Cinko jonų poveikis redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms švinu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse ir eritrocituose

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

Evelina Nekraševičiūtė

Cinko jonų poveikis redukuoto glutationo ir malondialdehido

koncentracijoms švinu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse ir

eritrocituose

Magistro baigiamasis darbas

Studijų programa: Medicina Vadovas: dr. Jurgita Šulinskienė

2

TURINYS

1. SANTRAUKA ... 3

2. SUMMARY ... 4

3. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 5

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5

5. SANTRUMPOS ... 6

6. ĮVADAS ... 7

7. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8

8. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

8.1 Aktyvios deguonies formos ir ląstelių antioksidacinės apsaugos sistema ... 9

8.2 Sunkiųjų metalų poveikis organizmui ... 11

8.3 Cinko savybės ir antioksidacinis poveikis ... 13

9. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI ... 15

9.1 Tyrimo objektas ir reagentai ... 15

9.2 Metalų poveikio laboratoriniams gyvūnams tyrimo modelis ... 16

9.3 Tyrimų metodai ... 17

9.3.1 Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas ... 17

9.3.2 Malondialdehido koncentracijos nustatymas ... 17

9.3.3 Duomenų patikimumo įvertinimas ... 18

10. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 19

11. IŠVADOS ... 24

3

1. SANTRAUKA

Darbo pavadinimas - Cinko jonų poveikis redukuoto glutationo ir malondialdehido

koncentracijoms švinu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse ir eritrocituose.

Darbo tikslas buvo įvertinti cinko jonų galimą apsauginį poveikį redukuoto glutationo (GSH) ir

malondialdehido (MDA) koncentracijoms švino jonais paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose.

Iškelti uždaviniai: nustatyti švino poveikį GSH ir MDA koncentracijoms pelių kepenyse ir

eritrocituose, bei įvertinti cinko jonų įtaką pelių kepenų ir eritrocitų antioksidacinei būsenai bei lipidų peroksidacijai (LPO), esant švino poveikiui.

Tyrimo metodai. Metalų jonų poveikiui įvertinti pelėms kasdien į pilvo ertmę švirkštėme

Pb(CH3COO)2 (48 μmol Pb/kg) ar/ir ZnSO4 (24 μmol Zn/kg) druskų tirpalus, kontrolinėms švirkštėme

fiziologinį tirpalą. GSH koncentraciją nustatėme pagal spalvoto junginio susidarymą reakcijoje su Elmano reagentu, MDA kiekis nustatytas pagal spalvoto junginio reakcijoje su tiobarbitūro rūgštimi susidarymą.

Gauti rezultatai parodė, jog 14 dienų švino poveikis sumažino GSH koncentraciją pelių kepenyse ir eritrocituose atitinkamai 30% ir 27%, lyginant su kontrolinių pelių grupe (p<0,05). ZnSO4

sušvirkštimas įtakos GSH koncentracijoms nei kepenyse, nei eritrocituose neturėjo. ZnSO4, sušvirkštas 20

min prieš Pb(CH3COO)2 tirpalo sušvirkštimą, neapsaugojo pelių kepenų nuo švino toksiškumo

sumažindami GSH koncentraciją 47% (p<0,05), lyginant su kontrolinių pelių grupe, tačiau iš dalies apsaugojo eritrocitų GSH nuo Pb sukelto išeikvojimo ir padidino šį parametrą 9%. Po 14 dienų poveikio švinas statistiškai reikšmingai 29% ir 45% padidino MDA koncentracijas pelių kepenyse ir eritrocituose. Zn jonai įtakos lipidų oksidacijai nei kepenyse, nei eritrocituose neturėjo, o sušvirkšti 20 min prieš Pb(CH3COO)2 tirpalo sušvirkštimą, nors neatstatė MDA iki kontrolės lygio, tačiau 10% (p>0,05)

sumažino LPO kepenyse ir statistiškai reikšmingai (19%) sumažino MDA koncentraciją eritrocituose.

Išvados: švinas mažino GSH koncentraciją bei didino MDA koncentraciją pelių kepenyse ir

eritrocituose. Cinko jonai neapsaugojo pelių kepenų nuo švino sukelto GSH išeikvojimo, tačiau dalinai apsaugojo eritrocitų GSH nuo švino toksiškumo. Apsauginis cinko poveikis prieš švino sukeltą LPO nustatytas pelių kepenyse ir eritrocituose.

4

2. SUMMARY

Title of the research – The effect of zinc ions on the content of reduced glutathione and

malondialdehyde in lead treated laboratory mice liver and erythrocytes.

The aim of this study was to determine the ability of zinc ions to protect reduced glutathione

(GSH) from depletion and lipids from peroxidation in lead treated mice liver and erythrocytes.

The tasks was to identify the effect of lead exposure on the content of GSH and

malondialdehyde (MDA) in mice liver and erythrocytes and to evaluate the impact of zinc ions on the antioxidant status and lipid peroxidation (LPO) of lead treated mice liver.

Research methods. Three mice groups were given daily intraperitoneal administration of

Pb(CH3COO)2 (48 μmol Pb/kg) or/and ZnSO4 (24 μmol Zn/kg) solutions. Control group received

injections of saline. GSH levels were determined according to color reaction with Elman's reagent, MDA content was determined according to the colored compound with thiobarbituric acid.

The results showed that 14 days exposure to lead decreased GSH levels in mice liver and

erythrocytes by 30% and 27% respectively, as compared to control mice (p<0.05).ZnSO4injections didn’t

affect content of GSH neither in liver nor in red blood cells of mice. ZnSO4 injected 20 minutes before

Pb(CH3COO)2 injection did not protect liver from lead toxicity and reduced GSH by 47% (p<0.05), as

compared with the control group of mice, however partially protected erythrocytes GSH from Pb-induced depletion and increased this parameter by 9%. Two weeks exposure to lead statistically significantly increased contents of liver and erythrocytes MDA by 29% and 45% respectively, as compared to control. Zn ions did not affect lipid oxidation neither in the liver nor in red blood cells. ZnSO4 injected 20 minutes

before Pb(CH3COO)2 injection partly (by 10%) attenuated toxicity of lead on mice liver and statistically

significantly (by 19%) reduced MDA levels in erythrocytes.

Conclusions: Lead decreased GSH and increased MDA content in liver and erythrocytes of

mice. Zinc did not protect GSH in mice liver, but increased GSH levels in erythrocytes. The protective effects of zinc against lead induced LPO were detected in liver and erythrocytes of mice.

5

3. INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2012-02-09 posėdžio protokolo Nr. 1 teigiama išvada buvo gautas leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais (leidimo Nr. 0221).

6

5. SANTRUMPOS

δ-ALR δ-aminolevulino rūgštis

δ-ALRD δ-aminolevulino rūgšties dehidratazė

DTNB Elmano reagentas 5,5`-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis)

GR glutationo reduktazė GSH redukuotas glutationas GSHPX glutationo peroksidazė GSSG oksiduotas glutationas G-6-PDH gliukozės-6-fosfatdehidrogenazė GST glutationo-S-transferazė KAT katalazė

LD50 vidutinė mirtina dozė

LPO lipidų peroksidinė oksidacija

MDA malondialdehidas

SOD superoksido dismutazė

TBR tiobarbitūro rūgštis TChA trichloracto rūgštis

7

6. ĮVADAS

Oksidacinis stresas – organizmo būklė, atsirandanti sutrikus pusiausvyrai tarp aktyvių deguonies formų (ADF) susidarymo ir antioksidacinės sistemos gebos jas neutralizuoti. [1, 2] Tokia būsena pasiekiama tuomet, kai, sumažėjus antioksidacinės sistemos fermentų aktyvumui arba išeikvojus antioksidacines molekules, organizme sparčiai didėja ADF kiekis. [3] ADF susidaro dėl įvairių priežasčių, tokių kaip ligos, vitaminų ar mineralų stoka, senėjimas ir kai kurių sunkiųjų metalų poveikis. Jos oksiduoja baltymus, lipidus bei nukleino rūgštis, taip pažeisdamos įvairius audinius ir sukeldamos sveikatos sutrikimus. [2]

Sunkieji metalai, pagal pavojingumą sveikatai, priskiriami prie toksiškiausių ir labiausiai pavojingų aplinkos veiksnių. [4] Vienas svarbiausių jų toksinio poveikio mechanizmų yra laisvųjų radikalų gamyba, sutrikdanti pusiausvyrą tarp oksidantų ir antioksidantų. [5] Nors žinoma apie neigiamą sunkiųjų metalų poveikį žmogui, kontaktas su šiais metalais tebesitęsia ir šiandieną. [4] Dalis jų yra mikroelementai ir tam tikrais kiekiais būtini normaliai organizmo veiklai palaikyti. [6] Tačiau kiti metalai neatlieka jokios biologinės funkcijos. [7] Dėl gausaus švino naudojimo industrializacijos laikotarpiu tarša šiuo sunkiuoju metalu ir šiomis dienomis tebėra aktuali problema. [8] Švinas blokuoja sulfhidrilines grupes, taip slopindamas įvairių fermentų veiklą, konkuruoja su kitais organizmui būtinais metalais, sutrikdo baltymų, angliavandenių ir kitų biomolekulių apykaitą organizme, skatina ADF susidarymą bei apoptozę. [4, 6] Patekę į organizmą net maži šio metalo kiekiai kaupiasi ir ilgainiui sukelia įvairius sveikatos sutrikimus. [9]

Sunkusis metalas cinkas yra svarbus mikroelementas, netiesioginis antioksidantas bei kai kurių toksiškų metalų antagonistas. [9] Cinkas teigiamai veikia imuninę sistemą bei turi neuroprotekcinių savybių. [7, 11]

Sunkiųjų metalų koncentracija bei jų tarpusavio sąveika turi įtakos biologiniam šių metalų poveikiui organizmui. Šiuo metu dar mažai žinoma apie kompleksišką švino ir cinko poveikį, todėl bus įvertintas cinko jonų galimas apsauginis poveikis prieš švino sukeltą oksidacinį stresą. Darbe bus nustatytas kompleksinis šių metalų jonų poveikis viduląstelinio antioksidanto GSH bei LPO žymens MDA koncentracijoms. Gauti duomenys leis detaliau suprasti cinko pajėgumą apsaugoti organizmą nuo toksinio švino poveikio.

Tikslas: Įvertinti cinko jonų galimą apsauginį poveikį GSH ir MDA koncentracijoms švino jonais paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose.

8

7. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Įvertinti cinko jonų galimą apsauginį poveikį redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms švino jonais paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose.

Uždaviniai:

1. Nustatyti švino poveikį redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose. 2. Įvertinti švino poveikį malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose.

3. Įvertinti cinko jonų įtaką pelių kepenų ir eritrocitų antioksidacinei būsenai ir lipidų peroksidacijai, esant švino poveikiui.

9

8. LITERATŪROS APŽVALGA

8.1 Aktyvios deguonies formos ir ląstelių antioksidacinės apsaugos sistema

Gyvame organizme nuolat vyksta daugybė cheminių reakcijų, vienos jų - oksidacijos - redukcijos reakcijos yra gyvybiškai svarbios ląstelių funkcijų palaikymui ir žalingų junginių detoksikavimui. [2] Biologinėse redokso reakcijose, dažniausiai dalyvaujant fermentams, vienas junginys, netekdamas elektronų, yra oksiduojamas, kitas, prijungęs elektronus, tampa redukuotu. [2] Pusiausvyra tarp oksiduotų ir redukuotų junginių organizme vadinama redokso būsena. [2] Sveikose ląstelėse ši pusiausvyra palaikoma natūralios, endogeninių antioksidantų apsaugos, neutralizuojančios laisvuosius radikalus. [2] Junginiai, turintys vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų ir dėl to būdami reaktyvūs, vadinami laisvaisiais radikalais. [3, 12] Tokiems junginiams priskiriamos ADF, aktyvios azoto formos, taip pat hipochloro rūgštis, lipidų peroksidų radikalai ir kt. [13]

Normaliomis sąlygomis laisvieji radikalai organizme nuolatos susidaro kaip metabolizmo produktai. [2] Dauguma ADF organizme susidaro biologinės oksidacijos metu mitochondrijose nepilnai redukuojant O2. [2] Pirmasis dalinės O2 redukcijos produktas - superoksido radikalas, susidaro prie

deguonies prijungiant tik vieną iš dviejų elektronų. [12] Veikiant antioksidantinės apsaugos sistemos fermentui superoksido dismutazei (SOD), superoksido radikalas yra paverčiamas vandenilio peroksidu. [12, 14] Vėliau vykstančiose Fenton ir Haber-Weiss reakcijose, dalyvaujant pereinamosios būsenos metalams (dažniausiai geležiai), vandenilio peroksidas redukuojamas susidarant ypač didelio aktyvumo hidroksilo radikalui. [2, 12]

Mažus laisvųjų radikalų kiekius evoliucijos eigoje gyvieji organizmai prisitaikė panaudoti tokioms biologinėms funkcijoms kaip: apoptozės valdymas, ląstelių gynyba, kraujagyslių tonuso reguliacija ir kt., tačiau dideli ADF kiekiai pažeidžia organizmo redokso pusiausvyrą. [2] Literatūroje nurodoma, jog ADF susidarymą taip pat skatina organizmo patiriamas stresas – hipoksija, nepilnavertė mityba, infekcijos, uždegiminiai procesai ir kt. [14] Rūkymas, teršalų poveikis, ozonas, hiperoksija, sunkieji metalai, radiacija – išoriniai ADF susidarymą skatinantys veiksniai. [3]

Redokso būsenos organizme pakitimai lemia neurologinių ir psichiatrinių sutrikimų vystymąsi bei progresavimą. [2] Dėl mitochondrijų disfunkcijos atsiradę oksidaciniai pažeidimai siejami su neurologiniais ir psichiatriniais sutrikimais, tokiais kaip: Alzheimerio liga, bipoliniu sutrikimu, didžiąja depresija, šizofrenija, Huntingtono liga ir šonine amiotrofine skleroze. [2, 3] Literatūroje nurodoma, jog

10

organizme susidarę laisvieji radikalai sąveikauja su DNR, lipidais ir baltymais, sukeldami šių biomolekulių pažaidas ir sutrikdydami jų funkcijas. [2]

Įvairūs in vitro tyrimai rodo, jog laisvųjų radikalų organizme sukelta LPO yra susijusi su įvairių citotoksiniu, kancerogeniniu, mutageniniu poveikiu pasižyminčių oksidacijos produktų susidarymu. [6] MDA yra galutinis ir labiausiai mutageniškas LPO produktas, tai geras laisvųjų radikalų sukeltų pažeidimų ir oksidacinio streso žymuo. [15] Ląstelių membranose susidaręs MDA toliau gali oksiduoti baltymus, fosfolipidus, nukleino rūgštis, tokiu būdu sukeldamas struktūrinius pakitimus, pažeidžiančius imuninę sistemą. [15]

Būklė, kuomet organizme sutrinka pusiausvyra tarp oksidantų ir antioksidantų, vadinama oksidaciniu stresu. [1, 2] (1 pav.) Antioksidantais vadinami junginiai, gebantys neutralizuoti laisvuosius radikalus, taip sumažindami jų keliamą žalą organizmui. [2] Juos galima suskirstyti į dvi plačias kategorijas – endogeniniai ir egzogeniniai. [2] Organizmo endogeninę antioksidacinę sistemą sudaro antioksidaciniai fermentai bei kitos, laisvųjų radikalų susidarymą slopinančios ar ADF neutralizuojančios, molekulės. [2] Nefermentinei antioksidacinei sistemai priskiriami tokie organizme sintetinami junginiai, kaip glutationas, melatoninas, šlapimo rūgštis. [2, 12] Fermentinę antioksidacinę organizmo sistemą palaiko fermentai: SOD, katalazė (KAT), glutationo peroksidazė (GSHPX) ir glutationo reduktazė (GR). [15] Veikdami drauge, šie fermentai neutralizuoja ADF. [15]

1 pav. Oksidacinio streso priežastys ir pasekmės

[16] Pusiausvyros sutrikimas Oksidacinis stresas Oksidacinės pažaidos ir ląstelių žūtis Antioksidantai Laisvieji radikalai

11

Egzogeniniams antioksidantams priskiriami vitaminai A, C, E, taip pat tokie biologiškai aktyvūs junginiai kaip flavanoidai, karotinoidai, fenoliai ir t.t. Egzogeniniai antioksidantai gali būti gaunami su maistu: šokoladu, alyvuogių aliejumi, vaisiais, daržovėmis ar maisto papildais. [2, 15] Veikdamos kartu, endogeninių ir egzogeninių antioksidantų sistemos padeda efektyviau apsaugoti organizmą nuo oksidacinio streso sukeliamų pažeidimų. [2]

Žmogaus organizme vienas svarbiausių ir gausiausių viduląstelinių antioksidantų yra GSH – tripeptidas, turintis sulfhidrilinę grupę, suteikiančią stipraus reduktoriaus savybes, ir randamas žinduolių audiniuose milimolinėmis koncentracijomis. [16] Veikdamas per antioksidacinės apsaugos fermentus ar tiesiogiai sąveikaudamas, GSH efektyviai neutralizuoja ADF. [17] Nustatyta, jog normaliomis sąlygomis apie 90% viso glutationo yra redukuotoje (GSH) ir tik apie 10% oksiduotoje (GSSG) formoje. [4, 16] Oksidacinio streso metu šis santykis dramatiškai pakinta, - išauga GSSG ir sumažėja GSH koncentracija. [1, 16]

8.2 Sunkiųjų metalų poveikis organizmui

Metalai – tai cheminių elementų grupė, pasižyminti geru elektriniu laidumu, lankstumu ir blizgesiu bei linkusi cheminėse reakcijose prarasti elektronus. [4] Natūraliai metalai yra randami žemės plutoje, jų sudėtis ir paplitimas skiriasi priklausomai nuo vietovės. [4] Gyvuosiuose organizmuose, mažomis koncentracijomis metalų jonai yra svarbūs palaikant įvairias biochemines ir fiziologines funkcijas, tačiau ilgainiui, besikaupdami ir viršiję tam tikrą koncentracijos ribą, jie tampa kenksmingi. [4, 6] Nors seniai žinoma, kad sunkieji metalai neigiamai veikia žmogaus sveikatą, o toksinis jų poveikis trunka ilgai, įvairiose pasaulio šalyse kontaktas su šiais metalais išlieka ir netgi dažnėja. [4] Vis daugiau dėmesio skiriant ekologijai, sveikai mitybai, dėl toksinio sunkiųjų metalų poveikio ženkliai padidėjęs aplinkos užterštumas tampa problema. [4, 18] Nuotekose dažniausiai randami dideli sunkiųjų metalų: arseno, kadmio, chromo, vario, švino, nikelio ir cinko, kiekiai kelia grėsmę aplinkai ir žmogaus sveikatai. [4] Literatūroje nurodomi įvairūs sunkiųjų metalų šaltiniai, dažniausi jų: dirvožemio erozija, natūralus žemės plutos dūlėjimas, kasybos, pramoninės miesto nuotekos bei insekticidai. [4]

Vienas sunkiųjų metalų toksinio poveikio mechanizmų susijęs su jų geba išstumti kitus būtinuosius metalus iš jų prisijungimo prie baltymų vietų. [4] Kiti sunkieji metalai, tokie kaip geležis, varis, kobaltas, chromas ar nikelis, jungiasi prie fosfolipidų, tokiu būdu pažeisdami membranų vientisumą ir padidindami jų jautrumą LPO. [6] Literatūroje nurodoma, jog sunkieji metalai: Pb, As, Cd, Ni ir kiti,

12

oksidacinį stresą sukelia jungdamiesi prie baltymų ir peptidų sulfhidrilinių grupių, tokiu būdu slopindami fermentus ar sukeldami kitų antioksidantų išeikvojimą. [6] Tyrimais nustatyta, kad sunkieji metalai jungiasi prie DNR ir branduolio baltymų, sukeldami šių biologinių makromolekulių oksidacines pažaidas. [4]

Švinas yra melsvai pilkas sunkusis metalas, nedideliais kiekiais randamas žemės plutoje. [18] Dėka savo fizikinių savybių ir ypatingai gero atsparumo korozijai jis ilgą laiką buvo plačiai naudojamas tiek pramonėje, tiek ir buityje. Toks platus šio metalo panaudojimas galiausiai sukėlė aplinkos užterštumą ir sveikatos problemas daugelyje pasaulio šalių. [4] Nors švino naudojimas šiuo metu yra stipriai apribotas, dideli šio metalo kiekiai vis dar randami iš Azijos šalių importuojamuose plastikiniuose žaisluose, mobiliuose telefonuose. Didelį užterštumą švinu lemia iškastinio kuro deginimas, kasybos pramonė. [18] Į žmogaus organizmą švinas patenka įkvėpus jo turinčių dulkių ar aerozolių, taip pat pro burną vartojant švinu užterštus maisto produktus, vandenį. [18]

Švinas nevienodai veikia skirtingus organus, šio metalo pasiskirstymas organizme taip pat yra labai nevienalytis. [4] Žinoma, jog beveik 95% švino nusėda skeleto kauluose netirpaus fosfato pavidalu. [4, 8] Likusi dalis pasiskirsto inkstuose, kepenyse bei kituose minkštuosiuose audiniuose. [18]

Švinas yra ypatingai toksiškas sunkusis metalas, skirtingai nei kiti sunkieji metalai, tokie kaip cinkas, varis, manganas ar geležis, jis neatlieka jokios biologinės funkcijos ir, patekęs į organizmą, sutrikdo daugelį biologinių procesų. [4] Gyvuose organizmuose švino sukeltas toksinis poveikis siejamas su oksidaciniu stresu. [4, 5, 19] Literatūroje nurodoma, jog švinas, prisijungdamas prie fermentų sulfhidrilinių ir amido grupių bei pakeisdamas struktūrą, slopina δ-aminolevulino rūgšties dehidratazės (δ-ALRD), GR, GSHPX bei glutationo-S-transferazės (GST) aktyvumus [16, 18] Tyrimai rodo, jog antioksidacinės sistemos fermentai SOD bei KAT taip pat yra potencialūs švino taikiniai. [16] Švino sukeltas fermentų aktyvumo slopinimas tiesiogiai susijęs su ADF organizme susidarymu bei viduląstelinių antioksidantų išeikvojimu.

Nustatyta, jog šis sunkusis metalas geba pakeisti kalcį, magnį, geležį bei natrį, taip trikdydamas nuo šių metalų priklausomų fermentų funkcijas. [16] Literatūroje švino toksiškumo mechanizmai siejami su biologinių procesų, tokių kaip ląstelių adhezija, brendimas, apoptozė, signalų perdavimas, jonų transportas, fermentų reguliacija ir neurotransmiterių atpalaidavimas, sutrikdymu. [4]

Apsinuodijimas švinu gali būti ūmus arba lėtinis. [4, 8] Ūmus apsinuodijimas gali sukelti apetito netekimą, galvos skausmą, hipertenziją, pilvo skausmą, inkstų funkcijos sutrikimą, nuovargį, nemigą, artritą, haliucinacijas ir vertigo. [4] Lėtinis apsinuodijimas švinu pasireiškia protiniu atsilikimu,

13

psichozėmis, įgimtomis ydomis, autizmu, alergijomis, disleksija, svorio netekimu, hiperaktyvumu, paralyžiumi, raumenų silpnumu, smegenų, inkstų pažeidimu ir net gali sukelti mirtį. [4]

Ypač pavojingas švino poveikis nėščiosioms, kadangi naujagimiai gimsta mažesnio svorio, dažnai būna neišnešioti. [18] Remiantis literatūros duomenimis, nustatytas ryšys tarp švino kiekio kraujyje ir sumažėjusio vaikų intelekto, susilpnėjusios klausos, augimo atsilikimo bei elgesio sutrikimų. [18]

Manoma, jog nervų sistema yra pažeidžiamiausia toksinio švino poveikio. [16, 18] Periferinės nervų sistemos pažeidimai dažniau stebimi suaugusiems, tuo tarpu vaikams būdingesni centrinės nervų sistemos sutrikimai, kliniškai pasireiškiantys nedėmesingumu, hiperaktyvumu bei irzlumu. [16] Vaikų organizmai jautresni toksiniam šio sunkiojo metalo poveikiui lyginant su suaugusiais. [5] Mokslinėje literatūroje yra duomenų, jog švinas pažeidžia mielino dangalą, taip pablogindamas nervinio impuso perdavimą bei sukeldamas raumenų silpnumą ir nuovargį. [16] Toksinis švino poveikis siejamas su neuropatijų išsivystymu. [16]

8.3 Cinko savybės ir antioksidacinis poveikis

Cinkas yra plačiai paplitęs elementas, gausiai randamas augaluose ir gyvūnuose. [7] Suaugusio žmogaus organizme šio mikroelemento yra apie 1,5-2,5 g. [7] Maždaug 85-90% cinko kaupiasi skeleto raumenyse ir kauluose, odoje ir kepenyse jis sudaro apie 8-10%, likusi dalis pasiskirsto kituose audiniuose. [6] Biologiniuose procesuose cinkas atlieka tris svarbias funkcijas: katalitinę, struktūrinę ir reguliacinę. [6] Šis mikroelementas įeina į fermentų, reguliuojančių daugelį organizme vykstančių procesų, tokių kaip DNR sintezė, smegenų vystymąsis, normalus augimas, kaulų formavimąsis, žaizdų gijimas, sudėtį. [6] Taip pat nustatyta, kad cinko jonai dalyvauja genetinės informacijos ekspresijoje, baltymų sintezėje. [6, 19] Cinkas yra pagrindinis baltymų, transkripcijos veiksnių, reguliuojančių DNR replikaciją, reparaciją, struktūrinis ir funkcinis elementas bei svarbus ląstelių apoptozės reguliatorius. [6]

Cinkui būdingas antioksidacinis veikimas pasireiškia dvejopai. Žinoma, jog jis apsaugoja nuo ADF prisijungdamas prie baltymų sulfhidrilinių grupių arba sukeldamas molekulėje tokius konformacinius pokyčius, kad šios grupės lieka apsaugotos nuo oksidacijos. [7] Antioksidacinis cinko poveikis pasireiškia ir tuo, jog jis, veikdamas kaip oksidacijos-redukcijos reakcijose dalyvaujančių pereinamosios būsenos metalų antagonistas, mažina hidroksilo ir kitų laisvųjų radikalų susidarymą. [7]

Yra duomenų, kad cinko papildai veiksmingi infekcijų prevencijai, gydant kvėpavimo takų infekcijas vaikams. [7] Literatūroje nurodoma, jog cinkas turi įtakos insulino poveikiui ir gliukozės

14

koncentracijai kraujyje bei dalyvauja imuninėse reakcijose. [7] Yra nustatyta, kad cinko koncentracija plazmoje su amžiumi mažėja ir koreliuoja su padidėjusiu širdies ir kraujagyslių ligų paplitimu. [6]

Cinko nepakankamumas pasireiškia augimo bei vystymosi sutrikimu, apetito praradimu, dermatitu, lėtu žaizdų gijimu, lytinės sistemos disfunkcija. [6] Cinko trūkumas siejamas su lipidų, baltymų ir DNR oksidacinėmis pažaidomis. [7] Studijos su gyvūnais patvirtino, kad, esant lėtiniam ir ilgai trunkančiam cinko nepakankamumui, padidėja organizmo jautrumas oksidacinio streso poveikiui. [7] Įrodyta, jog cinko trūkumą patyrusių žiurkių plaučių mikrosomose ženkliai sustiprėjo LPO. [6] Taip pat yra duomenų, kad, esant šio mikroelemento trūkumui, pažeidžiamas DNR vientisumas, sutrikdomas DNR reparacijos procesas, tokiu būdu didinama ląstelių supiktybėjimo tikimybė. [6] Literatūroje nurodoma, jog pacientų, kuriems diagnozuoti krūties, tulžies pūslės, plaučių, gaubtinės ir tiesiosios žarnos, galvos ar kaklo piktybiniai navikai, kraujo serume nustatoma sumažėjusi cinko koncentracija. [6] Tuo tarpu, ištyrus plaučių ir krūties navikų mėginius, nustatytas cinko kiekio padidėjimas. [6] Žinoma, jog cinkas ypatingai svarbus besivystančių smegenų struktūros ir funkcijų palaikyme, o esant šio metalo trūkumui, sutrinka centrinės nervų sistemos funkcijos, pasikeičia elgesys, pablogėja mokymasis, atmintis. [11] Literatūros duomenys rodo, kad cinko nepakankamumas sukelia oksidacinį stresą bei padidina neuronų jautrumą prooksidantų (švino, geležies) poveikiui. [11] Taip pat nustatyta, jog šio mikroelemento trūkumas sumažina GSH sintezę žmogaus neuroblastomos ląstelėse. [11]

Hematoencefalinis barjeras yra labai specializuota CNS kraujagyslių sistema, apsauganti smegenis nuo kenksmingų medžiagų. [6] Žinoma, kad hematoencefalinio barjero membranų polinesočiosios riebalų rūgštys yra jautrios ADF poveikiui. [6] Magnetinio rezonanso tomografija, atlikta cinko trūkumą patyrusiems laboratoriniams gyvūnams, parodė, kad cinko nepakankamumas padidina hematoencefalinio barjero pralaidumą ir skatina smegenų oksidacinį stresą. [6] Remiantis šiais rezultatais nustatyta, jog normaliomis sąlygomis antioksidacinės cinko savybės apsaugo nuo laisvųjų radikalų sukeliamų pažeidimų ir sumažina neurologinių sutrikimų vystymąsi. [6]

Nors cinkas būtinas gyviesiems organizmams metalas, bet per didelės jo dozės tampa toksiškomis. [19] Ūmus apsinuodijimas cinku, pasireiškiantis pykinimu, vėmimu, letargija, viduriavimu, raumenų skausmu, karščiavimu, diagnozuojamas retai. [6] Dažniau nustatomas lėtinis apsinuodijimas cinku, pasireiškiantis imuninės sistemos funkcijų sutrikdymu. [6] Literatūroje nurodoma cinko reikšmė neurologinių sutrikimų vystymesi, ypatingai Alzheimerio ligos. [6] Nustatytas suintensyvėjęs cinko kaupimasis beta amiloido plokštelėse, skatinantis jų formavimąsi. [6]

15

9. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI

9.1 Tyrimo objektas ir reagentai

Mokslinius tyrimus atlikome vadovaujantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo 14 straipsniu [Žin., 1997, Nr. 108-2728], Valstybinės veterinarijos tarnybos 2008 m. gruodžio 18 d. įsakymu Nr. B1-639 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ [Žin., 2009, Nr. 8-2870] ir 1999 m. sausio 18 d. įsakymu Nr. 4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ [Žin., 1999, Nr.: 49 -1591], ir Lietuvos Respublikos Sveikatos apsaugos ministro 1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“ [Žin., 1999, Nr. 35-1053], bei Europos etikos komiteto nustatytų reikalavimų darbui su laboratoriniais gyvūnais. Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2012-02-09 posėdžio protokolo Nr. 1 teigiama išvada buvo gautas leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais (leidimo Nr. 0221).

Eksperimentams naudojome 4–6 savaičių amžiaus, nelinijines baltąsias laboratorines peles, sveriančias 20–25 g. Jas atsivežėme iš LSMU Veterinarijos akademijos vivariumo ir 7 dienas laikėme karantino sąlygomis. Patinus ir pateles laikėme atskiruose narveliuose, sudarę optimalias laikymo sąlygas: patalpų optimali temperatūra ~20 o_{C, santykinė oro drėgmė 55±10%, natūralus šviesos (diena/naktis)}

režimas. Pakratams naudojome šieną ir medienos drožles, kuriuos kiekvieną dieną keitėme. Peles šėrėme pilnaverčiu maistu ir girdėme vandentiekio vandeniu.

Eksperimentams naudojome tokius reagentus: Tris, tiobarbitūro rūgštis (TBR), sacharozė, fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), 5,5`-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); β-merkaptoetanolis, KCl, NaCl, MgCl2, Pb(CH3COO)2, H3PO4, Na3PO4, firmos „Merck“

(Vokietija); ZnSO4 – firmos „Lachema“ (Čekija); trichloracto rūgštis (TChA), CH3COONa, n-butanolis –

Lietuva.

16

9.2 Metalų poveikio laboratoriniams gyvūnams tyrimo modelis

Metalų poveikiui įvertinti naudojome vidutinę mirtiną dozę (LD50) t.y. minimali medžiagos

koncentracija, nuo kurios žūva 50% visų bandomųjų gyvūnų. LD50 dozei nustatyti kiekviename narvelyje

dešimčiai pelių į pilvo ertmę sušvirkštėme atitinkamos metalo druskos tirpalą. ZnSO4 tirpinome

fiziologiniame tirpale, o Pb(CH3COO)2 – bidistiliuotame vandenyje. Po paros įvertinome kiek procentų

sudaro išgyvenusios ir kritusios pelės. Jei kritusių ir išgyvenusių pelių santykis sudarė po 50%, tai tirpale ištirpusį metalų kiekį mg laikėme LD50. Jei kritusių ir išgyvenusių pelių skaičius nebuvo vienodas, LD50

skaičiavome pagal formulę:

lgLD50 = lgDN – δ(ΣLi – 0,5) [20]

DN – eksperimente panaudota maksimali medžiagos dozė, δ – panaudotų dozių santykio

logaritmas, Li – kritusių ir visų pelių, kurioms buvo įvedama medžiagos dozė, santykis, ΣLi – Li reikšmių,

paskaičiuotų visoms panaudotoms dozėms, suma.

Nustatėme tokias metalų dozes, atitinkančias LD50: Pb(CH3COO)2 – 100 mg (483 μmol) Pb

vienam kūno masės kilogramui; ZnSO4 – 10,3 mg (157 μmol) Zn vienam kūno masės kilogramui.

Metalų jonų poveikiui laboratorinėms pelėms įvertinti pasirinkome ūmaus 14 dienų trukmės intoksikavimo modelį (n=32): 14 dienų vieną kartą per dieną pelėms į pilvo ertmę švirkštėme vienodą fiziologinio tirpalo ar bidistiliuoto vandens tūrį, kuriame buvo ištirpintas reikalingas ZnSO4 arba

Pb(CH3COO)2 kiekis. Metalų intoksikavimui, peles suskirstėme į grupes: I gr. fiziologinis tirpalas, II gr.

Pb(CH3COO)2; 0,1 LD50 – 10 mg (48 μmol) Pb/kg, III gr. ZnSO4; 0,15 LD50 – 1,56 mg (24 μmol) Zn/kg,

IV gr. ZnSO4 ir po 20 min Pb(CH3COO)2; minėtos dozės.

Praėjus intoksikavimo trukmei, peles anestezavome, atlikome cervikalinę dislokaciją ir dekapitaciją. Tyrimams naudojome pelių kepenis ir kraują.

17

9.3 Tyrimų metodai

9.3.1 Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas

GSH koncentracijai pelių kepenyse nustatyti naudojome Moron ir bendraautorių pasiūlytą metodiką [21]. Pelių kepenis pasvėrėme ir smulkinome stikliniame laboratoriniame smulkintuve (10 trikcijų), pridėję 6 tūrius (lyginant su kepenų mase) 5% TChA. Gautą kepenų ekstraktą 7 min centrifugavome 10000×g pagreičiu K-24 centrifuga (Vokietija) ir nupiltą viršutinį vandens sluoksnį (supernatanto frakcija) naudojome GSH koncentracijos nustatymui.

GSH koncentraciją nustatėme reakcijos mišinyje, kurį sudarė: 2 ml 0,6 mM DTNB, 0,2 ml supernatanto frakcijos ir 0,8 ml 0,2 M natrio fosfatinio tirpalo, pH 8,0. Gautame 3,0 ml mišinyje GSH koncentraciją nustatėmė spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 412 nm banga, naudojant molinį sugerties koeficientą 13600. GSH koncentraciją išreiškėme μmol vienam kepenų gramui.

GSH koncentracijai pelių eritrocituose nustatyti naudojome Sedlak ir bendraautorių pasiūlytą metodiką [22]. Reakcijos mišinį sudarė 0,2 ml eritrocitų, 1,8 ml dejonizuoto H2O ir 2 ml 0,6 M HClO4.

Gautą 4 ml mišinį 10 min centrifugavome 3000×g pagreičiu K-24 centrifuga. Po centrifugavimo nusiurbtą viršutinį vandens sluoksnį (supernatanto frakciją) naudojome GSH koncentracijai nustatyti. GSH koncentracijos nustatymui į 1 ml supernatanto įpylėme 3 ml 0,4 M Tris-HCl buferio (pH 9,2) ir 50 μl DTNB. GSH koncentraciją spektrofotometriškai nustatėme kaip ir pelių kepenyse. GSH koncentraciją eritrocituose išreiškėme μmol viename litre.

9.3.2 Malondialdehido koncentracijos nustatymas

MDA koncentracijai pelių kepenyse nustatyti naudojome Uchiyama ir bendraautorių pasiūlytą metodiką [23]. Pelių kepenis pasvėrėme ir smulkinome 9 tūriuose (lyginant su kepenų mase) atšaldyto 1,15% KCl tirpalo. Į 0,5 ml gauto kepenų ekstrakto įpylėme 3 ml 1% H3PO4 ir 1 ml 0,6% TBR vandeninio

tirpalo. Gautą mišinį išmaišėme stikline lazdele ir 45 min inkubavome verdančio vandens vonioje. Į ledo vonioje atšalusį mišinį įpylėme 4 ml n-butanolio, sumaišėme ir 10 min centrifugavome 8000×g pagreičiu K-24 centrifuga. Gautame viršutiniame vandens sluoksnyje matavome tirpalo sugertį ties 535 ir 520 nm banga. Iš kalibracinės kreivės apskaičiavome MDA koncentraciją, kaip standartą naudojome 1,1,3,3-tetrahidroksipropaną. MDA koncentraciją išreiškėme μmol vienam gramui kepenų masės [23].

18

MDA koncentracijai pelių eritrocituose nustatyti naudojome Stalnaja ir bendraautorių pasiūlytą metodiką [24]. Reakcijos mišinį sudarė 2 ml dejonizuoto H2O, 0,1 ml eritrocitų ir 1 ml 10% TChA.

Bendrą 3,1 ml reakcijos mišinio tūrį išmaišėme stikline lazdele, įpylėme 2 ml 0,5% TBR ir vėl išmaišėme. Gautą tirpalą 30 min inkubavome verdančio vandens vonioje. Atšaldytą ledo vonioje tirpalą 15 min centrifugavome 3000×g pagreičiu K-24 centrifuga. Gautą supernatantą nufiltravome per keturgubą sterilios marlės sluoksnį ir spektrofotometriškai matavome sugertį ties 540 nm banga. MDA koncentraciją eritrocituose skaičiavome pagal formulę ir išreiškėme μmol viename litre:

c = A×1250 [24].

A – supernatanto sugerties reikšmė ties 540nm, 1250 – koeficientas.

9.3.3 Duomenų patikimumo įvertinimas

Duomenis analizavome naudodamiesi Statistikos 6.0 paketu. Tyrimų rezultatai pateikiami vidurkiai (M) ± standartinė paklaida (Sx). Hipotezei apie vidurkių lygybę patikrinti taikėme Stjudento t testą. Skirtumus laikėme statistiškai reikšmingais, kai reikšmingumo lygmuo p<0,05.

19

10. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Gauti rezultatai parodė, kad po 14 dienų švinas 30% (p<0,05) sumažino GSH koncentraciją pelių kepenyse, lyginant su kontrolinių pelių grupe. ZnSO4 injekcijos statistiškai reikšmingos įtakos GSH

koncentracijoms pelių kepenyse neturėjo. ZnSO4/Pb(CH3COO)2 grupėje, priešingai nei buvo tikėtasi,

GSH koncentracija sumažėjo 47% (p<0,05) lyginant su kontroline grupe ir 17% (p<0,05) lyginant su švinu paveiktų pelių grupe. (2 pav.)

2 pav. GSH koncentracija pelių kepenyse po Pb(CH3COO)2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo

GSH koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (7,87 μmol/g) prilyginta 100%

*

Literatūroje nurodoma, jog labiausiai švino toksiškumas susijęs su glutationo metabolizmu. [7, 25] Tyrimuose su gyvūnais nustatyta, jog švinas mažina GSH koncentraciją. [25, 26] GR yra fermentas katalizuojantis GSH redukciją iš GSSG. [7] Yra duomenų, jog švinas slopina GR jungdamasis prie sulfhidrilo grupės aktyviajame šio fermento centre, tokiu būdu sumažindamas GSH kiekį. [7, 19] Mokslinėje literatūroje yra duomenų, jog slopindamas fermentų δ-ALRD, GSHPX bei GST aktyvumus, švinas dar labiau sumažina GSH koncentraciją. [16, 18] Manoma, jog švino sukeltas antioksidacinių fermentų, tokių kaip δ-ALRD, SOD, KAT, GSHPX, gliukozės-6-fosfatdehidrogenazės (G-6-PDH), aktyvumo slopinimas susijęs su jo geba blokuoti fermentų aktyviuose centruose esančias sulfhidrilo ir

0 20 40 60 80 100 120 K Pb Zn Zn/Pb GSH k o n ce n tr ac ij a (%)

*

*

20

amido grupes, bei savybe pakeisti fermentų sudėtyje esančius kitų metalų jonus, taip pažeidžiant fermentų struktūras ir sutrikdant jų aktyvumą. [18, 27, 28] Tikėtina, jog dėl šių, oksidacinį stresą sukeliančių, švino veikimo mechanizmų mūsų tyrime buvo nustatyta sumažėjusi GSH koncentracija pelių kepenyse.

Švino sukeltas poveikis GSH koncentracijai yra prieštaringas. Kitų tyrėjų atlikti tyrimai parodė, jog po 4 savaičių poveikio švinas didino GSH koncentracijas žiurkių kepenyse, inkstuose ir eritrocituose. [29] Manoma, kad toks GSH koncentracijos pokytis gali būti susijęs su organizmo kompensaciniais mechanizmais, siekiant apsisaugoti nuo švino toksiškumo. [29] Tyrėjai nurodė, jog švino koncentracija kraujyje yra tiesiogiai proporcinga eritrocitų GR aktyvumui. [29]

Mūsų rezultatai rodo, kad cinkas neapsaugojo GSH nuo švino toksinio poveikio pelių kepenyse. Netgi priešingai nei tikėtasi, buvo nustatytas dar didesnis GSH koncentracijos sumažėjimas. Tikėtina, jog didesnį GSH koncentracijos kepenyse sumažėjimą lemia sustiprėjęs dviejų metalų poveikis, taip pat galimai dėl endogeninių ADF. [19] Literatūroje nurodoma, kad švinas padidina kitų metalų toksiškumą, tuo būdu gerokai sumažinant GSH koncentraciją. [7] Yra duomenų, jog, priklausomai nuo dozės, pats cinkas taip pat gali išeikvoti GSH. [19]

Tyrimuose nustatėme, jog švinas statistiškai patikimai (27%) mažino GSH koncentraciją pelių eritrocituose lyginant su kontrolinių pelių grupe. Cinkas įtakos GSH koncentracijoms pelių eritrocituose neturėjo. Nors abiem metalais paveiktoje pelių grupėje GSH koncentracija eritrocituose buvo sumažėjusi 18% (p<0,05), lyginant su kontrolinių pelių grupe, tačiau, lyginant su švino grupe, cinkas padidino GSH koncentraciją 9%. (3 pav.)

Manome, jog GSH išeikvojimas pelių eritrocituose galimai yra susijęs su sumažėjusiu antioksidacinės apsaugos sistemos fermentų aktyvumu. Ankstesnių eksperimentų su švinu paveiktomis žiurkėmis rezultatai parodė GSSG koncentracijos eritrocituose padidėjimą. [26] Švino poveikyje sumažėjęs hemoproteino katalazės aktyvumas yra siejamas su hemo biosintezės slopinimu. [30] Tiriant žmones su aukštomis švino koncentracijomis kraujyje, nustatytas eritrocitų GSH kiekio sumažėjimas aiškinamas kaip apsauginis mechanizmas mažinant švino toksiškumą. [26]

Remiantis mūsų tyrimo rezultatais, tikėtina, jog padidėjusią GSH koncentraciją lėmė antioksidacinės cinko savybės bei konkurencinis dviejų metalų veikimas. Literatūroje nurodoma, jog cinkas, prisijungdamas prie baltymų sulfhidrilinių grupių arba sukeldamas molekulėje tokius konformacinius pokyčius, kad šios grupės lieka neoksiduotos, apsaugoja nuo ADF. [7] Taip pat nustatyta, kad, veikdamas kaip oksidacijos-redukcijos reakcijose dalyvaujančių pereinamosios būsenos metalų

21

(geležies, vario) antagonistas ir mažindamas hidroksilo radikalo susidarymą iš vandenilio peroksido, cinkas sumažina laisvųjų radikalų formavimąsi. [7]

3 pav. GSH koncentracija pelių eritrocituose po Pb(CH3COO)2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo

GSH koncentracija kontrolinių pelių eritrocituose (1027,7 μmol/l) prilyginta 100%

*

Įvairiuose literatūros šaltiniuose nurodoma, jog konkurencinis cinko ir švino veikimas gali sumažinti švino absorbciją, taip silpnindamas šio metalo toksinį poveikį. [10, 19, 27] Kitų mokslininkų tyrimai su žiurkėmis parodė, jog cinkas geba apsaugoti nuo švino toksinio poveikio bei sumažinti šio metalo sukeltas pažaidas tiek derinyje su metioninu, askorbo rūgštimi ar tiaminu, tiek atskirai. [19] Eksperimentuose su švinu paveiktomis žiurkėmis nustatyta, jog cinkas geba atstatyti fermentų, tokių kaip SOD ir δ-ALRD, aktyvumus. [9, 19] Cinko gebėjimas apsaugoti fermentus aiškinamas jo antioksidacinėmis savybėmis bei veikimu kaip chelatas mažinant švino toksiškumą. [7, 25]

Tolesnių mūsų eksperimentų tikslas buvo įvertinti švino poveikį MDA koncentracijai pelių kepenyse bei tikėtiną apsauginį cinko veikimą. Remiantis rezultatais, švinas statistiškai reikšmingai (29%), lyginant su kontroline pelių grupe, didino MDA koncentraciją. ZnSO4 injekcijos statistiškai

reikšmingos įtakos MDA koncentracijoms pelių kepenyse neturėjo. Sušvirkštus ZnSO4 tirpalo 20 min

prieš Pb(CH3COO)2 tirpalo sušvirkštimą, MDA koncentracija didėjo 19% (p<0,05) lyginant su kontroline

pelių grupe. Nors cinko jonai neatstatė MDA koncentracijos iki kontrolės lygio, bet, palyginus su švinu paveiktų pelių grupe, LPO sumažėjo 10% (p>0,05). (4 pav.)

0 20 40 60 80 100 120 K Pb Zn Zn/Pb GSH k o n ce n tr ac ij a (%)

*

*

22

4 pav. Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse po Pb(CH3COO)2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo

MDA koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (62,50 μmol/g) prilyginta 100%

*

Ankstesnių tyrimų su gyvūnais metu nustatyti panašūs rezultatai. Yra duomenų, jog Pb(CH3COO)2, Pb(NO3)2 ir PbCl2 paveiktų žiurkių kepenų, inkstų, smegenų homogenatuose nustatoma

padidėjusi MDA koncentracija. [17] Kitų mokslininkų tyrimų rezultatai taip pat parodė statistiškai reikšmingą LPO suintensyvėjimą žiurkių, paveiktų švinu, kepenyse. [30, 31] Švino sukeliama LPO ir dėl to padidėjusi MDA koncentracija siejama su švino poveikyje sukeliamais membraninių struktūrų pokyčiais. [27]

Literatūroje cinko trūkumas siejamas su didesnėm nei įprastai audinių oksidacinėmis pažaidomis, tokiomis kaip lipidų, baltymų ir DNR oksidacija. [19] Skirtingi bandymai su gyvūnais patvirtino, jog dėl ilgalaikio cinko nepakankamumo organizmas tampa jautresnis oksidaciniam stresui. [7, 19] Cinko trūkumo žiurkių kepenyse sukelta LPO siejama su ADF susidarymu ir nustatytu MDA koncentracijos padidėjimu. [19] Yra duomenų, jog cinko papildai geba atstatyti oksidacines lipidų pažaidas. [27] Šią išvadą patvirtina ir mūsų tyrimų rezultatai, kadangi cinkas iš dalies mažino švino sukeltą LPO. Tokie rezultatai galimai yra susiję su cinko ir švino antagonizmu.

Mūsų tyrimų rezultatai parodė, kad švinas 45% (p<0,05) padidino MDA koncentraciją pelių eritrocituose, lyginant su kontroline grupe. Cinkas neturėjo įtakos MDA koncentracijai eritrocituose. Zn/Pb grupėje, lyginant su kontrolinių pelių grupe, MDA koncentracija didėjo 26% (p<0,05), bet cinkas

0 20 40 60 80 100 120 140 K Pb Zn Zn/Pb MD A k o n ce n tr ac ij a (%)

*

*

23

statistiškai reikšmingai (19%) sumažino LPO lyginant su švinu paveiktų pelių grupe, nors iki kontrolės lygio neatstatė. (5 pav.)

5 pav. Malondialdehido koncentracija pelių eritrocituose po Pb(CH3COO)2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo

MDA koncentracija kontrolinių pelių eritrocituose (149,03 μmol/l) prilyginta 100%

*

Eritrocitai pasižymi dideliu giminingumu švinui, todėl 99% kraujyje cirkuliuojančio švino yra susijungę su šiomis kraujo ląstelėmis. [9] Eritrocitų jautrumą toksiniam švino poveikiui lemia membranų lipidų jautrumas peroksidacijai, hemoglobino oksidacija. [9] Literatūroje nurodoma, kad švinui slopinant fermentą δ-ALRD, jautriausią šio metalo toksiniam poveikiui, sumažėja hemo gamyba bei didėja δ-ALR koncentracija. [7, 9, 16, 18] Susikaupę didesni δ-ALR kiekiai skatina ADF susidarymą. [9, 16, 27] Laisvieji radikalai sukelia LPO, kurią patvirtina padidėjusi MDA koncentracija, ir membraninių struktūrų pažaidų atsiradimą. [7] Kiti tyrėjai nustatė padidėjusią MDA koncentraciją žiurkių serume po 6 savaites trukusio poveikio švinu. [28] Tyrimai su švinu paveiktais žmonėmis parodė, jog jų organizmuose, didėjant švino koncentracijai kraujyje, padidėja MDA kiekis eritrocituose. [7]

Mūsų eksperimente nustatytas cinko apsauginis poveikis prieš švino sukeltą LPO gali būti dėl šių metalų antagonistinio veikimo bei cinko gebėjimo atstatyti fermento δ-ALRD aktyvumą.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 K Pb Zn Zn/Pb MD A k o n ce n tr ac ij a (%)

*

*

24

11. IŠVADOS

1. Nustatyta, kad švinas mažino redukuoto glutationo koncentraciją pelių kepenyse ir eritrocituose (p<0,05).

2. Švinas didino malondialdehido koncentraciją pelių kepenyse ir eritrocituose (p<0,05).

3. Cinkas neapsaugojo pelių kepenų redukuoto glutationo nuo išeikvojimo (p<0,05). Tačiau iš dalies apsaugojo eritrocitų GSH nuo švino toksiškumo (p>0,05). Apsauginis cinko poveikis prieš švino sukeltą lipidų peroksidaciją nustatytas kepenyse (p>0,05) ir eritrocituose (p<0,05).

25

12. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Frijhoff J, Winyard P, Zarkovic N, Davies S, Stocker R, Cheng D et al. Clinical relevance of biomarkers of oxidative stress. Antioxidants & Redox Signaling. 2015;23(14):1144-1170.

2. Fraunberger E, Scola G, Laliberté V, Duong A, Andreazza A. Redox modulations, antioxidants, and neuropsychiatric disorders. Oxidative Med and Cell Longev. 2016;2016:1-14.

3. Al-Dalaen S. Review Article: Oxidative Stress Versus Antioxidants. American journal of bioscience and bioengineering. 2014;2(5):60-71.

4. Jaishankar M, Tseten T, Anbalagan N, Mathew B, Beeregowda K. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 2014;7(2):60-72.

5. Sharma B, Singh S, Siddiqi N. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. BioMed Research International. 2014;2014:1-26.

6. Valko M, Jomova K, Rhodes C, Kuča K, Musílek K. Redox- and non-redox-metal-induced formation of free radicals and their role in human disease. Archives of Toxicology. 2015;90(1):1-37. 7. Jomova K, Valko M. Advances in metal- induced oxidative stress and human disease. Toxicology.

2011;283:65–87.

8. Kim H, Jang T, Chae H, Choi W, Ha M, Ye B et al. Evaluation and management of lead exposure. Ann of Occup and Environ Med. 2015;27(1).

9. Patrick L. Lead toxicity. Part II, the role of free radical damage and the use of antioxidants in the pathology and treatment of lead toxicity. Altern Med Rev. 2006;2:114–27.

10. Hsu PC, Guo YL. Antioxidant nutrients and lead toxicity. Toxicology. 2002;180:33–44.

11. Omata Y, Salvador G, Supasai S, Keenan A, Oteiza P. Decreased zinc availability affects glutathione metabolism in neuronal cells and in the developing brain. Toxicological Sciences. 2013;133(1):90-100.

12. Birben E, Sahiner UM, Sackesen C, Erzurum S, Kalayci O. Oxidative stress and antioxidant defense. WAO Journal. 2012;5(1):9–19.

13. Devasagayam TPA, Tilak JC, Boloor KK, Sane KS, Ghaskadbi SS, Lele RD. Free radicals and antioxidants in human health: current status and future prospects. JAPI. 2004;52(794804), 4.

14. Sena L, Chandel N. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 2012;48(2):158-167.

26

15. Dauqan EMA, Abdullah A, Sani HA. Natural antioxidants, lipid profile, lipid peroxidation, antioxidant enzymes of different vegetable oils. Advance Journal of Food Science and Techn. 2011;3(4): 308-316.

16. Flora G, Gupta D, Tiwari A. Toxicity of lead: a review with recent updates. Interdisciplinary Toxicology. 2012;5(2):47-58.

17. Kasperczyk S, Kasperczyk A, Ostalowska A, Dziwisz M, Birkner E. Activity of glutathione peroxidase, glutathione reductase, and lipid peroxidation in erythrocytes in workers exposed to lead. Biol Trace Elem Res. 2004;102:61–72.

18. Tchounwou P, Yedjou C, Patlolla A, Sutton D. Heavy metal toxicity and the environment. Experientia Supplementum. 2012;101:133-164.

19. Šulinskienė J, Sadauskienė I, Ivanov L. The effects of lead and zinc ion exposure on the antioxidant status of mice liver. Biologija. 2011;57(1):20-25.

20. Zalups RK, Koropatnick J. Molecular biology and toxicology of metals. 2000.

21. Moron MS, Depierre JW, Mannervik. Levels of glutathione, glutathione reductase and glutathione s-transferase activities in rat lung and liver. Biochim Biophys Acta. 1979;582:67–78.

22. Sedlak J, Lindsey RH. Estimation of total protein-bound and nonprotein sulphydryl groups in the tissue with Ellman reagent. Analyt Biochem. 1968;25:192–205.

23. Uchiyama M, Mihara M. Determination of malondialdehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 1978;86:271–8.

24. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитировой кислоты // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1977.С. 66−68. 25. Koedrith P, Seo Y. Advances in Carcinogenic Metal toxicity and potential molecular markers.

IJMS. 2011;12(12):9576-9595.

26. Burns NA, Laegeler A, Kellogg G, Ercal N. Oxidative effects of lead in young and adult Fisher 344 rats. Arch Environ Contam Toxicol 2003; 44(3):417-20.

27. Patra R, Rautray A, Swarup D. Oxidative stress in lead and cadmium toxicity and its amelioration. Veterinary Medicine International. 2011;2011:1-9.

28. Kulikowska-Karpińska E, Moniuszko-Jakoniuk J. Lead and zinc influence on antioxidant enzyme activity and malondialdehyde concentrations. Polish Journal of Environ Stud. 2001;10.3:161-165. 29. Hsu JM. Lead toxicity as related to glutathione metabolism. The Journal of nutrition.

27

30. Sandhir R, Gill KD. Effect of lead on lipid peroxidation in liver of rats. Biological trace element research. 1995;48(1):91-97.

31. Patra RC, Swarup D, Dwivedi SK. Antioxidant defense and lipid peroxide level in liver and kidneys of lead exposed rats. Asian Australasian Journal of Animal Sciences. 2000;13(10):1433-1439.