NAFTODIANTRONŲ FRAKCINĖ ANALIZĖ JONAŽOLIŲ ŽIEDUOSE IR LAPUOSE IR GRIKIŲ ŽIEDUOSE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

LIUCIJA TOLEIKYTĖ

NAFTODIANTRONŲ FRAKCINĖ ANALIZĖ JONAŽOLIŲ

ŽIEDUOSE IR LAPUOSE IR GRIKIŲ ŽIEDUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Valdas Jakštas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Data:

NAFTODIANTRONŲ FRAKCINĖ ANALIZĖ JONAŽOLIŲ ŽIEDUOSE IR

LAPUOSE IR GRIKIŲ ŽIEDUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Valdas Jakštas Data: Recenzentas Data: Darbą atliko Magistrantė Liucija Toleikytė Data: KAUNAS, 2017

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Naftodiantronų apžvalga ... 11

1.2. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) apibūdinimas ir morfologiniai požymiai 14 1.3. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) paplitimas ... 15

1.4. Jonažolių (Hypericum perforatum L.) apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ... 16

1.5. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) ir jonažolių (Hypericum perforatum L.) cheminė sudėtis... 17

1.8. Jonažolių rūšių apibūdinimas ir jų panaudojimas ... 21

1.9. Naftodiantronų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai ... 22

2. TYRIMO METODIKA ... 28

2.1. Tyrimo objektas ... 28

2.2. Medžiagos ir tirpikliai ... 28

2.3. Aparatūra ... 28

2.4. Tyrimo metodai ... 29

2.4.1. Tiriamojo pavyzdžio ruošimas ... 29

2.4.2. Ekstraktų ruošimas naftodiantronų kiekybiniam ir kokybiniam įvertinimui. ... 29

2.4.3. Hipericino standarto paruošimas ... 30

2.5. Naftodiantronų kiekybinė ir kokybinė analizė ... 30

2.5.1. Bendro naftodiantronų kiekio išreikšto hipericino ekvivalentu nustatymas grikių ir jonažolių ekstraktuose ... 30

2.5.2. Kokybinis antraceno junginių nustatymas jonažolių žieduose pusiau preparatyvinės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 32

2.5.3. Antraceno junginių esančių grikių (Fagopyrum esculentum Moench) žieduose gryninimas kietafazės ekstrakcijos būdu ir identifikavimas naudojant ESC-MS chromatografiją. 33 2.6. Statistinė duomenų analizė ... 33

3.1. Kiekybinis naftodiantronų nustatymas sėjamųjų grikių žieduose ir jonažolių lapuose ir

žieduose ... 34

3.2. Antraceno junginių kiekio įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žieduose (2014 m.) ... 34

3.3. Antraceno junginių kiekio įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žieduose (2015 m.) ... 36

3.4. Kiekybinis naftodiantronų įvertinimas skirtingų rūšių jonažolių žieduose ir lapuose ... 38

3.5. Kokybinis antraceno junginių nustatymas ir gryninimas jonažolių žieduose pusiau preparatyvinės chromatografijos metodu ... 40

3.5.1. Metodikos vystymas ... 40

3.5.2. Naftodiantronų atskyrimas, frakcijų surinkimas ... 43

3.6. Kokybinis antraceno junginių nustatymas grikių (Fagopyrum esculentum Moench) žieduose kietafazės ekstrakcijos metodu ... 46

4. IŠVADOS ... 48

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 50

7. MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO REZULTATŲ MOKSLINĖ SKLAIDA ... 57

SANTRAUKA

L. Toleikytės magistro baigiamasis darbas „Naftodiantronų frakcinė analizė jonažolių žieduose ir lapuose ir grikių žieduose“. Mokslinis vadovas prof. dr. Valdas Jakštas. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, farmakognozijos katedra, Kaunas.

Raktiniai žodžiai: Fagopyrum esculentum Moench, Hypericum perforatum L.,

pusiau-preparatyvinė ESC, naftodiantronai, antraceno junginiai, KFE, ESC-MS.

Tyrimo tikslas: parinkti metodologines sąlygas naftodiantronų išskyrimui ir nustatymui grikių

žiedų ir jonažolių lapų bei žiedų ekstraktuose.

Uždaviniai: 1) Parinkti chromatografinės ir spektrofotometrinės analizės sąlygas ir atlikti grikių

ir jonažolių ekstraktų fitocheminę analizę; 2) Parinkti pusiau-preparatyvinės chromatografijos (ESC) metodikos sąlygas naftodiantronų išskyrimui ir surinkti antraceno junginių turtingas frakcijas; 3) Parinkti kietafazės ekstrakcijos metodologines sąlygas naftodiantronų išskyrimui; 4) Palyginti naftodiantronų kiekybinius rodiklius tarp skirtingų veislių grikių žiedų ir tarp skirtingų rūšių jonažolių lapų ir žiedų.

Tyrimo objektas: sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) skirtingų veislių žiedai.

Skirtingų rūšių jonažolių žiedai ir lapai. Tyrimo metu atliekamas antraceno junginių įvertinimas.

Tyrimo metodai: grikių žiedų ir jonažolių žiedų ir lapų antraceno junginių kiekybinė analizė

atlikta spektrofotometrijos metodu. Kokybinis naftodiantronų įvertinimas jonažolių žieduose atliktas pusiau preparatyvinės ESC metodu, o grikių žieduose KFE-ESC-MS metodu.

Išvados: 1) Pusiau-preparatyvinės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu išskirti ir

identifikuoti jonažolių ektrakte esantys naftodiantronai – hipericinas ir pseudohipericinas. Surinktos dvi antraceno junginių gausios frakcijos, kurių chromatografinis grynumas viršijo 85 proc. Iš 1,2 g jonažolių žaliavos išgryninta 0,96 mg hipericinų (0,08 proc.); 2) Remiantis naftodiantronų kiekybinio tyrimo rezultatais, nustatyta naftodiantronų išskyrimui tinkamiausia jonažolių rūšis – H. pallens D. Don, kurioje nustatyta naftodiantronų koncentracija yra beveik 7 kartus didesnė negu mažiausia nustatyta koncentracija H. russeggeri R. Keller rūšies žieduose; 3) KFE metodu išskirti ir ESC-MS metodu identifikuoti grikių ekstrakte esantys naftodiantronai – fagopirinas E ir fagopirinas F; 4) Remiantis naftodiantronų kiekybinio tyrimo rezultatais, nustatyta naftodiantronų išskyrimui tinkamiausia grikių veislė - intensyvioje žemdirbystės sistemoje užauginta „Belaruskij determinant-1“.

SUMMARY

Master thesis of L. Toleikytė „Fraction analysis of naphthodianthrones in St. John’s flowers and leaves and buckwheat flowers”; scientific supervisor prof. dr. Valdas Jakštas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of pharmacognosy, Kaunas

Keywords: Fagopyrum esculentum Moench, Hypericum perforatum L., semi-preparative HPLC,

naphthodianthrones, anthracenes, LC-MS, KFE.

The aim: To choose analytical conditions to identify naphthodianthrones in common buckwheat

flowers and St. John’s wort leaves and flowers. Qualitative and quantitative anthracene compounds evaluation.

Tasks: 1) To choose parameters of chromatography and spectrophotometry methods for

phytochemical analysis of buckwheat and St. John’s wort extracts; 2) To choose parameters of semi-preparative HPLC method for isolation of naphthodianthrones and collect fractions containing anthracene compounds; 3) To choose parameters of SPE method for isolation of naphthodianthrones from buckwheat extracts; 4) To compare quantitative results of naphthodianthrones among different variety of buckwheat flowers and different species of St. John’s wort leaves and flowers.

The object of the research: Different plant parts of St. John’s wort – leaves, flowers and flowers

of different buckwheat species. Performing analysis of naphthodianthrones.

Methods: Spectrofotometry was used for the quantitative analysis of naphthodianthrones in St.

John’s wort extracts. Combined semi preparative HPLC – electrospray mass spectrometry was used for determination of the naphthodianthrone constituents in extracts of dried blossoms of St. John‘s wort. KFE was used for determination and LC-MS was used for identification of anthracenes in buckwheat flowers.

Conclusions: 1) Naphtodianthrones – pseudohypericin and hypericin from St. John’s wort extracts

were determined and identified using semi-preparative ESC analysis. Two fractions containing both anthracenes were collected. The purity of both fractions determined to be more than 85%; 2) Results of quantitative analysis showed that the best specie of St. John’s wort for determination of naphthodianthrones is H. pallens D. Don, which contained 7 times higher concentration of the naphthodianthrone constituents compared to H. russeggeri R. Keller; 3) Two naphthodiantrones – fagopyrin E and fagopyrin F were determined using SPE and identified using HPLC-MS method from buckwheat extract; 4) Results of quantitative analysis showed that the best variety of common buckwheat for determination of naphthodianthrones is „Belaruskij Determinant-1” grown under conventional farming system.

PADĖKA

Noriu padėkoti farmakognozijos katedros doktorantui Vaidotui Žvikui už pagalbą atliekant pusiau preparatyvinės efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimą. Dėkoju doc. dr. Jolitai Radušienei už suteiktas jonažolių žaliavas ir Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialui už suteiktas sėjamųjų grikių žaliavas tyrimams (projekto numeris SVE-02/2014).

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

BMR – magnetinio branduolių rezonanso spektroskopija (angl. NMR)

DMD – fotodiodų matricos detektorius (angl. DAD arba PDA)

EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (angl. HPTLC)

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. HPLC)

FDT – fotodinaminė terapija (angl. PDT)

HE – hipericino ekvivalentas

IC

– inhibitoriaus koncentracija, sukelianti pusės (50 proc.) fermentinio

aktyvumo netekimo

KE – kapiliarinė elektroforezė

KFE – kietafazė ekstrakcija (angl. SPE)

MS – masių spektrometrija

PC – plonasluoksnė chromatografija (angl. TLC)

Ph. Eur. – Europos farmakopėja

FS – fotosensibilizatorius (angl. PS)

R

– regresijos koeficientas

ĮVADAS

Moksliniai in vivo ir in vitro tyrimai įrodo priešžvėžinį naftodiantronų aktyvumą, todėl pastaraisiais metais išaugo susidomėjimas šiais junginiais, kaip potencialia priemone vėžiui gydyti.

Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculeculentum Moench) kaupia fototoksines medžiagas fagopirinus, kurie gali veikti kaip fotosensibilizatoriai, po sužadinimo regimąja šviesa, sukeldami fagopirizmą. Fagopirizmas pasireiškia odos sudirginimu, kuris atsiranda būnant saulėje suvartojus didelį kiekį grikių. Nuo šviesos priklausomas fagopirinų aktyvumas gali prisidėti prie galimybės juos panaudoti kaip sensibilizatorius fotodinaminėje terapijoje (FDT). Dėl šios priežasties augalai, kurie kaupia didelius kiekius naftodiantronų, šiuo metu yra daugelio mokslininkų tyrimo objektas. Nuo šviesos priklausantis grikių ekstraktų antivirusinis aktyvumas yra panašus į jonažolių, kurios kaupia hipericiną ir pseudohipericiną. Hipericinas prisideda prie antidepresinio ir antiuždegiminio jonažolių poveikio. Hipericinas ir fagopirinas yra panašios struktūros naftodiantronai, todėl jų poveikis turėtų būti panašus [1]. Atrasta, kad naftodiantronai pseudohipericinas ir hipericinas gali sunaikinti virusų paviršines struktūras, taip pat dėl fotosensibilizacinių savybių kelia daug susidomėjimo ieškant naujų būdų vėžiui gydyti. FDT – tai gydymo būdas specialiais vaistais (fotosensibilizatoriais) kartu su šviesa, kuri būtina vaisto aktyvumui, vėžinių ląstelių naikinimui. FDT dar vadinama fotoradiacijos terapija, fototerapija arba fotochemoterapija [2].

Šio tyrimo objektas yra jonažolių žiedai, lapai ir sėjamųjų grikių žiedai. Žiedai kaupia didžiausią kiekį naftodiantronų lyginant su kitomis augalo dalimis. Norint įvertinti sėjamąjį grikį ir jonažolę kaip potencialią vaistinę augalinę žaliavą, būtina atlikti kokybinius ir kiekybinius jų kaupiamų bioaktyvių junginių tyrimus. Kiekybinė analizė buvo atliekama spektrofotometriniu metodu, nustatant naftodiantronų, išreikštų hipericinu, kiekį.

Apžvelgus mokslinėje literatūroje pateikiamus duomenis, nerasta Lietuvoje registruotų augalinių vaistinių preparatų, kurių sudėtyje būtų grikis, taip pat nėra mokslinių tyrimų, kurių metu būtų atlikta frakcinė naftodiantronų analizė grikių ar jonažolių žaliavose. Šio tyrimo metu siekta išvystyti metodologines sąlygas antraceno junginių išgryninimui kietafazės ekstrakcijos ir pusiau preparatyvinės efektyviosios skysčių chromatografijos būdu ir atlikti kiekybinę antraceno junginių analizę skirtingose sėjamųjų grikių veislėse ir jonažolių rūšyse. Įvertinus gautus kiekybinius rezultatus galima nustatyti skirtingų veislių ir rūšių potencialų panaudojimą kaip naftodiantronų šaltinį. Gauti tyrimo rezultatai gali būti reikšmingi ne tik ieškant naujų ir efektyvių vaistinių preparatų, bet ir gryninant biologiškai aktyvius junginius, junginių - standartų gamyboje.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: parinkti metodologines sąlygas naftodiantronų išskyrimui ir nustatymui grikių

žiedų ir jonažolių lapų ir žiedų ekstraktuose.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti chromatografinės ir spektrofotometrinės analizės sąlygas ir atlikti grikių ir jonažolių ekstraktų fitocheminę analizę.

2. Parinkti pusiau-preparatyvinės chromatografijos (ESC) metodikos sąlygas naftodiantronų išskyrimui ir surinkti antraceno junginių turtingas frakcijas.

3. Parinkti kietafazės ekstrakcijos metodologines sąlygas naftodiantronų išskyrimui.

4. Palyginti naftodiantronų kiekybinius rodiklius tarp skirtingų veislių grikių žiedų ir tarp skirtingų rūšių jonažolių lapų ir žiedų.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Naftodiantronų apžvalga

Naftodiantronai - kondensuotų antraceno darinių klasė. Vaistinėje augalinėje jonažolių žaliavoje randami šie gamtinės kilmės naftodiantronai: protohipericinas ir protopseudohipericinas, o grikių žaliavoje – protofagopirinas. Šviesos poveikyje protohipericinas transformuojasi į hipericiną, protopseudohipericinas į pseudohipericiną, o protofagopirinas - fagopiriną [3,4]. Nurodyti jonažolių ir grikių antraceno dariniai - tai vieni iš stipriausių gamtoje randamų fotodinaminių junginių [5]. Dėl prooksidantinių fotodinaminių savybių antracenai, kartu su apšvitinimu, gali būti naudojami fotodinaminėje vėžio terapijoje (PDT), nes skatina vėžinių ląstelių apoptozę ir nekrozę [5].

Daugiausia mokslinių tyrimų atlikta analizuojant hipericiną. Biochemiškai, hipericinas (4,5,7,4′,5′,7′-heksahidroksi-2,2′-dimetilnaftodiantronas) yra policiklinis chinonas, turintis keturias hidroksi grupes, kurios išsidėsčiusios greta dviejų karbonilo grupių. Dėl savo cheminės struktūros hipericinas yra labai fotoreaktyvus. Hipericinas yra raudonas pigmentas, kuris suteikia jonažolių aliejui raudoną spalvą [6]. Didžiausias jo kiekis randamas augalo žieduose, ypač juoduose taškeliuose, kurie išsidėstę ant augalo žiedlapių. Tikslią hipericino struktūrą (C30H16O8) 1953 metais nustatė H.

Brockmannas ir H. Muxfeldas. Bendras hipericino ir pseudohipericino kiekis esantis augale vadinamas „hipericinų suma” [7]. Hipericinų struktūra pavaizduota 1-ame paveiksle.

1 pav. Hipericino (1), protohipericino (2), pseudohipericino (3) ir protopseudohipericino (4) struktūra [8]

Fagopirinai yra struktūriškai susiję su hipericinu – antriniu metabolitu iš vaistinio jonažolės augalo [4,9]. Fagopirinas yra hipericino darinys [10], todėl hipericinas dažnai naudojamas kaip standartas (ang. reference compound) fagopirinų analizei [4]. Protohipericino struktūroje nėra piperidino žiedų, kurie yra protofagopirinų stuktūroje, todėl reaktyvesnis protohipericinas greičiau ir lengviau transformuojasi į hipericiną augaluose, o fagopirinai atsiranda tik po žaliavos ekstrahavimo ir ekstrakto apšvitinimo šviesa [11]. Atliktas mokslinis tyrimas, kurio metu tirta šviesos įtaka protofagopirinų transformacijai. Protofagopirinai esantys grikių ekstrakte, kuris buvo saugomas nuo šviesos, buvo analizuoti naudojant ESC-DMD metodą ir 590 nm bangos ilgį. Sulaikymo laikas buvo panašus, bet ne identiškas sulaikymo laikui fagopirinų, kurių ekstraktas buvo paveiktas šviesa. Prieš apšvitinimą grikių ekstrakte nebuvo aptikta fagopirinų. UV−Vis spektre, stiprus absorbcijos maksimumas buvo aptiktas po apšvitinimo šviesa, tai rodo, kad susiformavo fagopirinai [4].

Fagopirinai buvo atrasti daugiau nei prieš 100 metų, bet iki šių dienų yra mažai ištirti junginiai. Jų išskyrimą apsunkina unikalios molekulinės savybės, todėl nėra pamatinio junginio standarto, kuris leistų tinkamai įvertinti fagopirinų kiekį grikių produktuose ir ištirti dar neatrastas šio augalo savybes ir biologinį aktyvumą [4]. Hipericino ir fagopirino biosintezės keliai yra mažai išanalizuoti. Mokslinėje literatūroje pateikiamas galimas šių junginių biosintezės kelias. Manoma, kad hipericinas sintezuojamas poliketidų metabolizmo keliu, o chalkono (CHS) ir benzofenono sintazės [12] yra pagrindiniai fermentai dalyvaujantys hipericino biosintezėje [13,14,15]. Sintezė prasideda nuo vienos molekulės acetilkoenzimo A (CoA) su septyniomis molekulėmis malonyl-CoA kondensacijos į linijinę oktaketido grandinę, iš kurios ciklizacijos metu susiformuoja emodinantronas (EMDA) [5,16,17]. EMDA veikiamas EMDA oksigenazės yra oksiduojamas į emodiną (angl. emodin) [5]. Emodinantrono ir emodino kondensacija, dehidratacija ir fenolinė okcidacija lemia diantrono protohipericino susiformavimą [5,14,16,18]. Visas šias reakcijas katalizuoja fenolininės oksidacijos baltymas hyp-1 (angl. phenolic oxidative coupling protein) [14,19]. Galutinis etapas hipericino biosintezėje yra protohipericino metilo grupių oksidacija, po kurios protohipericinas transformuojasi į hipericiną [18]. Protoformų transformaciją į hipericiną ir pseudohipericiną lemia šviesa bei hyp-1 [14,16,19]. Literatūroje teigiama, kad EMDA yra protofagopirino pirmtakas. Paskutinė reakcija fagopirino sintezėje yra protofagopirino transformacija į fagopiriną po apšvitinimo šviesa [19,20]. Galima hipericino, pseudohipericino ir fagopirino biosintezė pavaizduota 2-ame paveiksle.

2 pav. Pseudohipericino, hipericino ir fagopirino biosintezė [5,17,19]

Molekulinė fagopirinų, kurie buvo acetilinti su acto rūgšties anhidridu ir piridinu, struktūra su dviejomis piperidino grupėmis pirmą kartą nustatyta naudojant chomatografinį skirstymą ir magnetinio branduolių rezonanso (BMR) spektroskopiją [21]. E. Benković ir kt. patvirtinto H. Brockmann‘o nustytą fagopirinų struktūrą ir nustatė dvi naujas struktūras (fagopiriną A ir E) naudojant UV-Vis spektrofotometriją, BMR spektroskopiją ir masių spektrometrinę analizę [1]. Fagopirinų struktūros pavaizduotos 3-ame paveiksle.

3 pav. Protofagopirino (1), fagopirino A (2), fagopirino E (3), fagopirino F (4) cheminės struktūros

[4]

1.2.

Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) apibūdinimas ir

morfologiniai požymiai

Sėjamasis grikis (lot. Fagopyrum esculentum Moench) - tai dviskiltis augalas, kuris priklauso grikių (Fagopyrum) genčiai, rūgtinių (Polygonaceae) šeimai, Magnoliopsida klasei, Tracheophyta skyriui [22]. Moksliniai sėjamojo grikio pavadinimai: Polygonum fagopyrum L., Fagopyrum fagopyrum (L.) Karst., Fagopyrum vulgare Hill, Fagopyrum sagittatum Gilib. Fagopyrum gentyje yra 19 grikių rūšių, kurios pasiskirsčiusios įvairiose pasaulio dalyse. Iš visų 19 rūšių daugiausia kultivuojamos dvi grikių rūšys: sėjamasis (Fagopyrum esculentum Moench) ir totorinis (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.) grikiai [23,24,25]. Sėjamųjų grikių žolė ir žiedai vaizduojami 4-ame paveiksle.

4 pav. Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench)

Sėjamasis grikis yra plačialapis, vienmetis žolinis augalas su paviršinėmis šaknimis, rausvu stiebu. Gali užaugti iki 70 cm aukščio. Stiebas lygus, viršuje šakotas, tuščiaviduris. Lapai ištisiniai, pražanginiai, trikampiai su strėlišku pagrindu ir plėveline makštimi ties apatinių lapų lapkočio pagrindu, 2-8 cm ilgio su smailėjančiais galiukais, tamsiai žalios spalvos, 11 cm ilgio, 7 cm pločio. Viršutiniai lapai – mažesni, bekočiai. Žiedai – rausvi arba balti su rausvu apyžiedžiu, 6 mm skersmens, žiedkotis 2-3 mm ilgio. Žiedynas – kvepiančios kekės su ilgu vaiskočiu. Vaisius – tribriaunės sėklelės apie 5 mm ilgio, rudos arba juodai-rudos spalvos [22,26]. Totorinio grikio (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.) augalai paprastai užauga silpnesni negu F. esculentum Moench. Jie yra labiau šakoti, lapai yra labiau strėliški negu sėjamojo grikio. Žiedai mažesni, turi neišsiskiriančius žalsvai baltus taurėlapius, todėl yra mažiau patrauklūs vabzdžiams [22].

1.3.

Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) paplitimas

Sėjamasis grikis yra kilęs iš centrinės Azijos [27]. Grikiai buvo kultivuojami Kinijoje jau 1-2 amžiuje. Seniausi Kinijos įrašai apie grikius rodo, kad jų produkcija Kinijoje išaugo 5-6 amžiuje. Grikiai Kinijoje buvo kultivuojami beveik tūkstantmetį kol išplito į Europą per Rusiją. Iš Europos grikiai paplito po Šiaurės Ameriką kartu su imigrantais iš įvairių šalių [22]. Pagrindiniai grikių augintojai: Kinija, Rusija, Ukraina ir Kazachstanas, taip pat kultivuojami Slovėnijoje, Lenkijoje, Vengrijoje ir Brazilijoje [28]. Lietuvoje sėjamasis grikis daugiausiai auginamas pietryčių Lietuvoje mažo našumo žemėse [29]. Grikiai auga net ir skurdžiausiose dirvose, geriausiai auga drėgname, šaltame klimate ir gerai

nusausintame smėlio dirvožemyje. Žydi birželio mėnesį, vaisiai prinoksta rugpjūtį. Vaistinė augalinė žaliava yra žolė ir žydinčios viršūnėlės, sėklos [27]. Daugelį metų grikių auginimas buvo sumažėjęs, bet pastaruoju metu stebėtinai išsaugo dėl teigiamo poveikio žmogaus sveikatai. Sėjamojo grikio grūduose ir kitose augalo dalyse yra daug sveikatai naudingų junginių, B grupės vitaminų. Grūdai yra mikroelementų Zn, Cu, Mn, Se ir makroelementų K, Na, Ca, Mg šaltinis. Grikiai gali būti naudojami ne tik maistui, bet ir kaip medicininė žaliava [28].

1.4.

Jonažolių (Hypericum perforatum L.) apibūdinimas ir morfologiniai

požymiai

Jonažolė (Hypericum perforatum L., Hypericaceae) – tai daugiametis augalas plačiai paplitęs Europoje, Azijoje ir Šiaurės Afrikoje [5,30]. Manoma, kad pavadinimas Hypericum yra kilęs iš graikiškų žodžių hyper ir eikon, o jonažole vadinama todėl, kad augalo žiedai pražysta birželio 24 dieną, per Jonines [30]. Jonažolė yra kvapnus augalas, kuris užauga iki 1 metro aukščio [5]. Lapai priešiniai, pailgai kiaušiniški, kraštai lygūs, bekočiai, nuo 1 iki 3 cm ilgio ir 0,3-1,0 cm pločio. Pažvelgus į augalo lapą prieš šviesą matomi tamsūs persišviečiantys taškeliai – eterinio aliejaus liaukutės. Liaukutės augalui suteikia „perforuotą“ išvaizdą. Žiedai ryškiai geltonos-oranžinės spalvos, susitelkę į skėtiškus žiedynus, taurelė ir vainikėlis nusėti juodais liaukiniais taškeliais. Patrynus taškelius tarp pirštų lieka raudonos žymės [5]. Jonažolės žolė ir žiedai pavaizduoti 5-ame paveiksle.

1.5.

Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) ir jonažolių (Hypericum

perforatum L.) cheminė sudėtis

Išanalizavus literatūros duomenis, įvertinta sėjamųjų grikių cheminė sudėtis. Literatūroje pateikiamas baltymų kiekis grikių sėklose svyruoja nuo 12 iki 18,9 proc. Grikiuose gausu K, Mg, Ca, Na ir mikroelementų – Fe, Mn, Zn. Sudėtyje yra B grupės vitaminų - B1, B2, B6 [28]. Pagrindiniai

biologiškai aktyvūs junginiai yra fenolinės rūgštys (chlorogeno, neochlorogeno, p-kumarino, ferulino, galo, p-hidroksibenzoinė), taninai, flavonoidai (rutinas, kvercitrinas, kvercetinas, hiperozidas), naftodiantronai (fagopirinas, pseudofagopirinas) [31]. Flavonoidai – dominuojanti fenolinių junginių grupė. Sėklose randami šeši flavonoidai (rutinas, kvercetinas, orientinas, izoorientinas, viteksinas, izoviteksinas) [32]. Didžiausias kiekis rutino randamas žieduose, augalo žydėjimo metu – apie 12 proc. Kaip ir kitų flavonoidų didžiausia rutino koncentracija yra jauniausiuose ir aukščiausiuose lapuose. Žemiausiose augalo lapuose rutino koncentracija siekia 1,5 proc, o aukščiausiose daugiau negu 10 proc. Kuo lapai senesni tuo rutino koncentracija mažesnė. Stiebų viršūnėse randama apie 3 proc., o stiebo apačioje apie 0,5 proc. rutino. Kvercetino didžiausia koncentracija žieduose – 0,35 proc., lapuose ir stiebuose – 0,02-0,03 proc. Kitose augalo dalyse kvercetino randama mažiau negu 0,005 proc. Hiperozidas daugiausia kaupiamas žieduose – 0,04 proc. Žieduose yra didžiausias kiekis chlorogeno rūgšties 0,25 proc., o lapuose tik 0,01-0,03 proc. Neochlorogeno rūgšties kiekis lapuose siekia 0,3 proc. ir tik 0,025 proc. randama žieduose. Stiebuose abiejų esterių kiekis apie 0,03 proc. Galo rūgštis – 0,25 proc. žieduose, 0,2 proc. lapuose, 0,1 proc. stiebuose. P-hidroksibenzoinė, p-kumarino, ferulino rūgštis – 0,001-0,01 proc. Taninai - 1,54-1,76 proc. Naftodiantronai - fagopirinas ir pseudofagopirinas, didžiausi jų kiekiai randami žieduose (0,08 proc. fagopirino ir 0,03 proc. pseudofagopirino), lapuose randami mažesni kiekiai (0,05 proc. fagopirino ir 0,02 proc. pseudofagopirino) [33].

Jonažolės cheminė sudėtis yra gerai išanalizuota [30]. Farmakologinį augalo aktyvumą lemia jo sudėtyje esantis hipericinas, hiperforinas ir flavonoidai [30]. Pirmasis hipericiną išskyrė A. Buchner (1830 m.) ir pavadino jį Hypericum Red. 1911 metais junginys buvo dar kartą išskirtas ir pavadintas „hypericin by Cerny“. Mokslinėje literatūroje pateikiama jonažolės cheminė sudėtis: naftodiantronai (hipericinas, pseudohipericinas, izohipericinas, ciklopseudohipericinas protohipericinas ir protopseudohipericinas), kai kuriuose šaltiniuose nurodomas hipericinų (hipericino ir pseudohipericino) kiekis procentais svyruoja nuo 0,05 iki 0,30 proc. [5,30,34]. Pseudohipericino kiekis augale yra nuo 2 iki 4 kartų didesnis negu hipericino, priklausomai nuo jonažolių rūšies [35]. Flavonoidų koncentracija svyruoja nuo 7 proc. lapuose iki 12 proc. žieduose [36]. Sudėtyje taip pat randami flavonoliai (kemferolis, kvercetinas), flavonai (liuteoninas), glikozidai – hiperozidas (0,9 proc.), izokvercetinas (0,3 proc.), rutinas (1,6 proc.) [37,38,39]. Hiperforino kiekis augale varijuoja nuo 2,0 iki 4,5 proc., adhiperforino nuo 0,2 iki 1,9 proc. [34,39]. Jonažolėje nustatyti ir kiti, įvairių klasių junginiai: taninai

(nuo 3 iki 16 proc.), ksantonai (1,28 mg/100 g), nedideli kiekiai rūgščių (nikotino, miristo, palmitino, stearino), karotinoidų, cholino bei pektino [36].

1.6.

Sėjamųjų grikių biologinio poveikio tyrimai ir panaudojimas

Farmakologiniai in vitro ir in vivo tyrimai patvirtina, kad sėjamasis grikis pasižymi priešvėžiniu [40], antioksidaciniu [41], antiuždegiminiu [42], hipolipideminiu [43], kepenis apsaugančiu [44] ir gliukozės kiekį kraujyje mažinančiu poveikiu [45]. Mokslinėje literatūroje pateikti duomenys veda prie išvados, kad grikis yra potenciali žaliava naujų vaistų kūrimui [32].

Priešvėžinis poveikis. Mokslinio in vitro tyrimo metu buvo išskirtas ir išgrynintas naujas priešvėžinis baltymas (TBWSP31) iš totorinių grikių ekstrakto. Krūties vėžinių ląstelių augimą inhibuojantis efektas įvertintas atliekant kolorimetrinį MTT-metodą. Ląstelių ciklo analizė parodė, kad gydymas TBWSP31 baltymu sustabdė G0/G1 fazę ir neleido pereiti į interfazės tarpsnį, kurio metu

sintezuojama ląstelės DNR (S fazė). Nustatyta, kad didinant baltymo koncentraciją didėjo ir ląstelių augimą inhibuojantis efektas, buvo sukelta jų apoptozė [40]. Kito in vitro tyrimo metu nustatyta, kad F. esculentum žiedynų ir lapų ekstraktas stipriai slopino naviko ląstelių proliferaciją ir skatino ląstelių apoptozę [46]. Leung ir Ng išskyrė peptidą iš grikio sėklų, kuris slopino kepenų karcinomos - HepG2 ląstelių (IC50 = 33 µm), leukemijos - L1210 (IC50 = 4 µm), krūties vėžio - MCF-7 (IC50 = 25 µm) ir

embriono kepenų - WRL68 (IC50 = 37 µm) ląstelių proliferaciją [47]. Grikių luobelių ekstrakto

priešvėžinis aktyvumas tirtas in vivo, naudojant laboratorinių pelių modelį, kurioms buvo implantuota sarkoma 180. Nustatyta, kad grikių ekstraktas sustabdė auglio augimą [24].

Antioksidacinis aktyvumas. Grikių biologinis antioksidacinis aktyvumas įrodytas atliekant in vivo tyrimus su pelėmis, šeriant jas dieta papildyta 0,75 proc. grikių luobelių ekstraktu 14 dienų [48], grikiais praturtinta dieta (15 proc., 4 savaites) [49] ir duodant grikių ekstraktą per os 100-200 mg/kg dozėmis 20 dienų [50]. Rezultatai parodė padidėjusį antioksidantinių fermentų aktyvumą, įskaitant superoksido dismutazę (SOD), katalazę (CAT), glutationo peroksidazę (GSH-Px), sumažėjusius lipidų prooksidacijos rodiklius tokius, kaip tiobarbiturinės rūgšties reaktyvių junginių (TBARS), malondialdehido (MDA) kiekį ir fluorescencijos intensyvumą (FLS) kraujo plazmoje, raudonuosiuose kraujo kūneliuose ir širdyje, inkstuose, kepenyse, smegenyse [51]. Tyrimas, kurio metu pelės gaudavo 100-200 mg/kg grikių ekstrakto dozę nustatė ir sumažėjusią kraujo šlapalo azoto ir kreatinino koncentraciją kraujo serume. Remiantis tyrimo rezultatais galima teigti, kad grikių ekstraktas apsaugo nuo galimo inkstų veiklos sutrikimo [50].

Stiprus antioksidacinis aktyvumas, kuriuo pasižymi grikis, gali padėti išvengti lipidų ir DNR oksidacijos, taip nutolindamas uždegimo, lėtinių ligų, tokių kaip vėžys, hipercholesterolemijos ir neurologinių ligų vystymąsi [51].

Gliukozės kiekį kraujyje mažinantis poveikis. Kawa ir kiti tyrinėjo sėjamojo grikio koncentrato, kurio dozė buvo 10-20 mg/kg, efektą gliukozės kiekiui kraujo serume. Pelėms buvo sukeltas cukrinis diabetas (intraperitoninė streptozotocino injekcija), sergančios pelės palygintos su normaliomis pelėmis. Nustatyta, kad viena sėjamojo grikio ekstrakto dozė pavartota per os sumažino gliukozės kiekį kraujo serume 12–19 proc. diabetu sergančioms pelėms praėjus 90–120 min. po suvartojimo [52].

Manoma, kad grikis pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis dėl sudėtyje esančių polifenolinių junginių, ypač rutino [53], o didelis antioksidantinis aktyvumas stabdo naviko augimą ir kancerogenezę – piktybinį, vėžinės ligos atsiradimą [42,54].

1.7.

Jonažolių biologinio poveikio tyrimai ir panaudojimas

Per pastaruosius metus iš jonažolės išgautų produktų vartojimas žymiai išsaugo ir šiuo metu jonažolė yra vienas iš daugiausiai suvartojamų vaistinių augalų visame pasaulyje [55]. Moksliniais tyrimais įrodytas, įvairiose augalo dalyse kaupiamų junginių, antivirusinis [56], antibakterinis, antiuždegiminis [56–58], žaizdas gydantis [59] bei skausmą mažinantis poveikis [60]. Silpnos ir vidutinės depresijos gydymas jonažolės preparatais yra efektyvus, alternatyvus gydymo būdas, kurio efektyvumas įrodytas ikiklinikiniais ir klinikiniais tyrimais [61]. Teigiama, kad jonažolėje kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai hiperforinas ir hipericinas lemia tokį poveikį [60].

Skausmą mažinantis poveikis. Atlikto mokslinio tyrimo metu buvo įrodytas neuropatinį skausmą mažinantis poveikis. Tyrimui naudotas laboratorinių pelių modelis: vienai pelių grupei buvo užspaustas sėdimasis nervas, kitai grupei buvo duodama oksaliplatina (imituotas chemoterapijos sukeliamas skausmas). Abu šie veiksmai sukėlė pelėms periferinį neuropatinį skausmą. Pelėms buvo sušerta viena sauso jonažolės ekstrakto dozė nuo 1 iki 100 mg/kg. Skausmą mažinantis efektas įvertintas atliekant letenėlės spaudimo testą. Rezultatai parodė, kad viena dozė pavartota per os sumažino mechaninę hiperalgeziją abiems pelių grupėms. Sausas jonažolės ekstraktas sukėlė ilgalaikį skausmo malšinimą, kuris buvo aptinkamas net ir po dviejų valandų po pavartojimo per os [62]. Kito mokslinio tyrimo metu įvertintas skausmą malšinantis poveikis žmonėms. Panaudojus jonažolę kartu su valgomuoju česnaku (Allium sativum L.), smulkiažiede tūbe (Verbascum thapsus L.) ir medetkos žiedais (Calendula flores) kaip lašus į ausį, sumažėjo skausmo įvertinimas balais apklausus vaikus sergančius ūmiu viduriniu ausies uždegimu [63]. Kitas klinikinis, atsitiktinių imčių, dvigubai aklas tyrimas, kuriame dalyvavo 144 moterys po cezario pjūvio operacijos, parodė žymų skausmo sumažėjimą moterims, kurios

naudojo jonažolės tepalą. Moterys atsitiktinai buvo padalintos į tris grupes. Dvi moterų grupės 16 dienų vartojo placebo arba tepalą su H. perforatum L. tris kartus per dieną, trečioji grupė buvo kontrolinė. Tyrime pateikiamos išvados, kad išorinis tepalo naudojimas yra saugus vartoti, gali palengvinti žaizdų gijimą po cezario pjūvio operacijos ir sumažinti randų formavimąsi bei niežulį [64].

Vežio gydymas, fotodinaminė terapija (PDT). PDT apima netoksiško vaisto – fotosensibilizatoriaus sisteminį, vietinį ar išorinį vartojimą. Fotosensibilizatorius kaupiasi navike. Po inkubacinio periodo audinys arba navikas yra apšvitinamas regimąja šviesa, fotosensibilizatorius sužadinamas, generuojamos aktyvios deguonies formos (singuletinis deguonis), kurios yra toksiškos naviko ląstelėms, auglio audiniai pradeda irti ir galiausiai įvyksta naviko nekrozė. PDT naudojamas yra labai patrauklus būdas dėl metodo selektyvumo [5]. Mokslinio tyrimo metu ištirtas hipericino efektyvumas in vitro rabdomiosarkomos ląstelėms. Fotodinaminė terapija su minimalia hipericino koncentracija (25 μm) kartu su 20 min. trukmės apšvitinimu lėmė beveik visišką ląstelių išnykimą po penkių dienų, o visiškas gyvybingų naviko ląstelių išnykimas pastebėtas po 50 μm hipericino dozės pavartojimo [65]. Kitų tyrimų metu tirtas hipericino efektyvumas gydant nosiaryklės karcinomą [66], glioblastomą [67], šlapimo pūslės [68] ir storosios žarnos vėžį [69]. Šie tyrimai atskleidė įspūdingą priešvėžinį, naviko augimą stabdantį, hipericino poveikį ir antiangiogeninį aktyvumą [66,67].

Tyrimo metu su melanomos ląstelėmis atrasta, kad UV-A spinduliais apšvitintas hipericinas sukėlė ląstelių žūtį kai jos buvo paveiktos 3 µm hipericino. Hipericinas sukelia melanomos ląstelių žūtį veikdamas dviem mechanizmais, kurie priklauso nuo ląstelių pigmentacijos. Pigmentuotose ląstelėse hipericinas padidina reaktyvių deguonies formų koncentraciją, skatinčią melanosomas išskirti toksiškus melanino pirmtakus į citoplazmą ir taip sukelia ląstelių nekrozę. Nepigmentuotose melanomos ląstelėse susikaupęs ląstelės viduje hipericinas aktyvina kaspazes, baltymus skaidančių fermentų grupę, kurios ardo branduolio struktūrą ir ląstelės baltymus, todėl įvyksta apoptozė [70].

Fotosensibilizatoriai gali būti naudojami vietiškai arba sistemiškai, tada pasirinktas odos plotas yra apšvitinamas tam tikro bangos ilgio lazerio šviesa tam, kad įvyktų biologinio audinio oksidacija [4].

Antidepresinis poveikis. Atliktas dvigubai aklas, atsitiktinių imčių tyrimas, kurio metu buvo lyginamas Hypericum perforatum L. ekstrakto ir paroksetino veiksmingumas ir tolerancija gydant didžiosios depresijos epizodą su vidutinio intensyvumo simptomais. Vidutinio sunkumo depresija nustatyta remiantis Hamiltono depresijos vertinimo skale (HAM-D), bendras pacientų rezultatas buvo nuo 22 iki 25. Pacientai 6 savaites vartojo hipericiną (3×300 mg/d) arba paroksetiną (20 mg/d). Veiksmingumui įvertinti naudotas galutinis HAM-D rezultatas. Tyrimas parodė, kad pacientų vartojusių hipericiną gydymo rezultatai buvo žymiai geresni lyginant su pacientų vartojusių paroksetiną rezultatais. Gydymas hipericinu ne tik sumažino depresijos sunkumo balą, bet ir buvo geriau toleruojamas negu gydymas paroksetinu [71]. Kiti klinikiniai, atsitiktinių imčių tyrimai patvirtino jonažolės ekstraktų

veiksmingumą gydant lengvo ir vidutinio sunkumo depresiją lyginant su placebo. Nustatyta, kad gydymas jonažole yra lygiai toks pat efektyvus kaip ir gydymas standartiniais antidepresantais [30].

1.8.

Jonažolių rūšių apibūdinimas ir jų panaudojimas

Hypericum hircinum L. – tai vidutinio aukščio krūmas, kuris auga natūraliai drėgnose, tamsiose vietose prie upelių, plačiai paplitęs Pietų Turkijoje [72]. Mokslinėje literatūroje aprašomas monoamino oksidazę (MAO) slopinantis [73], antimikrobinis [74], antioksidantinis ir antiproliferacinis [75,76] šios rūšies aktyvumas.

Hypericum pallens D. Don ir Hypericum russeggeri R. Keller – tai retos, daugiametės jonažolės rūšys, kurios auga kalkingose kalkakmenio olose Pietų Turkijoje [72]. Hypericum lanuginosum Lam. – tai endeminė, laukinė Turkiškos augalijos rūšis, kuri auga kalkingose zonose Pietų Turkijoje [72]. Mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie šių trijų rūšių farmakologinį poveikį.

Hypericum lydium Boiss. – Turkijoje žinoma kaip pilvo spazmus ir hemorojų gydanti rūšis. Liaudies medicinoje naudojama menstruacijų sutrikimams, skrandžio skausmams, žaizdoms, hemorojui ir virškinimo sutrikimams gydyti [77,78]. Atlikti tyrimai su Hypericum lydium Boiss. rūšies, kuri buvo užauginta Turkijoje, etanoliniu ekstraktu parodė, kad šios jonažolių rūšies kaupiami antraceno junginiai pasižymi nuo koncentracijos priklausomu antimutagenišku aktyvumu ir gali būti saugi ir efektyvi priemonė vėžio ir mutagenezės prevencijai [78]. Išanalizavus literatūros duomenis iki šio tyrimo buvo atliktas vienas mokslinis tyrimas, kurio metu tirtas antioksidacinis Hypericum lydium Boiss. eterinio aliejaus ir metanolinio ekstrakto biologinis aktyvumas [79], apie Hypericum lydium Boiss. etanolinio ekstrakto antioksidantinį aktyvumą ir apie antimutageninį aktyvumą daugiau duomenų nerasta.

Hypericum orientale L. – Turkijoje paplitusi jonažolių rūšis. Tai plačiai paplitęs laukinis daugiametis augalas, augantis ant vulkaninės kilmės šlaitų. Turkiškoje liaudies medicinoje šios rūšies nuoviras yra naudojamas hemorojui gydyti [80].

Hypericum thymifollium Banks & Sol.– pasižymi antibakteriniu, priešgrybeliniu ir proteazę inhibuojančiu aktyvumu [81]. Tiriant Hypericum thymifolium Banks & Sol. ekstrakto antibakterinį poveikį nustatyta, kad šios jonažolių rūšies ekstraktas sunaikino 12000 stafilokokų, kai antibiotikas sunaikino tik 137 [82].

1.9.

Naftodiantronų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai

Naftodiantronų ekstrakcija. Mokslinėje literatūroje aprašomi naftodiantronų ekstrakcijos būdai: maceracija, ekstrakcija ultragarsu, Soksleto ekstrakcija, ekstrakcija superkritiniu skysčiu ir pagreitinta ekstrakcija tirpikliais [5]. Dėl labai mažo kiekio naftodiantronų žaliavose ekstrakcijos procesas yra brangus, reikalaujantis keleto ekstrakcijos ciklų ir greito medžiagų paruošimo, nes naftodiantronai yra labilūs junginiai. Europos farmakopėjoje naftodiantronų ekstrakcijai naudojamas tetrahidrofuranas (THF) [5]. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis, kuriuose nurodyta, kad norint išgarinti tirpiklį, geriausias ekstrakcijos solventas yra acetonas/vanduo (9:1), grikių ir jonažolių ekstraktų gamybai pasirinktas acetonas [4]. Literatūroje nurodoma, kad aukštesnė temperatūra ir ultragarso vonelės naudojimas pagreitina ekstrakcijos procesą. Be naftodiantronų, augalai kaupia didelius kiekius chlorofilo, antocianų ir kitų fenolinių junginių. Geriausias tirpiklis chlorofilo pašalinimui - dichlormetanas, kai kurie flavonoidai gali būti pašalinami naudojant 30 proc. etanolį [4]. Žiedai yra puiki žaliava ekstraktų gamybai lyginant su kitomis augalo dalimis todėl, kad juose kaupiamas didžiausias kiekis antraceno junginių ir mažiausias kiekis chlorofilo [4,83]. Atsižvelgiant į tai tyrimams naudoti jonažolių ir grikių žiedai. Šiuo metu efektyviausias junginių išskyrimo metodas yra efektyvioji skysčių chromatografija, kuri leidžia visiškai atskirti naftodiantronus nuo kitų junginių [4].

Mėginio gryninimas (Kietafazė ekstrakcija). Ekstrakcija kietąja faze yra labai efektyvi mėginių paruošimo technika. Ši technika skirta greitam, selektyviam bandinio paruošimui ir valymui prieš atliekant chromatografinę analizę [84]. Metodas pasižymi dideliu selektyvumu, atkuriamumu, naudojami nedideli kiekiai solvento. Mėginys išvalomas nuo nereikalingų matricos komponentų, kurie trukdo analizei, o analitė sukoncentruojama. Ekstrakcijai atlikti gali būti naudojamos kolonėlės pagamintos iš polipropileno, kurios sumažina analizės kaštus [84,85]. KFE suteikia galimybę frakcionuoti analitę į kelias junginių grupes. Pagrindiniai KFE etapai: mėginio paruošimas prieš atliekant KFE (pH reguliavimas, centrifugavimas, filtravimas, buferio pridėjimas), kolonėlės kondicionavimas, mėginio įvedimas, kolonėlės praplovimas, eliuavimas (surenkama frakcija, kuri bus analizuojama) [85]. Fagopirinų analizė atlikta naudojant KFE/ESC/MS metodą.

Efektyvioji skysčių chromatografija yra vienas efektyviausių chromatografinio skirstymo metodų analizinėje chemijoje. Šis metodas suteikia galimybę atskirti, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti junginius, kurie yra tirpūs skysčiuose. Junginių nustatymas gali būti atliekamas esant net ir labai mažoms analičių koncentracijoms (ppt) [86]. ESC gali būti taikoma įvairiems mėginiams tirti: vaistams, maistui, biologiškai aktyvioms medžiagoms, kosmetikai, aplinkos terpėms ir pramoninėms cheminėms medžiagoms [86]. Metodo privalumai: lyginant su kitais chromatografinio skirstymo būdais, tokiais kaip PC, ESC yra labai greita, efektyvi, tiksli ir atranki. Jai būdinga didelė skiriamoji geba ir rezultatų atkuriamumas. Trūkumai: lyginant su KFE ir KE metodais, ESC yra brangesnė, o analizė trunka ilgiau,

reikalinga sudėtinga, brangi aparatūra [86]. Išanalizavus literatūros duomenis, duomenų apie visiškai grynų fagopirinų, kurie galėtų būti panaudoti kaip standartai, išskyrimą nerasta. Hipericinų išskyrimui iš jonažolių žiedų naudotas pusiau preparatyvinės ESC metodas, surinktas nedidelis kiekis išgrynintų junginių (<0,5 g).

ESC veikimo principas. Solventas (mobili fazė) laikomas rezervuare. Aušto slėgio siurblys generuoja ir matuoja tam tikrą mobilios fazės tėkmės greitį, paprastai mililitrais per minutę. Injektorius injekuoją analitę į nuolat judančią mobilios fazės srovę, kuri perneša analitę į ESC kolonėlę. Kolonėlės viduje yra solventas (stacionari fazė), kuris geba prisijungti tam tikras chromatografuojamas medžiagas. Mokslinėje literatūroje pateikiami rezultatai naudojant įvairias chromatografines kolonėles (C18, C8,

ciano). Nustatyta, kad geriausias chromatografinis junginių atskyrimas pasiektas naudojant C18 kolonėlę.

Ši kolonėlė mažiau nei per 14 min. izokratiškai atskiria naftodiantronus [35]. Mobili fazė perėjusi pro detektorių gali būti surenkama. Kai mobilioje fazėje yra atskira junginių grupė, ESC suteikia galimybę surinkti frakciją iš eliuato, kuriame yra išgrynintas junginys, tai vadinama preparatyvine chromatografija [86]. Surinkta frakcija gali būti panaudota tolimesnei analizei. ESC gali būti naudojama išgryninti ir surinkti norimus kiekvieno junginio kiekius, naudojant frakcijų kolektorių, kuris surenka atskirtas medžiagas pagal laiką, tūrį arba pikus. ESC chromatografijų apibūdinimas, naudojamos kolonėles ir dalelių dydis pateikiamas 1-oje lentelėje.

1 lentelė. Efektyviųjų skysčių chromatografijų apibūdinimas [86]

ESC Chomatografijos tikslas Kolonėlės

diametras

Dalelių dydis

Analitinė Informacija, junginio atpažinimas ir koncentracijos

nustatymas 1-8 mm

1,7-10 µm

Pusiau-preparatyvinė Informacija ir mažas kiekis išgryninto junginio (<0,5 g) 10-40 mm 5-15 µm Preparatyvinė Didesnis kiekis išgryninto junginio (>0,5 g)

50-100 mm

15-100 µm

Pramoninė Pramoninis kiekis išgryninto junginio (gramai,

kilogramai) >100 mm >100 µm

Kadangi, analitėje esančių junginių savybės gali būti labai skirtingos, naudojami kelių rūšių detektoriai. Jeigu junginys absorbuoja ultravioletinę šviesą, naudojamas UV sugerties detektorius, florescuojančių junginių nustatymui naudojamas fluorescencinis detektorius. Jeigu junginys neturi šių savybių naudojamas universalus garavimo šviesos sklaidos detektorius (ELSD). Efektyviausia naudoti kelis detektorius: UV ir/arba ELSD, šis detektorius gali būti naudojamas kartu su masių spektrometru,

tai suteikia išsamesnę informaciją apie analitę. Naftodiantronų analizei dažniausiai pasirenkamas fotodiodų matricos detektorius (DMD) [1,8,86]. Mokslinėje literatūroje pateikiami įvairūs naftodiantronų nustatymui naudojami ESC metodai, fagopirinų analizei taikomi metodai pateikti 2-oje lentelėje, o hipericinų 3-oje lentelėje.

2 lentelė. Naftodiantronų nustatymui sėjamųjų grikių žaliavose naudojamos ESC metodikos

ESC sąlygos

Metodika

[10] [1]

ESC sistema LaChrom Elite; Hitachi, Japan Shimadzu Prominence

Siurblys - Shimadzu LC-20A;

Eliuento degazuotojas DGU-200A5

Injektorius,

injekcijos tūris 20 µl -

Kolonėlė Inertsil ODS-SP (5 µm, 150×4.6

mm)

Phenomenex Kinetex® XB-C18 (2,7 µm, 10 cm×4,6 mm)

Temperatūra 250C 400C

Tėkmės greitis 1 ml/min 2 ml/min

Detektorius UV-Vis (V-560; Jasco, Japan)

Shimadzu SPD-M20A diodų matricos detektorius; LC-20AD XR

fluorescencinis detektorius Bangos ilgis 590 nm LC-20AD XR sužadinimo = 330 nm, emisijos = 590 nm; SPA-M20A 190-800 nm Mobili fazė Vanduo/metanolis/trifluoracetinė rūgštis (TFA)/tetrahidrofuranas(THF) (3:40:1:1) Eliuentas A - vanduo Eliuentas B - acetonitrilas

Nustatyti junginiai Fagopirinas A, fagopirinas E,

3 lentelė. Naftodiantronų nustatymui jonažolių žaliavose naudojamos ESC metodikos

ESC sąlygos Metodika

[88] [89] [90] [7]

ESC sistema Atvirkštinių

fazių ESC Preparatyvinė ESC (Waters Prep LC 4000 system, Milford, MA) Atvirkštinių fazių System Gold 125 Solvent module (Beckman, Fullerton, CA, USA) Ultima 300 System from Dionex Siurblys Perkin–Elmer LC-410 - - 2 pumps Injektorius, injekcijos tūris Automatinis ISS-100 Rheodyne (Cotali, CA) 7725i su 50-µL kilpa Rheodyne 7725i; 20 µl 20 µl Kolonėlė Atvirkštinių fazių Discovery C18 (5 µm, 150 mm×4.6 mm) Bondapack preparatyvinė C18 (25×100 mm, 15– 20 µm, 125Å porų dydis); Bondapack C18 guard Pak insert

(size 25×10 mm) LiChroCart 125-4 Purospher® RP-18 (HP) (5 µm, 125×4 mm.) ir LiChroCart 4-4 LiChrospher® 100 RP18prieškolonė (5 µm, 4×4 mm) Hypersil Gold RP18 column (5 µm, 150×4.6 mm.) Temperatūra 00C (MGW Lauda RM6 termostatas) 300_{C 20-25}0_{C 40}0_C Tėkmės

greitis 1,5 ml/min 15 mL/min 0,8 ml/min 1 ml/min

Detektorius LC 90 UV spektrofotomet rinis detektorius Waters 996 diodų matricos detektorius Elektrocheminis 1049A UV-vis Bangos ilgis 273 nm 589 nm - 590 nm Mobili fazė Acetonitrilas ir 0,3 proc. ortofosforo rūgštis (90:10, v/v); pH 2,5 MeOH–EtOAc–H2O (67:16:17, v/v) pH 3 (acto rūgštis) 10 proc. amonio acetatas:acto rūgšties buferis (0,5 M; pH 3.7), 40 proc metanolis ir 50 proc. acetonitrilas 15,6 g/l Natrio divandenilio fosfatas (pH 2 naudojant fosforo rūgštį), metanolis 41:160 Nustatyti junginiai Hiperforinas, hipericinas, pseudohiperici nas Hipericinas, pseudohipericinas Hipericinas, hiperforinas Hipericinas, pseudohiperici nas

Plonasluoksnė chromatografija (PC). Plonasluoksnė chromatografija – tai chromatografinis metodas naudojamas mišinių atskyrimui. Šį metodą atrado M.Tswett 1906 metais [91]. TLC atliekama ant stiklo, plastiko ar aliuminio plokštelės, kuri padengta plonu absorbuojančios medžiagos sluoksniu, paprastai silikageliu, aliuminio oksidu ar celiulioze. Adsorbento sluoksnis vadinamas stacionare faze [91]. Naftodinatronų nustatymui dažniausiai naudojamas silikagelis (stacionari fazė) ir fluorescencijos indikatorius. Etilo acetatas/skruzdžių rūgštis/vanduo (30:2:3 v/v/v) arba toluenas/etilo acetatas/skruzdžių rūgštis/vanduo (50:40:5:5 v/v/v/v) naudojami kaip mobili fazė, nes geriausiai atskiria flavonoidus ir hipericiną, pseudohipericiną [91,92]. Plonasluoksnės chromatografijos privalumai: paprastas, universalus, nebrangus metodas, greita kokybinė analizė, nesudėtinga technika [91]. Gali būti naudojama kaip pirminis analizės metodas prieš atliekant ESC [91].

Moksliniame straipsnyje aprašomas plonasluoksnės chromatografijos metodas, kurio metu naftodiantronų nustatymui Kuboje augančiose jonažolių rūšyse naudojama silikagelinė plokštelė. Junginių atskyrimui buvo naudojamos silikagelinės plokštelės (60 F254, 10×10 cm, Merck). Ant

plokštelių užlašinama 10 µl standarto ir tiriamojo mėginio ir dedama į kamerą su mobilia faze. Naudotos trys mobilios fazės: etilo acetatas/skruzdžių rūgštis/ledinė acto rūgštis/vanduo (100:11:11:27) (A), toluenas/etilformiatas/skruzdžių rūgštis (50:40:10) (B) ir etilo acetatas/dichlormetanas/skruzdžių rūgštis/acto rūgštis/vanduo (100:25:10:10:11) (C). Kiekybinis įvertinimas atliktas skenuojamosios densitometrijos būdu (Camag TLC Scanner 2 densitometrinio vertinimo PCC/EPC sistema). Hipericinas nebuvo aptiktas trijose jonažolių, augančių Kuboje, rūšyse [93]. Kito tyrimo metu plonasluoksnės chromatografijos būdu buvo tiriamas grikių ekstraktas. Plonasluoksnė chromatografija atlikta prieš atliekant efektyviąją skysčių chromatografiją. Naudota Kieselgel 60 F254 silikagelinė plokštelė, ant jos

užlašinta 2 µl mėginio. Judri fazė: toluenas/etilo formiatas/skruzdžių rūgštis/priridinas (50:40:10:20). Junginių identifikavimas atliktas naudojant UV šviesą ir 302 nm bangos ilgį. Identifikuotas junginys – fagopirinas, didžiausias kiekis fagopirino nustatytas grikių žiedų ir lapų ekstraktuose [94]. Grikių ekstrakto grynumas buvo nustatytas naudojant PC: silikagelis 60 F254 (Merck);

toluenas/etilformiatas/skruzdžių rūgštis/piridinas, 50:40:10:20 solventų sistema; UV detekcija ir 366 nm bangos ilgis naudotas raudonų florescuojančių dėmių aptikimui [95]. Nors metodika pigi ir paprasta, bet dėl sudėtingo kiekybinio tyrimo ir nedidelio efektyvumo [91] šis metodas kiekybiniams ekstraktų tyrimams nebuvo pasirinktas.

Masių spektrometrija (MS). Po junginių išskyrimo iš ekstraktų naudojant ESC, atliekamas jų struktūros nustatymas naudojant BMR arba MS. ESC kartu su UV detektoriumi dažnai naudojama junginių išskyrimui ir identifikavimui laboratorijose, bet UV detektoriai, net ir fotodiodų matricos detektoriai nesuteikia pakankamai informacijos apie tikslią junginio struktūrą [96], todėl norint nustatyti tikslią junginių struktūrą kartu su ESC kaip detektorius naudojamas masių spektrometras (ESC-MS). Šis

metodas nustato medžiagos jonizuotų atomų masę ir santykinį kiekį. Junginiai gali būti jonizuojami termopurkštuvu (angl. thermospray, TSI), elektropurkštuvu (angl. electrospray, ESI), bei matrica paremta lazerio desorbcija/jonizacija (angl. Matrix Assisted Laser Desorption, MALDI). TSI-MS nėra tinkamas metodas naftodiantronų analizei, todėl naudojama jonizacija elektropurkštuvu, kuri suteikia galimybę analizuoti ir mažos koncentracijos analites [35]. Jonai atskiriami remiantis jų masės/krūvio santykiu (m/z), jonų kiekis užrašomas kaip spektras atsižvelgiant į masės/krūvio santykinį intensyvumą ir dydį [97]. Masių spektrometro privalumai – tai universalus detektorius, kuris yra jautresnis negu elektrocheminiai, UV-Vis, fluorescenciniai detektoriai. Suteikia galimybę identifikuoti nepilnai chromatografiškai atskirtus junginius [98].

Atlikti moksliniai tyrimai įrodo šio metodo efektyvumą identifikuojant naftodiantronus ir nustatant chromatografiškai atskirtų junginių molekulines mases jonažolių [8,98] ir grikių žaliavose [4,1]. Masių spektrometrija šiuo metu yra viena iš galingiausių analitinių technologijų [8], todėl kokybiniam junginių įvertinimui jonažolių ir grikių ekstraktuose buvo pasirinktas būtent šis metodas.

2. TYRIMO METODIKA

2.1.

Tyrimo objektas

Buvo tirta 15, Lietuvoje augančių, sėjamųjų grikių (lot. Fagopyrum esculentum Moench), veislių. Grikių augalai buvo auginti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemose. Intensyvios žemdirbystės sistemoje buvo naudojamos mineralinės azoto, fosforo ir kalio trąšos. Tiriami grikių veislių „VB Vokiai“, „VB Nojai“, „Kora“, „Panda“, „Anita Belaruskaja“, „Smuglianka“, „Volma“, „Anika“, „Kvietka“, „Čanita“, „Žaleika“, „Mara“, „Žniajarka“, „Belaruskij determinant-1“, „Belaruskij determinant-2“ žiedai, kurie nupjauti žydėjimo tarpsnyje 2014-07-09, 2014-07-10 ir 2015-07-13. Grikių žaliavos augintos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialo eksperimentiniuose laukuose. Tirti jonažolių lapai ir žiedai. Tyrimui naudota 12 skirtingų jonažolių rūšių: H. confertum subsp. stenobotrys (Boiss.) Holmboe, Hypericum lydium Boiss. (populiacija 1), Hypericum lydium Boiss. (populiacija 2), Hypericum lydium Boiss. (populiacija 3), Hypericum lydium Boiss. (populiacija 4), Hypericum lydium Boiss. (populiacija 5), H. olivieri (Spach) Boiss., H. linarioides Bosse, H. pallens D. Don, H. russeggeri R. Keller, H. thymifolium Banks & Sol., H. hircinum L. Augalinės žaliavos buvo laikomos popieriniuose maišeliuose, sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje.

2.2.

Medžiagos ir tirpikliai

Acetonas (>99,5 proc. Sigma-Aldrich GmbH; Buchs, Šveicarija), metanolis (>99,9 proc. Sigma-Aldrich GmbH, Buchs, Šveicarija), išgrynintas vanduo (Ultra gryno vandens valymo sistema Milli-Q, Merc, Šveicarija), hipericino standartas (Sigma-Aldrich GmbH, Buchs, Šveicarija), skruzdžių rūgštis (≥95 proc. Sigma-Aldrich GmbH, Buchs, Šveicarija), acetonitrilas (>99,9 proc.) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija).

2.3.

Aparatūra

Augalinės žaliavos susmulkintos naudojant elektrinį smulkintuvą IKA A11 basic (Vokietija). Ekstraktų gamybai naudota ultragarsinė vonelė ELMA Elmasonic P (Vokietija). Centrifugavimas atliekamas Thermo Scientific Heraeus Biofuge Stratos (Centurion Scientific Global, Jungtinė Karalystė) centrifuga. Nuodžiūvis įvertintas naudojant laboratorinį drėgmės analizatorių Precisa HA 300

(Šveicarija). Svėrimams naudotos analitinės svarstyklės Sartorius CPA225D (Goettingen, Vokietija). Ektraktų filtravimui naudoti Frisnette Q-Max RR švirkštiniai filtrai, koncentravimui naudotas IKA RV 10 Basic rotacinis garintuvas su HB 10 vonele ir vertikaliu kondensatoriumi (Vokietija). Mėginiams paimti naudotos pusiau automatinės Eppendorf pipetės. Surinktos frakcijos džiovintos vakuuminėje Binder (JAV) džiovinimo spintoje. Kiekybiniai tyrimai atlikti Spectronic Camspec M550 spektrofotometru. Kokybinis jonažolių tyrimas atliktas Waters 2767 chromatografu su Waters 2998 PDA detektoriumi (Waters, Milford, USA). Kokybinei grikių ekstraktų analizei naudotas Acquity UPLC chromatografas (Waters Corp., Milford, MA, USA) kartu su Waters Xevo TQD masių spektrometru.

2.4.

Tyrimo metodai

2.4.1. Tiriamojo pavyzdžio ruošimas

Nuodžiūvio vertinimas. Grikių ir jonažolių žaliavų nuodžiūvis vertintas naudojant Precisa HA 300 (Šveicarija) drėgmės analizatorių. Atsveriamas 1 g susmulkintos žaliavos, kaitinama 120°C temperatūroje iki pastovios masės. Nuodžiūvio matavimai buvo atlikti tris kartus. Abi žaliavos atitiko Europos farmakopėjoje nustatytas ribas - žaliavose <10 proc. drėgmės. Gauti rezultatai parodė, kad abi augalinės žaliavos yra tinkamos naudoti atliekant tolimesnius eksperimentinius tyrimus. Nuodžiūvis (proc.) apskaičiuojamas remiantis formule:

𝑚1−𝑚2 𝑚0

×

100

m1- žaliavos masė prieš džiovinimą (g); m2- žaliavos masė po džiovinimo (g).

2.4.2. Ekstraktų ruošimas naftodiantronų kiekybiniam ir kokybiniam

įvertinimui.

Ekstraktai buvo ruošiami iš jonažolių lapų, žiedų ir grikių žiedų. Išdžiovintos augalinės žaliavos susmulkintos elektriniu malūnu IKA A11 basic (Vokietija) iki <3 mm dydžio. Susmulkintos augalinės žaliavos sverta 0,1 g (0,001 g tikslumu), užpilta 4 ml 80 proc. acetonu, ekstrakcija vykdyta 10 minučių veikiant ultragarsu, esant 400_{C temperatūrai. Gautas ekstraktas centrifuguojamas 10 min.}

7000 rpm. Centrifugatas nupilamas ir procesas kartojamas užpilant 4 ml 80 proc. acetono. Gautas ekstraktas nufiltruojamas per 0,22 µm filtrą. Kiekybinė analizė atliekama spektrofotometrijos metodu. Spektrofotometriniai matavimai buvo kartojami tris kartus ir išvestas gautų rezultatų vidurkis. Rezultatai

pateikti absoliučiai sausos žaliavos mase. Prieš atliekant pusiau preparatyvinę ESC analizę jonažolių ekstraktas perkeltas į permatomą, stiklinę kolbą ir apšviestas šviesa (15 min.) tam, kad įvyktų nuo šviesos priklausoma junginių transformacija: protohipericino į hipericiną, o protopseudohipericino į pseudohipericiną. Prieš atliekant ESC-MS analizę grikių ekstraktas taip pat buvo apšvitintas šviesa tam, kad protofagopirinas transformuotųsi į fagopiriną.

2.4.3. Hipericino standarto paruošimas

Standarto tirpalas paruoštas iš ESC grynumo standartinio junginio hipericino (≥95 proc). Standartinė medžiaga ištirpinta ir praskiesta ≥99,9 proc. metanoliu, pagaminti skirtingų koncentracijų tirpalai ir nubraižytas gradavimo grafikas.

2.5.

Naftodiantronų kiekybinė ir kokybinė analizė

2.5.1. Bendro naftodiantronų kiekio išreikšto hipericino ekvivalentu nustatymas

grikių ir jonažolių ekstraktuose

Analizei imamas 1 ml vaistinių augalinių žaliavų ekstrakto. Kiekybinis naftodiantronų nustatymas atliktas išorinio standarto metodu, naudojantis sudarytu analitėms tapačiu hipericino standarto gradavimo grafiku. Hipericino standartas ištirpinamas metanolyje. Lyginamasis tirpalas – metanolis. Spektrofotometru matuojama kiekvieno ekstrakto absorbcija prie 590 nm bangos ilgio. Gradavimo grafikas sudaromas iš septynių (2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 7,5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 30 µg/ml) skirtingų standarto koncetracijų. Standarto kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtis ir regresijos koeficientas pateiktas 4-oje lentelėje. Rezultatų tiesiškumą (angl. linearity) patvirtina regresijos koeficientas, kuris buvo R2_{≥0,9998. Metodo glaudumas (angl. precision) įrodytas}

apskaičiavus santykinį standartinį nuokrypį (SSN), visų gautų mėginio matavimo serijų, tomis pačiomis sąlygomis, standartinio nuokrypio vertės buvo mažesnės nei 5,0 proc. Gauti duomenys vertinti pagal hipericino standarto gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį. Gradavimo grafikas bendram naftodiantronų kiekiui nustatyti jonažolių ir grikių žaliavose pateiktas 6-ame paveiksle.

4 lentelė. Hipericino standarto kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtis ir regresijos koeficientas.

Kalibracinio grafiko tiesinės

regresijos lygtis Regresijos koeficientas R

2

Naftodiantronai Y = 0,1175x-0,1209 0,9998

Y – absorbcijos dydis;

X – bendras naftodiantronų kiekis išreikštas hipericino ekvivalentu (HE) µg/ml.

Suminis naftodiantronų kiekis išreiškiamas hipericino ekvivalentu (HE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę: 𝐻𝐸 = 𝐶 ∙ 𝑉

𝑚

×

100

100−𝑛

µg/g;

c - naftodiantronų koncentracija µg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g); n – nuodžiūvis.

6 pav. Gradavimo grafikas bendram naftodiantronų kiekiui nustatyti jonažolių ir grikių žaliavose.

0 0,11 0,23 0,35 0,47 0,58 0,703 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 2,5 5 7,5 10 15 20 30 Abso rb cijos d yd is Hipericino konc. mg/ml y = 0,1175x - 0,1209 R² = 0,9998

2.5.2. Kokybinis antraceno junginių nustatymas jonažolių žieduose pusiau

preparatyvinės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Naftodiantronai (hipericinas ir pseudohipericinas) esantys jonažolių ekstraktuose išgryninti ir identifikuoti taikant šiuos parametrus:

Naudota pusiau-preparatyvinė ESC sistema, kuri sudaryta iš Waters 2767 chromatografo (Waters Corporation, Milford, USA) ir Waters 1525 Binary HLPC siurblio, Waters injektoriaus su 1000-µl klipa ir 1000-µl švirkštu.

Detektorius - fotodiodų matricos detektorius Waters 2998 PDA (Waters Corporation, Milford, USA) Naudota ACE C18 10 cm ilgio, 100 mm skersmens, 5 μm dalelių dydžio, 100Ã porų dydžio chromatografinio skirstymo kolonėlė.

Detekcija atlikta prie 590 nm bangos ilgio. Tirpikliai: A – acetonas/vanduo, B - acetonas; Tėkmės greitis 5,0 ml/min;

Injekcija 1000 μl;

Gradiento kitimas nurodytas 5-oje lentelėje.

5 lentelė. Mobilios fazės gradiento kitimas chromatografinio skirstymo metu

Laikas (min.) Tėkmės greitis

(ml/min) %A (acetonas/vanduo) %B (acetonas) 0.00 1.00 50.00 50.0 2.00 5.00 50.00 50.0 8.00 5.00 0.0 100.0 9.00 5.00 50.00 50.0

Antraceno junginiai (pseudohipericinas ir hipericinas) identifikuoti pagal analičių ir standarto sulaikymo laikų bei absorbcijos spektrų 590 nm ribose sutapimus, esant vienodoms chromatografijos sąlygoms. Chromatogramos ir smailės įrašytos naudojant MassLynx programą su FractionLynx moduliu. Frakcijos gausios antraceno junginių surinktos į švarius, 13×1 mm mėgintuvėlius. Surinktų į frakcijas naftodiantronų koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal chromatografinių smailių plotus.

2.5.3. Antraceno junginių esančių grikių (Fagopyrum esculentum Moench)

žieduose gryninimas kietafazės ekstrakcijos būdu ir identifikavimas

naudojant ESC-MS chromatografiją.

Naftodiantronai (fagopirinas E ir fagopirinas F) esantys grikių ekstraktuose išgryninti ir identifikuoti taikant šiuos parametrus:

Atlikta ekstrakcija kietąja faze (angl. SPE – solid phase extraction):

Naudota Supelco Discovery DSC-18LT kolonėlė. Kolonėlės kondicionavimui naudotas 100 proc. metanolis ir 30 proc. vandeninis metanolio tirpalas. Atlikta 100 µl injekcija. Kolonėlė praplauta 70 proc. metanoliu ir eliuuota 100 proc. metanoliu. ESC-MS chromatografijos sąlygos pavaizduotos 6-oje lentelėje.

6 lentelė. Mobilios fazės gradiento kitimas chromatografinio skirstymo metu

Laikas (min.) Tėkmės greitis

(ml/min) %A (skruzdžių rūgštis) %B (acetonitrilas) 0.00 0.500 95.0 5.0 9.00 0.500 0.0 100.0 10.00 0.500 95.0 5.0

Chromatografinis junginių atskyrimas atliktas naudojant Acquity UPLC sample manager chromatografą (Waters Corp., Milford, MA, USA). Kolonėlė Acquity BEH C18 (1,7 µm, 2,1×50 mm). ESC sistema buvo susieta su Waters Xevo TQD masių spektrometru. Junginiai analizuoti teigiamoje (ESI+) ir neigiamoje (ESI-) jonizacijose, naudojant Zspray ESI jonizatorių. Kapiliaro įtampa ±3kV, kūgio įtampa 50V, jonų šaltinio temperatūra 150°C, išgarinimo dujų tremperatūra 600°C, o jų tėkmės greitis – 1000 l/val. Duomenys apdoroti naudojant MassLynx programinę įrangą.

2.6.

Statistinė duomenų analizė

Statistinei duomenų analizei atlikti naudotos „MS Excel 2016“ ir „IBM SPSS Statistics 23“ programinės įrangos. Bandymai kartoti tris kartus, rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė. Įvertintas duomenų aritmetinis vidurkis ir standartinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingi skirtumai apskaičiuoti taikant nepriklausomų duomenų (Independent-Samples T) testą ir vienfaktorinę dispersinę analizę (One-way ANOVA). Atskirom grupėm įvertinti taikytas aposteriorinis Tukey kriterijus. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas jei p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1.

Kiekybinis naftodiantronų nustatymas sėjamųjų grikių žieduose ir

jonažolių lapuose ir žieduose

Prieš atliekant kokybinę antraceno junginių analizę sėjamųjų grikių ir jonažolių ekstraktuose, įvertintas šių junginių kiekybinis pasiskirstymas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žieduose ir skirtingų rūšių jonažolių žieduose bei lapuose.

3.2.

Antraceno junginių kiekio įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų

skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žieduose (2014 m.)

Naftodiantronų kiekybinis pasiskirstymas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žieduose, kurie nupjauti žydėjimo tarpsnyje 2014-07-09 ir 2014-07-10 pateiktas 7-ame paveiksle.

7 pav. Suminis naftodiantronų kiekis grikių veislių, augintų intensyvioje ir ekologinėje žemdirbystės sistemose 2014 metais, žieduose

Ekologinės žemdirbystės sąlygomis užaugintų sėjamųjų grikių žieduose suminis nustatytų naftodiantronų kiekis kinta nuo 0,64±0,01 iki 1,08±0,04 mg/g, o intensyvios – nuo 0,77±0,01 iki 1,42±0,04 mg/g. Didžiausias antraceno junginių kiekis nustatytas intensyvios žemdirbystės sąlygomis

0,65 0,80 0,92 1,08 0,78 0,64 1,07 0,84 0,88 0,76 0,87 0,93 0,94 _0,89 0,93 0,93 0,95 0,96 1,29 0,77 0,95 1,08 0,95 0,95 1,10 0,97 1,30 0,94 1,42 1,22 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 Su mi nis na ft od ian tron ų kieki s (mg/ g )

Veislės Ekologinė Intensyvi

* - statistiškai reikšmingai didesnis junginių kiekis, lyginant su kita žemdirbystės sistema (p<0,05) * * * * * * * *