CINKO JONŲ ĮTAKOS ĮVERTINIMAS LĄSTELĖS ANTIOKSIDACINIAM BŪVIUI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI, NIKELIU PAVEIKTŲ PELIŲ KEPENYSE IR ERITROCITUOSE

MEDICINOS AKADEMIJA

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

IEVA KUPČIŪNAITĖ

CINKO JONŲ ĮTAKOS ĮVERTINIMAS LĄSTELĖS

ANTIOKSIDACINIAM BŪVIUI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI,

NIKELIU PAVEIKTŲ PELIŲ KEPENYSE IR ERITROCITUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

dr. Jurgita Šulinskienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis

Data:

CINKO JONŲ ĮTAKOS ĮVERTINIMAS LĄSTELĖS

ANTIOKSIDACINIAM BŪVIUI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI,

NIKELIU PAVEIKTŲ PELIŲ KEPENYSE IR ERITROCITUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

dr. Jurgita Šulinskienė

Data:

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Ieva Kupčiūnaitė

Data: Data:

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Laisvųjų radikalų ir kitų aktyvių deguonies formų charakteristika ir reikšmė ... 12

1.1.1. Laisvųjų radikalų ir kitų aktyvių deguonies formų apibūdinimas ... 12

1.1.2. Laisvųjų radikalų susidarymo šaltiniai ... 12

1.1.3. Laisvųjų radikalų fiziologinė reikšmė ... 13

1.2. Oksidacinio streso charakteristika ... 13

1.2.1. Oksidacinio steso apibūdinimas ir priežastys ... 13

1.2.2. Oksidacinio streso sukeliama žala žmogaus organizmui ... 14

1.3. Antioksidacinės sistemos charakteristika ... 15

1.3.1. Antioksidantų apibūdinimas, veikimas ir klasifikacija ... 15

1.3.2. Redukuoto glutationo vaidmuo antioksidacinėje sistemoje ... 17

1.4. Nikelis, jo savybės ir biologinis poveikis ... 18

1.4.1. Nikelio savybės ir paplitimas aplinkoje ... 18

1.4.2. Nikelio poveikis žmogaus organizmui ... 18

1.4.3. Nikelio toksinio ir kancerogeninio poveikio mechanizmai... 20

1.5. Cinko poveikis žmogaus organizmui ... 22

1.5.1. Cinko pasiskirstymas organizme, poreikis ir funkcijos ... 22

1.5.2. Cinko pertekliaus ir trūkumo organizme sukeliamos būklės ... 23

2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 25

2.1. Tyrimo objektas ir reagentai ... 25

2.2. Metalų poveikio laboratorinėms pelėms tyrimo modelis ... 26

2.3.1. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir eritrocituose ... 27

2.3.2. Malondialdehido koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir eritrocituose ... 28

2.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas ... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 30

3.1. Metalų poveikis redukuoto glutationo susidarymui ... 30

3.1.1. 24 valandų ir 14 dienų cinko, nikelio bei kompleksinis šių metalų jonų poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose ... 30

3.2. Metalų poveikis lipidų peroksidacijai ir malondialdehido susidarymui ... 34

3.2.1. 24 valandų ir 14 dienų cinko, nikelio bei kompleksinis šių metalų jonų poveikis malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose ... 35

4. IŠVADOS ... 39

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41

7. MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS . 51 8. PRIEDAI ... 52

SANTRAUKA

Ievos Kupčiūnaitės magistro baigiamasis darbas. Cinko jonų įtakos įvertinimas ląstelės antioksidaciniam būviui ir lipidų peroksidacijai, nikeliu paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose. Mokslinė vadovė dr. Jurgita Šulinskienė. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Neuromokslų institutas, Molekulinės neurobiologijos laboratorija, Kaunas, 2016.

Tyrimo objektas: 4–6 savaičių amžiaus nelinijinės baltosios laboratorinės pelės, sveriančios 20–25 g. Tyrimo tikslas: įvertinti Zn2+ įtaką ląstelės antioksidaciniam būviui ir lipidų peroksidacijai, Ni2+ paveiktų laboratorinių pelių kepenyse ir eritrocituose.

Darbo uždaviniai: 1) Nustatyti 24 valandų ir 14 dienų Ni2+

poveikį redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose; 2) Nustatyti 24 valandų ir 14 dienų Ni2+ poveikį malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose; 3) Įvertinti Zn2+

poveikį redukuoto glutationo koncentracijai, Ni2+ paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose; 4) Įvertinti Zn2+ poveikį malondialdehido koncentracijai, Ni2+ paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose.

Tyrimo metodai: taikyti du intoksikacijos metalais modeliai: 24 valandų ir 14 dienų. Pelės

suskirstytos į keturias grupes, kur buvo veikiamos NiCl2 ir/arba ZnSO4 tirpalais arba fiziologiniu tirpalu (kontrolinė grupė). Pelės intoksikuotos metalų tirpalais juos suleidžiant į pilvo ertmę. Metalų poveikis ląstelės antioksidaciniam būviui ir lipidų peroksidacijai įvertintas nustačius redukuoto glutationo ir malondialdehido koncentracijas pelių kepenyse ir eritrocituose spektrofotometriniu metodu. Atlikta gautų duomenų statistinė analizė. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai jų reikšmingumo lygmuo mažesnis nei 0,05 (p<0,05).

Tyrimo rezultatai ir išvados: 1) Po 24 valandų ir 14 dienų poveikio, Ni2+ mažino (p<0,05) redukuoto

glutationo koncentracijas pelių kepenyse (atitinkamai 18 proc. ir 24 proc.) ir eritrocituose (atitinkamai 23 proc. ir 31 proc.), lyginant su kontroline pelių grupe; 2) 24 valandų ir 14 dienų Ni2+ poveikis didino (p<0,05) malondialdehido koncentraciją pelių kepenyse (atitinkamai 277 proc. ir 45 proc.) ir eritrocituose (atitinkamai 23 proc. ir 116 proc.), lyginant su kontroline pelių grupe; 3) Zn2+ apsaugojo pelių kepenis ir eritrocitus nuo Ni2+

sukelto redukuoto glutationo išeikvojimo po 14 dienų, padidindami jo kiekius pelių kepenyse ir eritrocituose (atitinkamai 8 proc. (p<0,05) ir 6 proc.), tačiau po 24 valandų dar labiau sustiprino nikelio toksiškumą, sumažindami (p<0,05) redukuoto glutationo koncentracijas kepenyse 19 proc. ir eritrocituose 36 proc., lyginant su nikeliu paveiktų pelių grupe; 4) Zn2+ apsaugojo pelių eritrocitų lipidus nuo Ni2+ sukeltos peroksidacijos po 24 valandų ir 14 dienų, sumažindami (p<0,05) malondialdehido kiekius (atitinkamai 34 proc. ir 73 proc.), tačiau kepenyse po 14 dienų neatstatė lipidų peroksidacijos iki kontrolės lygio (malondialdehido koncentracija sumažėjo 21 proc.), o po 24 valandų dar labiau aktyvino šį procesą (nustatytas 247 proc. malondialdehido koncentracijos padidėjimas (p<0,05)), lyginant su nikeliu paveiktų pelių grupe.

SUMMARY

Master thesis of Ieva Kupciunaite. Evaluation of zinc ion exposure on the cell antioxidative state and lipid peroxidation in mice liver and eritrocytes effected by nickel ions. Scientific supervisor dr. Jurgita Sulinskiene. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Neuroscience Institute, Laboratory of Molecular Neurobiology, Kaunas 2016.

The subject of research: 4–6 weeks old white laboratory outbreed mice weighing 20–25 g.

The aim: to evaluate Zn2+ influence on the cell antioxidative state and lipid peroxidation in the laboratory mice liver and eritrocytes effected by Ni2+.

Tasks: 1) To define the effect of Ni2+ on reduced glutathione concentrations in the liver and eritrocytes of the mice after acute single (24 h) and repeated (14 days) intoxication; 2) To determine the effect of Ni2+ on malondialdehyde quantity in the liver and eritrocytes of the mice after 24 h and 14 days exposure; 3) To evaluate the effect of Zn2+ on the reduced glutathione concentrations in the liver and eritrocytes of the nickel treated mice; 4) To evaluate Zn2+ effect on malondialdehyde concentrations in the liver and eritrocytes of the mice effected by Ni2+.

Methods: in the study were used two intoxication models: 24 h and 14 days. Mice were randomly

assigned into 3 experimental groups and one control. Mice received intraperitoneall metals salts solutions injections (NiCl2/ZnSO4/both of them). The effects on cell antioxidative state and lipid peroxidation after metals exposure were evaluated by determining concentrations of reduced glutathione and malondialdehyde in the liver and eritrocytes of the mice spectrofotometrically. The statistical analysis was performed (p<0.05 was considered to be statistically significant).

Results and conclusions: 1) Both 24 h and 14 days intoxication with Ni2+ decreased (p<0.05) the content of reduced glutathione in mice liver (respectively 18% and 24%) and eritrocytes (respectively 23% and 31%), as compared to the control group of mice; 2) Both single and 14 days intoxication with Ni2+ increased (p<0.05) malondialdehyde concentrations in the liver (respectively 277% and 45%) and eritrocytes (respectively 23% and 116%), as compared to the control group of mice; 3) 14 days pre-treatment by Zn2+ raised reduced glutathione concentrations in mice liver and eritrocytes (respectively 8% (p<0.05) and 6%) proving protective effect against Ni2+ induced reduced glutathione depletion, however after 24 h effect of Zn2+ even more enhanced Ni2+ toxic effect reducing (p<0.05) reduced glutathione quantities in the liver by 19% and eritrocytes by 36%, as compared to the nickel treated mice group; 4) Single and 14 days Zn2+ pre-treatment protected the lipids of eritrocytes from Ni2+ induced peroxidation decreasing (p<0.05) malondialdehyde concentrations (respectively 34% and 73%), however in the liver after 14 days exposure of both metals, Zn2+ didn’t restore lipid peroxidation to the control level, and after 24 h even more activated these process in the liver (malondialdehyde concentration raised by 247% (p<0.05)), as compared to the nickel treated mice group.

PADĖKA

Norėčiau išreikšti nuoširdžiausią padėką visiems, kurie padėjo rengti magistro baigiamąjį darbą. Už visokeriopą pagalbą, geranoriškumą, motyvaciją, kantrybę bei pastabumą, atliekant eksperimentus bei rašant magistro baigiamąjį darbą, esu labai dėkinga savo darbo vadovei dr. Jurgitai Šulinskienei. Už vertingus patarimus, ruošiantis darbo gynimui, esu dėkinga Neuromokslų instituto Molekulinės neurobiologijos laborotorijos kolektyvui. Esu labai dėkinga savo tėvams bei draugamas už palaikymą ir optimizmą.

SANTRUMPOS

CAT – katalazė

DNR – deoksiribonukleorūgštis

DTNB – 5‘5-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) (Elmano reagentas) G-6-PDH – gliukozės 6-fosfatdehidrogenazė GR – glutationo reduktazė GSH – redukuotas glutationas GSHPX – glutationo peroksidazė GSSG – oksiduotas glutationas GST – glutationo-S-transferazė

HIF-1 – hipoksijos indukuojamas faktorius 1 JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos

LD50 – vidutinė mirtina dozė; dozė nuo kurios žūva 50 proc. tiriamųjų gyvūnų

LOOH – lipidų hidroperoksidai LPO – lipidų peroksidacija MDA – malondialdehidas

NADP – oksiduotas nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas NADPH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas Nrf2 – transkripcijos faktorius

PSO – Pasaulio sveikatos organizacija RAF – reaktyvios azoto formos RDF – reaktyvios deguonies formos RPD – rekomenduojama paros dozė SOD – superoksido dismutazė TBR – tiobarbituro rūgštis TChA – trichloracto rūgštis

ĮVADAS

Aplinkos užterštumas sunkiaisiais metalais dėl natūralių ir antropogeninių šaltinių yra viena svarbiausių pasaulinių ekologinių problemų [1]. Beveik visi sunkieji metalai laikomi kancerogenais, tačiau dėl unikalių cheminių ir fizikinių savybių, jie yra plačiai naudojami įvairiose pramonės srityse [2]. Per kelis pastaruosius dešimtmečius ženkliai padidėjęs sunkiųjų metalų sunaudojimas pramonėje lėmė padidėjusius jų kiekius aplinkoje [3]. Dėl vandens, maisto ir oro užterštumo, sunkieji metalai nuolatos veikia žmogaus organizmą ir gali sukelti įvairius sveikatos sutrikimus [4].

Nikelis (Ni) yra vienas sunkiųjų metalų, turintis itin platų pritaikymą modernioje pramonėje. Į žmogaus organizmą šis metalas patenka oraliniu, inhaliaciniu ir transderminiu būdais [5]. Ni junginiai pripažinti žmogaus kancerogenais, bei yra laikomi vienais didžiausių alergenų, sukeliančių kontaktinį dermatitą [6]. Nustatyta, jog šio metalo junginiai toksiškai veikia beveik visas organizmo sistemas ir organus bei yra siejami su daugelio ligų etiologija ir progresavimu [7]. Manoma, jog vienas svarbiausių Ni toksinio poveikio mechanizmų yra laisvųjų radikalų gamyba ir oksidacinio streso sukėlimas organizme [5].

Laisvieji radikalai pasižymi dideliu reaktyvumu ir geba oksiduoti kitas molekules. Pagrindiniai jų taikiniai organizme yra baltymai, lipidai bei deoksiribonukleino rūgštis (DNR) [8]. Laisvųjų radikalų kiekį organizme reguliuoja antioksidacinė sistema. Antioksidantų funkcija yra neutralizuoti susidariusį laisvųjų radikalų perteklių, apsaugoti ląsteles nuo toksinio jų poveikio [9]. Sutrikus pusiausvyrai tarp laisvųjų radikalų susidarymo ir jų neutralizavimo, gali pasireikšti būklė vadinama „oksidaciniu stresu“ [10,11]. Šio proceso metu, vykstant lipidų peroksidacijai (LPO), pažeidžiamos įvairios ląstelės struktūros, ypač membranos, kuriose oksiduojantis dideliam lipidų kiekiui susidaro citotoksiškas ir mutageniškas produktas – malondialdehidas (MDA). Oksidacinis stresas laikomas svarbiu veiksniu lėtinių ir degeneracinių ligų patogenezėje bei senėjime [9].

Nors cinkas (Zn) taip pat priskiriamas sunkiesiems metalams, tačiau jis yra būtinas mikroelementas gyviesiems organizmams [2,12]. Šis metalas būtinas daugiau nei 300 fermentų aktyvumui palaikyti ir beveik 2000 transkripcijos faktorių, reikalingų genų raiškai [13]. Zn trūkumas gali sukelti augimo sutrikimus, vyrų nevaisingumą, imuniteto disfunkciją bei oksidacinio streso padidėjimą [14]. Šis metalas pasižymi antioksidaciniu poveikiu, kaip kofaktorius yra būtinas antioksidaciniams fermentams, aktyvina metalotioneinų sintezę, stabilizuoja ląstelių membranas, mažina kitų sunkiųjų metalų sukeltą oksidacinį stresą ir tokiu būdu apsaugo ląsteles nuo laisvųjų radikalų sukeliamų pažaidų [4,15]. Tačiau yra duomenų tegiančių, jog pats Zn gali skatinti laisvųjų radikalų susidarymą organizme ir veikti kaip prooksidantas [16]. Zn poveikis organizmui priklauso nuo dozės, jo trūkumas siejamas su daugybe patologinių būklių, tuo tarpu didelės dozės – gali sukelti toksinį poveikį [12].

Tikslus sunkiųjų metalų toksinio poveikio mechanizmas iki šiol nėra žinomas. Oksidacinio streso žymenų, redukuoto glutationo (GSH) ir MDA, koncentracijų pokyčių stebėjimas gyvuosiuose organizmuose leidžia įvertinti metalų sukeltą oksidacinį stresą. Kadangi Zn poveikis nėra vienareikšmiškas, svarbu įvertinti jo kompleksinę sąveiką su kitais sunkiaisiais metalais. Nors Zn veiksmingumas esant tam tikroms organizmo būklėms yra įrodytas, tačiau iki šiol nėra žinoma ar jis veiksmingas esant intoksikacijai sunkiaisiais metalais.

Metalų poveikis ląstelės antioksidaciniam būviui ir lipidų peroksidacijai tyrime įvertintas nustačius GSH ir MDA koncentracijas baltųjų laboratorinių pelių, paveiktų nikelio chlorido (NiCl2) ir/arba cinko sulfato (ZnSO4) tirpalais, kepenyse ir eritrocituose spektrofotometriniu metodu.

Gauti tyrimų rezultatai pristatyti tarptautinėse mokslinėse konferencijose Lietuvoje.

Pagrindinis šio darbo tikslas – įvertinti cinko jonų įtaką ląstelės antioksidaciniam būviui ir lipidų peroksidacijai, nikelio jonais paveiktų laboratorinių pelių kepenyse ir eritrocituose.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: įvertinti cinko jonų įtaką ląstelės antioksidaciniam būviui ir lipidų

peroksidacijai, nikelio jonais paveiktų laboratorinių pelių kepenyse ir eritrocituose.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti 24 valandų ir 14 dienų nikelio jonų poveikį redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose.

2. Nustatyti 24 valandų ir 14 dienų nikelio jonų poveikį malondialdehido koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose.

3. Įvertinti cinko jonų poveikį redukuoto glutationo koncentracijai, nikeliu paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose.

4. Įvertinti cinko jonų poveikį malondialdehido koncentracijai, nikeliu paveiktų pelių kepenyse ir eritrocituose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Laisvųjų radikalų ir kitų aktyvių deguonies formų charakteristika ir

reikšmė

1.1.1. Laisvųjų radikalų ir kitų aktyvių deguonies formų apibūdinimas

Laisvaisiais radikalais laikomi cheminiai dariniai, kurie savo išorinėje orbitalėje turi vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų, pavyzdžiui: superoksido anijonas (O2-·), azoto monoksidas (NO·), hidroksilo radikalas (OH·). Žodis „laisvieji“ apibūdina šių cheminių junginių gebėjimą nepriklausomai egzistuoti [10,17–19]. Laisvieji radikalai pasižymi dideliu cheminiu nestabilumu, geba labai trumpai egzistuoti (pusinės eliminacijos periodas svyruoja nuo mili-, mikro- iki nanosekundžių) ir yra labai reaktyvūs – reaguoja su įvairiais organiniais substratais, ypač lipidais, baltymais ir genetine medžiaga [9,11,20].

Mokslinėje literatūroje dažnai minimas terminas „reaktyvios deguonies formos“ (RDF) apjungia ne tik laisvuosius radikalus, bet ir neradikalinius deguonies junginius, pasižyminčius didesniu aktyvumu už molekulinį deguonį (O2) ir galinčius lengvai virsti radikalais (vienas jų – vandenilio peroksidas (H2O2)) [18,21]. Radikaliniai ir neradikaliniai aktyvieji junginiai yra skirstomi į dvi pagrindines grupes: RDF ir reaktyvios azoto formos (RAF). Skirtumas tarp šių junginių yra RAF sudėtyje esantis azoto atomas [22]. Gamtoje taip pat egzistuoja ir reaktyvios sieros bei halogenų formos [10,18]. Taigi visi laisvieji radikalai yra RDF/RAF, bet ne visos RDF/RAF yra radikalai [18,21].

1.1.2. Laisvųjų radikalų susidarymo šaltiniai

Mokslininkai išskiria du pagrindinius RDF susidarymo šaltinius: endogeninius (vidinius) ir egzogeninius (išorinius) [17,22,23]. Pagrindinis eukariotinių ląstelių endogeninis RDF šaltinis – mitochondrijos, kuriose fiziologinėmis sąlygomis, vykstant ląsteliniam kvėpavimui, pagaminama daugiau nei 90 proc. visų endogeninių RDF [21,24–28]. Beveik visas ląstelinio kvėpavimo metu sunaudojamas O2 oksiduojamas, susidarant nekenksmingam produktui – vandeniui (H2O) [21,23], tačiau apie 1–2 proc. O2 nepilnai redukuojama tik vienu elektronu. Tokios dalinės redukcijos produktas – O2-· toliau gali būti verčiamas į H2O2, o iš jo, Fentono reakcijos metu, gali susidaryti pats aktyviausias OH· radikalas [19,21,23,27,29]. Kitiems endogeniniams RDF šaltiniams priskiriami įvairūs fermentai, ypač oksidazės, taip pat peroksisomos, endoplazminis tinklas bei fagocitai [21,23,26,29,30]. Uždegimo, didelio fizinio krūvio metu, infekcijos, išemijos bei senėjimo procesų metu taip pat susidaro RDF/RAF [9].

Dėl egzogeninių veiksnių organizme susidaro kur kas didesni laisvųjų radikalų kiekiai nei fiziologinėmis sąlygomis [22,31]. Prie egzogeninių laisvųjų radikalų šaltinių priskiriami: cigarečių dūmai, oro ir vandens teršalai, radiacija, ultarvioletinė ir mikrobangų spinduliuotės, pesticidai, ozonas, alkoholis, tam tikri vaistai (pavyzdžiui, ciklosporinas, takrolimuzas, gentamicinas), sunkieji metalai, didelis fizinis krūvis, nepilnavertė mityba ar badavimas bei stresas [9,22,32–36]. Mokslininkai teigia, jog laisvųjų radikalų susidarymas organizme yra tiek fiziologinis, tiek patologinis reiškinys [31].

1.1.3. Laisvųjų radikalų fiziologinė reikšmė

Nustatyta, jog fiziologinėmis sąlygomis susidarantys maži RDF kiekiai, yra normalaus organizmo metabolizmo produktai. Priklausomai nuo koncentracijos, jie gali būti naudingi arba žalingi ląstelėms ir audiniams [27,31,37]. Žinoma, jog kraujagyslių endotelio ląstelės produkuoja NO·, kaip endotelį atpalaiduojantį faktorių [21,32]. „Fiziologinėmis koncentracijomis“ RDF sąveikauja su signalinėmis molekulėmis, tokiu būdu reguliuodamos įvairius ląstelinius procesus, pavyzdžiui: proliferaciją, diferenciaciją, apoptozę, uždegimo slopinamąjį poveikį, genų raišką bei geležies homeostazę [10,20,21,26,38–40].

Maži RDF kiekiai indukuoja autofagiją, kaip apsauginį mechanizmą, siekiant pašalinti pažeistas mitochondrijas, kurios nekontroliuojamai produkuoja RDF ir tokiu būdu apsaugo ląstelę nuo apoptozės [31]. RDF sukeliama autofagija pritaikoma kai kurių ligų gydymui, pavyzdžiui, vaistas tamoksifenas skatina RDF susidarymą, aktyvina autofagiją ir yra naudojamas vėžio gydyme [30]. Esant oksidacinio streso būsenai, autofagija gali tapti nevaldoma ir sukelti ląstelių žūtį ar net skatinti kancerogenezę [41].

1.2.

Oksidacinio streso charakteristika

1.2.1. Oksidacinio steso apibūdinimas ir priežastys

Normaliomis sąlygomis RDF susidarymas ir jų eliminavimas žmogaus organizme yra tiksliai reguliuojamas procesas, užtikrinantis mažą RDF kiekį. Vis dėlto, tam tikromis sąlygomis ši pusiausvyra gali būti suardyta [21]. Kai organizme susidaro RDF perteklius, sukeliamas fenomenas vadinamas „oksidaciniu stresu“, tai yra žalingas procesas, kuris gali pažeisti ląstelės membraną ir kitas struktūras. Oksidacinis stresas pasireiškia tuomet, kai ląstelės nebegali efektyviai neutralizuoti susidariusio RDF pertekliaus ir tokiu būdu yra sutrikdomas ląstelės redokso balansas (1 pav.) [9].

Viena oksidacinio streso priežasčių yra ląstelės antioksidacinės sistemos pajėgumo sumažėjimas, dėl sumažėjusio antioksidacinių fermentų aktyvumo ar/ir antioksidantų kiekio organizme

[10]. Oksidacinis stresas taip pat gali būti sąlygotas padidėjusios RDF produkcijos organizme dėl egzogeninių ar endogeninių faktorių poveikio [18].

Didžioji dalis organizmo molekulių nėra radikalinės. Kai laisvasis radikalas reaguoja su neradikalu, susidaro naujas radikalas ir prasideda grandininės reakcijos [18]. Laisvųjų radikalų taikiniais gali būti lipidai, baltymai ar DNR. Atakuodami šias biomolekules, laisvieji radikalai sukelia jų oksidacines pažaidas [8,42]. Šių pažaidų padariniai priklauso nuo RDF kiekio, susidarymo vietos ir oksiduojamų biomolekulių kilmės [21].

1 pav. Oksidacinis stresas, jį sukeliančios priežastys [10,43]

1.2.2. Oksidacinio streso sukeliama žala žmogaus organizmui

Ląstelės membranų lipidai yra ypač jautrūs laisvųjų radikalų sukeliamai oksidacijai. Kai RDF reaguoja su lipidais, vyksta LPO [11]. LPO apibūdinamas kaip grandininis procesas, kurio metu laisvieji radikalai atakuoja lipidus, ypač polinesočiąsias riebalų rūgštis, susidarant lipidų hidroperoksidams (LOOH) ir lipidų peroksidų radikalams (LOO·). Šis procesas vadinamas grandininiu, nes susidarę LOO· toliau reaguoja su kitomis lipidų molekulėmis, susidarant naujiems radikalams [44]. Vienas svarbiausių galutinių LPO produktų yra MDA [45].

MDA, iš kitų LPO metu susidariusių produktų, išsiskiria stipriausiomis mutageniškomis savybėmis [44,46]. Yra žinoma, jog MDA gali sąveikauti su DNR nukleotidais, sukelti mutacijas, sustabdyti ląstelės ciklą ir indukuoti apoptozę [44]. Šio aldehido sukelti DNR pokyčiai gali prisidėti prie vėžio ir kitų genetinių ligų atsiradimo [44]. MDA taip pat reaguoja su organizmo baltymais ir sukelia jų funkcijų sutrikimus [45]. LPO ir jos metu susidarę produktai smarkiai pažeidžia ląstelės ir jos organelių membranų vientisumą bei pralaidumą [44]. Visi minėti pažeidimai lemia įvairių ligų atsiradimą ar jų progresavimą [44–46].

Oksidacinis stresas sukelia tam tikras nėštumo komplikacijas, LPO produktai pažeidžia endotelio kraujagysles, todėl oksidacinis stresas laikomas labai svarbiu veiksniu placentos bei gimdos augimo patologijose. Padidėjęs RDF kiekis siejamas ir su kitomis reprodukcinės sistemos patologijomis, pavyzdžiui, endometrioze ar pasikartojančiais persileidimais [39]. Tyrimai rodo, jog oksidacinis stresas sukelia ląstelių dieferenciacijos sutrikimus, dėl kurių vystosi osteoporozė, reumatoidinis artritas bei antrojo tipo cukrinis diabetas [47]. Cukrinio diabeto metu, esant hiperglikeminei būklei, susidarę laisvieji radikalai skatina diabetinių komplikacijų pasireiškimą. RDF sukelia mikrokraujagyslių disfunkciją ir lemia diabetinės neuropatijos bei retinopatijos išsivystymą [48,49]. Tyrimai su žmogaus plaukais rodo, jog senstančių individų plaukų žilėjimas susijęs su RDF sukelta melanocitų apoptoze plaukų folikuluose [50,51].

Smegenys yra jautriausios oksidacinio streso pažeidimams, nes čia yra didelė oksiduotis linkusių lipidų koncentracija [46,52]. Oksidacinio streso poveikis centrinei nervų sistemai lemia padidėjusį kraujo-smegenų barjero pralaidumą, neurogenezės bei neurotransmisijos procesų sutrikdymus [52]. Laisvieji radikalai atakuoja nervines ląsteles ir skatina neurodegeneraciją bei ligų, tokių kaip demencija, Alzheimeris bei Parkinsonas, vystymąsi [22,52–54].

Oksidacinis stresas siejamas su įvairių širdies ir kraujagyslių ligų patogeneze, įskaitant aterosklerozę [55]. Viena iš ankstyvųjų aterosklerozės formavimosi mechanizmų teorijų vadinama „oksidacinė aterosklerozės teorija“ [45]. Ši teorija teigia, jog RDF pažeidžia kraujagyslių sienelės ir skatina aterogenezę [45,55], sutrikdo kraujagyslių vazodilataciją, taip didindamos arterinės hipertenzijos išsivystymo riziką [56,57].

Su amžiumi organizmo antioksidacinės sistemos pajėgumas mažėja, o laisvųjų radikalų generacija didėja. Manoma, jog šis disbalansas sukelia ląstelės struktūrų pažeidimus ir fenotipo senėjimą [50].

1.3.

Antioksidacinės sistemos charakteristika

1.3.1. Antioksidantų apibūdinimas, veikimas ir klasifikacija

RDF kiekį ląstelėse reguliuoja antioksidacinė sistema, kurios tikslas – neutralizuoti organizme susidariusį laisvųjų radikalų perteklių, tokiu būdu apsaugant ląsteles nuo RDF toksinio poveikio ir prisidedant prie ligų prevencijos [9,47].

Antioksidantais laikomos medžiagos, apsaugančios molekulę taikinę nuo oksidacinio pažeidimo ar pašalinančios jį [58,59]. Antioksidantas reaguoja su oksidantu (RDF) ir jį neutralizuoja arba regeneruoja kitas molekules, galinčias reaguoti su oksidantu [58]. Viena antioksidanto molekulė gali reaguoti tik su vienu laisvuoju radikalu ir jį neutralizuoti, atiduodant vieną iš savų elektronų [36].

Sunaikinęs laisvąjį radikalą, antioksidantas oksiduojasi, todėl šios medžiagos organizme nuolatos turi būti atkuriamos [9].

Antioksidacinė sistema yra klasifikuojama į dvi dideles grupes: fermentiniai antioksidantai ir nefermentiniai antioksidantai (2 pav.) [60,61].

2 pav. Antioksidantų klasifikacija [36,61]

Fermentiniai antioksidantai pagal veikimo principus išskiriami į dvi grupes: pirminiai ir antriniai [17,61]. Antioksidantai, kurie nutraukia laisvųjų radikalų sukeliamas grandinines reakcijas, vadinami pirminiais. Šiai antioksidantų grupei priskiriami fermentai: superoksido dismutazė (SOD), glutationo peroksidazė (GSHPX) ir katalazė (CAT) [61]. SOD katalizuoja O2-· redukciją iki H2O2, kuris yra vėlesnis CAT substratas [9]. H2O2 gali dalyvauti Fentono reakcijose susidarant OH·. CAT ir GSHPX verčia OH· į H2O ir O2 [39]. Oksiduodama GSH, GSHPX geba redukuoti H2O2 iki H2O ir O2, susidarant oksiduotam glutationui (GSSG) [9]. Antriniai antioksidantai tiesiogiai RDF neutralizavime nedalyvauja, tačiau redukuoja oksiduotas antioksidantų molekules [17]. Glutationo reduktazė (GR) redukuoja GSSG, o gliukozės 6-fosfatdehidrogenazė (G-6-PDH) regeneruoja NADP+, kuris reikalingas GSSG redukcijai (3 pav.) [9,39].

Nefermentiniai antioksidantai skiriami į dvi grupes: metaboliniai ir maistinių medžiagų antioksidantai. Metaboliniai antioksidantai, tokie kaip lipoinė rūgštis, GSH, kofermentas Q10 (ubichinonas), melatoninas, šlapimo rūgštis, bilirubinas bei metalus sujungiantys baltymai, yra sintetinami organizme [9,32]. Kiti antioksidantai, pavyzdžiui, askorbo rūgštis (vitaminas C), tokoferolis (vitaminas E), karotenoidai, mineralai (Zn, selenas (Se)), flavonoidai, fenolinės rūgštys, omega-3 ir omega-6 riebalų rūgštys, nėra sintetinami organizme, todėl turi būti gaunami su maistu.

Nefermentiniai antioksidantai yra gyvybiškai svarbūs, nes gali įeiti į antioksidacinių fermentų aktyviojo centro struktūrą, veikti kaip kofaktoriai ar patys neutralizuoti RDF [39].

3 pav. Laisvųjų radikalų susidarymo organizme šaltiniai (faktoriai) ir pagrindiniai ląstelės antioksidacinės sistemos fermentai [30,39,62]

1.3.2. Redukuoto glutationo vaidmuo antioksidacinėje sistemoje

GSH yra gausiausias nefermentinis viduląstelinis antioksidantas, aptinkamas kiekvienoje organizmo ląstelėje milimolinėmis koncentracijomis [63]. Tai tripeptidas (γ-glutamilcisteinilglicinas), sudarytas iš glutamo rūgšties, cisteino ir glicino bei turintis merkapto grupę (-SH). Šis tripeptidas egzistuoja redukuota (GSH) ir oksiduota – glutationo disulfido (GSSG) formomis. Oksiduota glutationo forma susideda iš dviejų oksiduotų GSH liekanų, tarpusavyje sujungtų disulfidiniu ryšiu [64]. Esant normaliam ląstelės redokso balansui, redukuotas tripeptidas pasiskirstęs įvairių organų ląstelių citozoliuose, branduoliuose, endoplazminiuose tinkluose bei mitochondrijose [65].

GSH gali tiesiogiai neutralizuoti laisvuosius radikalus (OH· ir O2-·) ar veikti kaip antioksidacinių fermentų (GSHPX ir glutationo-S-transferazės (GST)) kofaktorius [65]. Šis tripeptidas dalyvauja redukuojant produktus, susidariusius RDF oksidacinės sąveikos su ląstelės komponentais metu, pavyzdžiui, lipidų oksidacijos metu susidariusį MDA. GSH dalyvauja šalinant lipidų oksidacijos produktus ir nutraukdamas LPO grandinines reakcijas, apsaugo biologines membranas [21]. Žinoma, jog tarp GSH ir baltymų -SH grupių susiformuoja disulfidai (procesas vadinamas glutationilinimu), tokiu būdu baltymų -SH grupės apsaugomos nuo oksidacijos [66]. GSH dalyvauja GST katalizuojamose elektrofilinių junginių ir ksenobiotikų neutralizacijos reakcijose, taip prisidėdamas

prie jų pašalinimo iš organizmo. Pavyzdžiui, vienas populiariausių analgetikų – acetaminofenas (paracetamolis) yra detoksikuojamas konjugacijos su GSH metu, toksinės šio preparato dozės išeikvoja GSH atsargas hepatocituose, sukelia oksidacinį stresą bei įvairius kepenų pažeidimus [67,68]. Literatūroje nurodoma, jog GSH geba regeneruoti kitus antioksidantus, pavyzdžiui, vitaminą C ir E bei dalyvauja DNR sintezėje [60,64,69]. GSH gali sąveikauti su metalų jonais, kuriuos geba prijungti struktūroje esanti -SH grupė, tokiu būdu apsaugodamas ląsteles nuo toksinio jų poveikio [21].

1.4.

Nikelis, jo savybės ir biologinis poveikis

1.4.1. Nikelio savybės ir paplitimas aplinkoje

Nikelis (Ni) yra kietas, sidabriškai baltas, pereinamasis metalas, kurio atominis skaičius – 28, o santykinė atominė masė – 58,71 [1,70]. Ni yra penkių stabilių izotopų mišinys [71]. Nors Ni gali egzistuoti keliais skirtingais oksidacijos laipsniais, tačiau normaliomis sąlygomis būna dvivalentis [1,71–73]. Šis metalas yra natūraliai sutinkamas elementas, randamas įvairiuose mineraluose, dažniausiai junginiuose su siera ar geležimi [71,74].

Ni plačiai pasiskirstęs aplinkoje, bei yra aptinkamas Žemės plutoje, kur pagal paplitimą yra 24-tas elementas [71]. Į aplinką šis metalas patenka tiek iš natūralių, tiek iš antropogeninų šaltinių [71,75,76]. Dėl savo unikalių fizikinių ir cheminių savybių, ypač dėl atsparumo korozijai, metalinis Ni ir jo junginiai yra plačiai naudojami modernioje pramonėje [71,75]. Ni lydiniai naudojami galvanizavime, Ni-kadmio baterijų bei nerūdijančio plieno gamyboje. Šis metalas taip pat naudojamas papuošalų, laikrodžių, monetų, keramikos, medicininių protezų, įvairių įrankių, elektroninių prietaisų bei dantų karūnėlių gamyboje [1,70,71,73,75,77].

Dėl didėjančio Ni poreikio pramonėje, ypač dėl nerūdijančio plieno gamybos, jo eksploatavimas kiekvienais metais didėja apie 6 proc. [78]. Auganti Ni gavyba iš rūdų ir jo panaudojimas lėmė padidėjusius šio metalo kiekius aplinkoje [73]. Ni turinčių produktų gamyba, apdirbimas, perdirbimas bei atliekų išmetimas į aplinką lėmė vandens, dirvos ir aplinkos oro užteršumą, kur šio metalo kiekis, priklausomai nuo šaltinio, gali svyruoti nuo 25 ng/m3

iki 170 ng/m3 [73,75]. Dėl plataus šio metalo vartojimo, vis didesni jo kiekiai patenka į žmogaus organizmą [6,79,80].

1.4.2. Nikelio poveikis žmogaus organizmui

Manoma, jog Ni yra būtinasis elementas keletai gyvūnų rūšių, mikroorganizmams ir augalams, kur jis yra sudedamoji fermentų ir baltymų dalis [1,71,81]. Yra žinomi septyni, nuo Ni

priklausantys, mikroorganizmų fermentai (pavyzdžiui, ureazė, hidrogenazė). Bakterija Helicobacter

Pylori, sukelianti opas ir skrandžio vėžį, turi nuo Ni priklausomą ureazę. Manoma, jog gali būti ryšys

tarp Ni suvartojimo, Helicobacter Pylori augimo bei opų vystymosi. Literatūroje yra duomenų, jog Ni nanomolinėmis koncentracijomis yra reikalingas palaikyti normaliai žarnyno mikroflorai, nors didesnės šio metalo koncentracijos sumažina gerųjų bakterijų kiekį (Bifidobacterium spp.,

Lactobacillus spp.) [72,75,82].

Ni reikšmė aukštesniesiems organizmams yra abejotina [72], plačiai paplitęs jis nuolat veikia žmogaus organizmą, todėl šio metalo trūkumas nėra nustatomas [71]. Aukštesniuosiuose organzimuose iki šiol nėra žinomi jokie fermentai ar kofaktoriai, kurie savo sudėtyje turėtų Ni [72], todėl šio metalo poreikis žmogui nėra galutinai įrodytas [71,77].

Įvairūs moksliniai tyrimai rodo, jog Ni junginiai yra toksiški žmogaus organizmui [1,77]. Toksinis poveikis priklauso nuo Ni junginių tirpumo, koncentracijos ir veikimo būdo [74,77]. Remiantis farmakokinetikos tyrimais, Ni yra absorbuojamas per plaučius, virškinamąjį traktą ir odą (4 pav.) [72,74,77,80]. Priklausomai nuo šio metalo cheminės formos ir tirpumo, Ni į ląsteles gali patekti jonų kanalais, difuzijos ar endocitozės būdais [44,80]. Vandenyje tirpios Ni formos (chloridas, nitratas, sulfatas) yra greičiau absorbuojamos [71]. Remiantis skirtingų autorių duomenimis, žmogaus virškinamasis traktas su maistu patenkančio Ni absorbuoja apie 1–25 proc. [72,74]. Šio metalo absorbcija iš vandens yra maždaug 40 kartų didesnė nei iš maisto produktų [71]. Kartu su geriamuoju vandeniu ir maistu į organizmą patenka didžiausi kiekiai Ni, todėl Lietuvos Respublikos higienos normos reglamentuoja leistinus Ni kiekius geriamajame vandenyje bei didžiausius leistinus migruojančio Ni kiekius į maistą iš medžiagų ir gaminių, skirtų liestis su maistu [83,84].

Ni pasižymi daugybiniais toksiniais poveikiais įvairioms organizmo sistemoms ir organams [85]. Remiantis mokslininkų in vivo ir in vitro tyrimų rezultatais, Ni junginiai toksiškai veikia imuminę, nervų, reprodukcinę, kvėpavimo sistemas, pažeidžia kepenis, inkstus, kraują, genetinę medžiagą, sutrikdo vaisiaus vystymąsi bei yra potencialūs kancerogenai [74,86]. Ni laikomas vienu didžiausių alergenų, sukeliančių kontaktinį dermatitą [6,79]. Epidemiologiniai duomenys rodo, jog apie 8–10 proc. moterų ir 1–2 proc. vyrų yra alergiški Ni [71,80].

Ni geba prasiskverbti pro placentos barjerą, veikti ten besivystantį vaisių bei patekti į maitinančios moters pieną [1,75,80]. Tyrimai rodo, jog daugumoje vaisiaus bei vaikų organų ir audinių Ni koncentracija yra žymiai didesnė negu atitinkamuose motinos organuose ir audiniuose [86]. Poveikis vaikų organizmui ypač aktualus tuose regionuose, kuriuose plėtojama Ni pramonė ar intensyviai vyksta elektronikos atliekų perdirbimas [87,88]. Tyrimų metu nustatyta, jog nėščiųjų, gyvenančių Ni užterštose vietovėse, virkštelių kraujo mėginiuose nustatyti didesni Ni ir 8-hidroksideoksiguanozino (8-OHdG) kiekiai, rodantys naujagimių DNR pažeidimus [88]. Tyrimai su gyvūnais rodo, jog esant Ni poveikiui gali sumažėti vaisiaus kūno svoris, pasireikšti įvairūs

išsigimimai, neišsivystyti smegenys, didėti naujagimių mirštamumo ir augimo sutrikimų rizika [1]. Taip pat pastebėta, jog nėščioms moterims, dirbančioms Ni perdirbimo gamyklose, didėja spontaninių persileidimų atvejų skaičius [74].

Nervų sistema yra viena pagrindinių Ni taikinių, nes pereidamas kraujo-smegenų barjerą, šis metalas gali kauptis smegenyse [89]. Esant Ni poveikiui gali pasireikšti įvairūs neurologiniai simptomai, pavyzdžiui: galvos skausmas, svaigulys, nuovargis ir letargija [74]. In vitro tyrimų su nervinėmis ląstelėmis metu įrodyta, jog Ni neurotoksiškumas susijęs su neuronų jonų kanalų veikimu, poveikiu į glutamato receptorius ir genų raiškos pokyčiais [85,89]. Padidėjęs ar sumažėjęs glutamato receptorių aktyvinimas siejamas su įvairiomis centrinės nervų sistemos ligomis, pavyzdžiui, insultu, šizofrenija ar neurodegeneracinėmis ligomis [89] .

Ni toksiškai veikia ne tik įvairius organus ir audinius, bet ir kraują [74,90]. Tyrimų su žiurkėmis metu nustatyta, jog Ni junginiai slopina kraujodaros kamieninių ląstelių aktyvumą, taip sumažindami eritrocitų bei hemoglobino kiekį kraujyje ir sukeldami anemiją [74]. Literatūroje nurodoma, jog Ni inhibuoja tromboksano A2 formavimąsi, tokiu būdu slopindamas trombocitų agregaciją bei prailgindamas krešėjimo laiką [90]. Taip pat įrodyta, jog Ni gali veikti širdies veiklą ir sukelti aritmijas [91].

Vienas pavojingiausių Ni patekimo į žmogaus organizmą būdas yra inhaliacinis [72,92]. Epidemiologinių studijų rezultatai rodo, jog Ni didina kvėpavimo takų ligų, pavyzdžiui, atrofinio rinito, bronchito, astmos bei plaučių ir nosies sinusų vėžio riziką [77,80,92,93]. Tyrimai rodo, jog darbuotojų, dirbančių Ni kasybos, perdirbimo ar lydymo srityse, mirtingumas nuo kvėpavimo takų piktybinių navikų yra padidėjęs [72,92]. Nustatyta, jog esant Ni junginių koncentracijai dulkėse daugiau nei 10 mg/m-3,reikšmingai padidėja rizika išsivystyti plaučių ir nosies vėžiui [77].

1.4.3. Nikelio toksinio ir kancerogeninio poveikio mechanizmai

Tarptautinė vežio tyrimų agentūra visus Ni (II) junginius priskiria žmogaus kancerogenams, o metalinis Ni klasifikuojamas kaip galimai kancerogeniškas žmogui [74,94]. Vis dėlto, tikslus šio metalo kancerogeniškumo mechanizmas dar nėra iki galo išaiškintas. Manoma, jog Ni kancerogeninis poveikis susijęs su keletu mechanizmų (4 pav.) [77,80].

Vienas galimų Ni toksinio poveikio mechanizmų – oksidacinio streso sukėlimas. Lyginant su kitais metalais (chromu, kadmiu), metalinio Ni sukeliamo oksidacinio streso intensyvumas yra gana mažas [7], tačiau Ni (II)-tiolių kompleksai, dalyvaudami Fentono tipo reakcijose, gali generuoti didelius laisvųjų radikalų kiekius [5,7,73,95]. Ni poveikyje susidariusios RDF inhibuoja antioksidacinius fermentus (CAT ir GSHPX) bei išeikvoja GSH atsargas [96].

Iš citozolio Ni patenka į branduolį ir kitas organeles, kur taip pat generuoja laisvuosius radikalus [73]. Tyrimo su Ni junginiais paveiktomis Kininio žiurkėnio kiaušidžių ląstelėmis metu, jau po 6 valandų buvo nustatomi oksidantai, susidarę ląstelės citozolyje, o po 18 valandų – branduolyje [75]. Ni poveikyje susidarę laisvieji radikalai sukelia branduolyje esančios DNR oksidacines pažaidas [73,88,97]. Oksidacinis DNR pažeidimas laikomas vienu svarbiausių mechanizmų, susijusių su įvairių ligų bei vėžio išsivystymu [5].

Ni jonų sąveika su DNR nėra reikšminga, tačiau šis metalas aktyviai sąveikauja su branduolio baltymais, ypač su histonais ir protaminais [77]. Dėl šios sąveikos aktyvinamas DNR metilinimas, sukeliamas histonų deacetilinimas bei genų raiškos slopinimas [5,73]. Pakitusi genų raiška sąlygoja vėžio vystymąsi ir progresavimą [5].

Manoma, jog kitas Ni kancerogeniškumo mechanizmas gali būti susijęs su hipoksijos indukuojamo faktoriaus (HIF-1) aktyvinimu [5,92,98]. HIF-1 lemia genų, padidinančių ląstelės atsparumą deguonies trūkumui, transkripciją [99], todėl Ni sukeltas šio faktoriaus aktyvumo padidėjimas skatina auglio progresavimą [92].

Tyrimų su Ni paveiktomis žmogaus inkstų epitelinėmis ląstelėmis metu buvo nustatyta p53 geno mutacija. P53 genas – tai naviką slopinantis genas, dalyvaujantis ląstelės proliferacijos ir apoptozės procesuose [80]. P53 geno mutacijos yra dažniausi genų pakitimai, nustatomi sergant vėžiu. Visa tai rodo Ni gebėjimą žinduolių ląstelėse veikti mutageniškai [5]. Taip pat manoma, jog Ni aktyvina protoonkogeną c-Myc ir indukuoja transkripcijos faktorių AP-1 ir tokiu būdu aktyvina vėžinių ląstelių proliferaciją [5].

Kitas galimas Ni karcinogenezės mechanizmas gali būti susijęs su jo geba slopinti DNR reperacijos procesą [95,100]. Įrodyta, jog Ni inhibuoja DNR reparaciją ir veikia sinergistiškai su kitais mutageniniais kancerogenais, padidindamas DNR pežeidžiančių veiksnių citotoksiškumą ir genotoksiskumą [92].

4 pav. Ni patekimo į žmogaus organizmą būdai ir jame sukeliamo toksinio ir kancerogeninio poveikių mechanizmai

1.5.

Cinko poveikis žmogaus organizmui

1.5.1. Cinko pasiskirstymas organizme, poreikis ir funkcijos

Dvivalentis Zn katijonas (Zn2+) pagal pasiskirstymą žmogaus organizme, yra antras pereinamasis metalas, po geležies [101–103]. Žmogaus organizme yra nuo 2 iki 4 g Zn [12,104]. Maždaug 80–90 proc. viso organizmo Zn kiekio aptinkama kauluose ir raumenyse, likęs kiekis pasiskirstęs kepenyse, inkstuose, prostatoje, odoje, akyse, širdyje bei smegenyse [12,103,105,106]. Literatūroje nurodoma, jog normali šio metalo koncentracija kraujo plazmoje svyruoja nuo 12–16 µmol/l iki 9–17 µmol/l [12,107]. Zn trūkumas siejamas su daugybe patologinių būklių, tačiau šio metalo perteklius yra toksiškas [12,108].

Rekomenduojama Zn paros dozė (RPD) tarp skirtingų amžiaus grupių svyruoja nuo 2 iki 13 mg per dieną [106], tačiau šio metalo pasisavinimas siekia tik 30 proc. [109]. Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, nustatyta Zn RPD suaugusiems vyrams yra 9,4 mg, o moterims – 6,5 mg [108]. Zn poreikis naujagimiams, vaikams, paaugliams, bei nėščiosioms ir maitinančioms moterimis yra didesnis, todėl jiems taikytinos Zn RPD yra didesnės [103,108].

Antioksidacinis Zn poveikis žmogaus organizme pasireiškia skirtingais mechanizmais [14]. Būdamas NADPH oksidazių inhibitorius, Zn geba sumažinti jų sukeliamą RDF generaciją [110]. Zn yra būtinas kai kuriems baltymams, palaikantiems antioksidacinę ląstelės būklę. Šis metalas yra fermento SOD kofaktorius. Yra žinoma, jog Zn konkuruoja su geležies ir vario jonais dėl prisijungimo prie ląstelių membranų ir baltymų, tokiu būdu juos išstumdamas ir neleisdamas minėtiems metalams Fentono reakcijos metu katalizuoti OH· susidarymo iš H2O2 [14,111]. Literatūroje nurodoma, jog Zn geba prisijungti prie biomolekulių –SH grupių ir tokiu būdu jas apsaugoti nuo laisvųjų radikalų sukeliamos oksidacijos. Esant ilgalaikiam Zn poveikiui, aktyvinama baltymų metalotioneinų, gebančių neutralizuoti OH·, sintezė [112]. Zn didina viduląstelinių antioksidantų, tokių kaip GSH, SOD, CAT, pajėgumą. Manoma, jog šis metalas reguliuoja transkirpcijos faktoriaus Nrf2, atsakingo už antioksidacinių molekulių (GSH, SOD, GST) genų raišką, veiklą [14].

Zn reikalingas daugiau nei 300 fermentų katalitiniam aktyvumui, dalyvauja nukleino rūgščių metabolizme, ląstelių proliferacijoje, diferenciacijoje, augime ir daugelyje kitų procesų. Šis metalas yra svarbus imuninei funkcijai palaikyti, žaizdų gijimui, baltymų ir DNR sintezei, genų raiškai bei apoptozei [13,103,113,114]. Zn reikalingas palaikyti normaliai uoslei, skonio jutimui, regėjimui, normaliam augimui ir vystymuisi bei neurogenezės ir neurotransmisijos procesams. Mažomis koncentracijomis šio metalo jonai pasižymi antibakteriniu aktyvumu [103,109].

Įvairių tyrimų metu įrodyta, jog Zn geba veikti kaip antioksidantas ir apsaugoti organizmą nuo oksidacinio streso ar sumažinti jo intensyvumą. Nors šis metalas yra organizmui būtinas mikroelementas, tyrimai rodo, jog Zn gali veikti prieštaringai ir pats sukelti RDF generaciją bei oksidacinį stresą. Mokslininkai mano, jog svarbiausias Zn toksinio poveikio mechanizmas gali būti

susijęs su jo geba inhibuoti GR, kuri yra būtina atstatant GSH kiekius. Esant šio fermento aktyvumo sumažėjimui, sutrikdoma pusiausvyra tarp GSH ir GSSG kiekių ir gali pasireikšti oksidacinis stresas [115].

1.5.2. Cinko pertekliaus ir trūkumo organizme sukeliamos būklės

Vartojant Zn papildus didelėmis dozėmis, gali pasireikšti toksinis poveikis. Apsinuodijimai Zn dažniausiai pasitaiko ilgą laiką vartojant padidintas Zn maisto papildų dozes [108]. Esant ūmiam apsinuodijimui Zn, pasireiškia virškinamojo trakto sutrikimai, mieguistumas, galvos skausmas, svaigimas, širdies veiklos sutrikimai; sunkesniais atvejais dėl plaučių edemos ir kepenų pažeidimo – sąmonės praradimas, koma bei mirtis [105,108]. Lėtinė intoksikacija šiuo metalu sumažima vario (Cu), SOD kiekius, sukelia anemiją, leukopeniją, sutrikdo širdies veiklą, padidina didelio tankio lipoproteinų kiekį [103,105,108].

Manoma, jog daugiau nei 20 proc. asmenų pasaulyje susiduria su Zn trūkumu, tai ypač aktualu besivystančiose šalyse [105]. Zn trūkumas organizme nustatomas tuomet, kai jo koncentracija kraujo plazmos mėginiuose yra mažesnė nei 10,71 µmol/l [106]. Zn stokos etiologija klasifikuojama į keturis tipus: nepakankamas Zn suvartojimas, pernelyg didelis Zn netekimas, malabsorbcija bei padidėjęs Zn poreikis [106]. Nėščiosioms ir žindančiosioms yra didesnė rizika patirti Zn stoką [103]. Vegetarai taip pat patenka į Zn stokos rizikos grupę dėl dažnai vartojamų grūdinių, ankštinių pruduktų, kurių sudėtyje yra fitatų, inhibuojančių Zn absrobciją [101]. Tam tikrų vaistų vartojimas, pavyzdžiui, chinolonų ir tetraciklinų grupių antibiotikų bei tiazidinių diuretikų, taip pat gali lemti Zn sumažėjimą organizme [103].

Zn trūkumas pasireiškia augimo sulėtėjimu, apetito praradimu ir sutrikusia imunine funkcija. Sunkesniais atvejais, Zn trūkumas sukelia plaukų slinkimą, viduriavimą, vėlesnį lytinį brendimą, impotenciją, vyrų hipogonadizmą, akių ir odos pažeidimus. Taip pat gali pasireikšti svorio kritimas, lėtesnis žaizdų gijimas, skonio anomalijos bei pažinimo funkcijų sutrikimas [103]. Sumažėjęs šio metalo kiekis gali būti pastebimas esant įvairiems organizmo funkcijų sutrikimams ir ligoms: viduriavimas, reumatoidinis artritas, pjautuvinė anemija, vėžys bei cukrinis diabetas [107].

Zn trūkumas sukelia infekcinio viduriavimo pasireiškimą, dėl kurio per metus miršta apie 800 tūkstančių vaikų [103]. PSO ir jungtinių tautų vaikų fondas nurodo, jog Zn vartojimas sumažina infekcinio viduriavimo trukmę ir sunkumą [116]. Ūminiam vaikų viduriavimui gydyti rekomenduojamas trumpalaikis Zn papildų vartojimas [103].

Zn trūkumas taip pat gali sukelti regėjimo tamsoje ir prieblandoje pablogėjimą. Esant amžinei geltonosios dėmės degeneracijai, žmogaus akyse taip pat nustatomas Zn trūkumas, galimai susijęs su

oksidacinio streso pasireiškimu ir tinklainės pažeidimu [117]. Tyrimai įrodo, jog papildomas Zn vartojimas 21 proc. sumažina amžinės geltonosios dėmės degeneracijos progresavimą bei 11 proc. regėjimo praradimo riziką [118].

Didelis Zn trūkumas silpnina imuninę sistemą, net ir mažas ar vidutinis šio metalo trūkumas gali pabloginti neutrofilų ir makrofagų funkcijas ir aktyvumą. Žmogaus organizmui Zn reikalingas T limfocitų formavimuisi ir aktyvacijai. Manoma, jog maži Zn kiekiai organizme susiję su vaikų, iš besivystančių šalių, bei senyvo amžiaus žmonių padidėjusiu imlumu plaučių uždegimui ir kitoms infekcijoms [103,104].

Zn pasižymi antioksidacinėmis ir uždegimą slopinančiomis savybėmis, todėl vartojamas peršalimo gydymui. Mokslininkai pateikia hipotezę, jog šis metalas gali veikti kaip antivirusinė medžiaga, tiesiogiai inhibuodamas vieną dažniausių peršalimo sukelėjų – rinovirusą bei sumažindamas tarpląstelinių adhezijos molekulių kiekius, reikalingus virusui prisijungti prie somatinių ląstelių paviršiaus [103,118,119]. Tyrimai rodo, jog Zn papildų vartojimas esant peršalimui, sumažina bendrą peršalimo bei peršalimo simptomų (kosulio, slogos) trukmę, lyginant su placebo grupe [119].

Zn atlieka svarbų vaidmenį palaikant normalų žaizdų gijimą ir audinių regeneraciją. Tiriant Zn oksido (ZnO) vietinį poveikį pelių žaizdoms, keratinocitų proliferacija padidėjo 30 proc. Nustatyta, jog šio metalo kiekis traumos vietoje padidėja nuo 15 iki 20 proc. Zn yra būtinas proteolitinių fermentų aktyvumui, taip pat dalyvauja pažeistų audinių reepitelizacijos procese bei kraujagyslių rekonstrukcijoje [106]. Tyrimai rodo, jog ZnO pasižymi vietiniu antibakteriniu poveikiu prieš

Staphylococcus aureus ir Mycobacterium bovis sukeltą odos infekciją [120].

Nurodoma, jog viena iš vyrų nevaisingumo priežasčų yra antikūnų prieš spermatozoidus (ASA) susidarymas. Tyrimas su nevaisingais vyrais, kurių spermoje buvo nustatyti ASA, parodė, jog Zn vartojimas reikšmingai sumažino ASA kiekius, padidino spermatozoidų koncentraciją, judrumą bei gyvybingumą [102]. Nustatyta, jog esant kitokių etiologijų vyrų nevaisingumui, spermoje nustatomas sumažėjęs Zn kiekis, lyginant su vaisingų vyrų sperma [121].

Dėl mažos Zn koncentracijos smegenyse, jo trūkumas gali sukelti įvairius nervų sistemos funkcijų pakitimus [12]. Depresija sergančių pacientų kraujyje aptinkamos mažesnės šio metalo koncentracijos, todėl manoma, jog Zn kiekis kraujyje gali būti potencialus šios ligos diagnostinis žymuo [122,123]. Metalo antidepresantinis mechanizmas siejamas su jo gebėjimu antagonistiškai veikti N-metil-D-aspartato (NMDA) receptorius bei akyvinti 5-hidroksitriptamino 1A receptorius (5-HT1A). Klinikinės studijos įrodo, jog papildomas Zn vartojimas kartu su antidepresantais gali pagerinti depresija sergančių pacientų būklę [124].

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1.

Tyrimo objektas ir reagentai

Moksliniai tyrimai su laboratorinėmis pelėmis buvo atlikti vadovaujantis šiuose įstatymuose bei įsakymuose nurodytais reikalavimais: Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo 14 straipsniu [Žin., 1997, Nr. 108-2728]; Valstybinės veterinarijos tarnybos 2008 m. gruodžio 18 d. įsakymu Nr. B1-639 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ [Žin., 2009, Nr. 8-2870]; 1999 m. sausio 18 d. įsakymu Nr. 4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ [Žin., 1999, Nr.: 49 -1591]; Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“ [Žin., 1999, Nr. 35-1053]; bei Europos etikos komiteto nustatytų reikalavimų darbui su laboratoriniais gyvūnais. Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2012-02-09 posėdžio protokolo Nr. 1 teigiama išvada buvo gautas leidimas atlikti mokslinius eksperimentus su laboratoriniais gyvūnais (leidimo Nr. 0221) (žr. Priedas Nr. 1).

Tyrimo objektas – 4–6 savaičių amžiaus nelinijinės baltosios laboratorinės pelės, sveriančios 20–25 g. Eksperimentams naudotos pelės buvo atsivežtos iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto veterinarijos akademijos vivariumo. Po atvežimo į laboratoriją, pelės 7 dienas laikytos karantino sąlygomis, pateles ir patinus atskiriant į skirtingus narvelius. Pelėms sudarytos optimalios laikymo sąlygos: patalpų temperatūra ~20 °C, santykinė oro drėgmė 55±10 proc., natūralus šviesos (diena/naktis) režimas. Pelės buvo šeriamos pilnaverčiu maistu ir girdomos vandentiekio vandeniu. Pakratams naudotas šienas ir medienos drožlės, kurie buvo keičiami kiekvieną dieną.

Eksperimentams atlikti buvo naudojami šie reagentai: Tris, tiobarbituro rūgštis (TBR), 5,5‘-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); kalio chloridas (KCl), fosforo rūgštis (H3PO4), nikelio chloridas (NiCl2) – firmos „Merck“ (Vokietija); cinko sulfatas (ZnSO4) – firmos „Lachema“ (Čekija); trichloracto rūgštis (TChA); n-butanolis, natrio fosfatas (Na3PO4), perchlorato rūgštis (HClO4), Tris-HCl buferis, 1,1,3,3-tetrahidroksipropanas.

Tirpalams gaminti naudotas dejonizuotas vanduo ir fiziologinis tirpalas. Tyrime naudotos elektroninės svarstyklės „Shimadzu AUW120D“ (Vokietija) bei „K-24“ centrifuga (Vokietija). GSH ir MDA koncentracijos nustatinėtos naudojant „LAMBDA 25“ (JAV) spektrofotometrą.

2.2.

Metalų poveikio laboratorinėms pelėms tyrimo modelis

Medžiagos toksinis poveikis dažniausiai vertinamas vidutine mirtina doze (LD50). LD50 – tai minimali medžiagos koncentracija, kuria paveikus bandomuosius gyvūnus, žūva pusė (50 proc.) jų. Darbe tyrinėjamų metalų (Zn ir Ni) toksiškumui įvertinti, nustatytos jų LD50 dozės eksperimente naudotoms baltosioms laboratorinėms pelėms. LD50 išreiškiama miligramais metalo, tenkančio bandomojo gyvūno vienam kūno masės kilogramui. Siekiant nustatyti metalų LD50 dozes, kiekviename narvelyje dešimčiai pelių į pilvo ertmę buvo sušvirkšta atitinkamo metalo druskos tirpalo. Tyrime naudotos NiCl2 ir ZnSO4 druskos, kurios buvo tirpinamos fiziologiniame tirpale. Praėjus parai po pelių intoksikavimo metalų druskų tirpalais, įvertinta, kiek procentų sudarė kritusios ir išgyvenusios pelės. Jei kritusių ir išgyvenusių pelių santykis pasiskirstė tolygiai po 50 proc., tai fiziologiniame tirpale ištirpęs metalų kiekis mg ir yra laikomas LD50. Jei kritusių ir išgyvenusių pelių skaičius nebuvo vienodas, LD50 paskaičiuota pagal formulę:

lgLD50 = lgDN – δ(ƩLi – 0,5) [125]

DN – eksperimente panaudota maksimali medžiagos dozė; δ – panaudotų dozių santykio logaritmas; Li – kritusių ir visų pelių, kurioms buvo įvedama medžiagos dozė, santykis; ƩLi – Li reikšmių, paskaičiuotų visoms panaudotoms dozėms, suma.

Nustatytos metalų dozės, atitinkančios LD50 yra: NiCl2 – 11,25 mg (192 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui; ZnSO4 – 10,3 mg (157 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui. Nustatytos metalų vidutinės mirtinos dozės padėjo pasirinkti, kokias Zn ir Ni dozes naudoti tolimesniuose tyrimuose, norint išvengti metalų perdozavimo ir pelių kritimo.

Siekiant įvertinti Zn ir Ni jonų poveikį laboratorinėms pelėms, buvo pasirinkti du tyrimo modeliai: vienkartinis (24 valandų) intoksikavimo modelis ir 14 dienų intoksikavimo modelis. Pelių intoksikavimui metalų druskų tirpalais pasirinktos injekcijos į pilvo ertmę, nes tai yra tikslesnis metodas, nei girdyti peles metalų druskų tirpalais per os būdu, kuomet sunku numatyti, kiek pelė per dieną išgers tirpalo.

Atliktuose tyrimuose taikant ūmaus vienkartinio (24 valandų) intoksikavimo modelį, tiriamosioms pelėms (n=64) į pilvo ertmę po vieną kartą buvo sušvirkštas vienodas kiekis fiziologinio tirpalo, kuriame ištirpintas reikalingas NiCl2 arba ZnSO4 kiekis. Organizmo veikimo metalų jonais trukmė – 24 valandos. Vienkartiniam 24 valandų trukmės intoksikacijai metalais, tiriamosios pelės suskirstytos į keturias grupes (1 lentelė).

1 lentelė. Vienkartinio (24 valandų) intoksikavimo modelis ir eksperimentinės pelių grupės Grupės Nr. Metalų druskų tirpalai Dozės dalis nuo LD50 reikšmės Dozė Tirpalų įvedimo būdas Intoksikacijos trukmė I NiCl2 0,5 LD50 5,62 mg (96 µmol) Ni/kg Injekcija į pilvo ertmę 24 valandos II ZnSO4 0,15 LD50 1,56 mg (24 µmol) Zn/kg III ZnSO4 ir po 20 min. NiCl2

Aukščiau minėtos dozės

IV (kontrolė) Fiziologinis

tirpalas -

Taikant 14 dienų trukmės intoksikavimo modelį, 14 dienų vieną kartą per dieną tiriamosioms pelėms (n=64) į pilvo ertmę buvo sušvirkštas vienodas fiziologinio tirpalo tūris, kuriame ištirpintas reikalingas NiCl2 arba ZnSO4 kiekis. 14 dienų intoksikacijai metalais, tiriamosios pelės taip pat buvo suskirstytos į keturias grupes (2 lentelė).

2 lentelė. 14 dienų intoksikavimo modelis ir eksperimentinės pelių grupės

Grupės Nr. Metalų druskų tirpalai Dozės dalis nuo LD50 reikšmės Dozė Tirpalų įvedimo būdas Intoksikacijos trukmė I NiCl2 0,1 LD50 1,12 mg (19 µmol) Ni/kg Injekcija į pilvo ertmę 14 dienų (po vieną injekciją kiekvieną dieną) II ZnSO4 0,15 LD50 _{µmol) Zn/kg} 1,56 mg (24 III ZnSO4 ir po 20 min. NiCl2

Aukščiau minėtos dozės

IV (kontrolė) Fiziologinis

tirpalas -

Praėjus intoksikacijos trukmei (24 valandoms arba 14 dienų), pelės buvo anestezuotos, atlikta cervikalinė dislokacija ir dekapitacija. Tolesniems tyrimams naudotos pelių kepenys ir kraujas. Siekiant įvertinti metalų poveikį antioksidacinei apsaugos sistemai, iš pelių kepenų ir kraujo mėginių buvo nustatinėjamos GSH ir MDA koncentracijos.

2.3.

Tyrimų metodai

2.3.1. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir

eritrocituose

GSH koncentracija pelių kepenyse buvo nustatyta pagal Moron ir bendraautorių pasiūlytą metodiką [126]. Pelių kepenys buvo pasvertos, perkeltos į plastikinius mėgintuvėlius ir pridėjus 6

tūrius (lyginant su kepenų mase) 5 proc. TChA, susmulkintos homogenizatoriumi. Gautas homogenatas 7 min. buvo centrifuguojamas 10000×g pagreičiu K-24 centrifuga. Praėjus centrifugavimo trukmei, atsiskyręs viršutinis vandeninis sluoksnis (supernatantas) nupiltas į mėgintuvėlius. Gautas supernatantas naudotas GSH koncentracijos nustatymui. GSH koncentracija nustatyta 3,0 ml tūrio reakcijos mišinyje, kurį sudarė: 2,0 ml 0,6 mM DTNB, 0,2 ml superantanto frakcijos ir 0,8 ml 0,2 M natrio fosfatinio tirpalo (reakcijos mišinio pH 8,0). Gautame mišinyje GSH koncentracija nustatyta naudojant instrumentinį analizės metodą – spektrofotometriją. Tirpalo sugertis matuota ties 412 nm bangos ilgiu, naudojant molinį sugerties koeficientą 13600. GSH koncentracija pelių kepenyse buvo išreikšta µmol vienam gramui kepenų masės.

GSH koncentracija pelių eritrocituose nustatyta pagal Sedlak ir bendraautorių pasiūlytą metodiką [127]. Reakcijos mišinį sudarė 0,2 ml kraujo, 1,8 ml dejonizuoto vandens ir 2,0 ml 0,6 M HClO4. Gautas 4,0 ml tūrio mišinys buvo 10 min. centrifuguojamas3000×g pagreičiu K-24 centrifuga. Po centrifugavimo nusiurbtas viršutinis vandeninis sluoksnis, buvo naudojamas GSH koncentracijai nustatyti. Į 1 ml gauto supernatanto įpilta 3,0 ml 0,4 M Tris-HCl buferinio tirpalo (pH 9,2) ir 50 µl DTNB. GSH koncentracija gautame mišinyje nustatyta spektrofotometriškai (bangos ilgis 412 nm, molinis sugerties koeficientas – 13600). GSH koncentracija pelių eritrocituose buvo išreikšta µmol viename litre (µmol/l).

2.3.2. Malondialdehido koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir eritrocituose

MDA koncentracija pelių kepenyse nustatyta pagal Uchiyama ir bendraautorių pasiūlytą metodiką [128]. Pasvertos pelių kepenys, perkeliamos į plastikinius mėgintuvėlius, kur pridėjus 9 tūrius (lyginant su kepenų mase) atšaldyto 1,15 proc. KCl tirpalo, susmulkinamos homogenizatoriumi. Į 0,5 ml gauto kepenų homogento įpylta 3,0 ml 1 proc. H3PO4 ir 1,0 ml 0,6 proc. TBR vandeninio tirpalo. Paruoštas mišinys išmaišytas stikline lazdele, po to mėgintuvėlius užkamšius vata, jie buvo inkubuoti verdančio vandens vonioje 45 min. Praėjus 45 min., mėgintuvėliai 10 min. buvo šaldomi ledo vonioje. Į atšalusį mišinį mėgintuvėliuose įpylta 4,0 ml n-butanolio, sumaišyta ir gautas mišinys 10 min. centrifuguotas 8000×g pagreičiu K-24 centrifuga. Po centrifugavimo nusiurbtas viršutinis vandeninis sluoksnis buvo naudojamas MDA koncentracijos nustatymui. Tirpalo sugertis nustatyta spektrofotometriškai ties 535 ir 520 nm ilgio bangomis. Kaip standartą naudojant 1,1,3,3-tetrahidroksipropaną sudaryta kalibracinė kreivė, kuria naudojantis apskaičiuota MDA koncentracija. MDA pelių kepenyse buvo išreikšta µmol vienam gramui kepenų masės.

MDA koncentracijai pelių eritrocituose nustatyti buvo naudojama Stalnaja ir bendraautorių pasiūlyta metodika [129]. MDA koncentracija nustatyta mišinyje, kurį sudarė: 2,0 ml dejonizuoto

vandens, 0,1 ml eritrocitų ir 1,0 ml 10 proc. TChA. Naudojant stiklinę lazdelę, mišinys buvo išmaišytas, po to įpylta 2,0 ml 0,5 proc. TBR ir vėl išmaišyta. Gautas 5,1 ml tūrio tirpalas 30 min. inkubuotas verdančio vandens vonioje. Praėjus inkubaciniam laikui, mėgintuvėliai su reakcijos mišiniu buvo 10 min. šaldomi ledo vonioje ir 15 min. centrifuguojami 3000×g pagreičiu K-24 centrifuga. Gautas supernatantas nufiltruotas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį. Nufiltruotame tirpale spektrofotometriniu metodu buvo matuojama sugertis ties 540 nm ilgio banga. MDA koncentracija pelių eritrocituose paskaičiuota pagal formulę ir išreiškšta µmol viename litre (µmol/l):

c = A × 1250 [129].

A – supernatanto sugerties reikšmė ties 540 nm ilgio banga, 1250 – koeficientas.

2.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas

Eksperimentų metu gauti duomenys buvo analizuojami naudojant STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., Tulsa, JAV) statistikos paketą. Tyrimų rezultatai pateikti kaip vidurkiai (M). Duomenų patikimumas įvertintas pagal Stjudento t testą. Skirtumai laikyti statistikšai reikšmingais, jeigu reikšmingumo lygmuo mažesnis nei 0,05 (p<0,05).

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1.

Metalų poveikis redukuoto glutationo susidarymui

GSH yra gausiausias, merkapto grupę (-SH) turintis, ląstelinis antioksidantas, aptinkamas visose žinduolių ląstelėse milimolinėmis koncentracijomis [64]. Cheminė GSH sudėtis nulemia jo funkcijas, o platus pasiskirstymas gyvuosiuose organizmuose atspindi jo biologinį vaidmenį [66]. GSH sudėtyje esanti -SH grupė svarbi antioksidacinių funkcijų palaikymui [66]. Tuo tarpu vienas pagrindinių sunkiųjų metalų toksinio poveikio ogranizmui mechanizmų – dėl RDF generacijos aktyvinimo sukeltas oksidacinis stresas [2].

Tiesiogiai reaguodamas su RDF ir RAF bei kitomis aktyviomis formomis, GSH jas neutralizuoja. GSH geba ne tik detoksikuoti sunkiųjų metalų poveikyje susidariusius laisvuosius radikalus, bet ir dalyvauti metalų pašalinime iš organizmo. Manoma, jog GSH sąveikauja su metalų jonais kaip metalus sujungiantis ligandas, susidarant glutationo tiolatams. GSH savo struktūroje turi šešias potencialias metalų jonų prisijungimo sritis, iš kurių -SH grupė, esanti cisteino liekanoje, pasižymi didžiausiu giminingumu metalų katijonams. Stabiliausi dvivalenčių metalų katijonų kompleksai su GSH susiformuoja esant santykiui 1:2 (metalas:GSH) [130]. Susidarius GSH kompleksams su metalais, jie yra pašalinami iš organizmo, tokiu būdu išvengiant toksinio metalų poveikio [66].

Atliktuose eksperimentuose nustatinėjant oksidacinio streso žymens – GSH koncentraciją pelių kepenyse ir eritrocituose, siekta įvertinti vieną iš toksinių Ni poveikių – gebėjimą sukelti oksidacinį stresą bei Zn, kaip antioksidanto, gebėjimą apsaugoti organizmą nuo sunkiojo metalo – Ni poveikio.

3.1.1. 24 valandų ir 14 dienų cinko, nikelio bei kompleksinis šių metalų jonų

poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose

Atliktuose tyrimuose įvertinta GSH koncentracija pelių kepenyse ir eritrocituose po 24 valandų Ni ir/arba Zn jonų poveikio. Kiekvienai tiriamajai pelių grupei buvo suleista vienkartinė injekcija į pilvo ertmę su atitinkamais metalų druskų tirpalais: NiCl2 (96 µmol Ni/kg) ir/arba ZnSO4 (24 µmol Zn/kg). Siekiant įvertinti kompleksinį metalų poveikį, vienai pelių grupei pirmiausiai buvo sušvirkšta ZnSO4 tirpalo, o po 20 min. – NiCl2 tirpalo. Kontrolinei pelių grupei sušvirkštas atitinkamas fiziologinio tirpalo tūris.

GSH koncentracija kontrolinių pelių eritrocituose ir kepenyse, praėjus 24 valandoms po fiziologinio tirpalo injekcijos, atitinkamai buvo 735,44 µmol/l ir 6,54 µmol/l. Gauti kontrolinės pelių

grupės kepenų ir eritrocitų GSH koncentracijų rezultatai (µmol/l) prilyginti 100 proc., o rezultatai esant metalų poveikiui taip pat išreikšti procentais, juos paskaičiuojant nuo kontrolinių rezultatų.

Gauti rezultatai, pateikti 5-ame pav., parodė, jog po vienkartinės (24 valandų) NiCl2 tirpalo injekcijos, GSH koncentracija, lyginant su kontrolinių pelių grupe, kepenyse sumažėjo 18 proc. (p<0,05), o eritrocituose – 23 proc. (p<0,05). Pelėms, kurioms į pilvo ertmę buvo švirkščiamas ZnSO4 tirpalas, GSH koncentracija eritrocituose, lyginant su kontroline pelių grupe, statistiškai nereikšmingai sumažėjo (13 proc.), o kepenyse – neturėjo reikšmingos įtakos GSH koncentracijos pokyčiams. Grupėje, kurioje pelėms buvo sušvirkšta ZnSO4 ir NiCl2 tirpalų, nustatytas GSH koncentracijos sumažėjimas (p<0,05) 37 proc. kepenyse ir 59 proc. eritrocituose, lyginant su kontroline pelių grupe. 24 valandų kompleksinio metalų poveikio rezultatus lyginant su Ni paveiktų pelių grupe, priešingai nei tikėtasi, GSH koncentracija kepenyse ir eritrocituose buvo statistiškai reikšmingai (p<0,05) sumažėjusi (atitinkamai 19 proc. ir 36 proc.).

5 pav. GSH koncentracija pelių eritrocituose ir kepenyse po vienkartinio (24 valandų) NiCl2 ir/arba

ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo. GSH koncentracija kontrolinių pelių eritrocituose (735,44 µmol/l) ir

kepenyse (6,54 µmol/l) prilyginta 100 proc.; * - statistiškai reikšmingi (p<0,05) skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe; # - statistiškai reikšmingi (p<0,05) skirtumai lyginant su Ni paveiktų

pelių grupe

Tolimesniuose eksperimentuose įvertinta GSH koncentracija pelių ertirocituose ir kepenyse po 14 dienų poveikio metalais. 14 dienų tyrimo modelis adekvatus 24 valandų tyrimo modeliui, tik tiriamosioms pelėms vieną kartą per parą dvi savaites (14 dozių) į pilvo ertmę buvo švirkščiamas vienodas fiziologinio tirpalo tūris, kuriame ištirpintas reikalingas kiekis NiCl2 (19 µmol Ni/kg) ir/arba ZnSO4 (24 µmol Zn/kg) metalų druskų.

GSH koncentracija kontrolinių pelių eritrocituose ir kepenyse po 14 dienų poveikio fiziologiniu tirpalu atitinkamai buvo 1005,86 µmol/l ir 9,01 µmol/l. Gauti 14 dienų kontrolinės pelių

77 87 41 82 103 63 0 20 40 60 80 100 120 Ni Zn Zn+Ni G S H k on ce n tr ac ija (pr oc .)

Metalas (-ai), kuriuo (-iais) buvo paveiktos pelės

Eritrocitai Kepenys

*

*

*

*