MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
BIOCHEMIJOS KATEDRA
KRISTINA ČIJAUSKAITĖ
CINKO IR SELENITO JONŲ ĮTAKA REDUKUOTO
GLUTATIONO KONCENTRACIJAI IR LIPIDŲ
PEROKSIDACIJAI KADMIU PAVEIKTŲ LABORATORINIŲ
PELIŲ KEPENYSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
dr. Rasa Bernotienė
Konsultantas
prof. habil. dr. Leonid Ivanov
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
BIOCHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis,
CINKO IR SELENITO JONŲ ĮTAKA REDUKUOTO GLUTATIONO
KONCENTRACIJAI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI KADMIU
PAVEIKTŲ LABORATORINIŲ PELIŲ KEPENYSE
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas Darbo vadovė prof., habil. dr. Leonid Ivanov dr. Rasa Bernotienė Data Data
Recenzentas Darbą atliko Vardas, pavardė, parašas Magistrantė
Kristina Čijauskaitė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
2.LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
2.1.Laisvieji radikalai ir lipidų peroksidacija ... 11
2.1.1. Laisvųjų radikalų susidarymas ir poveikis ląstelėms ... 11
2.1.2. Lipidų peroksidacija ir poveikis ląstelėms ... 12
2.2.Antioksidacinė ląstelės sistema ... 14
2.2.1.Antioksidacinės sistemos fermentai ... 14
2.2.2.Glutationas – antioksidacinis ląstelės komponentas ... 15
2.3.Sunkieji metalai ir jų poveikis organizmui ... 17
2.3.1.Kadmis, jo funkcijos ir poveikis ligų patogenezėje bei oksidaciniam stresui ... 17
2.3.2.Selenas, jo funkcijos ir antioksidacinis poveikis ... 20
2.3.3.Cinkas, jo funkcijos ir antioksidacinis poveikis ... 20
2.4. Žaliosios arbatos ekstraktas, jo funkcijos ir antioksidacinis poveikis ... 22
3.TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI ... 23
3.1. Tyrimo objektas ir reagentai ... 23
3.2. Metalų toksiškumo įvertinimas. Tyrimo modeliai ... 24
3.3. Tyrimų metodai ... 26
3.3.1. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ... 26
3.3.2. Malondialdehido koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ... 26
3.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas ... 27
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
4.1. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ... 28
4.1.1. Vienkartinis kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ... 28
4.1.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ... 30
4.2. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ... 33
4.2.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių
kepenyse ... 35
4.3. Ūmus keturiolikos dienų trukmės kadmio ir žaliosios arbatos ektrakto poveikis redukuoto glutationo susidarymui ir lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ... 37
4.4. Antioksidacinio poveikio palyginimas tarp žaliosios arbatos ekstrakto ir cinko su selenu kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse ... 39
5.IŠVADOS ... 41
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
SANTRAUKA
Kristinos Čijauskaitės magistro baigiamasis darbas „Cinko ir selenito jonų įtaka redukuoto glutationo koncentracijai ir lipidų peroksidacijai kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse”; mokslinė vadovė dr. Rasa Bernotienė, konsultantas prof. habil.dr. Leonid Ivanov; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, medicinos akademijos, biochemijos katedra – Kaunas.
Darbo objektas: baltosios laboratorinės pelės.
Darbo tikslas: Įvertinti cinko ir selenito jonų apsaugos vaidmenį redukuoto glutationo ir malondialdehido
koncentracijoms kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse.
Darbo uždaviniai: Nustatyti kadmio jonų poveikį redukuoto glutationo ir malondialdehido
koncentracijoms laboratorinių pelių kepenyse; įvertinti cinko jonų poveikį redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse; įvertinti selenito jonų poveikį redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse; palyginti žaliosios arbatos ekstrakto antioksidacinį poveikį su cinku ir selenu, kadmiu paveiktų pelių kepenyse.
Tyrimo metodai: metalų toksiškumo nustatymas, redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijų
nustatymas laboratorinių pelių kepenyse, duomenų statistinė analizė.
Darbo rezultatai: buvo nustatyta, kad redukuoto glutationo koncentraciją pelių kepenyse kadmis
padidino po 8 val. 35 proc., o po 14 dienų sumažino 35 proc. Po 8 val., tiek cinkas, tiek selenas taip pat padidino redukuoto glutationo koncentraciją, atitinkamai, 27 proc. ir 17 proc. Įvertinant malondialdehido koncentraciją pelių kepenyse, buvo nustatyta, kad kadmis padidino malondialdehido koncentraciją po 8, 24 val. ir 14 dienų, atitinkamai, 336 proc., 218 proc. ir 182 proc. Veikiant cinkui ir selenui, malondialdehido koncentracija pelių kepenyse padidėjo po 24 val. ir 14 dienų, atitinkamai, 325 proc. ir 437 proc., o po 14 dienų, atitinkamai, 162 proc. ir 288 proc. Taigi, cinkas pajėgus apsaugoti redukuotą glutationą nuo oksidacijos tik 8 val., o po ilgesnio laiko redukuotas glutationas išeikvojamas. Po 8 ir 24 val. tiek cinkas, tiek selenas pelių kepenyse geba apsaugoti lipidus nuo peroksidacijos, o po 14 dienų redukuotą glutationą nuo oksidacijos ir lipidus nuo peroksidacijos apsaugo tik žaliosios arbatos ekstraktas.
SUMMARY
Kristinos Čijauskaitės master's thesis "Influence of zinc and selenite ions on the reduced glutathione and lipid peroxidation in the cadmium-exposed mice liver"; supervisor dr. Rasa Bernotienė, consultant prof., habil., dr., Leonid Ivanov; Department of Biochemistry, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences – Kaunas.
Thesis object: white laboratory mice.
Study object: to evaluate zinc and selenite ions role on the reduced glutathione and malondialdehyde
concentrations of cadmium-exposed mice liver.
Study problems: to determine cadmium ion's effect on the reduced glutathione and malondialdehyde
concentrations in the cadmium- exposed mice liver; to identify zinc ion's effect on the reduced glutathione and malondialdehyde concentrations in the cadmium- exposed mice liver; to estimate selenite ion's effect on the reduced glutathione and malondialdehyde concentrations in the cadmium- exposed mice liver; to compare green tea extract antioxidant effect of zinc and selenium in the cadmium-exposed mice liver.
Study methods: determination of metals toxicity, estimation of reduced glutathione and malondialdehyde
concentrations in the mice liver, statistical data analysis.
Study results: it was determined, that after 8 h cadmium increased glutathione concentration by 35 %
while after 14 days decreased by 35 %. After 8 h both zinc and selenium also increased reduced glutathione concentration, respectively, 27 % and 17 %. Evaluating malondialdehyde concentration in mice liver, it was established, that cadmium increased malondialdehyde concentration after 8, 24 h and 14 days, respectively, 336 %, 218 % and 182 %. When mice liver were affected with zinc and selenium, malondialdehyde concentration increased after 24 h, respectively, 325 % and 437 % and after 14 days, respectively, 162 % and 288 %. To sum up, zinc can protect reduced glutathione from oxidation in mice liver just for 8 h, and after a longer period reduced glutathione is depleted. After 8, 24 h and 14 days both, zinc and selenium are eager to protect liver from lipid peroxidation and after 14 days reduced glutathione from oxidation. Lipids from peroxidation process can protect only green tea extract.
SANTRUMPOS
ATP adenozintrifosfatas CAT katalazė COX ciklooksigenazė DNR deoksiribonukleorūgštis DTNB 5,5-ditiobisnitrobenzoinė rūgštis DTT ditiotreitolis EC epikatechinas ECG epikatechino galatas EDTA etilendiamintetraacetatas EGC epigalokatechinas EGCG epigalokatechino galatas GSH redukuotas glutationas GSH –Px glutationo peroksidazė GSSH oksiduotas glutationas GST glutationo S-transferazė GTE žaliosios arbatos ekstraktasHPETE hidroperoksi – eikosotetraeno rūgštis MDA malondialdehidas
mRNR informacinė ribonukleorūgštis MT matalotioneinas
NADPH nikotinamidadenindinukleotido fosfatas LD50 vidutinė mirtina dozė
LOX lipooksigenazė LPO lipidų peroksidacija RNR ribonukleorūgštis
RNS reaktyvios azoto formos ROS reaktyvios deguonies formos PMSF fenilmetilsulfonilfluoridas Se- Cys selenocisteinas
SOD superoksido dismutazė TBR tiobarbituro rūgštis TChA trichloracto rūgštis
ĮVADAS
Didėjantis aplinkos užterštumas yra viena svarbiausių pasaulio ekologinių problemų. Todėl pastaraisiais metais vis didesnę svarbą įgauna įvairių teršalų poveikio biologinėms sistemoms tyrimai. Sunkieji metalai pagal pavojingumą gyvybei, sveikatai ir genomui, užima pirmąją vietą tarp kitų aplinkos veiksnių, tokių kaip pesticidai, rūgštūs lietūs, naftos išsiliejimai, cheminės trąšos, radioaktyviosios atliekos, miesto triukšmas.
Būtent kadmis (Cd) yra vienas toksiškiausių sunkiųjų metalų tiek augalams, tiek gyvūnams. Jo daugiausia gaunama iš aplinkos, kur Cd būna susikaupęs garuose, taip pat su maistu ir vandeniu (El-Sharaky et al., 2007). Lėtinis šio metalo poveikis sukelia žalą daugeliui organų ir jų sistemoms. Cd2+ slopina labai daug fermentų, trukdo medžiagų apykaitos procesus, įskaitant ir lipidų metabolizmą, sukelia membranos struktūros pokyčius, įtakoja kepenų, inkstų, sėklidžių, reprodukcinės sistemos sutrikimus, imuninės sistemos ir kitų organų pažeidimus (Rogalska et al., 2009; Ognjanovic et al., 2010; Messaoudi et al., 2010).
Atliekama labai daug tyrimų, kuriais ieškomi būdai kaip apsaugoti organizmą nuo toksinio Cd poveikio (Jihen et al., 2009). Šiuo poveikiu pasižymi fermentinė ir nefermentinė antioksidacinė sistema (Ozturk et al., 2013). Daug dėmesio skiriama mikroelementų tokių kaip cinkas (Zn) ir selenas (Se) apsauginiam poveikiui (Shih et al., 2012). Šie mikroelementai dalyvauja daugelyje biologinių funkcijų, yra svarbūs organizmui mikroelementai, kurie dar ir apsaugo nuo oksidacinio streso (Lazarus et al., 2010;
McCarty, 2012). Taip pat nuo laisvųjų radikalų neigiamo poveikio organizmui apsaugo ir glutationas (Ballatori et al., 2009).
Šiais laikais yra labai išaugęs maisto papildų populiarumas. Žmonės įsigyja juos įvairių susirgimų profilaktikai, norėdami sustiprinti akis, plaukus, turėti gražesnią odą ir nagus ar esant nuovargiui ir susilpnėjusiai atminčiai. Daugumoje preparatų tik skirtingomis koncentracijomis galime rasti Zn ir Se kaip vienus iš sudedamųjų dalių mikroelementus.
Labai daug dėmesio skiriama ir natūralių antioksidantų paieškai, ypač apsaugančių nuo laisvųjų radikalų poveikio. Nustatyta, jog būtent flavanoidai, kaip nefermentiniai antioksidantai, vaidina svarbų vaidmenį apsaugant nuo oksidacinio streso. Polifenolinių junginių labai daug randama žaliosios arbatos ekstrakte. Šiomis dienomis žalioji arbata yra randama vos ne kiekviename produkte, kaip viena iš sudedamųjų dalių, tai ne tik arbata, bet ir vitaminai, šampūnai, kremai, gėrimai, saldumynai, ledai ir kt. (El-Beshbishy, 2005). Žaliosios arbatos ekstraktas slopina laisvųjų radikalų poveikį, pasižymi
antioksidacinėmis, antimutageninėmis ir antikancerogeninėmis savybėmis (Lambert & Elias, 2010; Karak &Bhagat, 2010).
Oksidacinis stresas ir nekontroliuojama reaktyvių deguonies formų gamyba yra viena iš pagrindinių ligų progresavimo ir navikinių susirgimų priežastis (Forootanfar et al., 2014). Todėl būtina skirti ypatingai didelį dėmesį šio proceso atsiradimui, mechanizmams ir priemonėms, kuriomis būtų galima viso šito išvengti.
Vis dar nėra vieningos nuomonės, kas labiau apsaugo nuo oksidacinio streso, ar tradiciniai antioksidantai Zn ir Se, ar natūralūs augalinės kilmės antioksidantai. Todėl šiuo darbu siekėme pagilinti žinias ir įvertinti Zn, Se ir žaliosios arbatos ekstrakto antioksidacinį aktyvumą.
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Įvertinti cinko ir selenito jonų apsaugos vaidmenį redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse.
Uždaviniai:
1. Nustatyti kadmio jonų poveikį redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms laboratorinių pelių kepenyse.
2. Įvertinti cinko jonų poveikį redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse.
3. Įvertinti selenito jonų poveikį redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijoms kadmiu paveiktų laboratorinių pelių kepenyse.
4. Palyginti žaliosios arbatos ekstrakto antioksidacinį poveikį su cinku ir selenu, kadmiu paveiktų pelių kepenyse.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Laisvieji radikalai ir lipidų peroksidacija
2.1.1. Laisvųjų radikalų susidarymas ir poveikis ląstelėms
Laisviesiems radikalams yra priskiriami reaktyvios deguonies formos junginiai (ROS) ir reaktyvios azoto formos (RNS) junginiai (Catala, 2009). Klasikinis ROS apibrėžimas – deguonies turintys radikalai, galintys nepriklausomai egzistuoti su vienu ar daugiau neporinių elektronų. Tačiau terminas dažniausiai praplečiamas, kad apjungtų reaktyvios deguonies turinčius junginius, bet be neporinių elektronų, pvz., vandenilio peroksidas (H2O2) ir singletinis deguonis.
ROS gamybą įtakoja egzogeniniai ir endogeniai veiksniai. Pagrindiniai endogeniniai ROS šaltiniai yra mitochondrijos, citochromo P450 apykaita, peroksisomos ir uždegimo ląstelių aktyvacija (Valko et al., 2006). Energijos gamyba mitochondrijose priklauso nuo deguonies apykaitos, kada O2 yra
redukuojamas į H2O. Tuo metu vyksta elektronų perdavimas, nepakankama deguonies redukcija gali
sukelti ROS susidarymą, įskaitant superoksido radikalą (O2-•), singletinį deguonį, vandenilio peroksidą, ir
hidroksilo radikalą (•OH) (Niki et al., 2005). Prie endogeninių šaltinių taip pat priskiriami neutrofilai, eozinofilai ir makrofagai, kurie inicijuojami padidina deguonies kiekį, taip padidina galimybę susiformuoti ROS (Valko et al., 2006).
Superoksido radikalas yra labai reaktyvus, kuris susidaro po nepilnos deguonies redukcijos: O2 + e- -> O2•-
Superoksidas sukelia fermentų inaktyvaciją, įskaitant katalazę ir glutationo peroksidazę ir oksiduoja kitus ląstelės komponentus, tokius kaip glutationas. Pagal atliktus tyrimus teigiama, kad superoksido radikalas įtakoja vėžio vystymąsi, uždegimą, širdies ir kraujagyslių bei neurodegeneracines ligas, tačiau DNR tiesiogiai nepakenkia.
Deguonies molekulės elektronų sužadinimas generuoja singletinio deguonies susidarymą: O2 + hν -> 1O2
Singletinis deguonis susidaro veikiant ultravioletinei spinduliuotei, ozonui (O3), esant
peroksidacijos nutraukimui. Pirmiausia šis deguonis sukelia žalą nukleorūgštims, baltymams, lipidams ir steroliams. Tyrimų duomenimis, singletinis deguonis sukelia odos vėžį.
H2O2 kaip ir singletinis deguonis nėra radikalų rūšis ir yra gana stabilus. Susidomėjimas yra
kada superoksiddismutazė (SOD) slopina superoksido, glikolio, aminorūgščių, urato oksidazių veiklą. Hidroksilo radikalas (•OH) yra vienas iš labiausiai reaktyvių ir kenksmingiausių radikalų. Pagrindinis šaltinis šiam radikalui susidaryti ląstelėse yra Fenton reakcija su variu (I) ir geležimi (II) (Battin & Brumaghim, 2009).
Fe2+ + H2O2 -> Fe3+ + •OH + OH-
Cu+ + H2O2 -> Cu2+ + •OH + OH-
ROS sukelia lipidų, nukleorūgščių ir baltymų oksidaciją, todėl padaryta ROS žala yra pagrindinė ligų priežastis, įskaitant navikinius susirgimus, uždegimą ir neurodegeneracines ligas. ROS taip pat gali tiesiogiai pažeisti ląstelės membraną, tuomet ląstelė žūsta. Pagal tyrimus teigiama, kad ROS turi didelės įtakos miokardo infarkto patogenezėje (AL-Rasheed et al., 2013), taip pat gali sukelti vienos arba abiejų DNR vijų įtrūkimus, purino, pirimidino arba deoksiribozės modifikacijas. DNR pažeidimai gali sustabdyti transkripciją, gali atsirasti replikacijos klaidų ir genomo nestabilumas, ko pasekoje vystosi kancerogenezė (Valko et al., 2006).
Ląstelėse padidėjus laisvųjų radikalų koncentracijai, sutrinka antioksidacinė sistema, ląstelės nebesugeba pašalinti pažaidos ir to pasekoje sukeliamas oksidacinis stresas (Lazarus et al., 2011). Oksidacinio streso padariniai priklauso nuo pokyčių laipsnio. Ląstelės, veikiant antioksidacinei sistemai, gali atlaikyti kai kuriuos oksidacinės – redukcinės sistemos stabilumo pakitimus ir atgauti pradinę būseną, tačiau labiau išreikštas oksidacinis stresas sukelia ląstelių žūtį dėl ko atsiranda įvairūs susirgimai (Magdalena et al., 2010).
Prie egzogeninių veiksnių priskiriama: ultravioletinė spinduliuotė, terminis stresas, uždegiminiai citokinai, O3, azoto dioksidas (NO2), tabako dūmai, anglies tetrachloridas (CCl4), chemoterapijai skiriami
vaistai.
2.1.2. Lipidų peroksidacija ir poveikis ląstelėms
Vienas iš svarbiausių oksidacinio streso padarinių yra lipidų peroksidacija (LPO). Šis prosesas imtas nuodugniai tyrinėti 1955 metais mokslininkų Hayaishi ir Mason (Niki et al., 2005). LPO yra svarbus autokatalitinis procesas, kuris yra oksidacinės ląstelės pažaidos biologinė pasekmė. Pasireiškus ROS citotoksiniam efektui, įvyksta ląstelių membranose polinesočiųjų riebalų rūgščių peroksidacija, todėl pakinta membranų vientisumas ir laidumas (Chávez et al., 2012).
LPO vyksta trimis pagrindiniais mechanizmais: laisvųjų radikalų sukelta oksidacija, nefermentinė nepriklausoma nuo laisvųjų radikalų oksidacija ir fermentinė oksidacija. Singletinis deguonis ir O3 lipidus
oksiduoja neradikaliniu mechanizmu. O fermentinę oksidaciją vykdo lipooksigenazė (LOX) ir ciklooksigenazė (COX). Jie arachidono rūgštį oksiduoja į hidroperoksi – eikosotetraeno rūgštį (HPETE), prostaglandinus, prostaciklinus, tomboksanus ir leukotrienus.
LPO procesą radikaliniu mechanizmu sudaro trys etapai: pradėtis, sklidimas ir baigtis (Valko et al., 2006). Šio proseso metu sąveikauja deguonies kilmės laisvieji radikalai su polinesočiomis riebalų rūgštimis ir susidaro labai didelė įvairovė reaktyvių elektrofilinių aldehidų. Tai įvyksta, laisvųjų radikalų grandininių reakcijų metu. Dažniausiai lipidų peroksidacija prasideda, kada atimamas H atomas iš polinesočiųjų riebalų rūgščių:
LH + X- -> L. + XH
Tuomet riebalų rūgšties radikalas (lipidinis radikalas) reaguoja su O2 ir susidaro laisvas riebalų
rūgšties radikalas (lipidinis peroksiradikalas): L. + O2 -> LOO
.
Šie peroksidacijos radikalai gali reaguoti su greta esančiais lipidais ir vėl atimti H atomą, tuomet susidaro lipidinis radikalas ir hidroperoksiradikalas, ciklas vėl gali kartotis:
LOO.+ LH -> LOOH + L.
Taip gali susidaryti nestabilūs hidroperoksidai ir endoperoksidai. Grandininės reakcijos tęsiasi kol įvyksta baigties reakcija, susijungia du laisvieji radikalai ir susidaro neradikalinis produktas:
LOO. + LOO.
->
ne radikalas + O2Grandininės reakcijos sukelia molekulines pažaidas, todėl būtina kuo skubiau nutraukti procesą. Dažniausiai procesas nutraukiamas veikiant vitaminui E (tokoferoliams) (Reed, 2011):
LOO. + vit. E -> vit. E. + LOOH
Susidarius peroksidacijos radikalams jie per ciklinimo reakcijas gali būti pakeisti į malondialdehido prekursorius, kada galutinis jų produktas būna malondialdehidas (MDA) (Valko et al., 2006). MDA yra gausiausias LPO aldehidas ir padidėjus jo cheminiam reaktyvumui, didėja oksidacinis stresas, dėl ko įvyksta struktūriniai ir funkciniai ląstelių pokyčiai (Chávez et al., 2012). Būtent MDA yra plačiausiai naudojamas lipidų peroksidacijos žymuo (Valavanidisa et al., 2006).
LPO pasižymi įvairiu biologiniu poveikiu tiesiogiai sąveikaujant su baltymais, fermentais, nukleorūgštimis arba netiesiogiai per receptorius. LPO veikia ląstelių membranų fizines ir chemines savybes, keičia lipoproteinus į proaterogenines ir priešuždegimines formas ir dėl to mažėja ląstelių funkcinės savybės (Catala, 2009; Niki et al., 2005). Dažniausiai ir pirmiausia yra pažeidžiami membranų lipidai, kadangi laisvieji radikalai ir deguonis geriausiai tirpsta lipidų dvisluoksnyje, o ten daugiausia būna
susikaupusio ir laisvo deguonies (Pamplona, 2008). Reaktyvūs karbonilo junginiai, lipidų hidroperoksidai, hidroksilinės riebalų rūgštys, hidroksicholesterolis, ketocholesterolis, epoksicholesterolis gali sukelti ląstelių mirtį, todėl LPO yra susijusi su daugelių ligų ir ląstelių senėjimu, įskaitant aterosklerozę, kataraktą, reumatoidinį artritą ir neurodegeneracinius sutrikimus (Niki et al., 2005).
2.2. Antioksidacinė ląstelės sistema
2.2.1. Antioksidacinės sistemos fermentai
Organizmo ląsteles nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio apsaugo antioksidacinė sistema (Valko et al., 2006). Antioksidantai yra medžiagos, kurios sulaiko ir užkerta kelią, kad neįvyktų ląstelių substratų oksidacija. Apsisaugoti nuo oksidacijos yra esminis procesas kiekviename aerobiniame organizme, nes sumažėjus antioksidaciniam efektyvumui vystosi citotoksiškumo, mutageniškumo ir kancerogeniškumo rizika. Antioksidantai tiesiogiai arba netiesiogiai apsaugo ląsteles nuo ksenobiotikų, vaistų, kancerogenų ir toksiškų radikalų sukeliamų reakcijų.
Antioksidacinę gynybos sistemą (1 pav.) apima antioksidaciniai fermentai: SOD, katalazė (CAT), glutationo peroksidazė (GSH-Px), eozinofilų peroksidazė ir ne fermentiniai antioksidantai: vitaminai C ir E, karotenoidai, tiolis ir natūralūs flavanoidai, metalotioneinas, NADPH, adenozinas, kofermentas Q-10, polifenoliai, poliamidai, fitoestrogenai, cisteinas, homocisteinas, taurinas, metioninas, resveratrolis (Zwolak &Zaporowska, 2012; Mate´s, 2000).
GSH-Px, Cu/Zn SOD ir CAT yra būtent pirmosios apsauginės grandies antioksidantiniai fermentai. Šie fermentai paprastai laikomi biožymenimis, kurie parodo organizmo antioksidacinį aktyvumą (Ferramola et al., 2012). Antioksidantai yra lokalizuoti vandeninėje arba lipidinėje terpėje. Vitaminai C ir E yra tipiniai hidrofilinio ir lipofilinio antioksidanto atstovai, be to, vitaminas E yra pagrindinis lipofilinis antioksidantas in vivo, kuris neutralizuoja lipidų peroksidacijos radikalus (Niki et al., 2005).
1969 metais mokslininkas Fridovich įrodė SOD antioksidacinį aktyvumą, šis fermentas katalizuoja O2•- į mažiau reaktyvias formas, tokias kaip H2O2 ir O2:
2O2•- + 2H -> H2O2+ O2
Organizme yra aptinkamos trys SOD izoformos, kurių aktyvumo centruose aptinkami metalų jonai (Cu, Zn ir Mn). Tai citozolinė Cu ir Zn SOD, mitochondrijų Mn – SOD ir neląstelinė SOD. Atlikti tyrimai parodė, kad SOD apsaugo širdį nuo išeminės ligos ir kepenis nuo alkoholio sukeliamų pažeidimų, o Mn – SOD yra vienas stipriausių antinavikinių fermentų. Daugelis studijų rezultatų teigia, kad šis
fermentas sukelia naviko augimo sulėtėjimą (Battin & Brumaghim, 2009). Atsiradusios mutacijos SOD yra susijusios su pasireiškiančia amiotropine lateraline skleroze, Alzhaimerio liga, navikais ir Dauno sindromu (Battin & Brumaghim, 2009; Valko et al., 2006).
1pav. Antioksidacinės sistemos komponentų aktyvumas įtakoją ląstelės gynybą prieš laisvuosius
radikalus
Sudaryta autorės
2.2.2. Glutationas – antioksidacinis ląstelės komponentas
Glutationas (γ - glutamil - cistein – glicinas, GSH) yra svarbus mažos molekulinės masės tiolis, kuris paprastai milimolinėmis koncentracijomis būna visose ląstelėse. Pagrindinė GSH sintezės vieta yra kepenys, čia jį sintezuoja fermentas glutamilcisteino sintetazė ir glutationo sintetazė citozolyje (Glušiča et al., 2013; Moskaug et al., 2014).
Esant tiolio-disulfido sąveikai GSH oksiduojamas į oksiduotą disulfidinę formą (GSSH), kuri vėliau vėl paverčiama į GSH nuo NADPH priklausomos glutationo reduktazės. Taigi glutationas būna dviejų formų: redukuotas GSH ir oksiduotas (GSSH), turintis jungtį –S-S-. Dėl šių unikalių oksidacinių- redukcinių ir nukleofilinių savybių, GSH dalyvauja bio-redukcijos reakcijose kaip svarbus imuninės sistemos saugotojas nuo ROS, ksenobiotikų ir sunkiųjų metalų (Glušiča et al., 2013). GSH apsaugo ląsteles nuo endogeninių ir egzogeninių elektrofilų. Taip dalyvauja nukleotidų metabolizme ir NO2
homeostazėje bei veikia kaip neuromediatorius. GSH mažina ribonukleotidų ir deoksiribonukleotidų redukciją, reguliuoja baltymų ir genų ekspresiją, bei yra glutationo transferazės ir GSH-Px kofaktorius, taip pat yra atsakingas už įprastą ląstelių kvėpavimo procesą, reguliuoja aminorūgšties tirozino veiklą (Kazemi et al., 2014; Moskaug et al., 2014). GSH dalyvauja kaip formaldehido dehidrogenazė, kada susidaro S-formil-glutationas iš formaldehido, kuris reikalingas, kada prostaglandinas H2 endoperoksido izomerazės konvertuojamas į prostaglandiną D2 ir E2 (Wu et al., 2006). Nuo GSH taip pat priklauso ląstelės pažaidos pasekmė – proliferacija ar apoptozė (Dalton et al., 2004). Tyrimais įrodyta, kad glutationas yra pirminė ląstelės apsauga prieš Cd toksinį poveikį. Cd gali susijungti su tolinėmis grupėmis ko pasekoje kepenų ląstelėse yra išeikvojamas GSH ir tokiu būdu žymiai padidėja Cd toksinis poveikis (Liu et al., 2009).
GSH koncentracija organizme priklauso ir nuo mitybos, hormonų, streso, paros laiko, kitų fiziologinių veiksnių (2 pav.), kaip pvz., nėštumas. Padidėjus GSH lygiui organizme, padidėja antioksidantinis pajėgumas ir atsparumas oksidaciniam stresui, tai labai pastebima navikinėse ląstelėse. Taip pat GSH koncentracijos svyravimai įtakoja kaspazių aktyvumą, transkripcijos veiksnių aktyvaciją, keramidų gamybą (Ballatori et al., 2009). Pakitus GSH koncentracijai labai jautriai reaguoja ir plaučiai, gali atsirasti obstrukcinė plaučių liga ir ūminis respiracinis distreso sindromas. GSH organizme sumažėja sergant lėtinėmis ligomis, šlapimo takų, virškinimo, širdies ir kraujagyslių, kaulų, raumenų ligomis, taip pat ŽIV ir Parkinsono liga. GSH polimorfizmas yra susijęs su plaučių, šlapimo pūslės ir storosios žarnos navikiniais susirgimais (Moskaug et al., 2014). Sumažėjus pagrindinių fermentų veiklai, kurie sintezuoja GSH įtakoja dubens uždegimą ir hemolizinę anemiją (Moskaug et al., 2014; Ballatori et al., 2009).
2 pav. GSH mažėjimą įtakojantys veiksniai Sudaryta autorės
2.3. Sunkieji metalai ir jų poveikis organizmui
2.3.1. Kadmis, jo funkcijos ir poveikis ligų patogenezėje bei oksidaciniam stresui
Natūralūs Cd šaltiniai yra ugnikalnių išsiveržimai ir miškų gaisrai. Antropogeniniai šaltiniai yra: Cu ir Ni lydiniai, iškastinio kuro deginimas, fosfatinės trąšos. Profesinio poveikio – spalvotųjų metalų liejimas, Cd gamyba ir perdirbimas, elektroninių atliekų perdirbimas (Filipič, 2012). Iš maisto produktų: ryžių, bulvių, grūdų ir kitų daržovių šaknys (Barregard et al., 2013). Pagal tyrimus vidutiniškai Cd suvartojama per dieną 30 µg. Maždaug 3-10 proc. jo absorbuojama per virškinimo traktą, o 50 proc. inhaliacijos metu per plaučius (Nzenguea et al., 2011). Apskaičiuota, kad surūkius pakelį cigarečių per dieną Cd absorbuojama 1,4 μg per dieną (Zwolak &Zaporowska, 2012). Kūdikiai ir vaikai yra ypač
jautrūs Cd poveikiui, kūdikių žarnyne Cd absorbcija siekia iki 37 proc., kai suaugusiųjų žarnyne tik iki 5 proc. (Lazarus et al., 2011).
Cd yra plačiai paplitęs teršalas su aiškiu kancerogeniniu poveikiu tiek žmonėms tiek graužikams. Jo biologinis pusinės eliminacijos laikas žmogaus organizme yra matuojamas dešimtmečiais (Person et al., 2013). Tarptautinė vėžio tyrimo agentūra priskiria Cd kaip kancerogeną I grupei (Järup et al., 2009). Pirmasis neigiamas poveikis žmogaus sveikatai jau buvo praneštas 1858 metais, kada atsirado virškinimo ir kvėpavimo sutrikimai (Nordberg, 2009).
3 pav. Keliai, kuriais kadmis sukelia kancerogenezę (Smalinskienė, 2005)
Cd sukelia fiziologinę žalą skirtingiems organams, pvz., kepenims, plaučiams, inkstams, kasai, sėklidėms, placentai, kaulams ir širdžiai (3 pav.) (Ferramola et al., 2012). Žmonėms ūmus Cd poveikis įkvėpus sukelia plaučių edemą ir kvėpavimo takų dirginimą, o lėtinis poveikis dažniausiai sukelia inkstų funkcijos sutrikimus, anemiją, osteoporozę ir kaulų lūžius (Liu et al., 2009). Naujausiais tyrimais nustatyta, jog Cd gali pakeisti žmogaus bronchų epitelio ląsteles (Person et al., 2013). Cd imituoja steroidinių hormonų funkciją, taip pat didina genų reguliuojamą estrogenų transkripciją ir genų raišką, taip veikdamas ERα genomo keliu. Būtent dėl gebėjimo aktyvuoti ERα, Cd padidina riziką susirgti piktybiniu krūties naviku. Dėl galimybės imituoti androgenų poveikį ląstelių augime ir genų ekspresiją, jis turi įtakos prostatos piktybinio naviko vystymuisi. Tyrimais nustatyta, jog tokią riziką sukelia Cd patekęs į
organizmą su maistu ar vandeniu, bet neturi tokios didelės įtakos profesinėje veikloje (Byrne et al., 2009). Organizme jis stimuliuoja osteoklastų diferenciaciją ir aktyvumą, bet slopina osteoblastų diferenciaciją ir veiklą. Cd sukelta pažaida inkstuose ir virškinamajame trakte sustiprina tiesioginį neigiamą poveikį kaulams (Brzóska et al., 2011). Cd gali aktyvinti ląstelių baltymų kinazes (baltymo kinazę C), dėl šios priežasties pagreitėja transkripcijos faktorių fosforilinimas ir aktyvuojama genų ekspresija (Jomova & Valko, 2011). Be to, didina gliukozės kiekį kraujyje ir diabetinę nefropatiją (Nzengue et al., 2011). Taip pat Cd sukelia uždegimą kepenyse, o tai yra dar vienas mechanizmas sukeltas Cd oksidacinio streso. Aktyvuojant Kupferio ląsteles, esančias kepenų makrofaguose, Cd sužadina uždegimo mediatorių tokių kaip IL-1β, TNF-α, IL-6, ir IL-8 gamybą. Sauer ir Harstad atlikę eksperimentus su žiurkėmis ir pelėmis, įrodė, jog slopinant Kupferio ląsteles su gadolino chloridu Cd toksinis poveikis žymiai mažėja (Liu et al.,2009).
Cd įsisavinimas yra sąlygojamas pernašos baltymų, pvz., metalo pernašos baltymo 1, kalcio kanalo baltymų ir kt. Daugiausia Cd jungiasi su metalotioneinu (MT). Tyrimais įrodyta, jog Cd koncentracijos didėjimas organizme sukelia MT kiekio padidėjimą audiniuose. MT vaidina minimalų vaidmenį absorbuojant Cd iš virškinamojo trakto, tačiau svarbų vaidmenį sulaikant Cd audiniuose ir mažinant jo išsiskyrimą iš tulžies. Cd-MT kompleksas yra atsakingas už Cd kaupimąsi organizme ir ilgą Cd biologinį pusinės eliminacijos laiką. MT geno raiškos aktyvumas apsaugo nuo ūmiai sukelto Cd mirtingumo, taip pat staigaus toksinio poveikio kepenims ir plaučiams, vaidina svarbų vaidmenį lengvinant lėtinio intoksikavimo pasekmes inkstams, kepenims, plaučiams, imuninei sistemai ir kaulams. MT raiška dėl Cd poveikio išsivysčiusiems navikams kinta priklausomai nuo naviko rūšies ir vystymosi stadijos. Pvz., didelis kiekis MT aptinkama Cd sukeltoje sarkomos injekcijos vietoje, tačiau MT visiškai neaptinkama sarkomos metastazių plotuose (Ferramola et al., 2012; Klaassen et al., 2009).
Cd2+ toksinį poveikį sukelia keliais skirtingais mechanizmais, kurie inaktyvuoja -SH grupes; pakeičia Ca2+
ir/ar cinko Zn2+; sąveikauja su ląstelės paviršiaus receptoriais (Ferramola et al., 2012). Tyrimais įrodyta, kad maža ar vidutinė Cd koncentracija (0,1-10 µM) ląstelių kultūroje sukelia apoptozę, o esant didesnei koncentracijai (>50 µM) sukelia akivaizdžią ląstelių nekrozę. Cd nekrozę gali sukelti keliais veikimo mechanizmais: aktyvuojant ROS gamybą ir susilpninant bei išeikvojant antioksidantų veiklą (įvyksta lipidų peroksidacija ir pakenkiamos mitochondrijos), taip pat slopinant fermentus (slopinama ATP gamyba ir jonų reguliavimas ląstelės aplinkoje) (Templeton et al., 2010).
2.3.2. Selenas, jo funkcijos ir antioksidacinis poveikis
Se yra atrastas 1817 metais Švedijos chemiko Jöns Jacob Berzelius. Nuo 1957 metų yra laikomas būtinu mikroelementu žmonėms. Se savo biologines funkcijas daugiausia vykdo būdamas selenoproteinų sudėtyje, įskaitant glutationo peroksidazę (Zhao et al., 2014). Se rekomenduojama paros norma suvartoti yra 55 µg, jo daugiausia pasisavinama iš morkų, kopūstų, česnakų, sūrių, grybų, mėsos ir grūdų (Battin & Brumaghim, 2009). Se aplinkoje būna neorganinės ir organinės formos (Pacitti et al., 2013). Dominuojančios Se formos yra: selenometioninas, selenocisteinas (Se-Cys), seleno-metilselenocisteinas ir selenatas. Selenito formos natūraliai išgaunamos iš fitoplanktono (Zwolak & Zaporowska, 2012). Se-Cys yra dvidešimt pirma genetiškai užkoduota aminorūgštis (Liu et al., 2013), kuri ląstelėse reguliuoja antioksidacinę sistemą ir fermentų oksidacijos-redukcijos reakcijas.
Se dalyvauja genų transkripcijoje, signalo perdavimo kaskadose, skydliaukės hormono apykaitoje, imuninio atsako susidaryme ir reprodukcijoje (Pacitti et al., 2013). Se gali sumažinti arseno kaupimąsi organizme ir apsaugoti odą nuo arseno sukeliamų odos pokyčių. Graužikams ir ląstelių kultūrose Se slopina genotoksinį poveikį. Pagal atliktus tyrimus teigiama, jog selenitas ir organinis selenas apsaugo nuo LPO, DNR ir RNR oksidacijos. Natrio selenitas ir seleno dioksidas slopina DNR pažaidą, kurią sukelia Fenton reakcijos metu sąveikaujantys Fe ir H2O2 (Zwolak & Zaporowska, 2012). Taip pat Se
pasižymi priešuždegiminiu ir antihiperlipideminiu poveikiu (AL-Rasheed et al., 2013). Tyrimo duomenimis Se papildai sumažina ROS sukeltą pažaidą sergant plaučių tuberkulioze, o Se – Cu kompleksas yra vartojamas prevencijai apsisaugant nuo ROS, kadangi juos suriša ir neutralizuoja (Battin & Brumaghim, 2009). Esant Se trūkumui sukeliamos dvi pagrindinės endeminės ligos, tai kardiomiopatijos vadinamos Keshan liga ir osteoartropatijos, žinomos kaip Kashin – Beck liga. Taip pat vyrauja širdies ir kraujagyslių sutrikimai ir piktybiniai navikai. Apsinuodijimai Se yra labai reti (Zwolak & Zaporowska, 2012).
2.3.3. Cinkas, jo funkcijos ir antioksidacinis poveikis
Zn randamas kiekvieno gyvo organizmo ir augalo ląstelėje (Walker & Black, 2004). Zn gausu jūrų gėrybėse, jautienoje, avienoje, kiaušiniuose, kruopose, riešutuose ir jogurte. Rekomenduojama paros normos dozė yra 15 mg, o suaugusio žmogaus organizme Zn būna 1,5-2,5 g, kuris pasiskirstęs po visus organus, audinius ir skysčius (Jomova & Valko, 2011). Organizme Zn yra absorbuojamas iš tiesiosios ir klubinės žarnos, tačiau Ca mažina Zn įsisavinimą (Rostan et al., 2005).
Zn saugo nuo ultravioletinių spindulių, skatina žaizdų gijimą, reikalingas gydant infekcines ligas, būtinas DNR sintezei, ląstelių augimui ir diferencijacijai. Taip pat dalyvauja katalizės procesuose, stabilizuoja ląstelių membranas ir reguliuoja genų raišką (Walker & Black, 2004; Hughes & Samman, 2013). Jis įeina į daugiau nei 70 skirtingų fermentų sudėtį, pvz., Zn ir SOD, įtakoja insulino išsiskyrimą ir mažina gliukozės kiekį kraujyje (Jomova & Valko, 2011), bei vaidina svarbų vaidmenį tinklainės funkcijoms, kaip šviesos perdavimas, vaizdo susidarymas ir nervinių impulsų perdavimas (Ugarte et al., 2013). Zn jonų svyravimus reguliuoja MT koncentracija (Brun et al., 2014).
Zn lėtina oksidacijos procesus. Antioksidaciniai mechanizmai gali būti stiprūs ir lėtiniai. Lėtinį poveikį apima Zn buvimas kaip kitų medžiagų induktoriumi, pagrindinis antioksidantas šiuo atveju MT. Stiprų poveikį sukelia du mechanizmai:
Apsaugoma nuo baltymų sulfhidrilinio grupių reaktyvumo ir sumažina •OH radikalo formavimąsi iš H2O2 Fenton tipo reakcijos metu (Song et al., 2009).
Sumažina laisvųjų radikalų formavimąsi, veikia kaip aktyvių pereinamųjų metalų pvz., Fe, Cu antagonistas (Jomova & Valko, 2011).
ROS aktyvuoja NF-kappaB, kuris aktyvina augimo faktorius, apoptotines ląsteles ir dėl to įvyksta ląstelių proliferacija (piktybiniai navikai), padaugėja uždegiminių citokininų ir adhezinių molekulių. Esant tokiai būsenai, Zn sumažina uždegiminių citokininų gamybą formuodamas Zn pirštų baltymą, A20, kuris slopina NF-kB (Jomova & Valko, 2011). Zn įeina i SOD sudėtį, kuris yra pirminis gynybos fermentas nuo deguonies radikalų rūšių ir yra labai svarbus transkripcijos faktorius, atsakingas už DNR pažaidos atsaką (Song et al., 2009).
Pirmą kartą Zn trūkumas, kuris įtakojo berniuko augimą buvo užregistruotas 1963 metais. Zn organizme sumažėja sergant melabsorbcijos sindromu, lėtinėmis kepenų ir inkstų ligomis, pjautuvine anemija, piktybiniais navikais, rūkant ir vartojant daug alkoholio (Walker & Black, 2004). Vieni iš pirmųjų ūmaus Zn trūkumo organizme yra anoreksija, kvapo ir skonio sutrikimai, nuotaikų kaitos (Rostan et al., 2005). Po to sulėtėja augimas, vystosi imuninės disfunkcijos, protinis atsilikimas, slopinama užkrūčio liaukos funkcija, limfoproliferacija (Prasad et al., 2004). Ūmus Zn trūkumas susilpnina trombocitų agregaciją ir tai gali įtakoti pailgėjusį kraujavimo laiką (Hughes & Samman, 2013).
2.4. Žaliosios arbatos ekstraktas, jo funkcijos ir antioksidacinis poveikis
Žalioji arbata (Camellia sinensis) šiuo metu yra vienas labiausiai vartojamų gėrimų visame pasaulyje (Hussein, 2011). Ši arbata turtinga polifenoliniais junginiais, kurie skirstomi į flavanoidus, fenolines rūgštis, lignanus ir stilbenus. Daugiausia dominuoja katechinai, įskaitant epikatechiną (EC), epikatechino galatą (ECG), epigalokatechiną (EGC) ir epigalokatechino galatą (EGCG) (Xi et al., 2012; Siripatrawan & Harte, 2010). Saugiai ir gerai toleruojama su pakankamu efektyvumu yra 800 mg epigalokatechino galato. Apskaičiuota, kad išgeriant 720-1200 ml žaliosios arbatos per parą gaunama bent 250 mg katechinų (Johnson et al., 2012).
Žaliosios arbatos ekstraktas (GTE) pasižymi antibakteriniu poveikiu, padeda išvengti išeminės širdies ligos, mažina riebalinį audinį, skatina lipidų metabolizmą, didina termogenezę ir slopina skrandžio ir kasos lipazes (Bajerska et al., 2011; Xi et al., 2012), mažina trigliceridų ir cholesterolio adsorbciją, bei gliukozės kiekį kraujyje (Crespy et al., 2004). Be to, GTE slopina kepenų pažeidimus sustabdant CYP450s ekspresiją baltymuose ir mRNR, neutralizuoja laisvuosius radikalus, kovoja su piktybiniais navikais, senėjimo procesais, pasižymi priešuždegiminiu, hepatoprotekciniu poveikiu, apsaugo inkstus nuo pažaidos (Lu et al., 2013).
GTE pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu tiek in vivo tiek in vitro, bei sumažina LPO (Sundarama et al., 2013). Polifenoliai gali pasižymėti tiek antioksidacinėmis tiek ir pro-antioksidacinėmis savybėmis, priklausomai nuo polifenolių struktūros ir redukcijos-oksidacijos reakcijų ląstelėse (Kim et al., 2014). Buvo įrodyta, kad katechinai gali neutralizuoti tiek superoksido, tiek hidroksilo radikalus, taip pat peroksido radikalus, NO, singletinį deguonį, lipidų laisvuosius radikalus ir peroksinitritus, apsaugant tiroziną nuo nitrinimo (Mandel et al., 2006; Sutherland et al., 2006). Kitas svarbus mechanizmas, pagal kurį galima spręsti apie GTE antioksidacinį poveikį yra labai spartus elekronų perdavimas nuo katechinų į ROS pažeistą DNR vietą. Yra teigiama, kad katechinai gali neutralizuoti laisvuosius radikalus formuodami stabilius semichinono laisvuosius radikalus, tokiu būdu išvengiant deamininimo ir laisvųjų radikalų susidarymo galimybes. Pagal mokslinių tyrimų duomenis, katechinai sumažina LPO žymenis žiurkių kepenyse, kraujo serume ir smegenyse, įskaitant lipidų hidroksiperoksidus ir MDA (Sutherland et al., 2006). Beje, GTE padidina SOD aktyvumą serume (Crespy & Williamson, 2004).
3. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI
3.1. Tyrimo objektas ir reagentai
Šis mokslinis tyrimas atliktas remiantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Žin., 1997, Nr. 108-2728) 14 straipsniu, Valstybinės veterinarijos tarnybos 1998 m. gruodžio 31 d. įsakymu Nr. 4-361 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ ir 1999 m. sausio 18 d. įsakymu Nr. 4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ bei sveikatos apsaugos ministro 1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“, o taip pat Europos etikos komiteto darbui su laboratoriniais gyvūnais nustatytų reikalavimų. Šiam darbui su labaratoriniais gyvūnais buvo gautas leidimas, kurį išdavė Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos (leidimo Nr. 0200).
Eksperimentams buvo naudojamos nelinijinės 4-6 savaičių amžiaus baltosios laboratorinės pelės, sveriančios 20-25 g. Jos buvo atvežtos iš LSMU VA vivariumo ir 7 dienas laikomos karantino sąlygomis. Patinai ir patelės buvo laikomi atskiruose narveliuose, sudarytos optimalios laikymo sąlygos: patalpų optimali temperatūra ~20°C, santykinė oro drėgmė 55±10 proc., natūralus šviesos (diena/naktis) režimas. Pakratams buvo naudojamos medienos drožlės ir šienas, kurie kiekvieną dieną buvo keičiami švariais. Pelės buvo šeriamos pilnaverčiu maistu ir girdytos vandentiekio vandeniu ad libitum.
4 pav. Tyrimo objektas – baltoji laboratorinė pelė
Eksperimentams buvo naudojami šie reagentai: Tris, tiobarbituro rūgštis (TBR), ditiotreitolis (DTT), etilendiamintetraacetatas (EDTA), fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), etanolis, 5,5-ditiobisnitrobenzoinė rūgštis (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); 2-merkaptoetanolis, kalio chloridas
(KCl), druskos rūgštis (HCl), ortofosforo rūgštis (H3PO4), – firmos „Merck“ (Vokietija); natrio chloridas
(NaCl), kadmio chloridas (CdCl2), natrio selenitas (Na2SeO3), cinko sulfatas (ZnSO4) – firmos
„Lachema“(Čekija); trichloracto rūgštis (TChA), n-butanolis, chloroformas – Rusija, žaliosios arbatos ekstraktas (GTE) – firmos “Sanitas” (Lietuva).
Tirpalams gaminti buvo naudojamas dejonizuotas vanduo.
3.2. Metalų toksiškumo įvertinimas. Tyrimo modeliai
Medžiagos toksiškumas dažniausiai vertinamas vidutine mirtina doze (LD50). Tai yra minimali
jos koncentracija, nuo kurios žūva 50 proc. visų bandomųjų gyvūnų. Kiekvieno tirto metalo toksiškumui įvertinti, buvo nustatyta atitinkama LD50 dozė baltosioms laboratorinėms pelėms. Ji išreiškiama
miligramais metalo, tenkančiais bandomojo gyvūno vienam kūno masės kilogramui. Ši dozė buvo paskaičiuota vadovaujantis Ašmarino ir Vorobjovo pateikiama metodika (Ашмарин ir kt., 1962). LD50
dozės nustatymui kiekviename narvelyje dešimčiai pelių į pilvo ertmę buvo sušvirkščiamas tam tikras metalo druskos (CdCl2, Na2SeO3, ZnSO2) tirpalo kiekis. Po paros laiko buvo įvertinta, kiek procentų
sudarė kritusios ir išgyvenusios pelės. Jei kritusios ir išgyvenusios pelės sudarė po 50 proc., tai fiziologiniame tirpale esantis metalų kiekis mg ir yra LD50. Jei kritusių ir išgyvenusių pelių skaičius
nevienodas, LD50 paskaičiuojama pagal formulę (Ашмарин ir kt., 1962):
lgLD50 = lgDN – δ(ΣLi – 0,5)
DN – eksperimente panaudota maksimali medžiagos dozė, δ – panaudotų dozių santykio logoritmas, Li – kritusių ir visų pelių, kurioms buvo įvedama medžiagos dozė, santykis, ΣLi – Li reikšmių, paskaičiuotų visoms panaudotoms dozėms, suma.
Buvo nustatytos tokios metalo dozės, kurios atitinka LD50:
CdCl2 – 3,2 mg Cd (29 μmol) vienam kūno masės kilogramui;
ZnSO4 – 10,3 mg Zn (157 μmol) vienam kūno masės kilogramui;
Na2SeO3 – 2,5 mg Se (32 μmol) vienam kūno masės kilogramui;
Metalų jonų poveikis laboratorinėms pelėms buvo įvertintas pasirinkus 2 modelius:
1. Ūmios vienkartinės intoksikacijos modelis (n=160): pelėms į pilvo ertmę buvo sušvirkščiamas vienodas fiziologinio tirpalo tūris, kuriame buvo ištirpintas reikalingas CdCl2, Na2SeO3 ir
1 lentelė. Eksperimentinių pelių grupės
Grupės Nr.
Metalų jonų druskų tirpalai ir dozės
1. CdCl2 (1,6 mg (14 μmol) Cd vienam kūno masės kilogramui)
2. ZnSO4 (3,1 mg (47 μmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)
3. Na2SeO3 (0,6 mg (8 μmol) Se vienam kūno masės kilogramui)
4*. ZnSO4 ir CdCl2 aukščiau minėtose dozėse
5*. Na2SeO3 ir CdCl2 aukščiau minėtose dozėse
Kontrolinė Atitinkamas fiziologinio tirpalo tūris
1. Ūmaus 14 dienų trukmės intoksikacijos modelis (n=200): 14 dienų vieną kartą per dieną pelėms į pilvo ertmę buvo švirkščiamas vienodas fiziologinio tirpalo tūris, kuriame buvo ištirpintas reikalingas CdCl2, Na2SeO3, ZnSO4 ir GTE kiekis (2 lentelė).
2 lentelė. Eksperimentinių pelių grupės
Grupės Nr.
Metalų jonų druskų tirpalai ir dozės
1. CdCl2 (1,6 mg (14 μmol) Cd vienam kūno masės kilogramui)
2. ZnSO4 (1,56 mg (24 μmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)
3. Na2SeO3 (0,06 mg (0,8 μmol) Se vienam kūno masės kilogramui)
4. GTE (50 mg GTE vienam kūno masės kilogramui)
5*. ZnSO4 ir CdCl2 aukščiau minėtose dozėse
6*. Na2SeO3 ir CdCl2 aukščiau minėtose dozėse
7*. GTE ir CdCl2 aukščiau minėtose dozėse
Kontrolinė Atitinkamas fiziologinio tirpalo tūris
*eksperimentinėms grupėms ZnSO4, Na2SeO3 ir GTE tirpalai, atitinkamai, buvo švirkščiami 20 min. iki CdCl2 tirpalo
sušvirkštimo.
Praėjus numatytai intoksikacijos trukmei, pelėms buvo atlikta cervikalinė dislokacija ir dekapitacija. Tyrimams buvo išimtos pelių kepenys.
3.3. Tyrimų metodai
3.3.1. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas pelių kepenyse
GSH koncentracija kepenyse buvo nustatoma pagal Moron ir bendraautorių pasiūlytą metodiką (Moron et al., 1979). Pelių kepenys buvo pasveriamos ir susmulkinamos 6 tūriuose 5 proc. TChA stikliniame homogenizatoriuje (10-15 trikcijų). Gautas homogenatas buvo centrifuguojamas 10000×g pagreičiu 7 min. K-24 centrifuga ir viršutinis vandeninis sluoksnis nupilamas į mėgintuvėlį. Gautas supernatantas buvo naudojamas GSH koncentracijos nustatymui.
GSH koncentracija buvo nustatoma 3 ml tūrio reakcijos mišinyje, kurį sudarė: 2 ml 0,6 mM DTNB (pH 8,0), 200 µl supernantanto frakcijos ir 800 µl 0,2 M fosfatinio tirpalo. GSH koncentracija gautame mišinyje buvo nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 412 nm banga, naudojant molinį sugertiems koeficientą 13600. GSH koncentracija pelių kepenyse išreiškiama µmol/gramui kepenų masės.
3.3.2. Malondialdehido koncentracijos nustatymas pelių kepenyse
MDA koncentracija kepenyse buvo nustatyta pagal Uchiyama ir bendraautorių pasiūlytą metodiką (Uchiyama & Mihara, 1978). Pelių kepenys buvo pasveriamos ir susmulkinamos 9 tūriuose (lyginant su kepenų svoriu) šalto 1,15 proc. KCl tirpalo. Į 0,5 ml gauto homogenato įpilta 3 ml 1 proc. H3PO4 ir 1 ml 0,6 proc. TBR vandeninio tirpalo. Mišinys maišytas stikline lazdele ir inkubuotas 45 min.
verdančio vandens vonioje, po to atšaldytas ledo vonioje 10 min. Į atšaldytą mišinį buvo įpilta 4 ml n-butanolio, stipriai sumaišyta ir centrifuguota 8000×g pagreičiu 10 min. K-24 centrifuga. Po centrifugavimo nusiurbtas viršutinis sluoksnis ir tirpalo sugertis nustatyta spektrofotometriškai ties 535 ir 520 nm banga. Iš kalibracinės kreivės apskaičiuota MDA koncentracija (1,1,3,3-tetrahidroksipropanas naudojamas kaip standartas), kuri išreiškiama nmol/gramui kepenų masės (Uchiyama & Mihara, 1978).
3.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas
Gauti duomenys buvo analizuojami Statistikos 6.0 paketu. Duomenų patikimumas įvertintas pagal Stjudento t-testą (Swiergosz-Kowalewska, 2001). Skirtumai statistiškai reikšmingi, kai reikšmingumo lygmuo p<0,05.
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo
koncentracijai pelių kepenyse
4.1.1. Vienkartinis kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo
koncentracijai pelių kepenyse
Glutationas yra neatsiejama antioksidacinės sistemos dalis, kuris apsaugo ląsteles ir audinius nuo oksidacinės pažaidos (Dalton et al., 2004). Tai vienas gausiausių tripeptidų tiolių ląstelėse (Hatem et al., 2014). Be antioksidacinio poveikio, GSH taip pat dalyvauja medžiagų apykaitoje, signalo perdavimo procese ląstelėse, baltymų sintezėje, ląstelių dalijimosi procese, nuo jo priklauso transportas ląstelėje ir ląstelės degradacija (García-Giménez et al., 2013). GSH padeda ląstelėms apsisaugoti nuo toksinio endogeninių ir egzogeninių elektrofilų toksinio poveikio, tiesiogiai neutralizuoja superoksido ir hidroksilo radikalus, gali regeneruoti kitų antioksidantų, tokių kaip vitaminai C ir E į jų aktyvias formas (Chen et al., 2013).
Atliktuose eksperimentuose įvertinome GSH koncentraciją pelių kepenyse po 2, 8 ir 24 val. CdCl2 (14 μmol/kg) ir/arba ZnSO4 (47 μmol/kg), ir/arba Na2SeO3 (8 μmol/kg) tirpalų sušvirkštimo (4.1.1.1
ir 4.1.1.2 pav.).
Gauti rezultatai (4.1.1.1 pav.) parodė, kad po 8 val. tiek CdCl2 tiek ZnSO4 tirpalo sušvirkštimo,
GSH koncentracija pelių kepenyse statistiškai padidėjo 35 proc. (p<0,05) ir 27 proc. (p<0,05), atitinkamai, lyginant su kontrolinių pelių grupe. Tuo tarpu, kitais tirtais laiko tarpais (2 ir 24 val.), tiek Cd2+
tiek Zn2+ neturėjo įtakos GSH koncentracijai pelių kepenyse.
Tiriant galimą Zn2+
apsauginį poveikį prieš Cd2+ toksiškumą, nustatėme, kad ZnSO4 tirpalo
sušvirkštimas 20 min. iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo, po 8 val. atstatė GSH koncentraciją iki kontrolės
dydžio (4.1.1.1 pav.).
Tolimesniuose eksperimentuose nustatėme Cd2+
ir/arba SeO32- įtaką GSH koncentracijai pelių
kepenyse (4.1.1.2 pav.). Gauti rezultatai parodė, kad po 8 val. tiek Cd2+
tiek SeO32- padidino GSH
koncentraciją 35 proc. (p<0,05) ir 17 proc. (p<0,05), atitinkamai, lyginant su kontrolinių pelių grupe. Kitais tirtais laiko tarpsniais (2 ir 24 val.) GSH koncentracija pelių kepenyse buvo kontrolės lygyje (4.1.1.2 pav.).
Tiriant bendrą Cd2+
ir SeO32- įtaką GSH koncentracijai pelių kepenyse, nustatėme, kad 8 val. šis
4.1.1.1 pav. Redukuoto glutationo koncentracija pelių kepenyse po CdCl2 ir/arba ZnSO4 tirpalų
sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe; # - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kadmio jonais paveiktų pelių grupe
4.1.1.2 pav. Redukuoto glutationo koncentracija pelių kepenyse po CdCl2 ir/arba Na2SeO3 tirpalų
sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe
0 1 2 3 4 5 6 7
2 val. 8 val. 24 val.
Re d u k u ot o glu tat ion o k on ce n tr ac ija µ m ol/ g
Laikas praėjęs po CdCl2 ir/arba ZnSO4 sušvirkštimo (valandos)
Kontrolė Cd Zn Zn+Cd * * * 0 1 2 3 4 5 6 7 8
2 val. 8 val. 24 val.
Re d u k u ot o glu tat ion o k on ce n tr ac ija µ m ol/ g
Laikas, praėjęs po CdCl2 ir/arba Na2SeO3 sušvirkštimo (valandos)
Kontrolė Cd Se Se+Cd
4.1.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto
glutationo koncentracijai pelių kepenyse
Tolimesniuose tyrimuose nustatėme GSH koncentraciją pelių kepenyse po 14 dienų Cd2+
, Zn2+ ir SeO32- poveikio. Šiam tikslui pasiekti 14 dienų vieną kartą per dieną buvo švirkščiami CdCl2 (14 μmol/kg)
ir/arba ZnSO4 (24 μmol/kg), ir/arba Na2SeO3 (0,8 μmol/kg) tirpalai (4.1.2.1 ir 4.1.2.2 pav.).
Gauti rezultatai (4.1.2.1 pav.) parodė, kad Cd2+
ir Cd2+ + Zn2+ grupėse GSH koncentracija pelių kepenyse sumažėjo 35 proc. (p<0,05) ir 20 proc. (p<0,05) atitinkamai, lyginant su kontrolinių pelių grupe. Po 14 dienų Zn2+
poveikio, GSH koncentracija pelių kepenyse buvo kontrolės lygyje (4.1.2.1 pav.).
4.1.2.1 pav. Redukuoto glutationo koncentracija pelių kepenyse po 14 dienų CdCl2 ir/arba ZnSO4
tirpalų sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe
Tiriant Cd2+ ir/arba SeO32- įtaką GSH koncentracijai, nustatėme, kad Cd2+ ir Cd2+ + SeO3
2-grupėse GSH koncentracija pelių kepenyse sumažėjo 35 proc. (p<0,05) ir 21 proc. (p<0,05) atitinkamai, lyginant su kontrolinių pelių grupe. Tuo tarpu, po SeO32- poveikio, GSH koncentracija pelių kepenyse
buvo kontrolės lygyje (4.1.2.2 pav.).
* * 0 1 2 3 4 5 6 7 Kontrolė Cd Zn Zn+Cd Re d u k u ot o glu tat ion o k on ce n tr ac ija µ m ol/ g
4.1.2.2 pav. Redukuoto glutationo koncentracija pelių kepenyse po 14 dienų CdCl2 ir/arba Na2SeO3
tirpalų sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe
Taigi, savo ekperimentuose nustatėme, kad po 14 dienų tirtų tirpalų poveikio, tiek Zn2+
tiek SeO32- neapsaugojo GSH sintezės sistemos nuo slopinančio Cd2+ poveikio pelių kepenyse.
Cd neigiamai veikia daugelį organų ir audinių, įskaitant plaučius, kepenis, inkstus, sėklides, smegenis, kaulus ir kraują (Kataronosvski et al., 2009). Kadangi daugiausia Cd kaupiasi kepenyse, būtent jas pasirinkome tiriamuoju organu.
Savo darbe nustatėme, kad Cd2+
didino GSH koncentraciją pelių kepenyse po 8 val. CdCl2
druskos tirpalo sušvirkštimo. Tuo tarpu, po 14 dienų Cd2+
GSH koncentraciją pelių kepenyse sumažino. Literatūroje yra duomenų, kad GSH daugiausia randama kepenyse ir būtent jis yra pirmoji gynybos linija prieš Cd2+ poveikį. Kuo ilgiau kepenys yra veikiamos Cd2+
, tuo daugiau šio metalo susijungia su merkapto grupėmis ir tokiu būdu GSH išeikvojamas (Liu et al., 2009). Tokius rezultatus gali įtakoti MT, kurių sintetinama vis daugiau veikiant kepenis Cd2+. MT-Cd kompleksas yra atsakingas už Cd kaupimąsi audiniuose, ypač kepenyse ir ilgą biologinės pusinės eliminacijos laiką (Klaassen et al., 2009; Fowler, 2009). Leelavinothan Pari ir Kalist Shagirtha atliko bandymus su žiurkėmis - patinais, jie veikė kepenis 3 mg/kg CdCl2 21 dieną ir GSH koncentracija buvo didesnė negu mūsų atliktame bandyme po 14 dienų.
Manoma, kad tokius rezultatus gali įtakoti kūno masė, amžius ir lytis (Kataronosvski et al., 2009). Yves Nzengue ir kiti mokslininkai tyrė, kaip Cd2+
veikia žmogaus keratinocitų ląsteles. Ląstelės buvo veikiamos 3, 15, 50 ir 100 µM CdCl2 tirpalu ir matuojama GSH koncentracija po 24 ir 48 val. Gauti
* * 0 1 2 3 4 5 6 Kontrolė Cd Se Se+Cd Re d u k u ot o glu tat ion o k on ce n tr ac ija µ m ol/ g
rezultatai parodė, kad GSH koncentracija daugiausia didėjo grupėse, kurios buvo paveiktos 50 ir 100 µM CdCl2, praėjus ilgesniam laikui GSH koncentracija mažėjo. Tad jie pateikė išvadas, kad GSH atlieka labai
svarbų vaidmenį apsaugant keratinocitų ląsteles nuo citotoksiškumo ir DNR pažaidų (Nzengue et al., 2008). Ši pažaida siejama su pirmiausia pažeidžiamomis hepatocitų ląstelėmis, tuomet mitochondrijose sutrinka GSH homeostazė ir pažeidžiamas kepenų mitochondrijų vientisumas (Chen et al., 2013). Taigi galima daryti išvadas, kad Cd2+
turi neigiamos įtakos GSH lygiui kepenų ląstelėse (Zuo et al., 2006). Taip pat yra duomenų, kad GSH dalyvauja apsaugant organus nuo laisvųjų radikalų poveikio, kada vyksta LPO, dėl ko GSH gali būti išeikvojamas. Be to, GSH cisteino liekanoje esanti merkapto grupė yra labai gimininga Cd2+, su kuriais sudaro merkapto kompleksus, tampa inertiški ir greitai eikvoja GSH atsargas (El-Sharaky et al., 2007).
Zn vaidina svarbų vaidmenį biologinių membranų stabilizavime, baltymų sintezėje ir nukleorūgščių apykaitoje, dalyvauja kaip kelių fermentų sistemos kofaktorius, todėl labai svarbus jo poveikis slopinant oksidacinę žalą (Zuo et al., 2006).
Mūsų atliktame eksperimente, tiriant Zn2+
apsauginį poveikį, rezultatai parodė, kad Zn2+ GSH koncentraciją pelių kepenyse padidino 27 proc. (p<0,05) po 8 val., o veikiant Cd2+
+ Zn2+ po 14 dienų GSH koncentracija sumažėjo 20 proc. (p<0,05). Tokie rezultatai parodė, jog Zn2+
pajėgus apsaugoti pelių kepenis tik 8 val., o ilgesnis Cd2+ poveikis vistiek išeikvoja GSH. Literatūroje yra duomenų, kad Zn slopina fermentų, kurie veikia GSH metabolizmą, ypač glutationo reduktazės veiklą, po kiek laiko jį išaktyvina, sumažina GSH kiekį ir padidina GSSG (Bishop et al., 2007). Tai gali paaiškinti, kodėl po 14 dienų tarpui rezultatuose GSH koncentracija sumažėjo. Taip pat yra duomenų, jog didesni Cd kiekiai gali pakeisti Zn atomus fermentų aktyviuose centruose bei Zn „pirštų“ srityse (Rikans & Yamano, 2000). Iš kitos pusės, literatūroje yra ir prieštaringų tyrimų, kuriais pagrindžiamos išvados, kad Zn2+
neapsaugo nuoCd2+ toksiškumo (Amara et al., 2014).
Literatūroje yra ir daugiau duomenų, kad Se atlieka apsauginį poveikį prieš Cd sukeltą oksidacinį stresą įvairiuose organuose, pvz., kepenyse, inkstuose, sėklidėse (Zwolak & Zaporowska, 2011). Daug tyrimų atliekama tiriant tiek gyvūnų tiek žmonių kepenis, kadangi kepenys yra pagrindinis organas, kuriame vyksta Se homeostazė ir metabolizmas. Teigiama, kad žmonių sergančių lėtinėmis kepenų ligomis Se ir GSH koncentracijos būna mažesnės negu sveikų žmonių (Czuczejkoet al., 2003). Teigiama, kad GSH padidina seleno cianato junginio aktyvių grupių kiekį ir taip sustiprėja antioksidacinis poveikis
(Sk & Bhattacharya, 2006).
A.A. Newairy ir kiti mokslininkai tyrė, kaip Se apsaugo žiurkių kepenis nuo toksinio Cd poveikio. Tyrimas vyko 10 dienų, veikiant kepenis 2 mg/kg CdCl2 ir 1 mg/kg Na2SeO3 tirpalu. Rezultatai
parodė, kad GSH koncentracija žiurkių kepenyse padidėjo 17 proc. O mūsų gauti rezultatai parodė, kad GSH koncentracija pelių kepenyse padidėjo po 8 val. 17 proc. (p<0,05). Tiriant bendrą Cd2+
ir SeO3
2-poveikį, GSH koncentracija po 8 val. padidėjo net 51 proc. (p<0,05), o jau po 14 dienų, GSH koncentracija sumažėjo 21 proc. (p<0,05).
4.2. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse
4.2.1. Vienkartinis kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių
kepenyse
MDA - tai mažos molekulinės masės aldehidas, turintis tris anglies atomus, jis yra pagrindinis LPO produktas ir dažniausiai naudojamas kaip oksidacinės pažaidos rodiklis (Grotto et al., 2009; Rua et al., 2014).
Eksperimentuose įvertinome vienkartinį ūmų Cd2+
, Zn2+ ir SeO32- poveikį MDA koncentracijai
pelių kepenyse. Pelėms į pilvo ertmę buvo švirkščiami CdCl2 (14 μmol/kg) ir/arba ZnSO4 (47 μmol/kg),
ir/arba Na2SeO3 (8 μmol/kg) tirpalai (4.2.1.1 ir 4.2.1.2 pav.).
Gauti rezultatai (4.2.1.1 pav.) parodė, kad veikiant Cd2+
MDA koncentracija padidėjo pelių kepenyse po 8 ir 24 val. CdCl2 tirpalo sušvirkštimo atitinkamai 336 proc. (p<0,05) ir 218 proc. (p<0,05),
lyginant su kontrolinių pelių grupe. Tiriant Zn2+
poveikį MDA koncentracijai pelių kepenyse, nustatėme, kad po 24 val. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimo, MDA koncentracija padidėjo 325 proc. (p<0,05). Tuo tarpu
ZnSO4 duskos tirpalo sušvirkštimas 20 min. iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo, parodė, kad po 8 ir 24 val.
lipidai pelių kepenyse buvo apsaugoti nuo peroksidacijos. Po 2 val. visų tirtų eksperimentinių grupių pelių kepenyse MDA koncentracija buvo kontrolės dydžio.
Tolimesni mūsų rezultatai parodė (4.2.1.2 pav.), kad SeO32- sukėlė MDA koncentracijos
padidėjimą pelių kepenyse po 24 val. šio tirpalo sušvirkštimo 437 proc. (p<0,05). Tiriant galimą SeO3
2-poveikį prieš Cd2+
toksiškumą, nustatėme, kad 8 ir 24 val. Na2SeO3 druskos tirpalo sušvirkštimas 20 min.
iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo, sumažino MDA koncentraciją lyginant su Cd2+ paveiktų pelių grupe
(4.2.1.2 pav.). Po 2 val. MDA koncentracija visų eksperimentinių grupių pelių kepenyse buvo kontrolės dydžio.
4.2.1.1 pav. Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse po CdCl2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe; # - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kadmio jonais paveiktų pelių grupe
4.2.1.2 pav. Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse po CdCl2 ir/arba Na2SeO3 tirpalų
sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe; # - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kadmio jonais paveiktų pelių grupe
* * * # # 0 50 100 150 200 250 300 350
2 val. 8 val. 24 val.
M alon d ial d eh id o k on ce n tr ac ija n m ol/ g
Laikas, praėjęs po CdCl2 ir/arba ZnSO4 sušvirkštimo (valandos)
Kontrolė Cd Zn Zn+Cd * * * * # # 0 50 100 150 200 250 300 350 400
2 val. 8 val. 24 val.
M alon d ial d eh id o k on ce n tr ac ija n m ol/ g
Laikas, praėjęs po CdCl2 ir/arba Na2SeO3 sušvirkštimo (valandos)
Kontrolė Cd Se Se+Cd
4.2.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų
peroksidacijai pelių kepenyse
Darbe įvertinome ūmų 14 dienų trukmės Cd2+
, Zn2+ ir SeO32- poveikį MDA koncentracijai pelių
kepenyse. Šiam tikslui pelėms į pilvo ertmę 14 dienų buvo švirkščiami CdCl2 (14 μmol/kg) ir/arba ZnSO4
(24 μmol/kg) ir/arba Na2SeO3 (0,8 μmol/kg) tirpalai (4.2.2.1 ir 4.2.2.2 pav.).
Gauti rezultatai (4.2.2.1 pav.) parodė, kad Cd2+
ir Zn2+ grupėse MDA koncentracija pelių kepenyse padidėjo 182 proc. (p<0,05) ir 162 proc. (p<0,05), atitinkamai, lyginant su kontrolinių pelių grupe. Tiriant bendrą Cd2+ ir Zn2+ įtaką MDA koncentracijai pelių kepenyse, nustatėme, kad MDA koncentracija padidėjo 150 proc. (p<0,05) lyginant su kontrolinių pelių grupe.
4.2.2.1 pav. MDA koncentracija pelių kepenyse po 14 dienų CdCl2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe
Tiriant Cd2+ ir SeO32- įtaką MDA koncentracijai pelių kepenyse (4.2.2.2 pav.), nustatėmė, jog šis
rodiklis padidėjo 182 proc. (p<0,05) ir 288 proc. (p<0,05), atitinkamai, lyginant su kontrolinių pelių grupe. Tuo tarpu, tiriant galimą SeO32- apsauginį poveikį prieš Cd2+ toksiškumą, nustatėme, kad Na2SeO3
tirpalo sušvirkštimas 20 min. iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo MDA koncentraciją padidino 133 proc.
(p<0,05). * * * 0 20 40 60 80 100 120 140 Kontrolė Cd Zn Zn+Cd M alon d ial d eh id o k on ce n tr ac ija n m ol/ g
4.2.2.2 pav. MDA koncentracija pelių kepenyse po 14 dienų CdCl2 ir/arba Na2SeO3 tirpalų sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe
Tyrimais įrodyta, jog esant per mažam Zn kiekiui ląstelėse, slopinama SOD veikla ir mažėja MT gamyba, tokiu būdu didėja hidroksilo radikalų gamybą, ko pasekoje progresuoja oksidacinis stresas, todėl Zn svarbus apsisaugant nuo lipidų peroksidacijos (Shih et al., 2012).
Mokslininkas El Heni tyrė Cd poveikį žiurkių kepenims ir Se-Zn apsauginį poveikį. Atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad žiurkėms, kurioms buvo duodama geriamojo vandens 5 savaites su CdCl2, jų
kepenyse ir inkstuose pastebėti reikšmingi degeneraciniai pokyčiai. Tuo tarpu, žiurkėms, kurioms buvo duodama kartu ir Se, struktūrinių organų pokyčių nepastebėta, o toms, kurioms buvo duodama ir Se ir Zn, Cd toksiškumo rodiklių kepenyse išvis nepastebėta. Šio eksperimento autoriai teigė, kad Se ir Zn gali turėti apsauginį poveikį prieš Cd sukeltus struktūrinius pažeidimus kepenyse, tačiau ne inkstuose (Zwolak & Zaporowska, 2011). Savo eksperimentuose ir nustatėme, kad tiek Zn tiek Se apsaugojo lipidus nuo Cd sukeltos peroksidacijos 8 ir 24 val., bet neturėjo didelės įtakos po 14 dienų šių metalų poveikio.
* * * 0 50 100 150 200 250 Kontrolė Cd Se Se+Cd M alon d ial d eh id o k on ce n tr ac ija n m ol/ g
4.3. Ūmus keturiolikos dienų trukmės kadmio ir žaliosios arbatos ektrakto poveikis
redukuoto glutationo susidarymui ir lipidų peroksidacijai pelių kepenyse
Žalioji arbata yra vienas labiausiai vartojamų gėrimų, kuriame gausu polifenolinių katechinų. Teigiama, kad GTE pasižymi antioksidaciniu, hepatoprotekciniu, priešuždegiminiu poveikiu, apsaugo navikines ląsteles nuo didesnės pažaidos ir senėjimo procesų (Lu et al., 2013).
Savo darbe įvertinome GSH koncentraciją po Cd2+
ir GTE poveikio. Kadangi, nėra daug duomenų ir mažai tikėtina, jog GTE sukels pastebimus rezultatus po vienos injekcijos GSH ir MDA koncentracijoms pasirinkome dviejų savaičių eksperimentą. Šiam tikslui 14 dienų vieną kartą per dieną švirkštėme CdCl2 (14 μmol/kg) ir/arba GTE (50 mg/kg) tirpalus (4.3.1 pav.).
Tyrimų rezultatai (4.3.1 pav.) parodė, kad GSH koncentracija pelių kepenyse sumažėjo veikiant Cd2+ – 49 proc. (p<0,05), tačiau GSH koncentracija padidėjo veikiant GTE – 35 proc. (p<0,05). Tiriant galimą apsauginį GTE poveikį, nustatėme, kad GTE sušvirkštus 20 min. iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo,
sugrąžino GSH koncentraciją iki kontrolės dydžio.
4.3.1 pav. Redukuoto glutationo koncentracija pelių kepenyse po 14 dienų CdCl2 ir/arba GTE
sušvirkštimo
* - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe ; # - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kadmio jonais paveiktų pelių grupe
* * # 0 2 4 6 8 10 12
Kontrolė Cd GTE GTE+Cd
Re d u k u ot o glu tat ion o k on ce n tr ac ija µ m ol/ g
