1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS
HISTOLOGIJOS IR EMBRIOLOGIJOS KATEDRA
Ringaudas Palubinskas
ENDOMETRIUMO PROLIFERACIJOS TYRIMAS ŽYMENIU KI-67
POMENOPAUZĖS LAIKOTARPIU
Medicinos vientisųjų studijų BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS
Darbo vadovė Prof. dr. Ingrida Balnytė
Mokslinė konsultantė Dokt. Lina Adomaitienė
2
TURINYS
1.SANTRAUKA ... 3 2.SUMMARY ... 4 3.PADĖKA ... 5 4.INTERESŲ KONFLIKTAS ... 55.ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5
6.SANTRUMPOS IR SĄVOKOS ... 6
7.ĮVADAS ... 7
8.DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
9.LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
9.1. Endometriumo histofiziologija ... 9
9.2. Endometriumo proliferacijos sutrikimai ... 9
9.2.1 Endometriumo polipai ... 10
9.2.2 Endometriumo proliferacijos sutrikimų rizikos veiksniai ... 10
9.3. Ki-67 žymens praktiškumas ir pritaikomumas ... 10
10.TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI ... 13
10.1. Medžiaga ... 13
10.2. Imunohistocheminio tyrimo protokolas ... 13
10.3. Histologinių vaizdų morfologinis įvertinimas ... 13
10.4. Histologinių vaizdų mikromorfometrija ... 14
10.5. Statistinė duomenų analizė ... 15
11. REZULTATAI ... 16
11.1. Epitelinio audinio ląstelių dažymasis Ki-67 ... 16
11.2. Jungiamojo audinio ląstelių dažymasis Ki-67 ... 17
11.3. Bendrojo prolifercijos indekso sąsajos su klinikiniais duomenimis ... 17
12. REZULTATŲ APTARIMAS ... 22
13. IŠVADOS ... 24
3
1.SANTRAUKA
Ringaudas Palubinskas. Endometriumo proliferacijos tyrimas žymeniu Ki-67 pomenopauzės laikotarpiu. Medicinos vientisųjų studijų programos baigiamasis magistro darbas / darbo vadovė prof. dr. Ingrida Balnytė, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, Histologijos ir embriologijos katedra. Kaunas, 2019.
Tyrimo tikslas: ištirti endometriumo audinių proliferacijos intensyvumą žymeniu Ki-67 pomenopauzės laikotarpiu ir palyginti gautus rezultatus pacienčių amžiaus ir kitų klinikinių duomenų atžvilgiu.
Uždaviniai. 1. Nustatyti Ki-67 teigiamai nusidažiusių epitelinių ląstelių procentą endometriumo epiteliniame audinyje. 2. Nustatyti Ki-67 teigiamai nusidažiusių jungiamojo audinio ląstelių procentą endometriumo jungiamajame audinyje. 3. Apskaičiuoti endometriumo audinių bendrąjį proliferacijos indeksą ir palyginti su turimais anamnezės duomenimis.
Tyrimo objektai ir metodai: histologiniai pomenopauzinio amžiaus moterų, neturėjusių ginekologinių nusiskundimų, endometriumo polipų pjūviai (n=49) dažyti imunohistochemiškai naudojant monokloninius pelės antikūnius prieš žmogaus Ki-67 antigeną ((MIB-1, Dako, 1:100) ir EnVision vizualizavimo sistemą. Didžiuoju mikroskopo didinimu, skaitmeniniu būdu dokumentuota po dešimt regėjimo laukų kiekviename preparate ir atliktas nusidažiusių ir nenusidažiusių, endometriumo epitelinių ir jungiamojo audinio ląstelių skaičiavimas akimis ir naudojant Mousotron programėlę. Iš gautų duomenų apskaičiuotas kiekvieno audinio audinio atskirai ir bendrasis proliferacijos indeksas, jie palyginti su klinikiniais ir anamnezės duomenimis. Statistinio pasikliovimo lygmuo pasirinktas 95 proc., kai p < 0,05.
Tyrimo rezultatai. Ištirta 49 moterų endometriumo histologinių pjūvių, dažytų anti-Ki-67 antikūniais, ir suskaičiuotas epitelinio ir jungiamojo audinio besidauginančios ląsteles, apskaičiuotas jų proliferacijos indeksas. Nustatyta, kad epitelinio audinio ląstelių proliferacijos indeksas (EPI) buvo didesnis už jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksą (JPI), atitinkamai jų medianos buvo 4,8 ir 0,9, p < 0,05. Nustatyta vidutinio stiprumo koreliacija tarp EPI ir JPI, r = 0,613, p < 0,01. Tiriant sąsajas su amžiumi, pastebėta tendencija, kad bendrasis proliferacijos indeksas ir EPI yra didesnis jaunesniojo pomenopauzinio laikotarpio moterims.
Išvados: Pomenopauzės laikotarpiu dauginasi endometriumo ir epitelinės, ir jungiamojo audinio ląstelės. Bendrojo proliferacijos indekso statistiškai patikimų sąsajų su klinikiniais ir anamnezės duomenimis nenustatyta, tačiau pastebėta tendencija, kad EPI ir BPI yra didesni jaunesniojo pomenopauzinio laikotarpio nutukusioms moterims.
4
2.SUMMARY
Ringaudas Palubinskas. Evaluation of endometrial proliferation with Ki-67 marker in postmenopausal period. Master‘s Thesis in the continuous education study program Medicine / Scientific supervisor: Ingrida Balnytė, prof. dr., Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2019.
Aim of the study: to determine the intensity of proliferation of different endometrial tissues in postmenopausal period and to compare it in respect to age and other clinical data of the patients. Research objectives. 1. To determine the percentage of Ki-67 positive epithelial cells in endometrial glandular epithelial tissue. 2. To determine the percentage of Ki-67 positive stroma cells among endometrial connective tissue cells. 3. To determine total proliferation index and to compare it with age and clinical data of the patients.
Materials and methods: histological sections of endometrial polyps, obtained from asymptomatic postmenopausal women (n=49), were stained immunohistochemically by using mouse monoclonal antibodies anti-Ki-67 (Hu), (MIB-1, Dako, 1:100) and EnVision visualization system. Ten high-power vision fields were recorded by digital camera. Epithelial as well as connective tissue cell counts (Ki-67 positive and negative separately) were performed in eye control, and total proliferation index as well as proliferation index of separate tissue types was calculated. The obtained calculations were compared with the age and clinical data of the patients. Statistical significance level of p < 0.05 was chosen. Results:
A total of 490 high power vision fields were investigated morphologically, and mitotically active cells were counted. Proliferation index of epithelial and stromal cells (EPI and SPI, respectively) as well as total proliferation index (TPI) was calculated. It was determined that EPI is greater than SPI, and their median values are, correspondingly, 4.8 and 0.9, p < 0.05. Medium strong correlation was determined between EPI and SPI, r = 0.613, p < 0.01. A tendency of a greater TPI as well as EPI in early postmenopausal age was observed.
Conclusions:
Both epithelial and stromal cells of endometrium proliferate in the postmenopausal period. Total proliferation index did not demonstrate statistically significant relation to clinical and anamnesis data, but a tendency of greater EPI and TPI to be present in younger postmenopausal and obese women was observed.
5
3.PADĖKA
Pirmiausia dėkoju baigiamojo magistrinio darbo vadovei profesorei Ingridai Balnytei už rūpestį, geranoriškumą ir kantrybę ruošiant šį darbą.
Taip pat dėkoju už informaciją, bendradarbiavimą ir patarimus rengiant šį mokslinį darbą mokslinei konsultantei, akušerijos-ginekologijos klinikos doktorantei, gydytojai Linai Adomaitienei.
Dėkoju Histologijos ir embriologijos katedros laborantėms Rūtai ir Laurai už techninę pagalbą ruošiant histologinius preparatus.
4.INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui nebuvo interesų konflikto.
5.ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Bioetikos centro leidimas Nr. BEC – MF – 350. Išdavimo data – 2019 m. kovo 19 d.
6
6.SANTRUMPOS IR SĄVOKOS
Santrumpos
BPI – bendrasis proliferacijos indeksas
EPI – epitelinio audinio ląstelių proliferacijos indeksas JPI – jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksas IHC – imunohistochemija
FBT – fiziologinis fosfatinio buferio tirpalas G0, G1, G2, S, M – ląstelės ciklo fazės
Sąvokos
Endometriumas – gimdos gleivinė, arba gimdos sienos vidinis dangalas, sudarytas iš pamatinio ir funkcinio sluoksnių;
Hiperplazija – organo ar struktūros tūrio ir/ar apimties didėjimas dėl ląstelių proliferacijos; Menopauzė – tai moters mėnesinių ir vaisingumo išnykimas;
Perimenopauzės laikotarpis – tai moters amžiaus laikotarpis, kai silpstant endokrininei kiaušidžių funkcijai, menstruacijos tampa nereguliarios, retos;
Polipas – ribotas gerybinis gleivinės išvešėjimas;
Pomenopauzė – moters amžiaus laikotarpis, prasidedantis po perimenopauzės, praėjus daugiau negu 12 mėnesių nuo paskutinio kraujavimo;
Premenopauzė – laikotarpis tarp 40-45 gyvenimo metų, prieš perimenopauzę, kai dažniau pasitaiko mėnesinių ciklo sutrikimų;
7
7.ĮVADAS
Endometriumą, arba gimdos gleivinę, sudarančių audinių proliferacija reprodukciniu moters amžiaus laikotarpiu vyksta reguliariai kiekvieno menstruacinio ciklo metu, kadangi menstruacijų metu pasišalinus funkciniam gimdos gleivinės sluoksniui, jis turi regeneruoti iš pamatinio gimdos gleivinės sluoksnio [1]. Šiuos procesus reguliuoja cikliškai besikeičiantys moteriškų lytinių hormonų kiekiai kraujyje [2]. Pomenopauzėje, smarkiai sumažėjus cirkuliuojančio estradiolio, reguliari endometriumo proliferacija nebevyksta ir jo storis sumažėja iki vidutiniškai 1 mm [3]. Tačiau kai kurioms moterims pomenopauzės laikotarpiu endometriumas ima proliferuoti. Tai gali pasireikšti arba endometriumo polipu, arba endometriumo hiperplazija. M.O. Korhonen ir kiti hiperplaziją rado tik 0,54% tirtų moterų perimenopauzės ir pomenopauzės laikotarpiu [4]. Polipai yra gana dažna patologija, ir su amžiumi jų daugėja: premenopauzės laikotarpiu jų rasta 5,8% moterų, pomenopauzės laikotarpiu – 11,8%, be to, stebima aiški teigiama polipų dažnio ir moters amžiaus koreliacija [5]. Tikslios priežastys, kodėl polipai susidaro, nėra žinomos, tačiau tarp rizikos veiksnių yra amžius, nutukimas, tamoksifeno vartojimas [5][6][7]. Sisteminės apžvalgos duomenys rodo tikimybę, kad endometriumo polipai gali sukelti nevaisingumą, nemenstruacinius kraujavimus iš gimdos, bei 0,8-5,4% polipų gali supiktybėti ir tapti endometriumo vėžiu [8]. Stebima ilgametė sergamumo endometriumo vėžiu didėjimo tendencija didelėje dalyje pasaulio valstybių, taip pat ir Lietuvoje [9]. Endometriumo vėžiu Lietuvoje daugiausia serga 55–74 m. moterys, tai sudaro 9% visų šios grupės onkologinių susirgimų ir yra 3 pagal dažnį onkologinis susirgimas šioje grupėje [10]. Panašios tendencijos stebimos ir JAV epidemiologinėse studijose – apžvalga teigia, kad endometriumo vėžio atvejų stipriai padaugėja perimenopauzėje, didžiausias dažnis fiksuojamas praėjus daugiau nei dešimtmečiui po menopauzės pradžios [11]. Tai rodo, kad šis vėžys yra svarbi ir Lietuvos, ir kitų valstybių sveikatos problema, kuri ateityje gali tik didėti. Įvertinus duomenis, kad endomentriumo polipų dažnis su amžiumi didėja ir kad jie turi tikimybę supiktybėti, svarbu turėti galimybę įvertinti endometriumo polipų ląstelių proliferacijos intensyvumą. Vienas iš ląstelių dauginimosi intensyvumo matų yra proliferacijos indeksas, kuris vertinamas skaičiuojant imunohistochemiškai (IHC) dažytuose preparatuose nusidažiusių ląstelių branduolių dalį tarp nenusidažiusių, naudojant žymenį Ki-67 [12]. Todėl šiame darbe pasitelkiamas Ki-67 žymuo įvertinti pomenopauzinių endometriumo polipų epitelinio ir jungiamojo audinių ląstelių proliferacijos intensyvumą tarp moterų, nesiskundusių kraujavimu iš gimdos. Taip pat siekiama palyginti gautus rezultatus su kai kuriais anamnezės ir klinikiniais duomenimis, siekiant nustatyti galimą ryšį tarp ląstelių proliferacijos intensyvumo pomenopauziniame endometriume ir keletos žinomų rizikos veiksnių.
8
8.DARBO TIKSLAS
Ištirti endometriumo audinių proliferaciją žymeniu Ki-67 pomenopauzės laikotarpiu ir susieti gautus rezultatus su tam tikrais klinikiniais požymiais ir anamnezės duomenimis.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Ki-67 teigiamai nusidažiusių epitelinių ląstelių procentą endometriumo epiteliniame audinyje.
2. Nustatyti Ki-67 teigiamai nusidažiusių jungiamojo audinio ląstelių procentą endometriumo jungiamajame audinyje.
3. Apskaičiuoti endometriumo bendrąjį audinių proliferacijos indeksą ir palyginti jį su turimais anamnezės duomenimis.
9
9.LITERATŪROS APŽVALGA
9.1.Endometriumo histofiziologija
Endometriumas, arba gimdos gleivinė, yra vidinis gimdos sienos sluoksnis, sudarytas iš 2 sluoksnių: funkcinio ir pamatinio. Šiuos sluoksnius sudaro epitelinis ir jungiamasis audiniai. Epitelinis audinys iškloja gimdos ertmę ir sudaro endometriumo liaukas, o jungiamasis audinys sudaro stromą, apgaubiančią liaukas ir suteikiančią atramą [13]. Funkcinis endometriumo sluoksnis susidaro dauginantis pamatinio sluoksnio audiniams ir reprodukciniu moters amžiaus laikotarpiu reguliariai kinta dėl besikeičiančio kiaušidėse gaminamų moteriškųjų lytinių hormonų kiekio [1]. Mėnesinių ciklo pradžioje endometriumo storis svyruoja tarp 2 ir 5 mm, o sekrecijos fazės metu gali sustorėti iki 8 mm. [14]. Menstruacinio ciklo pradžia laikoma deskvamacijos fazė, kurios metu atsisluoksniuoja ir pasišalina funkcinis endometriumo sluoksnis ir dėl to kraujuojama. Ji trunka 3–5 dienas [15]. Tuo metu pradeda didėti kiaušidžių išskiriamo estradiolio kiekis, kuris pradeda skatinti pamatinio endometriumo sluoksnio audinius daugintis ir susidaryti liaukas bei stromą [16]. Toliau dvi savaites veikia vis didėjantis estrogenų kiekis, kuris stimuliuoja endometriumo ląsteles, sukeldamas vis stipresnę jų proliferaciją [17]. Įvykus ovuliacijai ir susidarius geltonajam kūnui, jo išskiriamas progesteronas sukelia gimdos gleivinėje vadinamąją sekrecijos fazę [18]. Progesteronas veikia antagonistiškai ir sustabdo estrogenų sukeltą proliferaciją, tuo pačiu skatindamas išvešėjusius funkcinio sluoksnio audinius diferencijuotis: liaukų ląstelės ne tik nustoja mitoziškai daugintis, jose atsiranda glikogeno intarpų ir matoma ląstelių dydžio pokyčių, stromos fibroblastocituose stebima tariamoji decidualizacija [19]. Jei ovuliuotas kiaušinėlis lieka neapvaisintas, ar toliau nesivysto, geltonasis kūnas nustoja išskirti hormonus, degeneruoja [20]. Dėl progesterono trūkumo spazmuoja funkcinio sluoksnio arteriolės, vystosi šio sluoksnio išemija, vyksta audinių nekrozė ir funkcinio sluoksnio atsisluoksniavimas [16]. Reprodukcinio moters gyvenimo laikotarpio metu mažėja folikulų atsargos kiaušidėse ir ilgainiui beveik visiškai išsenka. Dėl šios priežasties vidutiniškai apie 47-tuosius gyvenimo metus prasideda perimenopauzinis laikotarpis ir po vidutiniškai 5 metų įvyksta menopauzė [21].
9.2.Endometriumo proliferacijos sutrikimai
Pomenopauzėje reguliari endometriumo proliferacija nebevyksta ir jo storis sumažėja iki vidutiniškai 1 mm [3]. Tačiau kai kurioms moterims po menopauzės gali pasireikšti endometriumo proliferacija hiperplazijos arba polipų pavidalu. Hiperplazija yra tolygus viso vidinio gimdos sienos
10
sluoksnio išvešėjimas, kai tuo tarpu polipas yra lokalus gleivinės darinys, sudarytas iš jungiamojo audinio stromos ir liaukinio epitelio.
9.2.1.Endometriumo polipai
M.O. Korhonen ir kiti endometriumo hiperplaziją rado tik 0,54% tirtų moterų perimenopauzės ir pomenopauzės laikotarpiu [4]. Endometriumo polipai yra gana dažna patologija, ir su amžiumi jų daugėja: premenopauzės laikotarpiu jų rasta 5,8% moterų, pomenopauzės laikotarpiu – 11,8% [5]. Endometriumo polipai yra lokalūs gimdos gleivinės išvešėjimai, randami virš endometriumo paviršiaus, jie gali būti plataus pagrindo arba ant kojytės [22]. Jų dydis svyruoja nuo 1mm iki kelių centimetrų, dažniausiai pasitaikant polipams iki 15 mm, o vidutiniam dydžiui esant 12,8 mm [23]. Endometriumo polipai yra sudaryti iš endometriumo liaukų, stromos ir kraujagyslių. Jie gali susidaryti įvairiose gimdos dalyse, dažniau šoninių ir priekinės sienų srityse [24]. Šiuo metu tikslios endometriumo polipų susidarymo priežastys nėra žinomos, tačiau dėl polipų įvairialypiškumo galima spręsti, kad priežastys yra kompleksiškos ir galimai susijusios su genetinės informacijos pokyčiais 6 ir 12 chromosomose [25].
9.2.1.Endometriumo proliferacijos sutrikimų rizikos veiksniai
Vienas iš svarbiausių polipų susidarymo rizikos veiksnių yra nutukimas [7]. Nutukusios pacientės pomenopauzės laikotarpiu turi vidutiniškai 40% didesnę estrogenų koncentraciją kraujyje nei jų normalaus svorio bendraamžės [26]. Kadangi pomenopauzės laikotarpiu nebesusidaro progesteroną sekretuojantis geltonkūnis, todėl estrogenai nuolat skatina endometriumo proliferaciją. Polipuose randamas didesnis estrogenų receptorių kiekis nei aplinkiniame endometriume [27], todėl galima spręsti, kad kai kuriais atvejais polipas atsiranda ląstelėms pradėjus daugintis dėl susidariusio estrogenų-progesterono disbalanso. Taip pat didesnė tikimybė polipams susidaryti yra, jei moteris serga endometrioze arba polipai jau buvo šalinti anksčiau, ypač jei jų buvo daugiau nei vienas [28]. Kiti rizikos veiksniai yra amžius ir tamoksifeno vartojimas [5][6]. Endometriumo polipai gali pasireikšti nemenstruaciniu kraujavimu iš gimdos iki 45.6% atvejų [24]. Sisteminės apžvalgos duomenys rodo tikimybę, kad 0,8–5,4% polipų gali supiktybėti ir tapti endometriumo vėžiu [8].
9.3.Ki-67 žymens praktiškumas ir pritaikomumas
Proliferacijos žymuo Ki-67 yra branduolio ir branduolėlio baltymas, kurio randama besidalijančiose ląstelėse nuo G1 iki M ląstelės ciklo dalies. G0 ląstelės ciklo dalies metu šio baltymo nerandama [29]. Mitozės fazės pradžioje Ki-67 koncentracija pradeda mažėti, vėlesniuose mitozės
11
etapuose koncentracija sumažėja itin ryškiai [30]. Tai rodo, kad tik aktyviai besiruošiančios mitozei arba jau besidalijančios ląstelės nusidažys Ki-67 žymeniu, tokiu būdu atsirandant galimybei tiksliai įvertinti tiriamo audinio ląstelių proliferacijos intensyvumą.
Imunohistocheminio žymens pritaikomumą gali lemti preanalitinių veiksnių nenuspėjamumas. Nuo šių veiksnių kontrolės priklauso biologinių žymenų įvertinimo patikimumas. Tarp preanalitinių veiksnių priklauso biologinės medžiagos tipas (medžiaga iš adatinės biopsijos, rezekcijos, citologinis preparatas), laikas iki fiksavimo, laikas fiksatoriuje ir tam naudojamos medžiagos, sandėliavimo periodas iki imunohistocheminio tyrimo [31]. Studijų duomenys rodo, kad Ki-67 yra ne blogesnis ir kai kuriais atvejais geresnis žymuo tokių preanalitinių problemų atžvilgiu nei kiti žymenys [32][33]. Pavyzdžiui, Pinhel et al. atliko operacinių biopsijų vertinimo tyrimą ir atrado, kad Ki-67 dažymosi indeksas nesiskyrė, biopsinę medžiagą fiksavus per 20–80 minučių po paėmimo bei esant skirtingiems biopsijos tipams. Nepaisant nesiskiriančio indekso, buvo pastebėta, kad kiekvienas ląstelių branduolys dažosi vientisai, medžiagą fiksavus greitai, o nevienalyčiai – jei fiksavimas užtrunka [32].
Yra duomenų, kad biopsinės medžiagos fiksavimas formalino tirpalu, trukęs iki 154 dienų imtinai, neturėjo žymaus poveikio dažymuisi šiuo žymeniu [34]. Tai rodo, kad dažyti tiriamą medžiagą imunohistochemiškai su Ki-67 galima esant įvairiai fiksacijos trukmei. Tai yra paranku, nes tinka kitos, seniau priimtos, naviko audinių fiksacijos gairės, reikalingos kitų žymenų tyrimui, pvz., estrogenų receptoriams tirti reikalinga 8–72 val. fiksacija [35]. Paranku praktiniam Ki-67 žymens naudojimui yra ir duomenys, kad audinių antigeninės savybės jame išlieka dešimtmečius, jeigu iš medžiagos yra tinkamai paruoštas parafino blokas [36].
Praktiškai Ki-67 yra naudojamas įvairių vėžinių ląstelių proliferacijai tirti. Ki-67 gali būti naudojamas kaip nepriklausomas, gerą prognostinę vertę turintis žymuo storosios ir tiesiosios žarnos vėžio atveju [37]. Kitos studijos duomenimis, Ki-67 indekso raiška statistiškai patikimai koreliavo su 20 metų išgyvenamumu sergant prostatos vėžiu, todėl autoriai rekomenduoja įtraukti Ki-67 indekso vertę į šios ligos prognozės ir gydymo parinkimo algoritmus [38]. Didelė Ki-67 raiška (>10 proc.) yra nepriklausomas prognostinis veiksnys vertinant recidyvo tikimybę sergant krūties vėžiu, tačiau tik nesant HER2 receptorių [39]. Taip pat yra duomenų, kad Ki-67 raiška koreliuoja su naviko plitimu, sergant kasos neuroendokrininiu naviku [40].
12
10.TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI
10.1.Medžiaga
Iš LSMU Akušerijos ir ginekologijos klinikos duomenų bazėje turimų duomenų apie 1,9 tūkst. moterų atrinkta 49 moterys (pomenopauzėje, 53–89 metų amžiaus), kurioms profilaktinio patikrinimo metu tiriant ultragarsu buvo nustatytas ir pašalintas gimdos gleivinės polipas. Nė viena iš atrinktų moterų nevartojo hormoninių preparatų ir neturėjo su gimdos endometriumo pokyčiais susijusių simptomų (kraujavimo).
10.2.Imunohistocheminio tyrimo protokolas
Histologiniuose pjūviuose mitoziškai aktyvioms ląstelėms nustatyti buvo atliekama imunohistocheminė (IHC) reakcija naudojant anti-Ki-67 monokloninius antikūnius MIB-1. Nuo į parafiną įlietų formaline fiksuoto endometriumo audinio gabalėlių buvo mikrotomu atpjautos 3 mikrometrų storio nuopjovos ir patalpintos ant specialių „Super Frost“ objektinių stiklelių. Preparatai pernakt laikyti 62°C temperatūroje, kad ištirptų parafinas. Deparafinuoti ksilenu ir rehidratuoti mažėjančios koncentracijos etilo alkoholio tirpalais.
Epitopo išlaisvinimui rehidruoti pjūviai ant objektinių stiklelių buvo merkiami į citratinį buferį (Dako EnVision FLEX Target Retrieval Solution®, pH6 (10x) Dako, Glostrup, Denmark). Slėginiame inde 3 minutes buvo verdama 120°C temperatūroje, atvėsinama. Preparatai sudėti į specialius laikiklius ir plauti 5 minutes fiziologiniu fosfatinio buferio tirpalu (FBT). Pjūviai apdoroti 10 minučių peroksidazę blokuojančiu tirpalu ir plauti FBT. Pjūviai inkubuoti kambario temperatūroje 30 minučių iki rekomenduojamos koncentracijos (1:100) praskiestu pirminiu antikūniu (monokloniniu pelės prieš žmogaus Ki-67 antigeną, klonas MIB-1, Dako, Glostrup, Denmark), plauti FBT.
30 minučių inkubuota kambario temperatūroje su pirmu antriniu antikūniu (FLEX+Mouse (LINKER)), praplauta FBT. Pridėtas antras antrinis antikūnis, inkubuota 30 minučių kambario temperatūroje. Praplauta su FBT. Reakcijos vizualizuotos naudojant avidino-biotino peroksidazės kompleksą ir diaminobenzidiną kaip chromogeną, inkubuota 1 min. Meyer hematoksilinu nudažytos nenusidažiusios struktūros, plauta FBT. Preparatai sudėti į distiliuotą vandenį ir plauti 3 min. Dehidratuoti etilo spiritu, izopropilo alkoholiu, skaidrinti ksilenu, dengti dengiamaisiais stikleliais. Preparatai džiovinti traukos spintoje pernakt.
13
Kiekvienoje dažomų preparatų serijoje buvo po vieną teigiamos ir po vieną neigiamos kontrolės preparatą. Teigiamai ir neigiamai kontrolei naudotas plonosios žarnos gleivinės preparatas; neigiamos kontrolės metu nebuvo imama pirminio antikūnio, visus kitus veiksmus toliau atliekant pagal protokolą.
10.3.Histologinių vaizdų morfologinis įvertinimas
Kiekvienas hematoksilinu ir eozinu dažytas preparatas buvo vertinamas morfologiškai, tiriant iš pradžių mažiausiu mikroskopo didinimu, o paskui – didžiuoju mikroskopo didinimu. Išsirinktas geriausiai to atvejo endometriumą reprezentuojantis regėjimo laukas, kuriame nebuvo kraujosruvų ir mechaniškai suardytų audinių, įvertinant ląstelių morfologiją, epitelinio audinio sluoksnių skaičių. IHC dažytas preparatas tirtas mikroskopu Olympus BX 53F, Tokyo, Japan ir fotografuotas mikroskopo skaitmenine kamera QImaging EXi AQUA naudojant mažiausią didinimą (4X) ir tame regėjimo lauke atliekant 10 nuotraukų didžiausiu didinimu (40X) (1 pav.), naudojantis skaitmenine vaizdų analizės programa Image-Pro Plus 7.0.
1 pav. Proliferuojančių ląstelių endometriumo mėginyje imunohistocheminis dažymasis anti-Ki-67
antikūniais (MIB-1).
A – * - endometriumo liaukos, ilga rodyklė – cistiškai išsiplėtusi endometriumo liauka; B – trumpos baltos rodyklės – Ki-67 teigiamų epitelinių ląstelių branduoliai, juodos – Ki-67 teigiamų jungiamojo audinio ląstelių branduoliai. Objektyvo didinimas A – 4x; B – 40x. Skalė A – 200 m; B – 20 m.
14
Kiekvienoje skaitmeninėje nuotraukoje buvo skaičiuojamos visos epitelinio audinio ląstelės, visos jungiamajam audiniui priklausančios ląstelės, visos Ki-67 teigiamos ląstelės epiteliniame ir visos Ki-67 teigiamos ląstelės jungiamajame audinyje. Ląstelių proliferacijos indeksas buvo apskaičiuotas Ki-67 teigiamų ląstelių skaičių dalijant iš visų tame regėjimo lauke matomų tos rūšies audinio ląstelių skaičiaus ir padauginant iš 100. Taip apskaičiuotas epitelinio audinio ląstelių proliferacijos indeksas (EPI) ir jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksas (JPI) visose didžiuoju didinimu registruotose nuotraukose ir apskaičiuotas kiekvienam atvejui jų aritmetinis vidurkis. Bendras proliferacijos indeksas (BPI) buvo nustatytas įvertinant jungiamojo ir epitelinio audinio procentinę dalį kiekviename regėjimo lauke, naudojantis formule:
BPI(%)=𝑎+𝑏𝐴+𝐵∗ 100(%), kur BPI – bendras proliferacijos indeksas, a – epitelinio audinio Ki-67 teigiamų ląstelių skaičius,
b – jungiamojo audinio Ki-67 teigiamų ląstelių skaičius,
A – epitelinio audinio ląstelių skaičius tame pačiame regėjimo lauke, B – jungiamojo audinio ląstelių skaičius tame pačiame regėjimo lauke
Ląstelės skaičiuotos akių kontrolės pagalba, registruojant kiekvieną ląstelę rankiniu būdu, pelės klavišo paspaudimu paliekant žymę ant suskaičiuotos ląstelės. Tam buvo naudojamasi laisvai prieinama internete programinė įranga Mousotron (2 pav.).
2 pav. Kompiuterio darbastalio vaizdas atlikus skaičiavimus viename iš regėjimo laukų.
Tam, kad skaičiavimo rezultatų neveiktų išankstinės žinios, darbo autorius atliko ląstelių skaičiavimą užkoduotuose preparatuose, nežinodamas nei morfologinio tyrimo, nei klinikinių, nei anamnezės duomenų.
15
Siekiant standartizuoti tyrimo rezultatus ir įvertinti kiekybinio tyrimo paklaidą tuos pačius pjūvius tyrė du nepriklausomi tyrėjai (vienas jų darbo autorius), vienas apie kito darbą nežinodami. Tyrimo paklaida, atliekant tų pačių regėjimo laukų vertinimą ir ląstelių skaičiavimą, nesiekė 2 proc.
10.5.Statistinė duomenų analizė.
Statistinei duomenų analizei naudota MS Excel ir IBM SPSS v.23 programinė įranga. Įvertinti parametrinių (pacienčių amžiaus, nusidažiusių ląstelių procentinės dalies) duomenų skirstiniai naudojant Stjudento t kriterijų. Kadangi normaliojo skirstinio negauta, toliau naudoti neparametrinių duomenų analizės kriterijai. Wilcoxon‘o testu palyginti epitelinių ir jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksai. Medianos lygintos naudojant Kruskal-Wallis testą. Tam tiriamieji suskirstyti į tris grupes pagal ląstelių dažymosi Ki-67 bendrojo proliferacijos indekso (BPI) terciles. Toliau ieškota sąsajų tarp proliferacijos indeksų ir klinikinių bei anamnezės duomenų (pacienčių amžiaus, hipertenzijos, nutukimo ir cukrinio diabeto), naudojant Mann-Whitney-U testą; minėtų klinikinių ir anamnezės duomenų koreliacija su EPI, JPI, BPI tirta, naudojant neparametrinių duomenų Spearman‘o kriterijų. Pasirinktas 95 proc. statistinio patikimumo lygmuo (p < 0,05).
16
11.REZULTATAI
Tirtųjų moterų amžiaus vidurkis 67±8,2 metų, visoms pacientėms buvo nustatyta menopauzė, iš jų 7 pacientėms buvo praėję mažiau kaip 10 metų po menopauzės. Nė viena iš tirtųjų pacienčių nevartojo pakaitinės hormonų terapijos, nesiskundė kraujavimu iš genitalijų pomenopauzės laikotarpiu. Keturios pacientės sirgo cukriniu diabetu ir buvo nutukusios. Trylika pacienčių turėjo padidėjusį arterinį kraujospūdį.
Viso ištirta 49 histologinių endometriumo preparatų, IHC dažytų antikūniais prieš Ki-67, mažuoju mikroskopo didinimu ir didžiuoju mikroskopo didinimu skaitmeniniu būdu užregistruota 490 regėjimo laukų. Analizėje naudoti tų pačių 49 pacienčių klinikiniai ir morfologiniai duomenys.
11.1.Epitelinio audinio ląstelių dažymasis Ki-67
Suskaičiavus endometriumo liaukų epitelinio audinio ląsteles, buvo apskaičiuotas epitelinio audinio ląstelių proliferacijos indeksas (EPI), jo vidurkis 6,47 (proc.) ir mediana 4,8 (proc.). Naudojant Stjudento t kriterijų buvo patikrinta ir atmesta nulinė hipotezė apie normalųjį skirstinį, p < 0,05, 3 paveikslas, A. Naudojant Kruskal-Wallis testą, buvo palygintas bendrojo proliferacijos indekso tercilių EPI ir nustatyta, kad jose epitelinių ląstelių proliferacija statistiškai patikimai skyrėsi: labiausiai mitoziškai aktyvios buvo epitelinės ląstelės didžiausio BPI tercilėje, p < 0,05 (4 pav.).
3 pav. Endometriumo audinių ląstelių proliferacijos indeksų skirstiniai. A – epitelinio audinio; B – jungiamojo audinio.
17
11.2.Jungiamojo audinio ląstelių dažymasis Ki-67
Suskaičiavus endometriume tarp liaukų esančio intersticinio jungiamojo audinio ląsteles buvo apskaičiuotas jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksas (JPI), jo vidurkis 1,26 (proc.) ir mediana 0,9 (proc.). Naudojant Stjudento t kriterijų buvo patikrinta ir atmesta nulinė hipotezė apie normalųjį skirstinį, p < 0,05, (žr. 3 pav., B). Naudojant Kruskal-Wallis testą, buvo palygintas bendrojo proliferacijos indekso tercilių JPI ir nustatyta, kad visų trijų grupių (tercilių) JPI medianos statistiškai patikimai skyrėsi: labiausiai mitoziškai aktyvios buvo jungiamojo audinio ląstelės didžiausio BPI tercilėje, p < 0,05 (4 pav.).
Wilcoxon‘o rangų testo pagalba palyginta epitelinio ir jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksai ir nustatyta, kad jie skiriasi statistiškai reikšmingai, p < 0,01 (4 pav.).
4 pav. Epitelinio ir jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksų palyginimas
Spearman‘o testu buvo tirta EPI ir JPI koreliacija. Nustatytas vidutinio stiprumo teigiamas koreliacinis ryšys tarp skirtingų audinių lastelių proliferacijos indeksų, r = 0,613, p < 0,01.
11.3.Bendrojo proliferacijos indekso skaičiavimas ir klinikinių bei anamnezės
duomenų palyginimas
Tam, kad galima būtų ieškoti morfologinių ypatybių sąsajų su pacienčių klinikiniais ir anamnezės duomenimis, tiriamieji suskirstyti į tris grupes pagal ląstelių Ki-67 dažymosi bendrojo proliferacijos indekso (BPI) terciles: pirmoji grupė, žemo intensyvumo proliferacijos, BPI buvo tarp 0,1 ir 1,7 proc.; antroji grupė, vidutinio intensyvumo proliferacijos, BPI tarp 1,8 ir 3,4 proc.; trečioji grupė – didelio intensyvumo proliferacijos, kurioje BPI buvo nuo 3,5 proc. (5 pav.). Kaip matyti 5 paveiksle, didžiausio BPI tercilėje EPI yra taip pat labai didelis.
18
5 pav. Proliferuojančių ląstelių skirtinguose endometriumo audiniuose kiekis (vidurkis, %)
bendrojo proliferacijos indekso tercilėse.
Ieškota dėsningumų, lyginant BPI grupes pagal klinikinius ir anamnezės duomenis (pacienčių amžiaus, hipertenzijos, nutukimo ir cukrinio diabeto). Nors EPI vidurkis, lyginant skirtingo amžiaus moterų grupes, buvo didžiausias jauniausiųjų pomenopauzės laikotarpio moterų grupėje, skirtumai buvo statistiškai nepatikimi (6 pav.).
JPI, lyginant skirtingo amžiaus moterų grupes, buvo nežymiai didesnis ankstyvojo pomenopauzės laikotarpio moterų grupėje, negu vidutinio ar vėlyvojo pomenopauzinio laikotarpių grupėse, p > 0,05 (6 pav.).
6 pav. Endometriumo audinių ląstelių proliferacijos indeksas (PI) skirtingo amžiaus grupėse. Pateikiami proliferacijos indeksų vidurkiai, p > 0,05.
Kaip matoma 6 paveiksle, didesnis EPI, labiau negu JPI, lėmė ir didesnį BPI jauniausiojo pomenopauzinio laikotarpio moterims. Nagrinėjant BPI terciles paaiškėjo, kad didžiausio BPI tercilėje
19
pacientės yra jauniausios, vidutinio BPI tercilėje pacienčių amžius buvo linkęs būti didesnis, negu mažiausio BPI tercilėje, tačiau pastebėti skirtumai nėra statistiškai patikimi, p > 0,05 (7 pav.).
7 pav. Vidutinis pacienčių amžius bendrojo proliferacijos indekso tercilėse; pateikiamas amžiaus vidurkis ± standartinis nuokrypis, p > 0,05.
Ieškant ląstelių proliferacijos intensyvumo sąsajų su sergamumu cukriniu diabetu ir nutukimu, pastebėta nestipri šių būklių koreliacija su EPI, bet statistinio patikimumo negauta; kitų būklių (hipertenzijos, pomenopauzės trukmės) ir proliferacijos rodiklių statistiškai patikimų koreliacijų taip pat nenustatyta. Regresinės analizės metu pastebėta linijinė priklausomybė tarp EPI ir nutukimo bei tarp BPI tercilių ir cukrinio diabeto, p > 0,05 (8 pav.).
8 pav. Ląstelių proliferacijos intensyvumo ir metabolinių ligų regresinė analizė. A – epitelinio audinio ląstelių proliferacijos indekso sąsaja su nutukimu; B – bendrojo proliferacijos indekso sąsaja su cukriniu diabetu.
20
12.REZULTATŲ APTARIMAS
Audiniuose turi nuolat būti palaikoma pusiausvyra tarp ląstelių dauginimosi ir jų nykimo. Prasidėjus menopauzei ir jai pasibaigus, kai kiaušidėse išsieikvojęs užuomazginių folikulų rezervas, estradiolio koncentracija reikšmingai sumažėja, nelieka svarbiausio endometriumo proliferaciją skatinančio veiksnio. Todėl kaip nulinė hipotezė šiame darbe buvo pasirinkta nuostata, kad endometriumo ląstelės pomenopauzėje nesidaugina [41], ir jos atžvilgiu buvo lyginti gautieji rezultatai.
Tačiau kai kurioms moterims vis tik menopauzėje pasireiškia endometriumo audinių vešėjimas (hiperplazija) ir polipų susidarymas, kurių priežastys ir mechanizmai nėra iki galo aiškūs. Kaip tyrimo objektas pasirinktos moterys, kurioms nebuvo jokių simptomų, bet atsitiktinai buvo diagnozuoti endometriumo polipai. Buvo išsikeltas tikslas išsiaiškinti, ar tokiuose jokiais simptomais nepasireiškusiuose polipuose vyksta ląstelių proliferacija ir kokie klinikiniai ar demografiniai veiksniai galėtų būti susiję su ląstelių proliferacija.
Šiame darbe buvo ištirta endometriumo epitelinio ir jungiamojo audinio ląstelių proliferacija, nustatyti jų skirtumai, apskaičiuotas bendrasis proliferacijos indeksas ir ieškota sąsajų su veiksniais, kurie galėtų skatinti ląstelių dauginimąsi. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp EPI ir JPI, rodantis, kad pomenopauzės laikotarpiu epitelinės ląstelės linkusios aktyviau proliferuoti, negu jungiamojo audinio ląstelės. Atkreiptinas dėmesys į tai, kad endometriumo karcinoma ir yra, pirmiausia, sutrikusio epitelinių ląstelių proliferacijos reguliavimosi rezultatas [41]. Įdomu tai, kad tarp EPI ir JPI buvo nustatytas vidutinio stiprumo teigiamas koreliacinis ryšys, tai reiškia, kad veiksnys ar veiksniai, lėmę didesnį epitelinių ląstelių dauginimąsi, buvo susiję ir su didesniu jungiamojo audinio ląstelių dauginimusi. Šitas darbas taip pat rodo, kad pomenopauziniu kraujavimu nesiskundusių moterų endometriumo polipų ląstelių dauginimasis gali būti labai skirtingo intensyvumo, pirmiausia esant didesnei epitelinių, bet ne jungiamojo audinio, ląstelių proliferacijai. Ir EPI, ir JPI skirstiniai (žr.3 pav.) rodo, kad vis tik daugelio tirtų moterų polipai turėjo tik nedidelio intensyvumo ląstelių proliferaciją. Keletos moterų epitelinių ląstelių proliferacijos indeksas 4–7 kartus skyrėsi nuo vidurinės reikšmės (medianos). Mokslinėje literatūroje yra aprašyta nemažai studijų, įrodančių endometriumo ląstelių proliferacijos pomenopauzėje ryšį su endometriumo vėžiu [42][43], epidemiologinėmis studijomis nustatyti svarbiausi malignizacijos rizikos veiksniai [44] [45] [46] [47].
Aiškinamasi ne tik tai, kas sukelia padidėjusią ląstelių proliferaciją, bet ir ieškoma veiksnių, kurie ją mažina. Nustatyta tik keletas faktorių, mažinančių endometriumo vėžio riziką. Tai hormoninių
21
kombinuotų kontraceptinių tablečių vartojimas ir aspirinas, bet ne kiti vaistai nuo uždegimo [46][48]. Y. Kuyucu ir kiti [49] atliko eksperimentinį tyrimą, kurio metu išsiaiškino, kad vitaminas D yra vienas tokių veiksnių, kurio poveikyje tiek epitelinių, tiek liaukinių endometriumo ląstelių proliferacija yra mažesnė. Kadangi šių autorių buvo tirta hormonų sukelta tiek paviršinio, tiek ir liaukinio epitelio ląstelių proliferacija, Ki-67 dažymosi indekso vidurkis siekė atitinkamai 30 ir 32 proc. Pastaroji mokslininkų grupė netyrė stromos jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos.
Šio tyrimo metu buvo atrinktos moterys, kurios nevartojo pakaitinės hormonų terapijos pomenopauzės simptomams gydyti. Yra nustatyta, kad policistinių kiaušidžių sindromo metu randama didelė estrogenų koncentracija kraujyje, o estrogenai yra siejami su didesniu proliferacijos indeksu. Ki-67 raišką endometriume, esant policistinių kiaušidžių sindromui, tyrė A.Villavicencio ir kiti [50] ir nustatė reikšmingai didesnę ir epitelio, ir jungiamojo audinio ląstelių proliferaciją.
Šio tyrimo duomenys atskleidžia, kad didžiausio BPI tercilėje moterų amžiaus vidurkis yra linkęs būti mažiausias, o vidutinio BPI – didžiausias. Tai, kad vyriausiųjų pacienčių grupėje nei EPI, nei BPI reikšmingai nesumažėja, gali būti siejama su tuo, kad vyresniame amžiuje ima rastis vis daugiau ląstelių mitozę kontroliuojančių viduląstelinių mechanizmų defektų, kurie lemia dažnesnę onkologinę patologiją tarp vyresnio amžiaus asmenų, be to, kaupiasi DNR pažaidos, kurios taip pat gali lemti vėžinę ląstelių transformaciją [51].
K. Matsuo ir kiti [44] nustatė, kad keli rizikos veiksniai, tokie, kaip nutukimas, vyresnis amžius, cukrinis diabetas, išemine širdies liga, kai yra ir endometriumo hiperplazija, gali lemti endometriumo suvėžėjimą. Šiame darbe, analizuojant proliferacijos indekso sąsajas su klinikiniais pacienčių duomenimis, buvo pastebėta epitelinių ląstelių proliferacijos indekso silpna teigiama, bet statistiškai nepatikima, koreliacija su nutukimu ir su cukriniu diabetu. Nors regresijos analizės būdu statistiškai patikimai įrodyti didesnę bendrojo proliferacijos indekso tikimybę esant nutukimui ar cukriniam diabetui nepavyko, pastebėta tendencija atitinka L.A. Cantrell su bendraautoriais [45] atliktos studijos ir kitų epidemiologinių tyrimų, kuriose buvo aiškiai susieta endometriumo hiperplazija su nutukimu ir II tipo cukriniu diabetu, rezultatus [45][46][47].
22
13. IŠVADOS
1. Endometriumo epitelinės ląstelės pomenopauzės laikotarpiu dauginasi. Nors EPI mediana yra nedidelė, tačiau jo įvairovė didelė – tarp BPI tercilių nustatyti statistiškai reikšmingi EPI skirtumai. 2. Endometriumo jungiamojo audinio ląstelės pomenopauzės laikotarpiu dauginasi; JPI yra reikšmingai mažesnis už EPI.
3. Statistiškai reikšmingų sąsajų tarp BPI ir klinikinių bei anamnezės duomenų nenustatyta, tačiau pastebėta tendencija, kad endometriumo audiniai yra linkę proliferuoti jauniausiojo pomenopauzinio laikotarpio bei nutukusioms ir sergančioms cukriniu diabetu moterims.
23
14.LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Hawkins SM, Matzuk MM. Menstrual Cycle: Basic Biology. Ann N Y Acad Sci. 2008;1135(1):10–8.
2. Jabbour H, Kelly R, Fraser M, Critchley H. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 2006;27(1):17–46.
3. Warming L, Christiansen PRSSC. Measurement precision and normal range of endometrial thickness in a postmenopausal population by transvaginal ultrasound. Ultrasound Obs Gynecol. 2002;20(5):492–5.
4. Korhonen M, Symons J, Hyde B, Rowan J, Wilborn W, . Histologic classification and
pathologic findings for endometrial biopsy specimens obtained from 2964 perimenopausal and postmenopausal women undergoing screening for continuous hormones as replacement therapy (CHART 2 Study). Am J Obs Gynecol. 1997;176(2):377–80.
5. Dreisler E, Stampe Sorensen S, Ibsen P, Lose G. Prevalence of endometrial polyps and
abnormal uterine bleeding in a Danish population aged 20–74 years. Ultrasound Obs Gynecol. 2009;33:102–8.
6. Runowicz C, Costantino, JP, Wickerham D, Cecchini R, Cronin W, Ford L, Vogel V, et al. Gynecologic conditions in participants in the NSABP breast cancer prevention study of tamoxifen and raloxifene (STAR). Am J Obs Gynecol. 2011;205(6):535.
7. Onalan R, Onalan G, Tonguc E, Ozdener T, Dogan M, Mollamahmutoglu L. Body mass index is an independent risk factor for the development of endometrial polyps in patients undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril. 2009;91:1056–60.
8. Lieng M, Istre O, Qvigstad E. Treatment of endometrial polyps: a systematic review. Acta Obstet Gynecol Scand. 2010;89(8):992–1002.
9. Lortet-Tieulent, Joannie Ferlay J, Bray F, Jemal A. International Patterns and Trends in Endometrial Cancer Incidence, 1978–2013. J Natl Cancer Inst. 2018;110(4):354–61.
10. Smailytė G, Aleknavičienė B. Vėžys Lietuvoje 2012 metais. Nacionalinis vėžio institutas. 2015. 11. Cramer DW. The Epidemiology of Endometrial and Ovarian Cancer. Hematol Oncol Clin North
Am. 2012;26(1):1–12.
24
Transl Lung Cancer Res. 2016;5(5):554–6.
13. Buckley CH, Fox H. The normal endometrium as seen in biopsy material. In: Gottlieb LS, Neville AM, Walker R, editors. Biopsy Pathology Series. London: Chapman and Hall; 1989. p. 30–47.
14. Tsuda H, Ito YM, Todo Y, Iba T, Tasaka K, Sutou Y, et al. Measurement of endometrial
thickness in premenopausal women in office gynecology. Reprod Med Biol. 2018;17(1):29–35. 15. Dasharathy SS, Mumford SL, Pollack AZ, Perkins NJ, Mattison DR, Schisterman JW-WEF.
Menstrual Bleeding Patterns Among Regularly Menstruating Women. Am J Epidemiol. 2012;175(6):536–45.
16. Noyes RW, Hertig AT, Rock J. Dating the Endometrial Biopsy. Fertil Steril. 1950;1(1):3–25. 17. Direito A, Bailly S, Mariani A, Ecochard R. Relationships between the luteinizing hormone
surge and other characteristics of the menstrual cycle in normally ovulating women. Fertil Steril. 2013;99(1):279–85.
18. Ecochard R, Bouchard T, Leiva R, Abdulla S. Characterization of hormonal profiles during the luteal phase in regularly menstruating women. Fertil Steril. 2017;108(1):175–82.
19. Clarke C, Sutherland R. Progestin regulation of cellular proliferation. Endocr Rev. 1990;11(2):266–301.
20. Devoto L, Fuentes A, Kohen P, Cespedes P, Palomino A, Pommer R. The human corpus luteum: life cycle and function in natural cycles. Fertil Steril. 2009;92:1067–79.
21. McNamara M, Batur P, DeSapri K. In the clinic. Perimenopause. Ann Intern Med. 2015;162(3):1–15.
22. Kim K, Peng R, Ro J, Robboy S. A diagnostically useful histopathologic feature of endometrial polyp: the long axis of endometrial glands arranged parallel to surface epithelium. Am J Surg Pathol. 2004;28(8):1057–62.
23. Lasmar BP, Lasmar RB. Endometrial polyp size and polyp hyperplasia. Int J Gynecol Obstet. 2013;123(3):236–9.
24. Kanthi JM, Remadevi C, Sumathy S, Sharma D, Sreedhar S, Jose A. Clinical study of endometrial polyp and role of diagnostic hysteroscopy and blind avulsion of polyp. J Clin Diagnostic Res. 2016;10(6):QC01–4.
25
25. Vanni R, Dal Cin P, Marras S. Endometrial polyp: Another benign tumor characterized by 12q13-q15 changes. Cancer Genet Cytogenet. 1993;68:32–3.
26. Cauley J, Gutai J, Kuller L, LeDonne D, Powell J. The epidemiology of serum sex hormones in postmenopausal women. Am J Epidemiol. 1989;129(6):1120–31.
27. Sant’Ana de Almeida, EC Nogueira A, Candido dos Reis F, Zambelli Ramalho, LN Zucoloto S. Immunohistochemical expression of estrogen and progesterone receptors in endometrial polyps and adjacent endometrium in postmenopausal women. Maturitas. 2004;49:229–33.
28. Gu F, Zhang H, Ruan S, Li J, Liu X, Xu Y, et al. High number of endometrial polyps is a strong predictor of recurrence: findings of a prospective cohort study in reproductive-age women. Fertil Steril. 2018;109(3):493.
29. Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker H, Schwab U, Stein H. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol. 1984;133(4):1710–5.
30. Li L, Jiang G, Chen Q, Zheng J. Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer. Mol Med Rep. 2015;11(3):1566–72.
31. Robb JA, Gulley ML, Fitzgibbons PL, Kennedy MF, Al. E. A Call to Standardize Preanalytic Data Elements for Biospecimens. Arch Pathol Lab Med. 2014;138(4):526–37.
32. Pinhel I, Macneill F, Hills M, Al. E. Extreme loss of immunoreactive p-Akt and p-Erk1/2 during routine fixation of primary breast cancer. Breast Cancer Res. 2010;12(5):R76.
33. Bai Y, Tolles J, Cheng H, Al. E. Quantitative assessment shows loss of antigenic epitopes as a function of time to formalin fixation. Mod Pathol. 2011;91(8):1253–61.
34. Arber D. Effect of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical reactivity of breast markers. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2002;10(2):183–6.
35. Hammond M, Hayes D, Dowsett M, Al E. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 2010;134(6):907–22.
36. Cattoretti G, Becker M, Key G, Duchrow M, Schlüter C. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 1992;168(4):357–63.
26
37. Melling N, Kowitz C, Simon R, Bokemeyer C. High Ki67 expression is an independent good prognostic marker in colorectal cancer. J Clin Pathol. 2016;69(3):209–14.
38. Pascale M, Aversa C, Barbazza R, Marongiu B, Siracusano S, Stoffel F, et al. The proliferation marker Ki67, but not neuroendocrine expression, is an independent factor in the prediction of prognosis of primary prostate cancer patients. Radiol Oncol. 2016;50(3):313–20.
39. Kim J, Han W, Jung S, Park Y. The Value of Ki67 in Very Young Women with Hormone Receptor-Positive Breast Cancer: Retrospective Analysis of 9,321 Korean Women. Ann Surg Oncol. 2015;22(11):3481–8.
40. Panzuto F, Cicchese N, Partelli S, Rinzivillo M. Impact of Ki67 re-assessment at time of disease progression in patients with pancreatic neuroendocrine neoplasms. PLoS One.
2017;12(6):e0179445.
41. Sivridis E, Giatromanolaki A. The pathogenesis of endometrial carcinomas at menopause: facts and figures. J Clin Pathol. 2011;64(7):553–60.
42. Gao Y, Li S, Li Q. Uterine epithelial cell proliferation and endometrial hyperplasia: evidence from a mouse model. Mol Hum Reprod. 2014;20(8):776–86.
43. Yang B, Chen R, Liang X, Shi J, Wu X, Zhang Z, et al. Estrogen Enhances Endometrial Cancer Cells Proliferation by Upregulation of Prohibitin. J Cancer. 2019;10(7):1616–21.
44. Matsuo K, Ramzan A, Gualtieri M, Mhawech-Fauceglia, P Machida H, Moeini A, Dancz C, et al. Prediction of concurrent endometrial carcinoma in women with endometrial hyperplasia. Gynecol Oncol. 2015;139(2):261–7.
45. Cantrell LA, Zhou C, Mendivil A, M.Malloy K, A.Gehrig P, L.Bae-Jump V. Metformin is a potent inhibitor of endometrial cancer cell proliferation—implications for a novel treatment strategy. Gynecol Oncol. 2010;116(1):92–8.
46. Merritt MA, Strickler HD, Einstein MH, Yang HP, Sherman ME. Insulin/IGF and sex hormone axes in human endometrium and associations with endometrial cancer risk factors. Cancer Causes Control. 2016;27:737–48.
47. Liao C, Zhang D, Mungo C, Tompkins D, Zeidan A. Is diabetes mellitus associated with increased incidence and disease-specific mortality in endometrial cancer? A systematic review and meta-analysis of cohort studies. Gynecol Oncol. 2014;135(1):163–71.
27
and endometrial cancer: the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. Int J Cancer. 2010;127(2):442–51.
49. Kuyucu Y, Çelik LS, Kendirlinan Ö, Tap Ö, Mete UÖ. Investigation of the uterine structural changes in the experimental model with polycystic ovary syndrome and effects of vitamin D treatment: An ultrastructural and immunohistochemical study. Reprod Biol. 2018;18:53–9. 50. Villavicencio A, Bacallao K, Gabler F, Fuentes A, Albornoz J, Casals A, et al. Deregulation of
tissue homeostasis in endometria from patients with polycystic ovarian syndrome with and without endometrial hyperplasia. Gynecol Oncol. 2007;104(2):290–5.
51. Chatterjee N, Walker GC. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Env Mol Mutagen. 2017;58(5):235–63.
