FARMACIJOS FAKULTETAS
GIEDRĖ GRAJAUSKAITĖ
SPALVINGŲJŲ ŠERMUKŠNIŲ (SORBUS DISCOLOR L.) EKSTRAKTO
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS LABORATORINIŲ
PELIŲ ORGANUOSE
Magistro baigiamasis darbasVientisųjų studijų programa „Farmacija“, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis „Farmacija“
Darbo vadovas
Doc. dr. Asta Kubilienė
Konsultantas
Prof. dr. Ilona Sadauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė: prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data:
SPALVINGŲJŲ ŠERMUKŠNIŲ (SORBUS DISCOLOR L.) EKSTRAKTO
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS LABORATORINIŲ PELIŲ
ORGANUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas Darbo vadovas
Prof. dr. Ilona Sadauskienė Doc. dr. Asta Kubilienė Data: Data:
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Giedrė Grajauskaitė
Data: Data:
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Spalvingojo šermukšnio (S. discolor L.) morfologija ir paplitimas ... 11
1.2. Sorbus discolor L. augalinių žaliavų cheminė sudėtis ... 12
1.3. Šermukšnio (Sorbus L.) farmakologinės savybės ... 13
1.4. Fenoliniai junginiai ... 13
1.4.1. Antioksidacinės polifenolių savybės ... 14
1.4.2. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas ... 14
1.5. Laisvieji radikalai ... 15
1.6. Oksidacinis stresas ir jį įtakojantys veiksniai ... 16
1.6.1. Toksinis etanolio poveikis ... 17
1.6.2. Aliuminio toksiškumas ... 17
1.7. Antioksidacinis poveikis... 18
1.8. Redukuoto glutationo vaidmuo antioksidacinėje sistemoje ... 19
1.9. Malondialdehido vaidmuo antioksidacinėje sistemoje ... 19
1.10. Katalazės vaidmuo antioksidacinėje sistemoje ... 20
1.11. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1. Tyrimo objektas ... 22
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ... 22
2.3. Naudota aparatūra ... 23
2.4. S. Discolor L. ekstraktų paruošimas ... 23
2.5. Bendro fenolių kiekio nustatymas S. discolor L. ekstrakte ... 23
2.6. Tyrimas su laboratorinėmis pelėmis ... 25
2.7. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir smegenyse ... 25
2.9. Katalazės aktyvumo nustatymas pelių kepenyse ir smegenyse ... 27
2.10. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Sorbus discolor L. ekstraktuose ... 29
3.2. S. discolor L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių smegenyse ... 30
3.3. S. discolor L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse ... 31
3.4. S. discolor L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių smegenyse ... 33
3.5. S. discolor L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ... 34
3.6 S. discolor L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių smegenyse ... 35
3.7. S. discolor L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių kepenyse ... 37
3.8. Rezultatų apibendrinimas ... 38
4. IŠVADOS ... 39
5. REKOMENDACIJOS ... 40
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41
SANTRAUKA
G. Grajauskaitės magistro baigiamasis darbas „Spalvingųjų šermukšnių (Sorbus discolor L.) ekstrakto antioksidacinio aktyvumo įvertinimas laboratorinių pelių organuose“. Mokslinė vadovė doc. dr. A. Kubilienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2021.
Tyrimo tikslas. Įvertinti spalvingųjų šermukšnių (Sorbus discolor L.) lapų ekstrakto antioksidacinį
aktyvumą pelių smegenyse ir kepenyse.
Darbo objektas. Pelių, paveiktų Sorbus discolor L. ekstraktu kepenys ir smegenys.
Metodai. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti S. discolor L. ekstraktuose naudotas Folin –
Ciocalteu metodas. Spalvingųjų šermukšnių (Sorbus discolor L.) ekstrakto antioksidacinio aktyvumo įvertinimui nustatomos katalazės, glutationo ir malondialdehido fermentų koncentracijos pelių organuose, po kasdieninio 21 dienos trukmės šio ekstrakto vartojimo per os. Tyrimas atliktas su 5 pelių grupėmis: 3 kontrolinėmis grupėmis (vandens, aliuminio ir etilo alkoholio) bei 2 tiriamosiomis grupėmis (šermukšnių ekstrakto ir šermukšnių ekstrakto su aliuminiu). Kiekvieną grupę sudarė 8 pelės. Duomenų patikimumas vertintas pagal Stjudento t-testą.
Pagrindiniai tyrimo rezultatai. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas S. discolor L. lapų
žaliavoje. Pelių smegenyse, kurios po AlCl3 tirpalo sušvirktimo, buvo girdomos Sorbus discolor L. ekstraktu
lyginant su AlCl3 tirpalu,grupe, nustatyti MDA (32,3 proc., p ≤ 0,05), GSH (48proc., p ≤ 0,05) koncetracijų
ir CAT (23,8 proc., p ≤ 0,05) aktyvumo padidėjimai. Pelių kepenyse, lyginant tas pačias grupes, nustatyti MDA (87,7 proc., p ≤ 0,05), GSH (82 proc., p ≤ 0,05) koncetracijų ir CAT (33 proc., p ≤ 0,05) aktyvumo padidėjimai. Gauti rezultatai rodo, kad S. discolor L. ekstraktas atstatė MDA, GSH ir CAT rodiklius iki kontrolinės grupės lygio.
Išvados. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis ištyrus kelias Sorbus L. rūšis nustatytas Sorbus discolor L. ekstrakte; S. discolor L. ekstraktas statistiškai reikšmingai padidino malondialdehido
koncentraciją pelių kepenyse ir smegenyse, po AlCl3 sukelto oksidacinio streso; S. discolor L. ekstraktas
sumažino lipidų peroksidaciją atstatydamas redukuoto glutationo koncentraciją iki kontrolinių pelių kepenyse ir smegenyse nustatyto kiekio; S. discolor L. ekstraktas atstatė katalazės aktyvumą iki kontrolinių pelių smegenyse ir kepenyse nustatyto aktyvumo, taip sumažindamas aliuminio jonų sukeltą peroksidaciją;
S. discolor L. ekstraktas sumažino AlCl3 sukeltą lipidų peroksidaciją pelių kepenyse ir smegenyse,
atstatydamas malondialdehido, redukuoto glutationo koncentraciją ir katalazės aktyvumą iki kontrolės lygio.
SUMMARY
Master Thesis by G. Grajauskaitė “Evaluation of antioxidant activity of Colorful rowan (Sorbus discolor L.) extract in organs of laboratory mice”. Scientific Supervisor doc., dr. Asta Kubilienė, Lithuanian University of Health Sciences. Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2021.
Aim of the study. To determine if leaf extract of Colorful rowan (Sorbus discolor L.) have antioxidant
effect in the brain and liver of laboratory mice.
Object of the study. Brain and liver of mice affected by S. discolor L. extract.
Methods. Folin – Ciocalteu method was used to determine total phenolic compounds content in S. discolor
L. extracts. To evaluate the antioxidant activity of the Colorful rowan extract (Sorbus discolor L.), the concentrations of catalase, glutathione and malondialdehyde enzymes in the organs of mice were determined after daily oral administration of this extract for 21 days. The study was performed with 5 groups of mice: 3 control groups (water, aluminum and ethyl alcohol) and 2 study groups (S. discolor L. extract and S.
discolor L. extract with aluminum). Each group consisted of 8 mice. The reliability of the data was evaluated
according to Student’s t-test.
Main results. The highest total content of phenolic compounds was found in the leaf raw material of S. discolor L. In the brains of mice, that got S. discolor L. extract after AlCl3 injection, MDA (32,3 %), GSH
(48 %) concentration and CAT (23,8 %) activity increased statistically significantly compared to AlCl3
effected mice group. In the liver of mice, that got S. discolor L. extract after AlCl3 injection, MDA (87,7
%), GSH (82 %) concentration and CAT activity (33 %) increased statistically significantly compared to AlCl3 effected mice group. The results obtained show that S. discolor L. extract restored MDA, GSH and
CAT to the level of the control group.
Conclusions. The highest total content of phenolic compounds in several Sorbus L. genera was found in Sorbus discolor L. extract; S. discolor L. extract statistically significantly increased malondialdehyde
concentrations in the liver and brain of mice following AlCl3-induced oxidative stress; S. discolor L. extract
reduced lipid peroxidation by restoring the concentration of reduced glutathione to the levels determined in the liver and brain of control mice; S. discolor L. extract restored catalase activity to that found in the brain and liver of control mice, thereby reducing aluminum ion-induced peroxidation; S. discolor L. extract reduced AlCl3-induced lipid peroxidation in mouse liver and brain, restoring malondialdehyde, reduced
PADĖKA
Dėkoju mokslinio darbo vadovei doc. dr. Astai Kubilienei, konsultantei prof. dr. Ilonai Sadauskienei ir dr. Arūnui Liekiui už pagalbą atliekant mokslinį tyrimą, nuoširdų bendravimą, išsakytas pastabas bei patarimus.
SANTRUMPOS
ADJ – aktyvieji deguonies junginiai CAT – katalazė
DNR – deoksiribonukleorūgštis GSH – redukuotas glutationas GSSG – oksiduotas glutationas LD50 – vidutinė mirtina dozė
MDA – malondialdehidas
NADPH – redukuotas Nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas TBR – tiobarbitūro rūgštis
ĮVADAS
Šių laikų visuomenėje vis dažniau atliekami įvairūs tyrimai susiję su oksidacinio streso atsiradimu ir jį sukeliančiais veiksniais. Oksidacinį stresą sukelia laisvųjų radikalų kiekio padaugėjimas organizme, kuriam didelės įtakos turi įvairūs aplinkos veiksniai, tokie kaip oro tarša, rūkymas, tam tikri pesticidai, sunkieji metalai ir kt. [1]. Aliuminis, vienas pagrindinių veiksnių sukeliančių oksidacinį stesą. Aliuminio junginiai naudojami įvairių kasdieniam naudojimui skirtų prietaisų ir kosmetikos gaminių gamybai, taip pat jis yra įprastas priedas įvairiuose maisto produktuose bei gali būti aptinkamas ir geriamajame vandenyje. Pagrindiniai aliuminio patekimo būdai į sisteminę kraujotaką: absorbuojant per odą, nurijus ar injekuojant į raumenis. Įvairių tyrimų dėka nustatyta, kad jis pasižymi prooksidaciniu poveikiu in vivo ir in vitro, taip sukeldamas įvairius sveikatos sutrikimus [2].
Kitas ypač plačiai naudojamas veiksnys, sukeliantis oksidacinį stresą, yra alkoholis. Įrodyta, kad ilgalaikis alkoholio vartojimas, toksiškai veikia daugelį organizmo organų, generuodamas aktyviuosius deguonies junginius ir lipidų peroksidaciją ląstelėse ir audiniuose [3]. Dėl to yra ypač svarbu išlaikyti balansą tarp prooksidantų ir antioksidantų, norint apsisaugoti nuo oksidacinio streso sukeliamų ligų (Alzheimerio, Parkinsono, aterosklerozės, širdies nepakankamumo ir vėžio).
Antioksidantai yra ypač svarbūs apsaugai nuo oksidacinio streso. Augaluose kaupiami fenoliniai junginiai (ypač fenolinės rūgštys ir flavanoidai), pasižymi antioksidacinėmis savybėmis ir veikia kaip laisvųjų radikalų šalintojai, taip apsaugodami ląsteles nuo lipidų peroksidazės in vivo ir in vitro. Didelis šių junginių kiekis aptinkamas Sorbus discolor L. augalinėse žaliavose. Ištyrus šermukšnių lapų, uogų ir žiedų sudėtį, nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis aptinkamas lapuose bei žieduose. Įvairių eksperimentų metu įrodytas tiesioginis ryšys tarp antioksidacinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio bei sudėties [4].
Šio tyrimo tikslas yra nustatyti, ar spalvingųjų šermukšnių (Sorbus discolor L.) lapų ekstraktas pasižymi antioksidaciniu poveikiu laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse.
Šio darbo metu gauti rezultatai turėtų pagilinti žinias apie spalvingųjų šermukšnių ekstrakto antioksidacinį poveikį gyvam organizmui. Gauti duomenys gali būti naudingi ateityje, kuriant įvairius antioksidacinius farmacinius preparatus apsaugai nuo oksidacinio streso, į kurių sudėtį įeitų S. discolor L. dėl jų sudėtyje esančio gausaus fenolinių junginių kiekio.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:Įvertinti spalvingųjų šermukšnių (Sorbus discolor L.) lapų ekstrakto antioksidacinį aktyvumą pelių kepenyse ir smegenyse.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį Sorbus discolor L. ekstrakte.
2. Įvertinti S. discolor L. ekstrakto poveikį malondialdehido koncentracijai pelių smegenyse ir kepenyse.
3. Įvertinti S. discolor L. ekstrakto poveikį redukuoto glutationo koncentracijai pelių smegenyse ir kepenyse.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Spalvingojo šermukšnio (S. discolor L.) morfologija ir paplitimas
Spalvingasis šermukšnis (Sorbus discolor L.) yra priskiriamas erškėtinių (Rossaceae) šeimos, erškėtiečių (Rosales) eilės, erškėčiažiedžių (Rosidae) poklasio, dviskilčių (Magnoliopsida) klasės, gaubtasėklių (Magnoliophyta) skyriaus augalams [5],[6].
Erškėtinių augalų šeimai priklauso daugiau nei 100 genčių, kurias sudaro daugiau kaip 3000 rūšių augalų ir tai yra trečia ekonomiškai svarbiausia augalų šeima vidutinio klimato regionuose [7]. Sorbus L. gentis apima 85 rūšis ir daugiau nei 100 porūšių veislių, formų ir rūšių. Europoje yra 18 rūšių, iš jų 13 yra plačiai paplitusios. Baltijos šalyse natūraliai auga penkios rūšys iš kurių plačiausiai paplitusi paprastųjų šermukšnių rūšis [5], [8].
Sorbus L. yra visžaliai medžiai, krūmai ar puskrūmiai. Šermukšnių žievė – lygi, pilkos arba rudos
spalvos. Augalo aukštis varijuoja nuo 3 iki 20 metrų. Šermukšnių ūgliai nedygliuoti, pumpurai su plikais ar plaukuotais žvyneliais. Sorbus L. medžių ar krūmų lapai yra ištisiniai arba sudėtiniai, neporomis plunksniški, dantytais kraštais, skiautėti arba plunksniškai suskaldyti, dvigubai pjūkliški, kartais lygiakraščiai. Augalas žydi gegužės - birželio mėnesį. Žiedai, kurių skersmuo apie 8 – 15 mm, sudaryti iš 5 taurėlapių ir 5 vainiklapių (baltos, rečiau rožinės spalvos). Šermukšnių žiedai – dvilyčiai, turintys 1 – 5 liemenėlius, 15 – 25 kuokelius ir susitelkę į žiedynus. Mezginė apatinė. Vaisiai subręstantys rugsėjo – spalio mėnesiais yra rutuliškos arba kiaušiniškos formos, oranžinės arba raudonos spalvos [9]. (1pav.)
Šermukšniai dažniausiai dauginasi sėklomis, taip pat gali būti dauginami vegetatyviškai. Dauguma
Sorbus L. genties augalų yra atsparūs šalčiui ir gali augti įvairiame dirvožemyje [9].
1.2. Sorbus discolor L. augalinių žaliavų cheminė sudėtis
Lietuvoje augančių šermukšnių genties augalų cheminė sudėtis yra mažai tirta. Išanalizavus kitur augančių Sorbus L. sudėtį, mokslininkai nustatė, kad joje gausu įvairių biologiškai aktyvių medžiagų: ypač didelis kiekis nustatomas flavanoidų (kvercetinas, kemferolis ir jų glikozidai), taip pat gausu fenolinių junginių (chlorogeno rūgštis, neochlorogeno rūgštis, kavos rūgštis), antocianidų ir terpenoidų [7], [10].
Tiriant Sorbus discolor L. žiedų ir lapų ėminius, nustatyta, kad jų etanolinių ektraktų cheminėje sudėtyje identifikuojama neochlorogeno rūgštis, chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, taip pat aptinkamas rutinas, izokvercetinas, hiperozidas bei astragalinas [8], [9].
1 lentelė. Fenolinių rūgščių kiekinės sudėties įvairavimas Sorbus discolor L. augalų žiedų ir
lapų ėminiuose
Junginiai Kiekis (mg/g, absoliučiai sausai augalinei žaliavai)
Žiedai Lapai
Neochlorogeno rūgštis 11,11 ± 0,17 12,45 ± 0,10 Chlorogeno rūgštis 11,62 ± 0,42 21,27 ± 0,09 Kavos rūgštis 0,23 ± 0,01 1,03 ± 0,02
Ištyrus fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą S. discolor L. lapų ir žiedų ėminiuose nustatytas vyraujantis komponentas, kuris yra chlorogeno rūgštis, žiedų ėminiuose aptinkama 11,62 mg/g, o lapuose – 21,27 mg/g [9]. (1 lentelė)
Tiriant flavanoidų kiekinę sudėtį S. discolor L. lapų ir žiedų ėminiuose nustatyta, kad daugiausiai aptinkama rutino, žieduose – 4,37 mg/g, o lapuose 2,20 mg/g. Mažiausiai aptinkama astragalino, kurio kiekis žieduose 0,71 mg/g, o lapuose 0,33 mg/g [9]. (2 lentelė)
2 lentelė. Flavanoidų kiekinės sudėties įvairavimas Sorbus discolor L. augalų žiedų ir lapų
Junginiai Kiekis (mg/g, absoliučiai sausai augalinei žaliavai) Žiedai Lapai Rutinas 4,37 ± 0,13 2,20 ± 0,01 Hiperozidas 2,56 ± 0,04 0,50 ± 0,01 Izokvercetinas 3,52 ± 0,02 1,19 ± 0,02 Astragalinas 0,71 ± 0,01 0,33 ± 0,02
1.3. Šermukšnio (Sorbus L.) farmakologinės savybės
Šermukšniams (Sorbus L.) - būdingas didelis biologinio aktyvumo spektras, nes sudėtyje gausu įvairių biologiškai aktyvių medžiagų [9]. Nuo seno medicinoje šermukšniai ir iš jų pagaminti produktai (užpilai, nuovirai, ištraukos ir kt.) yra naudojami gliukozės kiekio mažinimui kraujyje, organizmo jautrumui į insuliną didinti, širdies ir kraujagyslių ligoms, infekcinėms ir onkologinėms ligoms, virškinamojo trakto ligoms (opaligei, gastritui) bei žaizdoms gydyti, imuninei sistemai stiprinti [11]. Siekiant nustatyti šermukšnių poveikį organizmui, vis dažniau yra atliekami įvairūs moksliniai tyrimai su šermukšnių augalinių žaliavų ekstraktais, norint įvertinti jų biologinį poveikį žmogaus organizmui, bei nustatyti veikimo mechanizmą [9],[11].
1.4. Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai yra antriniai augalų metabolitai, nustatomi visose augalinėse žaliavose įskaitant ir augalinius maisto produktus [12]. Iki šiol nustatyta daugiau nei 8000 fenolinių junginių augaluose. Juose esančius fenolinius junginius galima suskirstyti į fenolio rūgštis, tokoferolius ir flavanoidus (flavanoliai, flavonai, izoflavonai, antocianidinai, taninai ir kt.) [12],[13].
Nustatyta, kad fenolio ir flavanoidų junginiai veikia kaip antioksidantai ir pasižymi antialerginiu, priešuždegiminiu, antidiabetiniu, antimikrobiniu, antipatogeniniu, antivirusiniu, antitromboziniu ir kraujagysles plečiančiu poveikiu, taip pat turi įtakos tokioms ligoms kaip vėžys ir Alzheimerio liga. Svarbi flavanoidų savybė yra jų gebėjimas apsaugoti nuo oksidacinio streso sukeliamų ligų, aktyvuoti ir slopinti
įvairius fermentus, jungiančius specifinius receptorius, ir apsaugoti nuo širdies ir kraujagyslių ligų mažinant mažo tankio lipoproteinų oksidaciją [12].
1.4.1. Antioksidacinės polifenolių savybės
Padidėjusi aktyviųjų deguonies junginių (ADJ) gamyba gali sukelti negrįžtamus ląstelių pažeidimus, kurie gali sukelti uždegiminius procesus. Fenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo jų funkcinių grupių struktūros [13]. Augaluose sintetinamų fenolinių junginių struktūros bruožas yra aromatinis žiedas, su viena ar keliomis hidroksilo grupėmis [14].
Fenolinių junginių veikimo mechanizmas pasižymi jų gebėjimu slopinti ADJ susidarymą arba fermentų, dalyvaujančių jų gamyboje, slopinimu, ADJ pašalinimu bei antioksidantų gynybos reguliavimu ir apsauga. Polifenoliai mažina fermentų dalyvaujančių ADJ gamyboje aktyvumą. Aktyviųjų deguonies junginių susidarymas stiprina laisvuosius radikalus, redukuodamas vandenilio peroksidazę, susidarant reaktyviam hidroksilo radikalui. Mažesnis fenolių redoksinis aktyvumas mažina labai oksiduojančius laisvuosius radikalus dėl jiems būdingos savybės chelatuoti metalo jonus ir laisvuosius radikalus [13].
Fenoliniai junginiai plazmos membranoje reaguoja su laisvaisiais radikalais, esančiais hidrofobiniame vidiniame membranos sluoksnyje, šie membranos pokyčiai veikia lipidų ir baltymų oksidacijos greitį. Flavanoidai esantys hidrofobinėje membranos šerdyje trukdo oksidatorių patekimui į membraną, taip apsaugant jos struktūrą bei funkcijas [13].
1.4.2. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas
Naujausiuose tryimuose apžvelgiami fenolių analizės metodai ir jų išgavimas iš augalų. Vieni iš svarbiausių procesų fenolių analizėje yra tinkamas mėginių paruošimas ir ekstrahavimas, po kurio atliekamas klasifikavimas ir kiekybinis įvertinimas naudojant spektrofotometrijos, dujų chromatografijos, efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) ar kapiliarinės elektroforezės metodus [14].
Spektrofotometrija – vienas paprastesnių metodų skirtų fenolių kiekybiniam įvertinimui. Plačiausiai naudojami spektrofotometriniai metodai fenolių kiekiui augaluose nustatyti yra Folin – Denis ir Folin – Ciocalteu [14]. Metodas pagrįstas chemine fenolinių junginių redukcija dviem stipriais neorganiniais oksidatoriais, fosfomolibdato ir fosfovolframato rūgštimis, šarminėje terpėje. Susidaro mėlynos spalvos
produktai, esant plačiam absorbcijos spektrui 760 nm [15]. Šis metodas nėra specifiškas tik fenoliams, jis taip pat gali būti naudojamas nustatinėjant askorbo rūgštį, aromatinius aminus ir cukrus [14].
Dujų chromatografija (DC) - tai metodas, kuris naudojamas fenolio junginių atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui. Pagrindinis šio metodo trūkumas yra tai, kad dėl didelio fenolinių junginių lakumo jis nėra taikomas kartu su ESC metodu. Atliekant DC analizę, naudojami kelių tipų reagentai: etilo ir metilo chloroformiatas, diazometanas ir dimetilsufoksidas kartu su metiljodatu naudojami fenolio metilo arba etilo esteriams gaminti. Kita grupė reagentų yra trimetilsililo dariniai (trifluoracetamidas, trimetilsililo dariniai ir kt.) [14]. Ši sililatų reakcija yra pakankamai paprasta ir jos metu susidaro didelis kiekis lakių junginių ir mažai šalutinių produktų, kurie netrukdo analizei [14].
Fenolinių junginių analizei dažniausiai naudojamos 30 m ilgio kvarco kolonėlės, kurių skesmuo yra 25 – 32μm, o pastovios fazės dalelių dydis 0,25 μm. Nustatyta, jog norint gauti tikslesnius duomenis DC metodą reikėtų derinti kartu su masių spektrometrija [14].
Fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei augaluose atlikti, dažnai naudojamas ESC metodas - dėl jo efektyvumo ir greitumo, o kolonėlių pasirinkimas yra didelis. ESC metodo dėka galime atskirti ekstrakto komponentus ir nustatyti fenolinių junginių kiekius tirpale. Analizei atlikti turi būti palaikoma pastovi temperatūra. ESC analizė gali būti atliekama kambario temperatūroje, bet rekomenduojama kolonėlėje palaikyti apie 30 – 40 oC temperatūrą. Norint gauti kuo tikslesnius rezultatus,
analizę reikia vykdyti ilgesnį laiką. Įprastai tyrimas vykdomas 10-150 min [14].
1.5. Laisvieji radikalai
Laisvieji radikalai apibrėžiami kaip atomai ar molekulės, turintys vieną ar kelis neporinius elektronus valentiniame apvalkale ar išorinėje orbitoje, ir jie gali egzistuoti savarankiškai. Dėl nelyginio laisvųjų radikalų elektronų skaičiaus jie yra nestabilūs ir sąveikauja su kitomis molekulėmis [16]. Laisvieji radikalai gaunami iš deguonies, azoto ir sieros elementų, taip sukuriant aktyvius deguonies junginius (ADJ), aktyvius azoto junginius (ANJ) ir aktyvius sieros junginius (ASJ). Laisviesiems radikalams priskiriami hidroksilo radikalas (OH•), superoksido anijonas (O2• -), azoto oksidas (NO), vandenilio peroksidas (H2O2),
hidroperoksilo radikalas (HO2), hipochlorinė rūgštis (HOCl) ir kt. [1].
Laisvieji radikalai gali būti gaunami iš endogeninių ir egzogeninių šaltinių. Endogeniai veiksniai atsiranda dėl imuninių ląstelių aktyvacijos, uždegimo, psichinio streso, didelio fizinio aktyvumo, išemijos
ir vėžio. Egzogeniniai veiksniai gali būti tokie kaip oro ir vandens tarša, cigarečių rūkymas, alkoholis, sunkieji metalai ir kt. [1].
Daugiausiai ADJ gaminama ląstelių mitochondrijose, kur suvartojamas didelis deguonies kiekis. Esant sutrikusiai pusiausvyrai tarp laisvųjų radikalų gamybos ir antioksidacinio organizmo atsako, laisvųjų radikalų gaminama daugiau, dėl to atsiranda oksidacinis ir nitrozinis stresas. Didelis laisvųjų radikalų reaktyvumas, gali sukelti sunkius pažeidimus nukleorūgštims, baltymams ir lipidams [16].
1.6. Oksidacinis stresas ir jį įtakojantys veiksniai
Oksidacinis stresas apibrėžiamas kaip pusiausvyros sutrikimas tarp aktyviųjų deguonies junginių (ADJ) ir už jų neautralizavimą atsakingos antioksidacinės sistemos atsako. Oksidacinis stresas atsiranda padidėjus oksiduotų ląstelių makromolekulių susidarymui [17]. Aktyvūs deguonies junginiai, tokie kaip superoksido radikalas (O2• -), vandenilio peroksidas (H2O2) ir hidroksilo radikalas, susidaro visose
aerobinėse ląstelėse normalios apykaitos metu kaip šalutinis produktas, taip pat po oksidacinio streso [18]. ADJ pasižymi dideliu reaktyvumu, dėl to jie chemiškai sąveikauja su biologinėmis molekulėmis, lemdami ląstelių funkcijos pokyčius ir ląstelių mirtį. Įrodyta, kad ADJ atlieka svarbų vaidmenį kelių skirtingų uždegiminių ligų, tokių kaip reumatoidinis artritas, išemija ir aterokslerozė, patogenezėje ir sukeliamame sergamume [19]. Kiekvienas aerobinis organizmas turi antioksidacines sistemas, kurių tikslas apsaugoti ląsteles nuo ADJ, juos skaidant iki vandens [17]. Ląstelės sukūrė daug įvairių antioksidacinių fermentų šioms potencialiai toksiškoms molekulėms pašalinti. Katalazė kartu su malondialdehidu (MDA) ir natūraliais antioksidantais, tokiais kaip superoksido dismutazė ir glutationo peroksidazė yra pagrindiniai oksidacinio streso žymenys ir atlieka ypač svarbų vaidmenį apsaugant ląsteles nuo oksidacinio streso [18].
Įvairių tyrimu metu, nustatytas, tiesioginis ryšys tarp oksidacinio streso ir uždegiminio proceso. Oksidacinis stresas atlieka patogeninį vaidmenį sergant lėtinėmis uždegiminėmis ligomis. Padidėjęs ADJ kiekis gali moduliuoti sinapsinį ir nesinapsinį neuronų ryšį, dėl kurio kyla neuronų uždegimai ir ląstelių mirtis, o vėliau gali įsivystyti ir neurodegeneracija bei atminties sutrikimai [13].
1.6.1. Toksinis etanolio poveikis
Ilgalaikis alkoholio vartojimas toksiškai veikia daugelį organizmo organų, kepenis, širdies bei kraujagyslių, endokrininę, virškinimo ir centrinę nervų sistemas [3]. Suvartotas alkoholis absorbuojamas iš virškinamojo trakto, tuomet alkoholis difunduoja į kraują ir taip greitai pasiskirsto po visą organizmą. Didžioji dalis suvartoto etanolio metabolizuojama kepenyse. ADH pirmiausia oksiduoja etanolį iki acetaldehido, kuris vėliau ALDH pagalba oksiduojamas iki acetato [20], [21], [22]. Pakitęs NADH/ NAD + kiekis kepenų ląstelėse trukdo trikarboksirūgšties ciklo funkcijai bei lėtai riebalų rūgščių oksidacijai. Tad nesaikingas etanolio vartojimas, sukelia kepenų patogenezes, tokias kaip riebalų įsiskverbimo sutrikimas, alkoholinį hepatitą ir cirozę. Elektronams perėjus į deguonį, susidaro skirtingi ADJ: superoksido anijonas (O2∙-), vandenilio peroksidas (H2O2 ) ir hidroksilo radikalas (OH-) [3].
Įrodyta, kad etanolis toksinį poveikį sukelia generuodamas aktyvuosius deguonies junginius (ADJ) ir lipidų peroksidaciją skirtinguose ląstelių tipuose bei audiniuose. Oksidacinis balansas priklauso nuo ADJ kiekio ir antioksidacinių fermentų aktyvumo. Sutrikus šiai pusiausvyrai, išsivysto oksidacinis stresas, kuris veikia visą ląstelę, baltymus, lipidus ir DNR, taip iššaukdamas įvairių organų sistemų sutrikimus [3], [23]. Lipidų peroksidacija, veikia polinesočiąsias riebalų rūgštis membranos fosfolipiduose, didėjant oksidaciniam stresui, gaminant bioaktyvius aldehidus, tokius kaip 4-hidroksialenalai ir malondialdehidas [3]. Manoma, kad oksidacinio streso sukelta lipidų peroksidacija yra stipriai susijusi su aterosklerozinių plokštelių susidarymu, o tai lemia koronarinės širdies ir smegenų kraujagyslių ligų vystymąsi [24].
Nustatyta, kad etanolis geba praeiti pro kraujo ir smegenų barjerą, dėl to jis taip pat gali būti metabolizuojamas smegenyse. Etanolio oksidacija į acetaldehidą smegenyse gali vykti keliais būdais, kurie apima katalazę, citochromą CYP2E1 ir ADH [20]. Atliktų tyrimų su pėlemis dėka, nustatyta, kad etanolio metabolizmo metu susidaro: acetatas, glutamatas, glutaminas ir GABA [23].
1.6.2. Aliuminio toksiškumas
Aliuminis yra trečias pagal dydį metalas, kuris sudaro 8 proc. žemės sluoksnio. Aliuminis į žmogaus organizmą gali patekti su maistu, oru ar vandeniu [2]. Aliuminis kaupiasi visuose organizmo organuose, įskaitant inkstus, kepenis, širdį, kraują, kaulus ir smegenis. Inkstai atlieka svarbų vaidmenį aliuminio šalinime iš organizmo. Žmonėms, turintiems inkstų ar kepenų veiklos sutrikimų, gali pasireikšti toksinis aliuminio kaupimasis. Tai gali sukelti nefratotoksinį ir hepatotoksinį poveikį [25].
Yra keletas mechanizmų, kuriais aliuminis sukelia oksidacinius pažeidimus organams bei ląstelėms. Aliuminis gali prisijungti prie neigiamą krūvį turinčių fosfolipidų. Juose gausu polinesočiųjų riebalų rūgščių, kurios gali būti lengvai paveikiamos aktyviųjų deguonies junginių, tokių kaip H2O2, O2•¯ ir
OH-. Taip pat aliuminis skatina lipidų peroksidaciją, kurią inicijuoja geležis Fenton reakcijoje. Ši reakcija
sukelia ADJ gamybą bei Fe3+ junginių susidarymą. Taip pat Al3+ dėka yra neutralizuojamas superoksidas
(O2-), kad susidarytų Al – O2¯ kompleksas, kuris didina O2•¯ oksidacinį pajėgumą [26].
Atliktų tyrimų dėka, nustatyta, kad aliuminis pereina kraujo – smegenų barjerą, sąlygodamas įvairių nervų sistemos ligų atsiradimą, pvz. Alzheimerio, Parkinsono ligą [25]. Smegenų audiniai yra labai jautrūs aliuminio sukeltam oksidacianiam stresui. Manoma, kad tam įtakos turi didelis deguonies suvartojimo greitis (20 proc.), polinesočiųjų riebalų rūgščių buvimas ląstelių membranose, mažas anktioksidacinis fermentų aktyvumas bei didelis geležies kiekis. Aliuminio sukeltas oksidacinis stresas keičia lipidų peroksidaciją ir antioksidacinių fermentų aktyvumą. Julka ir Gill eksperimente su žiurkėmis, kurios buvo veikiamos aliuminiu 4 savaites, nustatyta padidėjusi lipidų peroksidacija žiurkių smegenų audiniuose. Susikaupęs didelis aliuminio kiekis, skatina H2O2 gamybą [26].
1.7. Antioksidacinis poveikis
Antioksidantai - tai medžiagos, kurios apsaugo ląsteles nuo žalingo ir kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio. Antioksidantas yra molekulė, slopinanti kitų molekulių oksidaciją [27]. Oksidacinis stresas, sukeltas laisvųjų radikalų yra pagrindinis ankstyvo senėjimo procesus skatinantis bei riziką susirgti lėtinėmis ligomis, tokiomis kaip onkologinės, širdies ir kraujagyslių ligos, aterosklerozė, Parkinsono bei Alzheimerio ligas, skatinantis veiksnys [27],[4],[28]. Oksidacinio streso metu susidaro per didelis kiekis ADJ ląstelėse ir audiniuose, dėl to antioksidantų sistema negali jų neutralizuoti. Dėl šios priežasties gali būti pažeistos ląstelių molekulės: DNR, baltymai ir lipidai [13].
Antioksidantai gali būti labai naudingi užkertant kelią ar atidedant degeneracinių ligų atsiradimą [4], [28]. Daugybė naturalių junginių, ypač augaluose kaupiami fenoliai, yra stiprūs antioksidantai veikiantys kaip laisvųjų radikalų šalintojai, reduktoriai ar kaip apsauga ląstelėms nuo lipidų peroksidazės in
vivo ir in vitro [4].
Šermukšnių augalinėse žaliavose nustatytas didelis anktioksidantų kiekis, tai vitaminas C ir polifenoliai (antocianinai, fenolio rūgštys, taninai, flavanoliai, flavonoliai ir flavonoidai) [27]. Ištyrus šermukšnių lapų, uogų bei vaisių antioksidacinį aktyvumą ir įvairių in vitro atliktų tyrimų metu, buvo
nustatyta, kad daugiausiai fenolių kaupiasi žieduose (11,83%) bei lapuose (9,09%). Taip pat įrodyta tiesioginė koreliacija tarp didelio antioksidacinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio bei sudėties [4].
1.8. Redukuoto glutationo vaidmuo antioksidacinėje sistemoje
Tripeptidas glutationas yra natūralus antioksidantas sudarytas iš trijų amino rūgščių: cisteino, glicino ir glutamo rūgšties. Glutationas aptinkamas žinduolių audiniuose, jo galima rasti citozolyje, branduoliuose ir daugumos ląstelių mitochondrijose. Fermentas gali būti redukuotas (GSH) ir oksiduotas (GSSG) [23], [29]. Ramybės būsenoje sveikose ląstelėse GSH / GSSG santykis yra >100, o ląstelėse, kurios yra paveiktos oksidacinio streso santykis nukrenta iki 1 - 10. Glutationas atlieka pagrindinį vaidmenį apsaugant organizmo ląstelių makromolekules nuo endogeninių ir egzogeninių aktyviujų deguonies ir azoto junginių [29].
Dėl didelio redukcijos – oksidacijos potencialo GSH veikia kaip kofaktorius ir antioksidantas fermentinėse reakcijose. Sveikose ląstelėse GSSG būna ne daugiau kaip 10 proc [30]. Glutationas ypač svarbus neautralizuojant laisvuosius radikalus. Taip pat gali būti naudojamas kaip kofaktorius kitiems antioksidaciniams fermentams. Jo dėka iš organizmo yra pašalinami įvairūs oksidatoriai, tokie kaip superoksido anijonas, hidroksilo radikalas, azoto oksidas ir anglies radikalai. Veikiant etanoliui, stipriai sumažėja GSH kiekis ląstelėje, šis procesas vadinamas apoptoze [29].
Didžiausias redukuoto glutationo aktyvumas nustatomas neuronuose ir glijos ląstelėse, o etanolio vartojimas stipriai slopina GSH aktyvumą smegenų žievėje. Antioksidacinių fermentų aktyvumas kinta gyvūnų CNS, kurie buvo veikiami etanoliu. CNS antioksidacinis pajėgumas taip pat priklauso nuo egzogeninių antioksidantų, kuriuos organizmas gauna su maistu [23].
1.9. Malondialdehido vaidmuo antioksidacinėje sistemoje
Malondialdehidas (MDA) naudojamas kaip bendras lipidų peroksidacijos laipsnio, atsirandančio dėl laisvųjų radikalų sukeliamo oksidacinio streso, rodiklis. MDA yra junginys, sudarytas iš trijų anglies atomų, kuris susidaro iš peroksiduotų polinesočiųjų riebalų rūgščių, daugiausiai arachidono rūgšties. Taip pat jis gali susidaryti ir nefermentinių reakcijų metu, kurios priklauso nuo deguonies radikalų iš biciklio
endoperoksido, kurio pagrindinis pirmtakas yra arachidono rūgštis. MDA yra vienas iš galutinių membranos lipidų peroksidacijos produktų [18].
MDA dažniausiai aptinkamas dviejų formų: laisvas ir kovalentiškai prisijungęs prie baltymų, nukleino rūgščių, lipoproteinų ar amino rūgščių. Cirkuliuojanti MDA ir MDA, prijungta prie tirpių aminorūgščių iš organizmo pasišalina su šlapimu. Malondialdehidas yra vienas iš dažniausiai naudojamų oksidacinio streso biologinių žymenų. MDA ir tiobarbitūrinės rūgšties derivatizacija, kurios metu susidaro tiobarbitūrinės rūgšties (TBR) reaktyvieji junginiai yra paprastas ir lengvas indikatorinis metodas, skirtas lipidų peroksidacijos ir laisvųjų radikalų nustatymui bei įvertinimui biologiniuose mėginiuose. TBR testas yra pagrįstas TBR reaktyvumu MDA atžvilgiu. Reakcijos junginiai gali būti išmatuojami spektrofotometriškai arba fluorimetriškai. MDA gali būti įvertintas žmogaus biologiniuose skysčiuose ir audiniuose [18], [31].
1.10. Katalazės vaidmuo antioksidacinėje sistemoje
Katalazė (CAT) yra vienas iš pagrindinių antioksidacinių fermentų, kuris apsaugo ląsteles nuo toksinio vandenilio peroksido poveikio. Katalazė katalizuoja vandenilio peroksido (H2O2) dismutazę į
deguonį ir vandenį [32]. CAT fermentą sudaro keturios hemoproteinų grupės ir jų molekulinė masė yra 250 kDa. Fermentas aptinkamas augalų ir gyvūnų ląstelėse, tokiose kaip eritrocitai, inkstų ir kepenų ląstelės [33].
Žinduolių katalazė yra tetrametras, kuriame yra monomeras turintis geležies hemo (porfirino) grupę, susijungusią su katalizės vieta. Visos hemo grupės yra apsaugotos nepolinėse kišenėse su siaurais hidrofobiniais kanalais, taip užtikrinant selektyvumą vandenilio peroksidui [17]. H2O2 metabolizuojamas
žinduolių ląstelėse ir yra pagrindinis oksidacinio streso metabolitas. Įrodyta, kad didelis ADJ kiekis turi įtakos skirtingų uždegiminių ligų atsiradimui. Katalazė atlieka svarbų vaidmenį, mažindama aktyviųjų deguonies junginių kiekį, taip sumažindama riziką patologinių sutrikimų, tokių kaip senėjimas, katarakta, aterosklerozę ir diabetas atsiradimui [33]. Atliktų tyrimų dėka, nusatyta, kad padidėjusi CAT raiška apsaugo nuo oksidacinio streso laboratorinius gyūnus ir kultivuojamas ląsteles [17].
Pagrindinis katalazės aktyvumo nustatymui naudojamas metodas yra UV spektrofotometrija, kuomet bangos ilgis yra 240 nm. Tačiau, šis metodas nėra tinkamas katalazės aktyvumo įvertinimui baltymuose kuriuose yra biologinių tirpalų, nes baltymai ir DNR sugeria UV šviesą [34].
1.11. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Spalvingųjų šermukšnių (Sorbus discolor L.) lapų ir žiedų cheminėje sudetyje gausu fenolinių junginių, flavanoidų, antocianidų ir terpenoidų. Atliktų tyrimų dėka nustatyta, kad visi šie junginiai pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu.
Oksidacinio streso metu, sutrinka pusiausvyra tarp ADJ ir antioksidacinės organizmo sistemos. Siekiant įvertinti oksidacinį stresą, naudojami metodai, pagal kuriuos matuojami laisvųjų radikalų sukeltų oksidacinių procesų biomarkeriai, tokie kaip MDA, GSH ar CAT. Oksidacinio streso poveikyje, gali išsivystyti įvairūs sveikatos sutrikimai. Padidėjęs aktyviųjų deguonies junginių kiekis turi įtakos lėtinių ligų, širdies ir kraujagyslių sistemos ligų, degeneracinių bei uždegiminių ligų, vėžio ir organizmo senėjimo patogenezei. Šių ligų prevencijai yra ypač svarbu antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčios medžiagos, kurių gausu augalinėse žaliavose. Dėl to yra svarbu nustatyti biologiškai aktyvių junginių kiekį bei antioksidacinio aktyvumo įvairavimą, Sorbus discolor L. žaliavoje bei jo priklausomybę nuo fenolinių junginių kiekio.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimui naudota spalvingųjų šermukšnių (S. discolor L.) lapų ir žiedų žaliava, gauta iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros. S. discolor žaliava rinkta iš įvairių Lietuvos augaviečių, 2012 metųbalandžio – rugsėjo mėnesiais augalo vegetacijos periodo metu.
Eksperimentui atlikti naudotos 4 – 6 savaičių amžiaus BALB/c laboratorinių pelių patinai ir patelės, sveriantys 20 – 30 g. Tyrime naudotas bendras pelių skaičius 40. Laboratorinės pelės gautos iš LSMU Veterinarijos akademijos vivariumo. Po atvežimo į laboratoriją, gyvūnai buvo laikomi karantino sąlygomis 7 dienas, kad priprastų prie pasikeitusių aplinkos sąlygų. Atskirti į skirtingus narvus patinai ir patelės, laikomi optimaliomis sąlygomis: patalpų temperatūra ~20 °C, santykinė oro drėgmė 55 ± 10 proc., natūralus šviesos režimas (diena/naktis). Eksperimento metu pelės buvo šeriamos pilnaverčiu maistu ir girdomos vandentiekio vandeniu ad libidum. Narvelių pakratams naudotos šieno ir medienos drožlės, kurios buvo keičiamos kiekvieną tyrimo dieną.
Eksperimentai su laboratorinėmis pelėmis buvo atliekami remiantis Lietuvos Respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymu. Iš Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos gautas leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais (leidimo Nr. G2-80) (žr. Priedas Nr. 1).
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai
Etanolis 96 proc. (Vilniaus degtinė);
Chloroformas ≥99 proc. ( „Sigma-Aldrich“, Missouri, JAV) Trichloracto rūgštis (TChA), n-butanolis (Lietuva);
Tris - HCl buferis, tiobarbitūro rūgštis (TBR), 5,5`-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) (DTNB) („Serva“, Vokietija);
Kalio chloridas, vandenilio peroksidas, fosforo rūgštis („Merck“, Vokietija);
Tirpalų gamybai buvo naudojamas išgrynintas vanduo, dejonizuotas vanduo ir fiziologinis tirpalas.
2.3. Naudota aparatūra
• Ultragarso vonelė – WiseClean;
• Analitinės svarstyklės – Shimadzu AUW120D (Bellingen, Vokietija); • Automatinės pipetės – Eppendorf Research (Eppendorf, JAV);
• Centrifuga – Beckman J2-21 (JAV); • Spektrofotometras – LAMBDA 25 (JAV);
• Bandinių tyrimui naudotos 1 cm skersmens kiuvetės.
2.4. S. Discolor L. ekstraktų paruošimas
Šermukšnių žaliava smulkinama iki dalelių praeinančių pro 355 µm sietą. Ekstrakto gamybai naudojama 0,2 g augalinės žaliavos. Žaliava pasveriama ir supilama į 50 ml kolbutę, užpilama 20 ml 50 proc. (v/v) etanolio ir gerai sumaišoma. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 20 min. Gautas ekstraktas filtruojamas per popieriaus filtrą į 25 ml kolbutę ir pilama 50 proc. (v/v) etanolio iki žymos. Ekstraktai filtruojami per membraninius filtrus (porų dydis 0,22 μm). Tolimesniems tyrimams su pelėmis, ekstraktas buvo skiedžiamas iki 10 proc. Pagamintas ekstraktas laikomas stikliniuose buteliukuose [9].
2.5. Bendro fenolių kiekio nustatymas S. discolor L. ekstrakte
Fenolinių junginių bendrasis kiekis nustatomas naudojant Folin – Ciocalteu metodą aprašytą S. Gasparavičiūtės tyrime [35]. Tyrimui atlikti ruošiamas 7 proc. natrio karbonato tirpalas (7g natrio karbonato ištirpinami distiliuotame vandenyje 100 ml kolboje). Tirpalui paruošti, imamas 1 ml tiriamosios žaliavos ekstrakto ir sumaišomas su 1 ml Folin – Ciocalteu reagento, 9 ml distiliuoto vandens ir po 5 min. įpilama 10 ml 7 proc. natrio karbonato tirpalas, kuris praskiedžiamas iki 25 ml. Tirpalas sumaišomas ir paliekamas stovėti tamsoje, kambario temperatūroje, 90 min. Praėjus reikiamam laikui, gauto tirpalo absorbcija matuojama naudojant spektrofotometrą esant 750 nm šviesos bangos ilgiui. Matavimas atliekamas 3 kartus.
Lyginamajam tirpalui paruošti naudojamos tokios pačios sąlygos, kaip ir tiriamajam tirpalui, tik vietoj šermuknių augalinės žaliavos ekstrakto yra pilama 1 ml distiliuoto vandens.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip ir tiriamieji, tik vietoje 1 ml ekstrakto imama 1 ml žinomos koncentracijos galo rūgšties tirpalų. Penkių skirtingų koncentracijų galo rūgšties tirpalams: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 mg/ml. paruošti, naudojamas 70 proc. etanolinis tirpalas.
2 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivėbendrai fenolinių junginių koncentracijai nustatyti [35]
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį (2 pav.):
y = 0,9068x + 0,0617; y = absorbcijos dydis;
x = bendra fenolinių junginių koncentracija, išreikšta GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml. 𝑅2 = 0,996, koreliacijos koeficientas artimas vienetui, todėl galima daryti išvadą, jog metodikos
tiesiškumas yra tinkamas ir bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas S. discolor L. ekstraktuose yra tikslus.
2.6. Tyrimas su laboratorinėmis pelėmis
Tyrimo pradžioje pelės buvo suskirtytos į 5 eksperimentines grupes, kiekvienoje grupėje buvo po 8 peles. 5 eksperimentinės pelių grupės:
1. Pirmoji - kontrolinė grupė. Šioje grupėje esančioms pelėms girdomas fiziologinis tirpalas (0,9 proc. NaCl).
2. Antrajai pelių grupei intragastriniu būdu girdomas S. discolor L. ekstraktas.
3. Trečiajai grupei į pilvo ertmę švirkščiamas AlCl3 tirpalas, praėjus 20 min. intragastriniu būdu
girdomas 10 % etanolinis S. discolor L. ekstraktas.
4. Ketvirtajai grupei į pilvo ertmę švirkščiamas AlCl3 tirpalas.
5. Penktajai grupei intragastriniu būdu girdomas 10 proc. etanolis.
Kiekvienoje grupėje pelės buvo sužymimos pikrino rūgštimi ir sveriamos kas antrą dieną (svoris užrašomas žurnale). AlCl3 tirpalui sušvirkšti į pilvo ertmę naudojamas 1 ml insulininis švirkštas. Tiriamųjų
tipalų zondavimui naudojamas 1 ml švirkštas, prie kurio pritvirtintas specialiai pelėms pritaikytas zondas. Tiriamųjų tirpalų tūriai paskaičiuoti kiekvienai pelei atsižvelgiant į jos kūno masę (10 g pelės kūno masės atitinka 0,1 ml ekstrakto). Eksperimentas truko 21 dieną.
Oksidacinio streso sukėlimui, naudojamas aliuminio chlorido tirpalas, kurio koncentracija parinkta atsižvelgiant į nustatytą vidutinę mirtiną dozę (LD50) remiantis I. Stanevičienės ir benadraautorių gautais
tyrimo rezultatais [36]. Tiriamajam AlCl3 tirpalui pagaminti naudota 7,5 mg aliuminio vienam kūno masės
kilogramui (15 LD50) -kuris buvo tirpinamas 0,9 proc NaCl fiziologiniame tirpale. Aliuminio poveikis pelių
organizme pasireiškia praėjus 20 minučių, dėl to S. discolor L. etanolinis ekstraktas intragastriniu būdu girdomas pelėms praėjus tokiam laiko tarpui po AlCl3 tirpalo injekcijos.
Praėjus 21 eksperimento dienai, laboratorinėms pelėms atliekama cervikalinė dislokacija, dekapitacija ir kraujo surinkimas, vadovaujantis Europos konvencija dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų stuburinių gyvūnų apsaugos. Pelių organai (kepenys ir smegenys) nuplaunami fiziologiniu tirpalu ir dedami į petri lėkšteles ir užšaldomi - 40 °C temperatūroje iki tolimesnių tyrimų.
2.7. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir smegenyse
GSH koncentracija laboratorinių pelių organuose nustatyta taikant J. Sedlak ir kitų bedraautorių metodiką [37]. Visų pirma organas (kepenys arba smegenys) pasveriamas, tuomet dedamas į mėgintuvėlį ir
užpilamas 6 kartus didesniu kiekiu už svorį tūriu 5% trichloracto rūgšties (TchA) tirpalu. Gautas mėginys homogenizuojamas naudojant audiniams skirtą smulkintuvą. Homogenatas centrifuguojamas 1000×g pagreičiu 7 minutes. Gautas supernatantas nupilamas į atskirą mėgintuvėlį ir naudojamas GSH koncentracijos nustatymui.
GSH koncentracijai nustatyti, į mėgintuvėlį pilama 2 ml 0,6 mM DTNB (Elmano reagentas/5,5 ҆-ditio-bis (2-nitrobenzenkarboksirūgštis), 200 µl supernatanto frakcijos bei 800 µl 0,2 M fosfatinio buferio, taip gauname 3 ml mišinio. Koncentracija nustatoma spektrofotometru, esant 412 nm bangos ilgiui. GSH koncentracija pelių organuose išreiškiama µmol/g smegenų/kepenų masės ir apskaičiuojama pagal formulę:
∁µmol/g audinio = A×3×Vgal
2,72×⍵ , kur A – supernatanto sugerties reikšmė ties 412 nm ilgio banga; Skaičiai – koeficientai;
Vgal – tirpalo tūris po centrifugavimo;
⍵ - audinio masė g.
2.8. Malondialdehido koncentracijos nustatymas pelių smegenyse ir kepenyse
MDA koncentracija pelių kepenyse ir smegenyse tiriama remiantis Uchiyama ir Mihara metodika [38]. Atšildyti ir pasverti organai homogenizuojami šaltu KCl 1,15 proc. tirpale 9 tūriais (lyginant su kepenų ir smegenų svoriu). Tyrimui imama 1 dalis organo, ji pasveriama ir dedama į mėgintuvėlį, gautas svoris dauginamas iš 9, taip sužinomas reikalingas KCl kiekis ml, kuris sudaro 9 dalis mišinio. Mišinys homogenizuojamas ir gaunamas 10 proc. homogentas. Vėliau į 0,5 ml homogenato pilame 3 ml 1 proc. H3PO4 (fosforo rūgšties) ir 1 ml tiobarbitūro rūgšties (TBR) vandeninio tirpalo.
Tiriamieji mišiniai sumaišomi ir šildomi 45 min. verdančioje vandens vonioje. Po inkubacijos mišinys 10 min. šaldomas ledo vonioje. Atšaldžius mišinį įpilama 4 ml n-butanolio ir gerai sumaišoma. Butanolio sluoksnis atskiriamas centrifuguojant 10 min. 8000 x g pagreičiu. Pabaigus centrifugavimą viršutinis butanolio sluoksnis nusiurbiamas ir absorbcija nustatoma spektrofotometru, esant 535 ir 520 nm
ilgio bangoms. Gautas skirtumas tarp bangų yra TBR reikšmė, kurios pagalba apskaičiuojama MDA koncentracija (µmol/g) pelių kepenyse ir smegenyse.
Apskaičiuojama pagal formulę:
∁𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑔 =∆O.V.×100000
113
,
kur O.V. - optinių vienetų skirtumas;100000/113 – koeficientas.
2.9. Katalazės aktyvumo nustatymas pelių kepenyse ir smegenyse
Katalazės aktyvumas laboratorinių pelių kepenų ir smegenų homogenatuose nustatomos remiantis Rachmanovos ir bendraautorių metodika [22]. Reakcijai sustabdyti naudojamas amonio molibdatas, kuris reaguodamas su vandenilio peroksidu sudaro geltonos splavos kompleksinį junginį. Tiriamajam buferio – substrato mišiniui („B-S“) paruošti pilama 50 mM Tris – HCl (pH 7,4) buferio, 30 ml 0,08 proc. vandenilio peroksido bei 100 μl homogenato („HF”). Gautas mišinys inkubuojamas 37 ºC vandens vonioje 1 min. su kepenų homogenato mėginiu ir 3 min. su smegenų homogenato mėginiu. Reakcija sustabdoma 2 ml 4,5 proc. amonio molibdato tirpalu. Susidariusios geltonos spalvos komplekso sugertis matuojama spektrofotometru ties 410 nm bangos ilgiu.
Lyginamajam tirpalui paruošti, naudojama 1ml „B-S“, 3 ml dejonizuoto vandens ir 100 μl „HF”. Gautas mišinys inkubuojamas 37 ºC vandens vonioje, 3min.
Katalazės aktyvumas pelių organuose nustatomas apskaičiuojamas pagal formulę:
A = (Ek − Eb) × 12 × 10
3 × 4,1 × 106
22,2 × 106 × 3 (t)
kur,
A – katalazės aktyvumas (Vnt./g); Ek – sugertis (kontrolės mėginio vidurkis); Eb – sugertis (bandymo mėginio vidurkis); 12×103 – praskiedimo faktorius; 4,1×106 – perskaičiavimo į mikromolius
koeficientas; 22,2×106 – H2O2 moliarinės ekstinkcijos koeficientas; 3 (t) – inkubacijos laikas min.
Inkubacijos laikas priklauso nuo „HF“ šaltinio (kepenų „HF“ atveju – 1 min., o smegenų „HF“ atveju - 3 min. ).
2.10. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas
Tyrimo metu gautų duomenų analizė atlikta naudojant MS Excel (Microsoft, JAV) ir SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV) kompiuterines programas. Visi atlikti tyrimai pakartoti aštuonis kartus ir išvestas gautų rezultatų matematinis vidurkis. Apskaičiuotas tyrimo duomenų standartinis nuokrypis (SNN), regresijos bei koreliacijos koeficientas.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Sorbus discolor L. ekstraktuose
Bendras fenolinių junginių kiekis buvo nustatinėjamas septyniose Sorbus L. rūšyse. Išmatavus pagamintų tirpalų absorbciją spektrofotometru (esant 750 nm bangos ilgiui), buvo gauti tokie rezultatai: S.
semi-incisa – 0,170 mg/ml, S. aranensis – 0,170 mg/ml, S. discolor – 0,259 mg/ml, S. caucasica – 0,143
mg/ml, S. hostii – 0,079 mg/ml, S. aria – 0,107 mg/ml, S. gracilis – 0,233 mg/ml (2 paveikslėlis). Iš turimų duomenų galime spręsti, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas Sorbus discolor L. žaliavose.
2 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/ml) Sorbus L. ekstraktuose
Remiantis K. Gaivelytės darbe atliktu fenolinių junginių sudėties įvairavimo tyrimu, nustatyta, kad spalvingųjų šermukšnių žiedų ėminiuose nustatytas didesnis už vidutinį chlorogeno rūgšties, rutino ir astragalino kiekis lyginant su kitomis šermukšnių rūšimis. S. discolor L. rūšių vaisių ėminiuose aptiktas didžiausias kiekis rutino. Taip pat didelis kiekis chlorogeno rūgšties, kiek mažiau neochlorogeno rūgšties, hiperozido ir izokvercitrino. Tiriant lapų ėminius nustatytas didžiausias chlorogeno rūgšties ir rutino kiekis, lyginant su kitomis šermukšnių rūšimis [9].
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 B en d ra f en oli n ių jun gin ių k on ce n tr ac ija, išr eik šta G RE m g/m l.
Remiantis literatūros duomenimis, fenoliniai junginiai veikia kaip antioksidantai ir taip padeda apsisaugoti nuo oksidacinio streso sukeliamų ligų. Tad norint ištirti Sorbus discolor L. antioksidacines savybes, ekstrakto gamybai pasirinkome ekstrakciją ultragarso vonelėje 20 min, o kaip ekstrahentą naudojome 50 proc. etanolį [9]. Velėsniuose tyrimuose su pelėmis, šermukšnių ekstrakto galimam antioksidacinio poveikio nustatymui, ekstraktas praskiestas iki 10 proc.
3.2. S. discolor L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių smegenyse
Malondialdehido (MDA) koncentracija pelių smegenyse įvertinta po 21 dieną trukusio tyrimo, kurio metu kiekvieną dieną Sorbus discolor L. ekstraktas buvo įvedamas tiesiai į pelių skrandį. Gautos MDA koncentracijos, tiriant S. discolor L. ekstrakto poveikį pelių smegenų mėginiuose, pateiktos 3 paveikslėlyje.
3 pav. Malondialdehido koncentracija (µmol/g baltymo) pelių smegenyse
# – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe.
Malondialdehido koncentracija smegenyse kontrolinėje pelių grupėje siekė 26,77± 3,81 µmol/g. Gautų rezultatų duomenimis, veikiant AlCl3 tirpalu MDA koncentracija pelių smegenyse statistiškai
reikšmingai sumažėjo 17 proc., lyginant su kontroline pelių grupe ir siekė 22,28 ± 2,83 µmol/g. Grupėje, kurioje pelės buvo girdomos 10 proc. Etanoliu, nustatyta 51,1 ± 2,22 µmol/g MDA koncentracija
smegenyse, kuri buvo 52 proc. (p ≤ 0,05) didesnė nei kontrolinėje grupėje. Sorbus discolor L. ekstraktu girdomų pelių smegenyse MDA koncentracija statistiškai reikšmingai padidėjo 38 proc. lygininat su kontroline grupe ir siekė 37,17 ± 2,58 µmol/g. Nors ir ekstrakto sudėtyje yra etanolio, kuris stipriai padidino malondialdehido koncentraciją pelių smegenyse, tačiau ekstraktu girdomų pelių MDA koncentracija, lyginant su 10 proc. etanoliu girdomų pelių grupe, buvo artimesnė kontrolinei grupei. Pelių smegenyse, kurioms 21 dieną buvo injekuojamas AlCl3, o praėjus 20 minučių sugirdomas Sorbus discolor L. ekstraktas,
MDA koncentracija padidėjo 23 proc. (p ≤ 0,05), lyginant su kotroline grupe ir siekė 32,92 ± 3,00 µmol/g. Tą pačią grupę lyginant su pelių, kurioms buvo švirščiamas AlCl3 tirpalas, grupe, nustatytas statistiškai
reikšmingas MDA koncentracijos padidėjimas (32,2 proc.).
Malondialdehidas yra lipidų peroksidacijos galutinis produktas ir yra laikomas vienu reikšmingiausiu oksidacinio proceso eigos žmogaus organizmo ląstelių žymeniu [39]. Atliktų tyrimų duomenimis, aliuminio druskos, pvz. AlCl3, veikia neurotoksiškai, sukeldamas oksidacinį stresą ir manoma,
kad turi didelės įtakos tokių ligų kaip Alzheimeris, Parkinsonas atsiradimui [40]. Aliuminio jonai sumažina bendrą antioksidantų kiekį pelių smegenyse, dėl ko prasideda lipidų peroksidacija ir padidėja H2O2 gamyba
[26], [40]. Mūsų atlikto tyrimo metu nustatytas priešingas aliuminio poveikis MDA lygiui, lyginant su I. Stanevičienės atliktu tyrimu, kurio metu nustatyta, kad po 14 dienų MDA koncentracija pelių smegenyse, kurios buvo veikiamos AlCl3, padidėjo 17 proc., lyginant su kontroline grupe [36].
Nors mūsų tyrimo metu gauti aliuminio poveikio MDA koncentracijai rezultatai nesutampa su kitų autorių duomenimis, tačiau galime daryti išvadą, kad Sorbus discolor L. ekstraktas pasižymi antioksidaciniu poveikiu, nes atstatė ir statistiškai reikšmingai padidino MDA koncentraciją, kuri AlCl3 poveikyje buvo
sumažėjusi.
3.3. S. discolor L. ekstrakto poveikis malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse
Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse įvertinta po 21 dieną trukusio eksperimento, kurio metu kiekvieną dieną Sorbus discolor L. ekstraktas buvo įvedamas tiesiai į pelių skrandį. Gautos MDA koncentracijos, tiriant S. discolor L. ekstrakto poveikį pelių kepenų mėginiuose, pateiktos 4 paveikslėlyje.
Kontrolinėje grupėje malondialdehido koncentracija siekė 108,85 ± 27,28 µmol/g. MDA koncentracija pelių kepenyse, kurioms buvo injekuojamas AlCl3 tirpalas į pilvo ertmę, lyginant su kontroline
grupe, sumažėjo 89 proc. (p ≤ 0,05) ir siekė 11,63 ± 1,53 µmol/g. 10 proc. etanoliu girdytų pelių kepenyse nustatyta 87,10 ± 4,06 µmol/g malondialdehido koncentracija, kuri buvo 20 proc. statististiškai reikšmingai
mažesnė lyginant su kontroline grupe. S. Discolor L. ekstraktu girdomų pelių grupėje MDA koncentracija, lyginant su kotroline grupe, sumažėjo 43 proc. (p ≤ 0,05) ir siekė 62,20 ± 16,89 µmol/g. Pelių, kurioms buvo suleidžiamas AlCl3 tiesiai į pilvo ertmę, o praėjus 20 minučių sugirdomas Sorbus discolor L.
ekstraktas, kepenų mėginiuose MDA kiekis siekė 94,69 ± 31,16 µmol/g, kas rodo, kad koncentracija statistiškai nereikšmingai sumažėjo 13 proc., lyginant su kontroline grupe. Tą pačią grupę lyginant su pelių, kurioms buvo leidžiamas aliuminio chlorido tirpalas, MDA koncentracija padidėjo 87,7 proc. (p ≤ 0,05).
4 pav. Malondialdehido koncentracija (µmol/g baltymo) pelių kepenyse
# – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe.
Nustatyta, kad aliuminis sukelia hematobiocheminių parametrų pokyčius, padidindamas lipidų peroksidaciją ir taip sumažindamas antioksidacinių fermentų aktyvumą plazmoje ir audiniuose. Per didelis ADJ susidarymas sužadina hepatocitų apoptozę, kurios metu vyksta negrįžtama proteolizinių baltymų kaspazių aktyvacija, dėl ko išeikvojami endogeniniai antioksidaciniai fermentai [41]. Daugumoje kitų autorių atliktų tyrimų metu nustatyta, kad aliuminio poveikyje MDA koncentracija pelių kepenyse padidėja, lyginant su kontroline grupe [41], [42].
Mūsų eksperimento metu, sumažėjusi MDA koncentracija prieštarauja literatūros duomenims, tačiau gautų rezultatų duomenimis galime teigti, kad tiriamasis Sorbus discolor L. ekstraktas pasižymi antioksidaciniu poveikiu, nes juo girdomų pelių kepenyse MDA koncentracija statistiškai reikšmingai padidėjo ir tapo artima kontrolinei grupei.
# # # # 0 20 40 60 80 100 120 140
Kontrolė 10% Etanolis S. Discolor L. S. Discolor L. + AlCl3 AlCl3
M DA k on ce n tr ac ija µ m ol/ g
3.4. S. discolor L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių
smegenyse
Redukuoto glutationo (GSH) koncentracija pelių smegenyse įvertinta po 21 dieną trukusio eksperimento, kurio metu kiekvieną dieną Sorbus discolor L. ekstraktas buvo įvedamas tiesiai į pelių skrandį. Gautos GSH koncentracijos, tiriant S. discolor L. ekstrakto poveikį pelių smegenų mėginiuose, pateiktos 5 paveikslėlyje.
5 pav. Redukuoto glutationo koncentracija (µmol/g baltymo) pelių smegenyse
# – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe.
Pateiktoje diagramoje galime matyti, kad kontrolinėje pelių grupėje GSH koncentracija siekė 0,25 ± 0,02 µmol/g. Pelių smegenyse, kurioms buvo injekuojami aliuminio jonai, GSH koncentracija, lyginant su kontroline grupe, sumažėjo 48 proc. (p ≤ 0,05) ir siekė 0,13 ± 0,01 µmol/g. Grupėje pelių, kurios buvo girdomas etanolis, GSH kiekis statistiškai reikšmingai išaugo 470 proc. ir siekė 1,18 ± 0,02 µmol/g. Tuo tarpu girdant peles Sorbus discolor L. ekstraktu nustatyta GSH koncentracija 0,29 ± 0,01 µmol/g, kuri yra didesnė 16 proc. (p ≤ 0,05), lyginant su kotroline grupe. Po 21 dieną trukusio tyrimo nustatyta, kad pelių smegenyse, kurioms buvo injekuojamas AlCl3 tirpalas į pilvo ertmę, o praėjus 20 minučių sugirdomas
šermukšnio ekstraktas, GSH koncentracija išliko tokia pati, kaip ir kontrolinėje grupėje (0,25 ± 0,04 µmol/g), tačiau šis skirtumas statistiškai nėra reikšmingas. Šią grupę lyginant su pelių, kurioms buvo švirkščiamas AlCl3 tirpalas, grupe, nustatytas reikšmingas GSH koncentracijos padidejimas (48 proc.).
# # # 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Kontrolė 10% Etanolis S. Discolor L. S. Discolor L. + AlCl3 AlCl3 G SH k on cen tr aci ja µ m ol /g
Oksidacinio streso sukelimui naudojamas aliuminis, kuris pritraukia elektroną iš šalia esančių molekulių (glutationo, kuris atiduoda elektroną), dėl šios savybės aliuminis yra giminingas GSH. Glutationui, atidavus elektroną, susidaro GSH ir jo kiekis stipriai sumažėja kraujyje. Oksiduotas glutationas, reduktazės metu sugražinamas į GSSG, tam naudojamas NADPH. Sutrikdžius šį procesą, pasireiškia toksinis metalo poveikis organizmui [14]. I. Stanevičienės ir kitų bendraautorių 14 dienų trukusiame eksperimente nenustatyti statistiškai reikšmingi GSH koncentracijos pokyčiai pelių smegenyse, kurioms buvo injekuojamas AlCl3 [36].
Mūsų tyrimo metu nustatyta, kad 21 dieną trukusi intoksikacija aliuminiu sukėlė statistiškai reikšmingą redukuoto glutationo koncentracijos sumažėjimą. Pelių smegenyse Sorbus discolor L. ekstraktas pasižymėjo antioksidaciniu poveikiu, nes GSH koncentracija atsistatė iki kontrolinių pelių smegenyse nustatyto GSH kiekio.
3.5. S. discolor L. ekstrakto poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių
kepenyse
Redukuoto glutationo koncentracija pelių kepenyse įvertinta po 21 dieną trukusio tyrimo, kurio metu kiekvieną dieną Sorbus discolor L. ekstraktas buvo įvedamas tiesiai į pelių skrandį. Gautos GSH koncentracijos, tiriant S. discolor L. ekstrakto poveikį pelių kepenų mėginiuose, pateiktos 6 paveikslėlyje.
Redukuoto glutationo koncentracija pelių kepenyse, kurioms į pilvo ertmę buvo švirščiamas AlCl3
tirpalas, nustatyta 0,36 ± 0,04 µmol/g ir buvo 82 proc. (p ≤ 0,05) mažesnė nei kontrolinėje grupėje. Pelių
grupėje, kurios buvo girdomos 10 proc. etanoliu, GSH koncentracija, lyginant su kontroline grupe, statistiškai reikšmingai padidėjo 285 proc. ir siekė 5,6 ± 0,17 µmol/g. Pelių smegenyse, kurioms girdytas
Sorbus discolor L. ekstraktas, GSH kiekis sumažėjo 26 proc. (p ≤ 0,05) ir siekė 1,46 ± 0,03 µmol/g. Sorbus discolor L. + AlCl3 grupėje nustatyta redukuoto glutationo koncentracija siekė 2,00 ± 0,04 µmol/g, tačiau
skirtumas, lyginant su kontroline grupe, statistiškai nėra reikšmingas. Tą pačią grupę lyginant su pelių, kurios buvo veikiamos aliuminio chlorido tirpalu, GSH koncentracija padidėjo 87,7 proc. (p ≤ 0,05).
6 pav. Redukuoto glutationo koncentracija (µmol/g baltymo) pelių kepenyse
# – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe.
Kitų autorių atliktuose tyrimuose, AlCl3 paveiktų pelių grupėje nustatytas GSH koncentracijos
sumažėjimas kepenyse [41], [42]. Mūsų atlikto eksperimento metu, redukuoto glutationo koncentracija taip pat statistiškai reikšmingai sumažėjo, lyginant su kontroline grupe.
Gautų rezultatų duomenimis, pelių kepenyse, kurios buvo girdomos šermukšnio ekstraktu, GSH koncentracija statistiškai reikšmingai padidėjo, lyginant su AlCl3 grupe. Dėl to galime daryti išvadą, kad Sorbus discolor L. ekstraktas veikia kaip antioksidantas, nes jo poveikyje GSH koncentracija padidėjo ir
tapo artimesnė koncentracijai, nustatytai kontrolinėje pelių grupėje.
3.6. S. discolor L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių smegenyse
Katalazės (CAT) aktyvumas pelių smegenyse įvertintas po 21 dieną trukusio tyrimo, kurio metu kiekvieną dieną Sorbus discolor L. ekstraktas buvo įvedamas tiesiai į pelių skrandį. Gautas katalazės aktyvumas, tiriant S. discolor L. ekstrakto poveikį pelių smegenų mėginiuose, pateiktas 7 paveikslėlyje.
Kontrolinėje pelių grupėje katalazės aktyvumas smegenyse siekė 122,38 ± 3,79 vnt/mg. Pelių, kurioms buvo leidžiamas AlCl3 tirpalas, katalazės aktyvumas siekė 69,19 ± 7,01vnt/mg, kuris yra 43 proc.
(p ≤ 0,05) mažesnis, lyginant su kontroline grupe. Pelių grupėje, kurioje gyvūnai girdyti 10 proc. etanoliu, katalazės aktyvumas statistiškai reikšmingai sumažėjo 47 proc., lyginant su kontroline grupe, ir siekė
# # # 0 1 2 3 4 5 6 7
Kontrolė 10% Etanolis S. Discolor L. S. Discolor L. + AlCl3 AlCl3 G S H k on ce n tr ac ija µ m ol/ g
65,51 ± 10,58 vnt/mg. Šermukšnių ekstraktu girdomų pelių grupėje katalazės aktyvumas siekė 92,76 ± 5,73 vnt/mg, kas parodo, jog lyginant su kontroline grupe CAT aktyvumas sumažejo 24 proc. (p ≤ 0,05) lyginant su kontroline grupe. Pelių smegenyse, kurioms 20 min. po AlCl3 tirpalo sušvirkštimo,
buvo girdomas šerkmukšnių ekstraktas, CAT aktyvumas statistiškai reikšmingai sumažėjo 26 proc., lyginant su kontrole, ir siekė 90,86 ± 4,71 vnt/mg, o lyginant su AlCl3 paveikų pelių grupe, CAT aktyvumas
padidėjo 23,8 proc. (p ≤ 0,05).
7 pav. Katalazės aktyvumas (vnt/mg baltymo) pelių smegenyse
# – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe.
Jangra ir kitų autorių tyrimuose nustatytas katalazės fermento aktyvumo sumažėjimas pelių smegenų hipokampe, kurį sukelia AlCl3. Sumažėjęs CAT aktyvumas lemia H2O2 kaupimąsi, nes
deaktyvuota katalazė negali jų suskaidyti į vandenį ir deguonį, o tai lemia hidroksilo radikalų susidarymą. To pasekoje yra sukeliamas oksidacinis stresas, kuris nulemia įvairius smegenų ląstelių pažeidimus [43], [44].
Mūsų atliktame eksperimente taip pat nustatytas CAT aktyvumo sumažėjimas, lyginant su kontroline grupe. Sorbus discolor L. ekstraktas pasižymėjo antioksidaciniu poveikiu pelių smegenyse statistiškai reikšmingai padidindamas CAT aktyvumą, kuris tapo artimesnis kontrolės rodikliui.
# # # # 0 20 40 60 80 100 120 140
Kontrolė 10% Etanolis S. Discolor L. S. Discolor L. + AlCl3 AlCl3 CA T , Vnt/m g (bal tym o)
3.7. S. discolor L. ekstrakto poveikis katalazės aktyvumui pelių kepenyse
Katalazės aktyvumas pelių kepenyse įvertintas po 21 dieną trukusio eksperimento, kurio metu kiekvieną dieną Sorbus discolor L. ekstraktas buvo įvedamas tiesiai į pelių skrandį. Gautas katalazės aktyvumas, tiriant S. discolor L. ekstrakto poveikį pelių kepenų mėginiuose, pateiktas 8 paveikslėlyje.
8 pav. Katalazės aktyvumas (vnt/mg baltymo) pelių kepenyse
# – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe.
Kontrolinėje pelių gupėje, CAT aktyvumas siekia 607,06 ± 45,07 vnt/mg. Grupėje, kurioje pelės buvo veikiamos AlCl3, katalazės aktyvumas siekė 403,12 ± 10,04 vnt/mg ir buvo 34 proc. (p ≤ 0,05)
mažesnis nei kontrolinėje grupėje. Etanoliu girdytų pelių kepenyse nustatytas 613,59 ± 41,33 vnt/mg CAT aktyvumas, kuris buvo 1,06 proc. didesnis nei kontrolinėje grupėje, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nesudarė. Sorbus discolor L. ekstraktu girdomų pelių grupėje, nustatytas 573,63 ± 54,63 vnt/mg katalazės aktyvumas, kuris buvo mažesnis (5,82 proc., p > 0,05), lyginant su kontroline grupe. Šermukšnio ekstaktas + AlCl3 grupėje, CAT aktyvumas, lyginant su kontroline grupe, sumažėjo 0,9 proc. ir siekė
601,70 ± 69,01 vnt/mg, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta, bet lyginant su AlCl3 grupe,
CAT aktyvumas padidėjo 33 proc.
Kaip ir kitų autorių seniau atliktuose tyrimuose, taip ir mūsų eksperimente nustatytas reikšmingas CAT aktyvumo sumažėjimas pelių kepenyse, kurios buvo veikiamos aliuminiu [43], [44]. Po 21 dieną trukusio tyrimo, galime daryti išvadą, kad šermukšnių ekstraktas pasižymėjo antioksidaciniu poveikiu, nes sugebėjo atstatyti katalazės aktyvumą iki kontrolinių pelių kepenyse aptinkamų šių parametrų lygio.
# 0 100 200 300 400 500 600 700
Kontrolė 10% Etanolis S. Discolor L. S. Discolor L. + AlCl3 AlCl3 CA T , Vnt/m g (bal tym o)
3.8. Rezultatų apibendrinimas
Atliktų tyrimų metu nustatėme, kad Sorbus discolor L. ekstraktas pasižymi antioksidaciniu poveikiu, nes jo sudėtyje gausu biologiškai aktyvių junginių, tokių kaip fenoliai, flavanoidai ir kt. Taip pat atlikus tyrimus su pelėmis, kurie truko 21 dieną, nustatėme, kad daugeliu atveju po AlCl3 sukelto oksidacinio
streso tiriamasis spalvingųjų šermukšnių ekstraktas sugebėjo statistiškai reikšmingai atstatyti MDA ir GSH koncentraciją bei CAT aktyvumą iki normos ribų, lyginant su kontrolinėmis grupėmis.
