinių sistemų ir organizmo funkcijų sutrikimus, o tai skatina ligų vystymąsi *23, 24].
14
Medžiagos, mažinančios biologinių membranų oksidacinį pažeidimą, vadinamos antioksidantais [24]. Šių medžiagų antioksidacinės savybės gali būti analizuojamos vykdant reakcijas su radikalais (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH), 2,2‘-azino-bis (3-etilbenztiazolino-6-sulfoninė rūgštis) (ABTS) ar kt.) ir tiriant radikalų aktyvumo sumažėjimą. Bendram mišinio ar ekstrakto junginių antioksidaciniam aktyvumui įvertinti naudojami spektrofotometriniai metodai, o atskirų junginių antioksidacinis aktyvumas gali būti vertinamas naudojant efektyviosios chromatografijos sistemas su reakcijos detektoriumi [26 – 28].
15
EKSPERIMENTINĖ DALIS
3. Tyrimų objektas ir metodika
3.1. Medžiagos ir tirpikliai
Metanolis, 99,5% (Barta a Cihlar, Čekija); Trifluoracto rūgštis, 98% (Merck, Vokietija); Fosforo rūgštis, 85% (Reachim, Rusija);
Folin-Ciocalteau fenolinis reagentas (Sigma-Aldrich, JAV); Natrio karbonatas, 99,5%, (Merck, Vokietija);
DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidratas) (Sigma-Aldrich, Vokietija); Aliuminio chloridas, grynas (La Chema, Čekija);
Natrio dihidrofosfatas, 99,0% (La Chema, Čekija); Natrio hidrofosfatas,99,5% (Merck, Vokietija); Baikalino standartas (ChromaDex, JAV); Baikaleino standartas (ChromaDex, JAV); Skutelarino standartas (ChromaDex, JAV); Galo rūgštis (Sigma-Aldrich, Vokietija); (+)-katechino standartas. (Fluka, Šveicarija). 3.2. Augalinė žaliava ir ekstraktų gamyba
Baikalinės kalpokės augalinė žaliava buvo surinkta 2006 metų birželio – rugpjūčio mėnesiais Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodo vaistinių augalų kolekcijoje. Žaliava džiovinta sausoje vietoje vengiant tiesioginių saulės spindulių. Augalinės žaliavos ženklinimas, surinkimo datos ir augimo tarpsnis nurodyti 3 lentelėje.
3 lentelė. Analizei naudota baikalinės kalpokės vaistinė augalinė žaliava.
Žaliavos ženklinimas
Augalo dalis Surinkimo data
Augalo augimo tarpsnis
A Antžeminė 2006-06-01 Intensyvus augimas.
B Antžeminė 2006-06-27 Butonizacija.
Z1 Antžeminė 2006-07-04 Žydėjimo pradžia.
Z2 Antžeminė 2006-07-11 Masinis žydėjimas.
Z3 Antžeminė 2006-07-31 Žydėjimo pabaiga, vaisių brendimas.
R Šaknis 2006-08-23 Vaisių subrendimas, lapų nykimo
16
Išdžiovinta augalinė žaliava susmulkinta buitiniu smulkintuvu (Braun, Vokietija): antžeminė dalis (lapai, stiebeliai ir žiedai) iki 0,2-1 cm, o šaknis iki 2-3 mm dalelių. 0,5 g susmulkintos augalinės žaliavos buvo užpilta 9 ml 75% metanoliu ir palikta ekstrahuotis purtyklėje Titer-Tek (Flow Laboratories, JAV) 24 valandoms. Gauti ekstraktai filtruoti per popierinius filtrus ir pavadinti pagal žaliavos, iš kurios jie gauti, pavadinimus.
Ekstraktai chromatografinei analizei paruošti kietafazės ekstrakcijos būdu. Naudotos 1 ml šerdelės (LiChrolut, Merck), užpildytos 100 mg RP-18 sorbento, ir vakuuminis kolektorius (Visiprep DL, Supelco), kuriame buvo palaikomas 20-30 kPa vakuumas. Kietafazės ekstrakcijos etapai nurodyti 4 lentelėje.
4 lentelė. Kietafazės ekstrakcijos etapai.
Kietafazės ekstrakcijos etapai Etapo aprašas
Šerdelės kondicionavimas Į šerdelę įleidžiama 1 ml 75% metanolio; 3 ml trifluoracto
rg. parūgštinto vandens, kurio pH2.
Bandinio įleidimas Į šerdelę įleidžiama 10 ml 1:10 metanolinio baikalinės
kalpokės ekstrakto, pH2 (parūgštinta trifluoracto rg.).
Priemaišų pašalinimas Įleidžiama 3 ml trifluoracto rg. parūgštinto vandens, pH2.
Šerdelės džiovinimas Šerdelė džiovinama 5 minutes vakuumu.
Analičių reabsorbcija Tiriamos medžiagos surenkamos įleidžiant 1 ml 75%
metanolio.
3.3. Baikalinės kalpokės ekstraktų analizė spektrofotometriniu metodu
Naudojant spektrofotometrinį metodą buvo įvertinti bendri fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai bei antioksidacinis tiriamų ekstraktų aktyvumas. Tyrimams atlikti buvo naudojamas Spectronic 1201 (Milton Roy, JAV) spektrofotometras ir 1 ml talpos kiuvetės.
Bendras fenolinių junginių kiekis buvo įvertintas pagal [26, 29] reakciją su Folin-Ciocalteau reagentu, naudojant etaloninį galo rūgšties tirpalą. 0,1 ml 2N Folin-Ciocalteau reagento sumaišyta su 2,5 ml vandens ir 0,1 µl tiriamojo ekstrakto. Tirpalas supurtytas ir įpilta 0,5 ml 20% Na2CO3. Po 30 minučių išmatuota absorbcija esant 760 nm bangos ilgiui. Fenolinių junginių
kiekis ekstrakte (mg/ml) apskaičiuotas pagal galo rūgšties kalibravimo kreivę, o jų kiekis vaistinėje augalinėje žaliavoje (mg/g) apskaičiuotas pagal formulę:
17
,
čia: C – polifenolinių junginių kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentais, mg/g; c – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml; V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;
m – ekstrakcijai paimto augalinio mėginio masė, g.
Bendras flavonoidų kiekis nustatytas aliuminio chlorido kolorimetriniu tyrimu [26]. Į 250 µl ekstrakto įpilta 1,25 ml distiliuoto vandens ir 0,75 ml 5% NaNO2. Po 6 minučių įpilata 0,15 ml
10% AlCl3. Gautas tirpalas praskiestas bidistiliuotu vandeniu iki 2,5 ml tūrio. Tirpalų absorbcija
matuota esant 510 nm bangos ilgiui. Flavonoidų kiekis ekstrakte (mg/ml) apskaičiuotas pagal katechino kalibravimo kreivę, o jų kiekis vaistinėje augalinėje žaliavoje (mg/g) apskaičiuotas pagal formulę:
,
čia: C – flavonoidų kiekis, išreikštas katechino ekvivalentais, mg/g; c – katechino koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml; V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;
m – ekstrakcijai paimto augalinio mėginio masė, g.
Antioksidacinis aktyvumas nustatytas DPPH radikalinio sujungimo metodu [28, 30]. 50 µl ekstrakto sumaišyta su 2 ml 6×10-5M metanolinio DPPH tirpalo. Lyginamasis tirpalas ruoštas naudojant 75% metanolį. Spektrofotometru po 15 minučių išmatuota mėginių absorbcija esant 515 nm bangos ilgiui. Sujungto DPPH radikalo kiekis procentais apskaičiuotas pagal formulę:
,
čia: Ab – tuščiojo mėginio absorbcija;
Aa – tiriamojo mėginio absorbcija pusiausvyroje.
3.4. Baikalinės kalpokės ekstraktų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas taikytas flavonoidams identifikuoti, jų kiekiui nustatyti bei baikalinės kalpokės ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui įvertinti. Analizei naudota ESC sistema (5 pav.), sudaryta iš:
18
Degazatoriaus G1322A Degasser HP series 1100 (HP, Japonija);
Siurblio G1310A HP Iso Pump Series 1100 (HP, Japonija);
UV detektoriaus Spectra 200 (Spectra-Physics, JAV);
Siurblio Pheonix 20 CU (Carlo Erba Instruments, Italija);
Regimos šviesos detektoriaus Linear Uvis 200 (Linear Instruments Corp., JAV);
Kolonėlė Eurospher 100-5 C18, 250×3 mm su prieškolone (Knauer, Vokietija).
Pradinės baikalinės kalpokės ekstraktų analizės sąlygos buvo surinktos iš literatūros *18+: Tirpikliai: A – H2O, pH3, parūgštinta H3PO4. B – CH3OH. Gradientas: 0-15 min. 25-55% B; 15-18 min. 55-70% B; 18-26 min. 70% B; 26-28 min. 70-25%. Injekcija: 4 µl. Tėkmės greitis: 0,75 ml/min. Detekcija: λ=280 nm.
ESC būdu atskirtų junginių antioksidaciniam aktyvumui nustatyti naudotas DPPH tirpalas, paruoštas pagal Vytauto Didžiojo universiteto Gamtos mokslų fakulteto Biochemijos ir biotechnologijų katedroje naudojamą metodiką: 1 mg DPPH ištirpintas 100 ml acetonitrilo. Į gautą tirpalą įpilta 200 ml 50 mM fosfatinio buferio, pagaminto iš natrio hidrofosfato ir natrio
2 3 4 6 7 8 9 10 11 1 5 5
5 pav. Analizei naudotos ESC sistemos schema. 1 – tirpiklių rezervuarai, 2 – degazatorius, 3 – siurblys, 4 – autoinjektorius, 5 – prieškolonė, 6 – kolonėlė, 7 – UV detektorius, 8 – rezervuaras su DPPH radikalu, 9 – siurblys, 10 – regimos šviesos detektorius, 11 – kompiuteris.
19
dihidrofosfato (pH7,6). Šis tirpalas tiektas į ESC sistemą 0,25 ml/min. greičiu, o chromatogramos registruotos esant 517 nm bangos ilgiui.
Duomenys registruoti kompiuterine programa ChromStar (Bruker, Vokietija), chromatogramos apdorotos programa OriginPro 8 (OriginLab Corporation, JAV), statistinė duomenų analizė atlikta programa Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV).
4. Darbo rezultatai ir jų aptarimas
4.1. Baikalinės kalpokės ekstraktų kietafazės ekstrakcijos sąlygų optimizavimas
Atlikus baikalinės kalpokės ekstraktų kietafazę ekstrakciją, spektrofotometriniais metodais buvo nustatyti šie nuostoliai:
Fenolinių junginių kiekio – 42%.
Flavonoidų kiekio – 26%.
Nuostoliai galėjo atsirasti dėl per mažo kietafazei ekstrakcijai naudojamo sorbento kiekio šerdelėje: sorbento aktyvūs centrai užsipildė greičiau nei buvo praleistas visas parūgštintu vandeniu praskiestas ekstraktas, tad fenoliniai junginiai nebuvo sulaikomi sorbente.
Kietafazės ekstrakcijos metodui optimizuoti buvo pasirinktas ekstraktas Z1. Surinktos 5
frakcijos po 2 ml, gautos praleidus 10 ml trifluoracto rūgštimi parūgštintu vandeniu praskiesto ekstrakto (1:10) per kietafazei ekstrakcijai naudojamą šerdelę. Su kiekviena frakcija atlikta reakcija bendram fenolinių junginių bei flavonoidų kiekiui nustatyti ir išmatuota gautų tirpalų absorbcija (6 pav.).
20
Iš 6 pav. matyti, kad pradedant antra frakcija, fenolinių junginių ir flavonoidų nuostoliai labai padidėja. Įvertinus šiuos rezultatus buvo nuspręsta atliekant kietafazę ekstrakciją per sorbentą praleisti tik 1 frakciją (2 ml) praskiesto ekstrakto.
Pakeitus kietafazės ekstrakcijos sąlygas ir atlikus spektrofotometrinius tyrimus bendram fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiams nustatyti, buvo apskaičiuoti kietafazės ekstrakcijos nuostoliai:
Fenolinių junginių – 12%.
Flavonoidų – 9%.
Visi metanoliniai baikalinės kalpokės ekstraktai prieš efektyviosios skysčių chromatografijos analizę buvo ekstrahuojami kietafazės ekstrakcijos būdu, per sorbentą praleidžiant 2 ml parūgštintu vandeniu praskiesto (1:10) bandinio.
4.2. Baikalinės kalpokės ekstraktų spektrofotometrinė analizė
4.2.1. Paklaidų įvertinimas
Pagal metodikas bendram fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiui bei antioksidaciniam aktyvumui įvertinti spektrofotometriniu būdu buvo nustatytos ekstrakcijos ir matavimų paklaidos. Ekstrakcijos paklaidai įvertinti buvo pagaminta po tris ekstraktus iš trijų skirtingais baikalinės kalpokės vegetacijos tarpsniais surinktų žaliavų pavyzdžių (Z1, Z2, Z3). Matavimų
paklaidos buvo įvertintos matuojant to paties bandinio absorbciją tris kartus kelių minučių laikotarpiu. Apskaičiuotas gautų reikšmių santykinis standartinis nuokrypis (SSN). Gauti rezultatai pateikiami 5 lentelėje.
5 lentelė. Ekstrakcijos ir matavimo paklaidų įvertinimas.
SSN, %
Ekstrakcijos Matavimų
Prieš KFE Po KFE Bendram fenolinių kiekiui 9,95 2,12 1,56 Bendram flavonoidų kiekiui 16,02 2,16 2,40 Antioksidaciniam aktyvumui 12,85 15,16
Kaip matome iš 5 lentelės, didžiausia matavimo paklaida daryta tiriant ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Šio matavimo paklaidą daugiausia lėmė nestabilus DPPH radikalas.
21
4.2.2. Baikalinės kalpokės ekstraktų sudėties priklausomybė nuo žaliavos vegetacijos
periodo
Nustatytas bendras fenolinių junginių bei flavonoidų kiekis baikalinės kalpokės ekstraktuose bei įvertintas šių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Gauti duomenys pateikiami 7 ir 8 paveiksluose.
7 pav. Kietafazės ekstrakcijos būdu išgrynintų ekstraktų palyginimas.
8 pav. Kietafazės ekstrakcijos būdu negrynintų ekstraktų palyginimas. Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti šie ekstraktai buvo skiesti 25 kartus.
22
Iš 7 ir 8 pav. matyti, kad baikalinės kalpokės ekstraktuose bendri fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai didėja butonizacijos ir žydėjimo laikotarpiu, pasiekdami didžiausias reikšmes žaliavoje, surinktoje masinio žydėjimo metu. Didžiausia flavonoidų koncentracija nustatyta šaknies ekstrakte.
Literatūros duomenų apie baikalinės kalpokės ekstraktų ar vaistinės augalinės žaliavos sudėties kitimus priklausomai nuo vegetacijos periodo nerasta. Tačiau šaltiniuose [10] ir[14] minima, kad augaluose flavonoidų kiekis yra didžiausias žydėjimo metu ir jų daugiausia jaunuose audiniuose. Tuo būtų galima paaiškinti gautus rezultatus.
Iš 7 ir 8 pav. galima pastebėti, kad didėjant flavonoidų kiekiui, didėja antioksidacinis ekstraktų aktyvumas.
4.3. Baikalinės kalpokės ekstraktų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
4.3.1. ESC sąlygų optimizavimas
Pradinės analizės sąlygos buvo paimtos iš literatūros šaltinio *18], kuriame buvo aprašoma baikalinės kalpokės ekstraktų analizė. Buvo optimizuoti parametrai metanoliniams baikalinės kalpokės ekstraktams ir pritaikyti turimai aparatūrai:
Tėkmės greitis: 0,3 ml/min. Gradientas: 0-35 min. 40-70% CH3OH; 35-40 min. 70-90% CH3OH; 40-45 min. 90-95% CH3OH; 45-50 min. 95-40% CH3OH.
Du paskutiniai gradiento etapai naudoti kolonėlei kondicionuoti ir nulygsvarinti. Baikalinės kalpokės metanolinio ekstrakto, pagaminto iš intensyvaus augimo metu surinktos vaistinės augalinės žaliavos (A), chromatogramos, užregistruotos prieš ir po gradiento optimizavimo, pateiktos 9 pav.
23 0 10 20 30 40 0 20 40 60 80 100 Abso rb ci ja . mV Laikas, min.
9 pav. Efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygų optimizavimas, Analizuotas A ekstraktas. Raudonos spalvos chromatograma gauta, naudojant pradinį gradientą: 0-15 min. 25-55% CH3OH; 15-18 min. 55-70% CH3OH; 18-26 min. 70%
CH3OH; 26-28 min. 70-25% CH3OH. Tėkmės greitis 0,75 ml/min. Juodos spalvos chromatograma gauta, naudojant optimizuotą
gradientą. Injekcijos tūris 4 µl.
Iš 9 pav. matyti, kad optimizavus efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygas padidėjo skiriamoji geba, buvo atskirta daugiau smailių.
4.3.2. Flavonoidų identifikacija
Junginių identifikavimas pagrįstas etaloninių junginių ir bandinio analičių sulaikymo laiko atitikimu. Flavonoidams identifikuoti baikalinės kalpokės ekstraktuose buvo taikomas išorinio standarto metodas. Identifikuoti keturi flavonoidai: apigenino-7-glikozidas, baikalinas, skutelarinas ir baikaleinas. 10 ir 11 pav. pateiktose chromatogramose pažymėti identifikuoti junginiai iš skirtingais baikalinės kalpokės vegetacijos tarpsniais surinktos augalinės žaliavos pagamintuose metanoliniuose ekstraktuose.
24 10 20 30 40 0 20 40 60 80 100 120 140 Abso rb ci ja , mV Laikas, min. A ekstraktas B ekstraktas Z1 ekstraktas 1 2 3 4
10 pav. Flavonoidų identifikavimas baikalinės kalpokės ekstraktuose. Identifikuoti flavonoidai: 1 – apigenino-7-glikozidas, 2 – baikalinas, 3 – skutelarinas, 4 – baikaleinas. Gradientas: 0-35min. 40-70% CH3OH, 35-40min. 70-90% CH3OH, 40-45min.
90-95% CH3OH, 45-50min. 95-40% CH3OH. Tėkmės greitis 0,3 ml/min. Injekcijos tūris 4µl.
10 20 30 40 0 50 100 150 200 Abso rb ci ja , mV Laikas, min. Z2 ekstraktas Z3 ekstraktas R ekstraktas 1 2 3 4
11 pav. Flavonoidų identifikavimas baikalinės kalpokės ekstraktuose. Identifikuoti flavonoidai: 1 – apigenino-7-glikozidas, 2 – baikalinas, 3 – skutelarinas, 4 – baikaleinas. Analizės sąlygos kaip 10 pav.
25
Iš chromatogramų matyti, kad junginių eliucijos eilė ir jų sulaikymo laikas priklauso nuo junginio poliškumo. Glikozidų sulaikymo laikas yra trumpesnis ir jie iš kolonėlės sorbento eliuojami anksčiau nei anglikonas (baikaleinas).
4.3.3. Flavonoidų kiekio nustatymas ESC metodu baikalinės kalpokės ekstraktuose
Kiekybinis baikalinės kalpokės ekstraktuose identifikuotų flavonoidų įvertinimas buvo atliktas pagal sudarytus kalibracinius grafikus (12 ir 13 pav.). Dėl standartų trūkumo, baikaleino, skutelarino ir apigenino-7-glikozido koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal katechino standartą ir išreikštos katechino ekvivalentais, mg/g žaliavos. Baikalino koncentracija buvo apskaičiuota pagal baikalino kalibracinį grafiką.
14 pav. Baikalino, baikaleino, apigenino-7-glikozido, skutelarino ir baikaleino kiekių pasiskirstymas skirtingais baikalinės kalpokės vegetacijos periodais.
26
Iš 14 paveikslėlio matyti, kad baikalinės kalpokės flavonoidai vaistinėje augalinėje žaliavoje pasiskirsto nevienodai. Antžeminėje dalyje daugiausia randama apigenino-7-glikozido, o šaknyse – baikalino. Skutelarino ir baikaleino kiekiai antžeminėje dalyje yra gana maži – 0,16-0,9 mg/g, o šaknyse jų jau atitinkamai randama 3,4 ir 7,9 mg/g. Iš diagramos taip pat matyti, kad šaknyse kaupiasi daugiau flavonoidų nei antžeminėje dalyje.
Nagrinėtose literatūros šaltiniuose pateikti baikalinės kalpokės žaliavoje nustatytų flavonoidų kiekiai labai skiriasi priklausomai nuo ekstrakcijos metodo, naudotų tirpiklių, vaistinės augalinės žaliavos augimo sąlygų. Šaknyse jo nustatyta 19,33 mg/g [22] – 150 mg/g [12], 4,5 mg/g [12] skutelarino, 4,7 mg/g [12] – 8,4 mg/g [15] baikaleino, apie 0,3 mg/g [12] apigenino-7-glikozido. Apie šių flavonoidų pasiskirstymą subrendusioje antžeminėje baikalinės kalpokės dalyje duomenų nerasta.
4.3.4. Baikalinės kalpokės antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ESC metodu
Antioksidacinis atskirų baikalinės kalpokės ekstraktuose identifikuotų flavonoidų aktyvumas buvo tiriamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu vykdant pokolonėlinę išskirstytų junginių reakciją su DPPH radikalo tirpalu. UV detektoriumi užregistruotų chromatogramų (15, 16 pav.) viršutinėje dalyje matomas junginių atskyrimas, o apatinėje dalyje – reakcijos detektoriumi užregistruotas atskirtų junginių antioksidacinis aktyvumas.
0 10 20 30 40 0 50 100 150 200 Abso rb ci ja , mV Laikas, min.
15 pav. Baikalinės kalpokės šaknies ekstrakto skirstymo (juoda) ir jo antioksidacinio aktyvumo (raudona) chromatogramos. Skirstymo chromatograma registruota esant tokioms pat sąlygoms kaip 10 pav. pavaizduotos chromatogramos. Antioksidacinė chromatograma registruota 517nm ilgio banga ir DPPH tirpalui tekant 0,25ml/min. greičiu.
27 0 10 20 30 40 -20 0 20 40 60 80 100 120 Abso rb ci ja , mV Laikas, min.
16 pav. Baikalinės kalpokės Z1 ekstrakto skirstymo (juoda) ir jo antioksidacinio aktyvumo (raudona) chromatogramos. Sąlygos
tokios pat kaip 13 pav.
Buvo apskaičiuoti visų identifikuotų flavonoidų antioksidacinių smailių plotai. Pagal gautus duomenis įvertintas apytikslis kiekvieno iš šių junginių indėlis bendram nustatytų flavonoidų antioksidaciniam aktyvumui. Gauti duomenys pateikiami 17 pav.
17 pav. Keturių dentifikuotų flavonoidų antioksidacinių aktyvumų santykis skirtingais baikalinės kalpokės vegetacijos periodais.
28
Iš 17 paveikslėlio matyti, kad antžeminėje baikalinės kalpokės dalyje iš nustatytų flavonoidų didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi apigenino-7-glikozidas, o šaknyje – baikalinas. Skutelarino ir baikaleino antioksidacinio aktyvumo dalies nepavyko nustatyti antžeminėje dalyje dėl mažo šių flavonoidų kiekio. Dėl didelio bazinės linijos triukšmo registruojant antioksidacines chromatografas ir mažo metodo jautrumo, šis antioksidacinio aktyvumo palyginimas yra tik orientacinio pobūdžio.
29
5. IŠVADOS
1. Optimizuotas kietafazės ekstrakcijos metodas baikalinės kalpokės bandiniams ESC analizei paruošti. Fenolinių junginių išgava padidinta nuo 58% iki 88%, o flavonoidų – nuo 74% iki 91%.
2. Spektrofotometriniu metodu įvertintas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis bei antioksidacinis aktyvumas baikalinės kalpokės ekstraktuose. Nustatyta, kad šių medžiagų koncentracijos antžeminėje augalo dalyje pasiekia maksimalias vertes masinio žydėjimo metu (žaliava rinkta liepos 11 d.). Didžiausi fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai nustatyti baikalinės kalpokės šaknyje, tad šią augalo dalį geriausia rinkti kaip vaistinę augalinę žaliavą.
Pastebėta, kad didėjant fenolinių junginių ir flavonoidų koncentracijoms baikalinės kalpokės ekstraktuose, didėja ekstraktų antioksidacinis aktyvumas.
3. Atlikus efektyviosios skysčių chromatografijos analizę, identifikuoti keturi baikalinės kalpokės flavonoidai – apigenino-7-glikozidas, baikalinas, skutelarinas ir baikaleinas. Atlikta kiekybinė šių junginių analizė skirtingais augalo vegetacijos periodais surinktoje žaliavoje. Nustatyta, kad antžeminėje augalo dalyje labiausiai yra paplitęs apigenino-7-glikozidas, o šaknyje – baikalinas (35,09mg/g).
4. Atlikus antioksidacinių savybių ESC analizę, nustatyta, kad iš identifikuotų flavonoidų antžeminių baikalinės kalpokės dalių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą didžiąja dalimi lemia apigenino-7-glikozidas. Iš šaknų pagamintų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą lemia baikalinas.
30
Literatūra
1. E. Rijke, P. Out, W. M. A. Niessen, F. Ariese, C. Gooijer, U. A. Th. Brinkman. Analytical separation and detection methods for flavonoids. J. Chromatography A. 1112 (2006) 31-63. 2. H.-B. Li, Y. Jiang, F. Chen. Separation methods used for Scutellaria baikalensis active
components. J. Chromatography B. 812 (2004) 277-290.
3. M. Heinrich, J. Barnes, S. Gibbons, E. M. Williamson. Fundamentals of pharmacognosy and phytotherapy. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2004. p. 106-129, 246-252, 282.
4. Д. А. Муравьева. Фармакогнозия. Москва: Медицина; 1991. p. 483.
5. Н. И. Гринкевич. Лекарственные растения: справочное пособие. Москва : Высшая школа, 1991. p. 376-378.
6. Prieiga per internetą (2009-05-13):
http://sacredmedicinesanctuary.com/index.php?main_page=popup_image&pID=2481. 7. Prieiga per internetą (2009-05-13):
http://www.horizonherbs.com/product.asp?specific=724.
8. V. M. Malikov, M. P. Yuldashev. Phenolic compounds of plants of the Scutellaria L. genus. Distribution, structure, and properties. Chemistry of natural compounds, Vol. 38, No. 4, 2002.
9. L. Braun, M. Cohen. Herbs & natural supplements: an evidence - based guide. 2nd edition. Australia: Elsevier; 2007. p. 153-162.
10. B. Bohm. Introduction to flavonoids. Amsterdam: OPA, 1998.
11. J. Barnes, L. A. Anderson, J. D. Phillipson. Herbal medicines. Third edition. London: Pharmaceutical Press; 2007. p. 530-532.
12. Ch. R. Horvath, P. A. Martos, P. K. Saxena. Identification and quantification of eight flavones in root and shoot tissues of the medical plant Huang-qin (Scutellaria baicalensis Georgi) using high-performance liquid chromatography with diode array and mass spectrometric detection. J. Chromatography A, 1062 (2005) 199-207.
13. V. Janulis, G. Podžiūnienė, F. Malinauskas. Fitocheminė analizė. Mokomoji knyga. Kaunas: KMU leidykla; 2008. p. 89-108.
14. O. M. Andersen, K. R. Markham (editors). Flavonoids. Chemistry, Biochemistry and Applications. Boca Raton: Taylor and Francis Group; 2006.
31
15. M.-Ch. Lin, M.-J. Tsai, K.-Ch. Wen. Supercritical fluid extraction of flavonoids from
Scutellariae Radix. J. Chromatography A, 830 (1999) 387-395.
16. Prieiga per internetą (2009-05-14):
http://www.whatman.com/SolidPhaseExtractionSPE.aspx
17. Guide to Solid Phase Extraction. Prieiga per internetą (2009-05-14): http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf.
18. Guide to Solid Phase Extraction. Bulletin 910. Prieiga per internetą (2009-05-14): http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf.
19. Wu, A. Sun, R. Liu. Separation and purification of baicalin and wogonoside from the Chinese medicinal plant Scutellaria baicalensis Georgi by high-speed counter-current chromatography. J. Chromatography A, 1066 (2005) 243–247.
20. H.-B. Li, F. Chen. Isolation and purification of baicalein, wogonin and oroxylin A from the medicinal plant Scutellaria baicalensis by high-speed counter-current chromatography. J. Chromatography A, 1074 (2005) 107–110.
21. S.M.A. Zobayed, S.J. Murch, H.P.V. Rupasinghe, J.G. de Boer,B.W. Glickman, P.K. Saxena. Optimized system for biomass production, chemical characterization and evaluation of chemo-preventive properties of Scutellaria baicalensis Georgi. Plant Science, 167 (2004) 439–446.
22. G. Zgorka, A. Hajnos. The Application of Solid-Phase Extraction and Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography for Simultaneous Isolation and Determination of Plant Flavonoids and Phenolic Acids. Chromatographia, 2003, 57, Suppl., S-77 – S-80.
23. A. Praškevičius, L. Ivanovienė, H. Rodovičius. Biologinės membranos, Biologinė oksidacija. Fotosintezė. Kaunas: KMU Spaudos ir leidybos centro leidykla; 2001. p. 94-112.
24. V. Mildažienė, S. Jarmalaitė, R. Daugelavičius. Ląstelės biologija. Kaunas: VDU; 2004. p. 293-313.
25. Prieiga per internetą (2009-05-14): http://www.imunitetas.lt/?aid=304.
26. Ch.-H. Wu, H. N. Murthy, E.-J. Hahn, K.-Y. Paek. Improved production of caffeic acid derivatives in suspension cultures of Echinacea purpurea by medium replenishment strategy. Arch. Pharm. Res. Vol. 30 No. 8, 945-949, 2007.
32
27. M. Hajimahmoodi, M. Hanifeh, M. R. Oveisi, N. Sadeghi, B. Jannat. Determiantion of total antioxidant capacity of green teas by ferric reducing / antioxidant power assay. Iran. J. Environ. Health. Sci. Eng., 2008, Vol. 5, No. 3, pp. 167-172.
28. G. Kasparavičienė, V. Briedis. Juodųjų serbentų ir juodavaisių aronijų uogų sulčių stabilumas ir antioksidacinis aktyvumas. Medicina (2003) 39 tomas, 2 priedas. 65-69.
29. P. Viškelis, R. Bobinaitė. Fenolinių junginių ir antocianinų kiekis nokstant avietėms. Maisto chemija ir technologija. 2007. T. 41, Nr. 2.
30. G. Kasparavičienė, V. Briedis, L. Ivanauskas. Šaltalankių aliejaus technologijos įtaka jo antioksidaciniam aktyvumui. Medicina (Kaunas) 2004; 40(8) 753-757.
33
Santrauka
Raktiniai žodžiai: baikalinė kalpokė, flavonoidai, efektyvioji skysčių chromatografija.
Baikalinė kalpokė (lot. Scutellaria baikalensis Georgi) – daugiametis žolinis lūpažiedžių šeimos augalas. Savaime auga Japonijoje, Kinijoje, Korėjoje, Rusijoje.
Baikalinės kalpokės ekstraktai pasižymi plačiu farmakologiniu poveikiu. Jos ekstraktai turi priešuždegiminį, antifibrotinį, hepatoprotekcinį, antioksidacinį antialerginį, neuroprotekcinį, antimikrobinį, priešvėžinį, raminantį poveikį, teigiamai veikia širdies ir kraujagyslių sistemą.
Darbo tikslas - atlikti baikalinės kalpokės metanolinių ekstraktų analizę
spektrofotometriniu ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.
Eksperimentinė dalis. Analizei naudota baikalinės kalpokės augalinė žaliava (lapai ir šaknys) rinkti VDU Kauno botanikos sode 2006 metų birželio – rugpjūčio mėnesiais. Ekstraktai buvo ruošiami 0,5 g žaliavos užpilant 9 ml 75% metanoliu ir ekstrahuojant 24 valandas purtyklėje. Gauti ekstraktai filtruoti per popieriaus filtrus. Optimizuotas kietafazės ekstrakcijos metodas baikalinės kalpokės metanoliniams ekstraktams ekstrahuoti, spektrofotometriniais metodais nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis bei antioksidacinis pagamintų ekstraktų aktyvumas. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodais identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti keturi baikalinės kalpokės flavonoidai: apigenino-7-glikozidas, baikalinas, skutelarinas ir baikaleinas.
Rezultatai. Optimizavus kietafazę baikalinės kalpokės ekstrakciją fenolinių junginių nuostoliai sumažėjo nuo 42% iki 12%, o flavonoidų – nuo 26% iki 9%.
Didžiausi fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai nustatyti šaknyse, o antžeminėje augalo dalyje jie pasiekia maksimumą masinio žydėjimo metu.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodais nustatyta, kad baikalinės kalpokės šaknyse yra didžiausias baikalino kiekis (35,09mg/g), o antžeminėje dalyje – apigenino-7-glikozido. Šie flavonoidai turi didžiausios įtakos atitinkamai šaknų ir antžeminės augalo dalies ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui.
34
Summary
Key words: Baikal skullcap, flavonoids, High-performance liquid chromatography.
Baikal skullcap (Scutellaria baikalensis Georgi) is a perennial herbaceous plant from family Labiatae. It can be found growing wild in Japan, China, Korea and Russia.
Extracts of Baikal skullcap have a wide pharmacological action. Anti-inflammatory, antifibrotic, hepatoprotective, antioxidant, antiallergic, neuroprotective, antimicrobial, anxiolytic, anticancer activities were reported as well as a beneficial impact on heart and vessel system.
The objective of this study was to perform analysis of main biologically active compounds in methanolic Baikal skullcap extracts by means of spectroscopic methods and high efficiency liquid chromatography (HPLC).
Raw material. The Baikal skullcap plant material (6 samples) was received from Kaunas Botanical Garden. Samples were collected at different vegetation phases during June – August, 2006.
Experimental. Baikal skullcap extractions were prepared by adding 9 ml of 75% methanol to 0,5 gram of raw material and 24 hour shaking in orbital shaker. The methanol extracts were filtered. Spectrophotometric methods were used to determine the total amount of phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity. For qualitative and quantitative analysis of Baikal skullcap flavonoids a high performance liquid chromatography was used.
Results. The optimization of solid phase extraction was an important step of this analysis as it reduced the loss of phenolic compounds from 42% to 12% and loss of flavonoids from 26% to 9% and prepared samples for HPLC analysis.
The maximal amounts of phenolic compounds and flavonoids were found in root extractions of Baikal skullcap. The amount of biologically active compounds as well as antioxidant activity in terrestrial part of the plant was found to be highest at the blossoming period.
Four flavonoids were identified: apigenin-7-glucuronide, baicalin, scutellarin and baicalein. It was determined that baicalin was the main flavonoid in Baikal skullcap root while apigenin-7-glucuronide was the main in terraneous part of the plant. These flavonoids had the main impact on the antioxidant activity of extractions of the plant parts they were found.
