LĄSTELĖS PROLIFERACIJOS ŽYMENS Ki67 RAIŠKOS VERTINIMO YPATUMAI NUSTATANT ĮVAIRIUS PATOLOGINIUS PROCESUS IR LIGAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA

ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

MILVINAS KAZLAUSKAS

LĄSTELĖS PROLIFERACIJOS ŽYMENS Ki67 RAIŠKOS

VERTINIMO YPATUMAI NUSTATANT ĮVAIRIUS

PATOLOGINIUS PROCESUS IR LIGAS

Darbo vadovas Lektorius Dalius Baltušnikas Konsultantė prof. habil. dr. Dalia Pangonytė

TURINYS

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

3.1. Ląstelės ciklas ... 9

3.2. Ląstelės ciklo reguliacija ... 11

3.3 Ląstelės proliferacijos žymuo Ki67 ... 12

3.4. Ki67 kaip diagnostikos žymuo ... 14

3.5 Ki67 kaip prognozinis žymuo ... 15

3.6. Ki67 kaip žymuo, apsprendžiantis gydymą ... 16

4. TYRIMO METODIKA ... 18

4.1. Tyrimo planavimas, objektas ... 18

4.2. Tiriamųjų atranka ... 18

4.3. Tyrimo metodai ... 18

4.3.1. Audinių parengimas mikroskopiniam tyrimui ... 18

4.3.2. Imunohistocheminis tyrimas ... 20

4.3.3. Statistinė analizė ... 20

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 23

5.1. Patologinių pakitimų lokalizacija ir pobūdis, kai buvo atlikta Ki67 imunohistocheminė reakcija ... 23

5.2. Ki67 raiškos pokyčiai ... 30

6. IŠVADOS ... 34

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 35

SANTRAUKA

Magistro darbo pavadinimas – Ląstelės proliferacijos žymens Ki67 raiškos ypatumai nustatant įvairius patologinius procesus ir ligas.

Darbo tikslas - nustatyti Ki67 proliferacijos žymens raiškos ypatumus nustatant piktybinius ir gerybinius navikus bei kitus nenavikinės prigimties patologinius pakitimus.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti, kokios lokalizacijos biopsinės ir operacinės medžiagos patologijos tyrimo metu yra naudojamas Ki67 žymuo.

2. Nustatyti Ki67 imunožymens be kitų žymenų ir drauge su kitais žymenimis naudojimo dažnumą. 3. Įvertinti piktybinių ir nepiktybinių navikų bei kitų patologinių pakitimų dažnumą, kai diagnozės patikslinimui ir gydymo taktikos parinkimui buvo naudojams Ki67 imunožymuo.

4. Įvertinti Ki67 proliferacijos žymens raiškos dažnumą, kai buvo nustatyti skitingi patologiniai pakitimai.

Tyrimo medžiaga ir metodai. Tyrimo objektas - 182 ligoniai, kuriemsatiriant biopsinę ir operacinę medžiagą taikytas Ki67 imunohistocheminis dažymas. Duomenų analizė atlikta naudojant statistinės analizės programą „IBM SPSS Statistics 20.0“.

Tyrimo rezultatai. Imunohistocheminis tyrimas, kuriame naudotas Ki67 žymuo 2017 m. atliktas 182 pacietams: 117 (64,3 %) moterų ir 65 (35,7 %) vyrams. Pacientų amžiaus vidurkis – 59,07±19,02 metai (mediana – 61 metai). Dažniausiai buvo tiriama biopsinė ir operacinė medžiaga iš odos ir minkštųjų audinių (41,2%), krūties ir moters lytinių organų (19,8 %) bei imuninės sistemos organų (12,6 %), rečiau - virškinimo sistemos, šlapimo išskyrimo, kvėpavimo ir nervų sistemos. 42,9% atvejų nustatyta piktybiniai navikai, 38,5% – gerybiniai navikai ir 18,7% – kita patologija.

47,8% Ki67 buvo naudojamas tik vienas, be kitų imunožymenų, likusiais atvejais derinyje su kitais imunožymenimis. Daugiau nei pusei tirtųjų (52,6 %), kai buvo diagnozuoti piktybiniai navikai, Ki67 indeksas buvo daugiau 30 proc., 16-30 proc. – 21,1 % ir 1–15 proc. – 26,3 % (16 pav.). Ši tiriamųjų grupė statistiškai patikimai skyrėsi tiek nuo grupės, kai buvo diagnozuota gerybiniai navikai (p<0,05), tiek ir kai buvo nustatyta kiti patologiniai pakitimai (p<0,5).

Išvados:

1. Ki67 imunožymuo, kaip diagnostinis rodiklis, buvo dažniausiai vertinamas tiriant odos ir minkštųjų audinių, krūties ir moters lytinių organų bei limfinės sistemos organų biopsinę ir operacinę medžiagą. 2. Ki67 imunožymuo 47,8 % buvo naujamas be kitų imunožymenų, 17,6 % – drauge su vienu imunožymeniu, 21,4 % su dviem ir 13,2 % su trimis ir daugiau imunožymenimis dažniausiai patologinių pokyčių histogenezei įvertinti ir gydymo taktikai patikslinti.

3. Įvertinus Ki67 ir kitų imunožymenų raišką, 42,9 % patvitinta piktybinių navikų, 38,5 % – gerybinių navikų ir 18,7 % – kiti patologiniai pakitimai.

4. Daugiau nei pusei (54,7%) tirtųjų Ki67 proliferacijos indeksas buvo mažas (iki 15 proc.) vidutinis (16-30 proc.) – 12,7 % ir didelis (daugiau 30 proc.) – 26,5 %. Piktybinių navikų Ki67 proliferacijos indeksas buvo didžiausias.

SUMMARY

Master thesis – Ki67 Proliferation Marker Assessment Pecullarities for Testing Various Pathologic Processes and Diseases

Aim of research – to determine characteristic expression patterns of proliferation marker Ki67 testing for benign and malignant neoplasms, as well as non-neoplastic pathologic processes.

Goals:

1. To determine the most common localizations of biopsies and surgical material in pathology examination when testing for proliferation marker Ki67.

2. To determine the rate patterns of proliferation marker Ki67 as a single diagnostic parameter in compositon with other immunomarkers.

3. To evaluate the rates of benign and malignant neoplasms, as well as non-neoplastic pathologic processes, when proliferation marker Ki67 was applied with a purpose to specify a diagnosis or plan a treatment strategy.

4. To evaluate the expression rate of proliferation marker Ki67 in different pathologic processes. Material and methods. Object – 182 patients who had their biopsy or surgical material tested for Ki67 immunohistochemical reaction. Data analysis was performed by statistical programme „IBM SPSS Statistics 20.0“. Statistical significance was p<0,05.

Results. Immunohistochemical examination with marker Ki67 was applied for 182 patients in 2017: 117 (64.3%) women and 65 (35.7%) men. Mean age of patients was 59.07±19.02 years old (median – 61 years old). Most common localizations of testing biopsy or surgical material were skin and soft tissues (41.2%), breast and female genital organs (19.8%), and immune system organs (12.6%), less common localizations were in gastrointestinal, uropoetic, respiratory and nervous systems. Malignant neoplasms were diagnosed in 42.9% cases, benign neoplasms – in 38.5% cases, and other pathology – in 18.7% cases.

Proliferation marker Ki67 was applied alone in 47.8% cases of testing, and the remaining cases – in composition with other immunomarkers. More than a half of tested cases (52.65%) of malignant neoplasms had their Ki67 index value determined as more than 30%, 21.1% cases – when Ki67 index value was between 16 – 30%, and 26.3% cases – when Ki 67 index value was 1 – 15%. This group representing malignant neoplasms was statistically significantly different when compared to both the group of benign neoplasms (p<0.05) and group of non-neoplastic pathologic processes (p<0.05). Conclusions:

1. Most common localizations of application immune marker Ki67 as a diagnostic testing parameter were the biopsies and surgical material of skin and soft tissues, breast and female genital organs, and immune system organs.

2. Ki67 immune marker was applied as single testing parameter in 47.8% cases, in a composition with one other immune marker – in 17.6% cases, in a composition with two other immune markers – 21.4% cases, in a composition with three or more other immune markers – in 13.2% cases with a purpose to evaluate histogenesis of pathologic processes and determine treatment strategy.

3. Diagnosis of malignant neoplasms was confirmed in 42.9% cases, benign neoplasms – in 38.5% cases and non-neoplastic pathologic processes – in 18.7% after testing the expression of Ki67 and other immune markers.

4. More than a half of tested cases (52.65%) of malignant neoplasms had their Ki67 index value determined as great (more than 30%), 21.1% cases – when Ki67 index value was moderate (between 16 and 30%), and 26.3% cases – when Ki67 index value was small (between 1 and 15%). Proliferation index of Ki67 in malignant neoplasms was the greatest.

PADĖKA

Dėkoju savo baigiamojo magistro mokslinio darbo vadovui, Respublikinės Panevėžio ligoninės Patologijos skyriaus vedėjui, lektoriui Daliui Baltušnikui už konsultacijas ir skirtą laiką. Taip pat dėkoju LSMUL KK Patologinės anatomijos klinikos vadovei prof. habil. dr. Daliai Pangonytei už pagalbą, skirtą laiką ir pastabas, rašant baigiamajį magistro darbą.

INTERESŲ KONFLIKTAS

SANTRUMPOS

bp – bazių poros

CDK – nuo ciklinų priklausomos kinazės

PICELs - imunokonjugantais inkapsuliuotos liposomos PNR – peptidinės nukleino rūgštys

siRNR - maža interferuojanti RNR shRNR – „trumpų segtukų“ RNR

1. ĮVADAS

Kasdieninėje patologijos diagnostikos praktikoje be įprastinių histologinių tyrimų, kurie leidžia nustatyti ląstelių ir audinių morfologinius pokyčius, šių pokyčių histogenezei pagrįsti ir proceso prognozei įvertinti neatsiejama tyrimų dalimi yra audinių tyrimas, atliekant imunohistochemines reakcijas, kurių metodikos (antigeno (epitopo) išlaisvinimo ir antigeno-antikūno komplekso vizualizavimo) pastaruoju metu labai supaprastėjo (1). Kita vertus atsirado šių tyrimų išorės kokybės kontrolės centrai, kurių pagalba galima lengviau standartizuoti įvairias imunohistocheminio tyrimo procedūras (http://www.nordiqc.org).

Ki67 yra vienas žymenų, nustatomų imunohistochemiškai, plačiai taikomų kasdieniniame patologijos diagnostikos tyrimų darbe (2, 3).

Ki67 – tai dvi baltymo izoformos, kurių molekulinė masė 345 ir 395 kDa. Jis nustatomas visose aktyviose ląstelės ciklo fazėse: G1, S, G2 ir M, bet jo nerandama G0 fazėje. Šis baltymas yra susijęs su navikinių ląstelių proliferacija ir augimu, ir yra plačiai taikomas patologijos praktikoje, kaip ląstelių proliferacijos žymuo. Branduolio Ki67 baltymas yra vertinanamas kaip prognozės ir predikcijos rodiklis tiriant sergančiųjų piktybiniais navikais biopsinę ir operacinę medžiagą (4).

Ki67 proliferacijos indeksas (imunohistochemiškai nustatomų pozityvių ląstelių branduolių skaičius (%) lyginant su visų naviko ląstelių branduolių skaičiumi) koreliuoja su piktybinių navikų metastazavimo tikimybe ir navikų klinikine stadija (2, 4). Nustatyta, kad mažiau diferencijuotų piktybinių navikų Ki67 ekspresija žymiai didesnė nei labiau diferencijuotų. Ki67 žymuo šiais atvejais padeda išskirti ligonius labiau specializuotai terapijai (2). Atsižvelgiant į didelę ląstelių proliferaciją, dažnai siejamą su Ki67 baltymų proliferacijos indeksu, Ki67 taip pat gali būti perspektyvus veiksnys tikslinei įvairių piktybinių navikų molekulinei terapijai (5).

Ki67 žymens imunohistocheminis tyrimas yra gana nesunkiai standartizuojamas, tačiau jo proliferacijos indekso vertinimas patologijos praktikoje vis dar išlieka gana komplikuotas, o jo reikšmės kiekvienu konkrečiu diagnostiniu atveju gana problematiškos (6).

Šiuo tyrimu siekiama išaiškinti Ki67 proliferacijos žymens, nustatyto imunohistochemiškai, raiškos ypatumus, kai buvo diagnozuota piktybiniai ir gerybiniai navikai bei kiti nenavikinės prigimties patologiniai pakitimai atliekant biopsinės ir operacinės medžiagos patologijos diagnostikos rutininius tyrimus.

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo tikslas - nustatyti Ki67 proliferacijos žymens raiškos ypatumus nustatant piktybinius ir gerybinius navikus bei kitus nenavikinės prigimties patologinius pakitimus.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti, kokios lokalizacijos biopsinės ir operacinės medžiagos patologijos tyrimo metu yra naudojamas Ki67 žymuo.

2. Nustatyti Ki67 imunožymens be kitų žymenų ir drauge su kitais žymenimis naudojimo dažnumą.

3. Įvertinti piktybinių ir nepiktybinių navikų bei kitų patologinių pakitimų dažnumą, kai diagnozės patikslinimui ir gydymo taktikos parinkimui buvo naudojams Ki67 imunožymuo.

4. Įvertinti Ki67 proliferacijos žymens raiškos dažnumą, kai buvo nustatyti skitingi patologiniai pakitimai.

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Ląstelės ciklas

Ląstelės egzistavimas prasideda jos susidarymu iš motininės ląstelės ir baigiasi dalijimusi į dvi dukterines ląsteles. Tarp dviejų dalijimųsi ląstelėje vyksta tam tikri pokyčiai: ląstelė auga, sintezuoja baltymus, replikuoja DNR ir dalijimosi metu vienodai paskirsto genetinę medžiagą dviems dukterinėms ląstelėms. Procesų visuma nuo ląstelės susidarymo iš motininės ląstelės iki pasidalijimo vadinama ląstelės ciklu. Eukariotinės ląstelės dalijimosi ciklas vyksta tam tikrais etapais (1pav.).

Skiriami du pagrindiniai ląstelės ciklo etapai: interfazė, kuri skirstoma į tris fazes: G1, S ir G2 ir M fazė. Pastaroji skirstoma į dvi stadijas: 1) mitozę, kurios metu padvigubėjusios chromosomos yra iškiriamos i du branduolius, arba mejozę, kurios metu padvigubėjusios chromosomos yra išskirstomos į keturis branduolius ir 2) citokinezę – kai visa ląstelė pasidalija į dvi dukterines ląsteles (7).

Interfazė – tai tarpas tarp vienos M fazės pabaigos (citokinezės pabaigos) ir kitos M fazės pradžios (pirmosios mitozės fazės – profazės – pradžios). Interfazės metu ląstelė auga ir gyvena: yra metaboliškai aktyvi ir atlieka savo funkcijas. Interfazė yra skirstoma į keletą savitų stadijų pagal DNR kiekį ląstelėje. Tai DNR sintezės stadija S fazė (pagal “Sintezė”), ir dvi tarpinės G fazės (angl. Gap – tarpas): G1 – tarpas tarp M ir S fazių, G2 – tarpas tarp S ir M fazių).

G1 fazė (pirmasis tarpas) – interfazės tarpsnis nuo citokinezės pabaigos iki DNR sintezės pradžios; šioje fazėje DNR kiekis yra būdingas nesidalijančios ląstelės genomui; ląstelė intensyviai

1 pav. Ląstelės ciklas

2 pav. Interfazės stadijos

(http://pieiki.info/interphase-diagram-of-the-cell-cycle/interphase-diagram-of-the-cell-cycle-elegant-05-cell-division/)

sintetina baltymus, auga, vyksta medžiagų apykaita bei dvigubėja organelės, gali diferencijuotis (grįžtamai arba negrįžtamai);

S fazė – interfazės tarpsnis, kai sintezuojama DNR; jos metu DNR kiekis didėja, o jai pasibaigus DNR būna dvigubai daugiau, negu G1 fazėje;

G2 fazė (antrasis tarpas) - tai laikotarpis nuo S fazės pabaigos iki mitozės pradžios; šioje fazėje ląstelė jau turi dvigubą chromosomų rinkinį. DNR patikros taškas: jei DNR pažeista, ji taisoma. Jei DNR pažeista nepataisomai, prasideda apoptozė. G2 fazės metu ląstelė auga ir ruošiasi mitozei (8).

M fazės metu ląstelėje vyksta esminiai pokyčiai: kinta chromatino kondensacija, suyra branduolio apvalkalas, persitvarko ląstelės griaučiai, chromosomos juda vidurio plokštumos link, o vėliau – ląstelės polių link, dalijasi branduolys ir visa ląstelė. Šie procesai garantuoja tikslų genetinės medžiagos padalijimą į dvi lygias dalis, atitenkančias dukterinėms ląstelėms. Skirtingai nuo interfazės, M fazės metu biosintezės procesai beveik nevyksta, visas ląstelės aktyvumas skiriamas dalijimuisi. M fazės tarpsniu sintezuojami tik tam tikri reguliaciniai baltymai. M fazės metu ląstelė suapvalėja, branduolio srityje išryškėja chromosomos.

Citokinezė – citoplazmos dalijimasis, užbaigiantis genetinės medžiagos skirstymą tarp dviejų naujų ląstelių. Mitozė – tai ląstelės ciklo etapas, kurio metu dalijasi ląstelės branduolys ir jame esanti DNR. Pagrindiniai kitimai, vykstantys mitozės metu, lemia tikslų chromosomų pasiskirstymą tarp dukterinių ląstelių.

Ląstelės ciklo trukmė priklauso nuo organizmo, jo vystymosi stadijos, ląstelių rūšies. Ląstelės, kurios greitai dalijasi, ciklas gali trukti mažiau kaip 30 min. Lėtai augančių organų ląstelės ciklas gali trukti keletą mėnesių. Vidutinė eukariotinės ląstelės ciklo trukmė yra apie 24 val.

Skiriasi ir ląstelės ciklo etapų trukmė. M fazė yra trumpa, vidutiniškai trunka apie 1 valandą. Mitozės metu branduolys pasidalija per 30–60 min. Ilgiausia yra interfazė. S fazė trunka 10–12 val. Daugiausia skiriasi ląstelių G1 fazės trukmė, o kai kurios ląstelės šios fazės išlieka visą savo gyvenimą.

Laikinai ar visiškai nesidalijančios G1 fazės ląstelės vadinamos „besiilsinčiomis“ ląstelėmis arba

pasitraukusiomis iš ląstelės ciklo.

Mitozė. Terminą „mitozė“ (iš graikų k. – siūlas) 1870 m. pirmasis vartojo W. Flemming‘as, stebėdamas chromosomų struktūros kitimus ląstelės ciklo metu. Mitozės metu chromatinas sutankėja bei išryškėja chromosomos. Jos matomos kaip dvigubos struktūros, suformuotos iš dviejų seserinių chromatidžių. Tradiciškai mitozė yra skirstoma į keturias fazes: profazę; metafazę; anafazę; telofazę (8,9).

3.2. Ląstelės ciklo reguliacija

Ciklinai – heterodimerinių kinazių reguliaciniai subvienetai. Kintanti jų koncentracija kontroliuoja ląstelės ciklo įvykius, skatina arba slopina ląstelių dauginimąsi. Kinazių katalitiniai subvienetai vadinami nuo ciklino priklausomomis kinazėmis (CDK) ir aktyvios tik tuomet, kai susijungia su ciklinais. CDK vykdo reguliacinių ir struktūrinių baltymų fosforilinimą. CDK kiekis ląstelėje nekinta, bet tam tikromis ląstelės ciklo fazėmis kinta ciklinų koncentracija. Kiekvienas CDK gali susijungti su skirtingais ciklinais ir nuo susijungusio ciklino priklauso, kokie baltymai bus fosforilinami (10).

3 pav. pateikiama trijų pagrindinių ciklin-CDK kompleksų klasių vaidmuo: G1, S-fazės ir

mitozės ciklin-CDK kompleksų. Kai ekspresuojami G1 ciklin-CDK kompleksai, ląstelė stimuliuojama

replikacijai. G1 ciklin-CDK kompleksai paruošia ląstelę S fazei, aktyvuodami transkripcijos faktorius.

Pastarieji inicijuoja genų transkripciją, koduojančių DNR sintezei reikalingus baltymus bei S-fazės ciklinus ir CDK. Du ubikvitino ligazės kompleksai, SCF ir APC, poliubikvitilina specifinius substaratus, S-fazės inhibitorius (5 žingsnis), sekuriną (8 žingsnis) ir mitozės ciklinus (9 žingsnis), pažymėdami juos, kad būtų degraduoti proteosomose.

S-fazės inhibitorių proteolizė aktyvuoja S-fazės ciklin-CDK kompleksus, kurie aktyvina chromosomų replikaciją. Mitozės ciklin-CDK kompelksai sintetinami S ir G2 fazių metu. Kai

defosforilinami inhibitoriai, mitozės ciklin-CDK kompleksai yra aktyvuojami. Chromosomoms išsidėsčius metafazės plokštelėje, APC poliubikvitilina sekuriną, kuris degraduojamas. Kai degraduojamas sekurinas, degraduojami baltymų kompleksai, kurie jungia seserines chromatides metafazės metu. Tuomet prasideda anafazė, kai seserinės chromatidės atskiriamos ir traukiamos į skirtingus mitotinės verpstės polius. Mitozės ciklinų proteolizė inaktyvuoja mitozės ciklin-CDK

3 pav. Eukariotinės ląstelės ciklo reguliacija

(https://www.slideserve.com/eli/cell-cycle-regulation-and-checkpoints)

kompleksus, toliau vyksta vėlyvosios mitozės įvykiai, kol galiausiai prasideda citokinezė. Ciklas vyksta viena kryptimi, nes baltymų degradacija yra negrįžtamas procesas (11).

3.3 Ląstelės proliferacijos žymuo Ki67

Ki67 yra ląstelių proliferacijos žymuo, ir iš ląstelės ciklo žymenų šitas rodiklis tiriamas daugiausia. Ki67 yra ląstelės branduolyje esantis baltymas. Šis baltymas nustatomas visose ląstelės ciklo fazėse, išskyrus G0 (12). Navikuose Ki67 žymuo parodo naviko proliferacinį aktyvumą, t.y. augimo frakcijos dydį. Proliferacinis aktyvumas išreiškiamas proliferacijos indeksu, kuris parodo besidalijančių ląstelių procentą audinyje (13). Ki67 antigenas koduoja dvi baltymines izoformas, kurių molekulinis svoris yra 345 ir 395 kDa, buvo identifikuotas Scholer ir Gerdes 1980-ųjų metų pradžioje (14). Ki67 baltymo pusinis eliminacijos laikas yra ~ 1-1,5 val. Jis yra visuose aktyviuosiuose ląstelės ciklo etapuose (G1, S, G2 ir M), bet nėra šio baltymo poilsio cikle (G0) (15,16). Vėlesniuose mitozės etapuose (anafazės ir telofazės metu) staigiai sumažėja Ki67 baltymo lygis. Ki67 baltymo (pKi67)

4 pav. Ki67 genas (http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_MKI67.html)

ekspresija yra susijusi su vidinių ląstelių populiacijų proliferaciniu aktyvumu piktybiniuose navikuose, todėl jį galima naudoti kaip auglio agresyvumo žymeklį. Ki67 koduojamo baltymo genas yra 29545 bp ilgio nuolatinė seka, aptinkama 10 chromosomoje 10q26.2 lokuse ir yra sudaryta iš 15 egzonų, kurių dydžiai svyruoja nuo 46 iki 6845 bazių porų ir 14 intronų, kurių dydžiai svyruoja nuo 87 iki 3561 bp.

13 egzono sudėtyje yra 16 homologinių 366 bp segmentų (Ki67 pasikartojimų), esančių šio geno centre. 6845 bp ilgiu Ki67 13 egzonas yra vienas didžiausių iš žinomų žinduolių egzonų.

Ki67 baltymo ekspresija sutampa su ląstelės tranzitu per mitozę. In vivo mitozės metu baltymas fosforilinamas ir defosforilinamas, todėl jis yra jautrus proteazėms. Be to, baltymo struktūra rodo, kad jos raiška reguliuojama proteolitinėmis priemonėmis, tokiomis kaip ciklinas B ir ciklinui priklausanti kinazė-2. Žinoma, kad Ki67 turi struktūrinių panašumų (įskaitant vadinamąjį šakutės galvos siejamą domeną) su kitais baltymais, dalyvaujančiais ląstelių ciklo reguliavime, pavyzdžiui, DUN1 ir RAD baltymais (17). Ki67 promotoriaus regiono apibūdinimas yra labai svarbus genų transkripcijos supratimui, todėl svarbu tai ištirti, siekiant sukurti tikslines intervencijas, skirtas modeliuoti genų ekspresiją. Buvo nustatyta, kad regionas nuo -223 iki +12 nukleotido gali sukelti Ki-67 geno transkripciją ir kad transkripcijos faktoriaus Sp1 jungties vieta yra būtina KiKi-67 geno transkripcijos reguliavimui (18). Elektroforezės metu nustatyta, kad Ki67 promotoriuje yra trys jungties vietos, būtinos jo transkripcijos aktyvumui. Manoma, kad yra mažiausiai du transkripcijos reguliavimo mechanizmai. Vienas iš jų susijęs su baltymo p53 slopinamąją funkcija. Kitas mechanizmas galimai susijęs su baltymo p53 ir transkripcijos faktoriaus Sp1 sąveika Ki67 promotoriaus ir Sp1 jungties vietose (19,20)

3.4. Ki67 kaip diagnostikos žymuo

Ki67 dažnai naudojamas kaip ląstelių proliferacijos rodiklis (20). Ki67 žymiai labiau išreikštas piktybiniuose navikuose negu įprastuose audiniuose. Ki67 raiška taip pat didėja blogėjant naviko diferenciacijai ir tai koreliuoja su didesne naviko stadija bei dažnesnėmis metastazėmis (21). Ląstelių proliferacinį aktyvumą navikuose galima nustatyti keliais būdais, pavyzdžiui, skaičiuojant mitozes įprastinės šviesinės mikroskopijos metu, ar tėkmės citometrijos būdu atrenkant ląsteles aktyviai sintezuojančias DNR (22). Imunohistochemiškai proliferuojančias ląsteles galima nustatyti naudojant antikūnus, reaguojančius su įvairiais proliferuojančių ląstelių antigenais. Dažniausiai naudojamas monokloninis (klonas MIB-1) antikūnas prieš branduolio antigeną Ki67. Jo raiška įvertinama procentais ir nustatomas ląstelių proliferacijos indeksas. Koreliuojant Ki67 imunohistocheminio tyrimo duomenis su įprastiniais histologiniais tyrimais gaunama daugiau informacijos apie naviką, ar kitą audinių pažeidimą, bei galima tikslesnė histologijos diagnozė. Ki67 raiška audiniuose taip pat koreliuoja su įvairių tipų navikų iniciacija, progresavimu ir metastazavimu. Šiuos procesus atspindi ir kiti navikinių procesų reguliatoriai, tokie kaip Smac, MCM7, p53, Bcl-2, PCNA ar CD105 (23). Dėl to Ki67 gali atspindėti ir kitus ne vien tik su Ki67 baltymo raiška pagrįstus proliferacijos mechanizmus.

Vertinat navikus rutininėje diagnostikoje Ki67 raiška padeda atskirti skirtingos diferenciacijos virškinamo trakto neuroendokrininius navikus ir diferencijuoti tarp neuroendokrinio naviko G1, neuroendokrinio naviko G3 ir neuroendokrininės karcinomos (24). Taip pat gali padėti diagnozuoti skirtingo agresyvumo meningiomas ir išskirstyti jas pagal diferenciacijos laipsnį (25). Kasos navikų atvejais Ki67 raiška padeda atskirti navikinius audinius nuo nenavikinių., bei padeda atskirti skirtingos diferenciacijos navikus (26). Kolorektalinės karcinomos atvejais Ki67 proliferacijos indeksas koreliuoja su naviko išplitimo laipsniu (pagal Dukes), taip pat yra skirtingas skirtingo diferenciacijos laipsnio karcinomose (27). Kita vertus yra tyrimų, kurie rodo, kad Ki67 proliferacijos indeksas gali būti labai aukštas jau mažai išplitusiose kolorektalinėse karcinomose, bei būti skirtingas skirtingos diferenciacijos nemucininėse kolorektalinėse adenokarcinomose, palyginus su mucininėmis adenokarcinomomis (21). Melanocitiniuose navikuose Ki67 proliferacijos indeksas padeda atkirti gerybinius apgamus, darinius nuo įvairių melanomos variantų (28). Melanocitinių navikų atvejais, siekiant pagerinti Ki67 proliferacijos indekso tikslumą, rekomenduojama kartu su Ki67 naudoti ir specifinį melanomos antigeną (klonas MART1). Toks dvigubas dažymas, leidžia atskirti proliferuojančias Ki67 melanocitines ląsteles nuo kitų proliferuojančių nenavikinių ląstelių, pavyzdžiui, limfocitų, stromos ląstelių, epitelio ląstelių (29,30).

3.5. Ki67 kaip prognozinis žymuo

Prognostiniai žymenys leidžia numatyti naviko agresyvumą bei biologinę elgseną. Ki67 gali būti naudojamas kaip prognostinis žymuo, kuris vienas ar kartu su kitais naviko histologiniais pokyčiais ar kitais imunohistocheminias žymenimis parodo galimą tolimesnę naviko elgseną, jo metastazavimo tikimybę bei recidyvų riziką. Daugeliu atveju Ki67 yra nepriklausomas prognostinis faktorius, apimantis visas naviko stadijas (31) ir tiesiogiai susijęs su paciento išgyvenamumu (31,32).

Ki67 koreliuoja su naviko diferenciacijos laipsniu, histologiškai nustatomomis mitozėmis (26, 33). Mantijos limfomų atveju didesnė Ki67 raiška susijusi su naviko progresavimu ar atsinaujinimu (34). Invazinių šlapimo pūslės karcinomų atveju Ki67 proliferacijos indeksas pavieniui bei kartu su kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus raiška yra naudingas, siekiant nustatyti naviko prognozę (35). Ki67 tiesiogiai koreliuoja su paciento išgyvenamumu gimdos kaklelio karcinomos, gimdos kūno karcinomos, ne Hodžkino limfomos atvejais. Kolorektalinės karcinomos atvejai, pasižymintys didele Ki67 raiška, taip pat turi blogesnę prognozę (36). Kasos karcinomų atvejais didesnė Ki67 raiška susijusi su naviko plitimu limfmazgiuose (33). Krūties karcinomų atvejais Ki67 kartu su kitais prognostiniais žymenimis padeda diferencijuoti geros prognozės karcinomas (liuminalinio A tipo), nuo blogos prognozės karcinomų (liuminalinio B tipo) (37). Odos melanomų atvejais mažesnis Ki67

proliferacijos indeksas (≤20%) susijęs su geresne naviko prognoze, tokie pat rezultatai gaunami ir naudojant kitą proliferacijos žymenį PCNA. Panašūs dėsningumai nustatomi ir anorektalinės melanomos ar nazofaringinės melanomos atvejais, tik skiriasi Ki67 ir PCNA raiškos rezultatai (38).

Daugelis tyrimų patvirtina Ki67 proliferacijos indekso, kaip vėžio prognostinio rodiklio, naudingumą ir parodo koreliaciją su pirminiu naviko dydžiu, regioninėmis ir atokiosiomis metastazėmis, pacientų išgyvenamumu. Taip pat Ki67 raiška koreliuoja su kitais ląstelės proliferaciją nusakančiais kriterijais – mitozėmis, DNR tėkmės citometrijos tyrimais ir turi panašią prognostinę svarbą (39). Tačiau Ki67 indekso skaičiavimas užima pakankamai daug laiko, galima skirtingų tyrėjų rezultatų variacija. Be to, rezultatai gali skirtis dėl paties naviko heterogeniškumo (39). Dėl to, Ki67 retai naudojamas kaip vienintelis prognostinis žymuo, dažniausiai vertinami įvairūs naviko parametrai.

3.6. Ki67 kaip žymuo, apsprendžiantis gydymą

Faktoriai, nurodantys būsimo gydymo efektyvumą, vadinami predikciniais žymenimis. Kadangi Ki67 tiesiogiai atspindi naviko agresyvumą, jo įvertinimas prieš gydymą tampa vis svarbesnis. Dažniausiai Ki67 naudojamas kaip nepriklausomas surogatinis predikcinis žymuo, apsprendžiantis, ar reikia neoadjuvantinės chemoterapijos ankstyvos stadijos krūties vėžiui (40).

Ki67 yra jautrus baltymas, susijęs su ląstelių proliferacija. Atsižvelgiant į didelę ląstelių proliferaciją, dažnai siejamą su Ki67 baltymų proliferacijos indeksu, Ki 67 gali būti perspektyvus žymuo tikslinei molekulinei terapijai (41). Antisensiniai oligodeoksinukleotidai (ASO) buvo tiriami kaip specifinės navikų gydymo priemonės (42). Gyvūnų modeliuose prieš Ki67 veikiantys ASO žymiai slopina naviko augimą. Tačiau yra keletas veiksnių, kurie įtakoja jų taikymą, įskaitant nukleazių degradaciją (43). Norint pagerinti ASO savybes, reikia tobulinti jų preparatus, ypač sukurtus peptidinių nukleino rūgščių (PNR) pagrindu (44). PNR labai panašios į DNR, dėl to vaistas gali efektyviai veikti reikiamas DNR ir RNR sritis. In vitro PNR antikūnai prieš Ki67 stipriau slopino Ki67 ekspresiją nei ASO ir turėjo didesnį poveikį žmogaus inkstų karcinomos ląstelių proliferacijai ir apoptozei.

Pastaraisiais metais buvo sukurta nauja technologija, vadinama RNR interferencija. Ją sukelia specifiška RNR forma vadinamoji siRNR (maža interferuojanti RNR), kuri slopina genų raišką (45). Įrodyta, kad siRNR sukeltas Ki67 ekspresijos slopinimas, stabdo ląstelių proliferaciją. Nors sintetinės siRNR gali greitai ir efektyviai paveikti tikslinius genus, rezultatas yra trumpalaikis. Svarbiausios siRNR naudojimo kliūtys yra efektyvus jų įsisavinimas ir ilgalaikis stabilumas. Norint išspręsti šias problemas, reikėtų aktyvinti plazmidžių veiklą, kad šeimininko ląstelės stabiliai sintezuotų

vadinamąsias "trumpų segtukų RNR" (shRNAs) ir tai leistų sintetinėmis formoms pagal savo veikimą priartėti prie natūralių įgimtų ląstelės procesų (46).

Kito tyrimo metu buvo sukurta nauja onkolitinė adenoviruso pagrindu pagaminta shRNR sistema, vadinama ZD55. ZD55 antikūnai prieš Ki67 sukelia Ki67 geno slopinimą, o tai savo ruoštu skatina naviko ląstelių apoptozę in vitro ir laboratorinėse pelėse (47).

Be to, nustatyta, kad antikūnų, nukreiptų prieš Ki-67, mikroinjekcija sumažina ląstelių dalijimosi greitį. Tačiau šios technologijos pagrindinė kliūtis yra tikslus antikūnų pristatymas į branduolį. Zhang ir kt. (48) naudojo liposominiu būdu inkapsuliuotą konstrukciją, skirtą fotografuoti imunokonjugantais inkapsuliuotas liposomas (PICELs). Nekatijoniniai PICELs yra ypač naudingi įterpiant smulkias daleles į ląstelės struktūras.

Apibendrinant galima teigti, kad Ki67 proliferaicnis indeksas yra išreikštas visose proliferuojančiose ląstelėse, o ypač navikinėse. Taigi, proliferuojančios ląstelės kaip molekulinės terapijos taikiniai yra gana perspektyvūs kuriant naujas vaistų formas.

4. TYRIMO METODIKA

4.1. Tyrimo planavimas, objektas

Tiriamasis darbas buvo atliktas Respublikinėje Panevėžio ligoninėje, Patologijos skyriuje. Tyrimo objektas - atrinkti atvejai, kai tiriant biopsinę ir operacinę medžiagą taikytas Ki67 imunohistocheminis dažymas.

4.2. Tiriamųjų atranka

Gydytojas patologas, įvertinęs hematoksilinu – eozinu dažytus preparatus, paskiria Ki-67 imunohistocheminį dažymą. Išanalizuota 182 patologijos tyrimų rezultatų aprašymai.

4.3. Tyrimo metodai

4.3.1. Audinių parengimas mikroskopiniam tyrimui

Biopsinė ir operacinė medžiaga fiksuojama 10 proc. buferiniu formalino tirpalu. Po makroskopinio vertinimo atliekama operacinės medžiagos separavimo procedūra, mikroskopiniam tyrimui reikalingi audinio fragmentai perkeliami į standartizuotas patologijos tyrimui histologines kasetes ir dedami į procesorių Shandon Pathcentre (gamintojas Shandon, Didžioji Britanija), kuriame standartizuotai atliekamos audinių dehidratacijos, skaidrinimo bei impregnavimo parafinu procedūros (1 lentelė).

Parafine impregnuoti audiniai pernešami į blokų formavino centrą TBS88 (gamintojas Medite

GmbH, Vokietija) bei patalpinami į parafino vonelę, iš kurios išimamos histologinės kasetės.

Histologinės kasetės atidaromos, audinys įdedamas į įliejimo formelę, orientuojamas centre, švelniai prispaudžiamas prie dugno pinceto pagalba. Ant šaldomosios plokštės pašaldžius, uždedama histologinė kasetė, su parafino dozatorium užpilamas parafinas. Parafinui sustingus, iš formelės išimamas suformuotas parafininis blokas.

Parafininiai blokai pjaunami rotaciniu mikrotomu „Leica RM2125RT“ (gamintojas Leica

Biosystems, Vokietija). Pjūvių storis 3 μm. Pjūvis pernešamas į termostatinę vonelę, užpildytą 37ºC

temperatūros vandeniu. Pjūvis ištiesinamas bei uždedamas ant objektinio stiklelio. Preparatas džiovinamas esant kambario temperatūrai, vėliau transportuojamas į termostatą (60ºC). Išsilydęs parafinas fiksuoja audinį ant objektinio stiklelio.

1 lentelė. Audinių fiksavimo, dehidratacijos, skaidrinimo ir impregnavimo parafinu protokolas

Etapas Reagentas Trukmė

Dehidratacija

10 proc. formalino tirpalas 60 min 10 proc. formalino tirpalas 60 min 70% etilo alkoholis 45 min 96% etilo alkoholis 45 min Izopropanolis 60 min Izopropanolis 60 min Izopropanolis 60 min Skaidrinimas Ksilenas 60 min Ksilenas 60 min Ksilenas 60 min Impregnacija Parafinas 45 min Parafinas 45 min Parafinas 60 min Parafinas 60 min

2 lentelė. Histologinių preparatų dažymo hematoksilinu ir eozinu automatizuoto dažymo protokolas

Etapas Reagentas Trukmė Deparafinizavimas Ksilenas 3 min

Ksilenas 3 min Izopropanolis 1 min Izopropanolis 1 min Etanolis, 96o 1 min Etanolis, 96o 1 min Dažymas Vanduo 1 min Mayerio hemotoksilinas 5 min 0,1 % amonio vanduo 1 min Vanduo 1 min Etanolis, 96o 1 min Eozinas 1 min Skaidrinimas Etanolis, 96o 1 min Izopropanolis 1 min Ksilenas 2 min Ksilenas 2 min Ksilenas 2 min

Histologiniai preparatai dažomi rutininiu hematoksilino ir eozino būdu (2 lentelė). Hematoksilino dažai ląstelės branduolius nudažo mėlynai, eozinas ląstelės citoplazmą nudažo įvairiais rožinės spalvos atspalviais, priklausomai nuo citoplazmos sudėties. Histologinių preparatų dažymo procedūra atliekamo automatizuotai, naudojant histologinių preparatų dažymo automatą Leica Auto Stainer XL (2 lentelė).

Nudažyti histologiniai preparatai uždengiami dengiamaisiais stikleliais. Histologiniai preparatai yra parengti mikroskopiniam tyrimui.

4.3.2. Imunohistocheminis tyrimas

Po atlikto detalaus histologinio tyrimo, gydytojas patologas paskiria imunohistocheminį tyrimą nurodydamas reikalingus imunožymenis. Pagaminami papildomi audinių pjūviai ir uždedami ant Super Frost plus objektinių stiklelių. Stikleliai laikomi prieš dažant 3 val. 58oC temperatūros termostate.

Imunohistocheminis dažymas atliktas naudojant Ventana BenchMark GT dažymo automatą (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, JAV). Parafininiai pjūviai po deparafinavimo ksilenu ir dehidratavimo etilo alkoholiu perkeliami į Ventanos plovimo tirpalą. Antigenų epitopams atstatyti naudotas Ventanos ląstelių kondicionavimo tirpalas (pH 8,5) – 96°C 30 min. Vėliau pjūviai inkubuoti monokloniniu antikūnu – 37°C 8 min., naudojant Ventana Ultraview DAB detekcijos sistemą. Buvo naudojamas Spring triušio monokloninis antikūnas prieš Ki67 baltymą, klonas – Sp6. Foniniam dažymui naudotas hematoksilinas. Detalesnis protokolas pateikiamas 3 lentelėje. Analogiškai dažyti ir kiti imunožymenis, jiems pritaikius protokolo laikus. Nudažyti objektiniai stikleliai uždengiami dengiamaisiais stikleliais.

Teigiamai imunohistocheminio tyrimo kontrolei naudoti rekomenduotini kontrolinio audinio pjūviai, neigiama kontrolė atlikta tuose pačiuose pjūviuose, naudojant atitinkamos klasės imunoglobulinus vietoj pirminio antikūno.

Ki67 ir kitų imunožymenų imunohistocheminio tyrimo vertinimą atliko gydytojas patologas. Vertinta Ki67 proliferacijos indeksas – pozityviai nusidažiusių ląstelių branduolių procentas.

4.3.3. Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant statistinės analizės programą „IBM SPSS Statistics

3 lentelė. Ki67 imunohistocheminio dažymo protokolas

1. Stiklelis su pjūviu dedamas į automtinį stiklelių dažytuva, ant vieno iš 20 "padukų", jo temperatūra pakyla iki 75°C, inkubuojama 4 minutes.

2. Po to, tokioje pat temperatūroje, stiklelis padengiamas EZ Prep reagentu, kuris naudojamas parafino likučius nuo audinių imunohistocheminių reakcijų metu. Inkubuojama 4 minutes po du kartus (tarp jų - skalavimas).

3. Stiklelis skalaujamas. Naudojamas reakcijos buferis. Reakcijos buferis automatiniame objektinių stiklelių dažytuve naudojamas kaip pagrindinis komponentas palaikant tinkamą vandeninę aplinką daugeliui reakcijų, tokių kaip pagrindinis plovimas, inkubavimas su antikūnu ir inkubavimas su fermentais bei kitais priedais.

4. Stiklelis padengiamas CC1 reagentu. Inkubuojama 95°C, 30 minučių. Reagentas naudojamas epitopo išlaisvinimui.

5. Skalavimas.

6. Temperatūra pažeminama iki 37°C, stiklelis padengiamas Reakcijos buferiu, inkubuojama 4 minutes.

7. Skalavimas.

8. Stiklelis padengiamas UV Inhibitor reagentu, inkubuojama 37°C, 4 minutes. Reagentas naudojamas inhibicijai.

9. Skalavimas.

10. Stiklelis padengiamas Ki67 antikūnu, inkubuojama 37°C, 8 minutes. 11. Skalavimas.

12. Stiklelis padengiamas UV HRP UNIV MULT reagentu, inkubuojama 37°C, 4 minutes. 13. Skalavimas.

14. Stiklelis padengiamas UV DAB ir BAB H2O2 reagentu, inkubuojama 37°C, 4 minutes. Reagentai naudojami antrinio imuninio komplekso išryškinimui.

15. Skalavimas.

16. Stiklelis padengiamas hematoksilino dažais, dažoma 37°C, 8 minutes. 17. Skalavimas.

18. Stiklelis padengiamas BLUING reagentu. Inkubuojama 37°C, 4 minutes. Reagentas naudojamas blukinimui.

19. Skalavimas.

Kiekybinei duomenų analizei hipotezė apie matuojamų požymių reikšmių normalųjį skirtinį tikrinta taikant Kolmogorov-Smirnov kriterijų.

Tiriamiesiems požymiams aprašyti buvo naudojama aprašomosios statistikos charakteristika – vidurkis bei standartinis nuokrypis. Kokybinei duomenų analizei skirtumams tarp grupių nustatyti

buvo taikyti χ2 kriterijus bei Fisher vienpusio ir dvipusio kriterijų skaičiavimas. Ranginių požymių skirstiniams palyginti taikyta Kruskall-Wallace ANOVA ir Mann-Whitney U testas. Taikytas statistinio patikimumo lygmuo p<0,05.

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

5.1. Patologinių pakitimų lokalizacija ir pobūdis, kai buvo atlikta Ki67

imunohistocheminė reakcija

Imunohistocheminis tyrimas, kuriame naudotas Ki67 žymuo 2017 m. atliktas 182 pacietams: 117 (64,3 %) moterų ir 65 (35,7 %) vyrams. Pacientų amžiaus vidurkis – 59,07±19,02 metai (mediana – 61 metai). Jauniausias pacientas buvo 8 metų, vyriausias – 93 metų.

Dažniausiai buvo tiriama biopsinė ir operacinė medžiaga iš odos ir minkštųjų audinių (41,2%), krūties ir moters lytinių organų (19,8 %) bei imuninės sistemos organų (12,6 %), rečiau - virškinimo sistemos, šlapimo išskyrimo, kvėpavimo ir nervų sistemos (6 pav.).

Atlikus histologinį audinių tyrimą, 42,9% atvejų nustatyta piktybiniai navikai, 38,5% – gerybiniai navikai ir 18,7% – kita patologija (7 pav.), dažniausiai įvairūs reaktyviniai pakitimai.

Įvairios lokalizacijos patologinių pakitimų dažnumas pateiktas 8 pav. Tiriant skirtingų lokalizacijų patologinius pakitimus vyravo diferenciacijos poreikis tarp piktybinių ir gerybinių navikų.

Imunohistochemiškai nustatomas Ki67 imunožymuo dažnai naudojamas kaip ląstelių proliferacijos indikatorius, kuris nustatomas visose ląstelės ciklo aktyviose fazėse (G1, S, G2 ir M) (22). Įvairių studijų duomenimis Ki67 daugiau išreiktas piktybinių nei gerybinių navikų ląstelėse (2). Šiuose tyrimuose dažniausiai naudojamas klonas MIB-1, tačiau taip pat tinkamais laikomi klonai

6 pav. Patologinių pakitimų lokalizacija

Oda ir mikštieji audiniai 75 41,2% Krūtis ir moters lytiniai organai 36 19,8% Imunininė sistema 23 12,6% Virškinimo sistema 18 9,9% Šlapimo išskyrimo sistema 13 7,1% Kvėpavimo sistema 8 4,4% Nervų sistema 7 3,8% Prostata 2 1,1%

7 pav. Patologinių pakitimų dažnumas

MM-1, Ki-S5 ir Sp6 (43), kuris buvo naudojamas mūsų analizuojamame tyrime. Atliekant Ki67 imunohistocheminį tyrimą, kaip ir vertinant kitus imunožymenis, svarbi yra preanalitinė fazė. Reikalinga atkreipti dėmesį į audinio fiksatoriaus tipą (10 proc. neutralaus formalino tirpalas),

8 pav. Įvairios lokalizacijos biopsinės ir operacinės medžiagos patologinių pakitimų dažnumas Gerybiniai navikai 70 38,5% Piktybiniai navikai 78 42,9% Kita patologija 34 18,7% 0% 20% 40% 60% 80% 100% Imu n in ė s is te ma Šlap im o išsk yr im o sist e ma Vir škinim o sist em a Kvėp av im o sist ema Pr o st at a O d a ir min kšt ie ji au d in iai Kr ū ti s ir mo te rs lyt in iai o rgan ai Ne rv in ė s ist e ma Kita Gerybiniai navikai Piktybiniai navikai

9 pav. Skirtingo intensyvumo Ki67 raiška ląstelėse: a – ryški reakcija, b – vidutinė reakcija.

Metaplaziškas bronchų epitelis, orig.pad. x40

fiksacijos trukmę (8-72 val. priklausomai nuo medžiagos dydžio), ir parengtų histologinių preparatų laikymo trukmę (rekomenduojama ne ilgiau 2 sav.). Tyrimai atskleidė, kad Ki67 yra vienas iš

10 pav. Imunožymenų, drauge su kuriais buvo naudotas Ki67, kiekis

(*p<0,05 lyginant grupes, kai buvo naudotas tik Ki67 vienas imunožymuo su grupėmis, kai buvo naudotas drauge su vienu, dviem, trimis ir daugiau imunožymenimis)

*Kiti imunožymenys nenaudoti 87 47,8% Su vienu imunožymeniu 32 17,6% Su dviem imunožymenimis 39 21,4% Su trim ir daugiau imunožymenimis 24 13,2%

stabiliausių imunožymenų (2). Analitinė fazė yra klasikinė, bet koks branduolių nusidažymas laikomas teigiamu, jo raiška gali įvairuoti priklausomai muo ląstelės ciklo fazes, vėlyvose mitozės fazėse (anafazėje ir telofazėje) jo raiška ženkliai sumažėja (9 pav). Svarbu yra parinkti teisingą foninį dažymą (hematoksinu), kitaip galimas rezultatų pervertinimas (klaidingai teigiamas įvertinimas) (1).

Mūsų tyrimo duomenimis, 182 tiriamiesiems, kai buvo atlikta imunohistocheminė Ki67 reakcija, buvo atlikta 182 imunohistocheminės kitų imunožymenų reakcijos, t.y. santykis Ki67 ir kitų imunožymenų atliktų vertinimų 1:1. Arti pusės atvejų (47,8%) Ki67 buvo naudojamas tik vienas, be kitų imunožymenų, 17,6% su vienu imunožymeniu, 21,4% su dviem imunožymenimis ir 13,2% atvejų su trimis ir daugiau žymenų (10-12 pav.).

Beveik 70% atvejų Ki67 buvo panaudotas be kitų imunožymenų, kai buvo nustatyta gerybinių navikų diagnozė, ir statistiškai patikimai skyrėsi nuo grupės, kai buvo kiti patologiniai pakitimai (p<0,05, 13 pav.). Tiriant biopsinę ir operacinę medžiagą, kai buvo nustatyti piktybiniai navikai, Ki67 dažniau buvo naudojamas drauge su kitais 26 imunožymenimis, naudojamais Panevėžio respublikinės ligoninės Patologijos skyriuje (4 lentelė). Dauguma jų skirti audinio histogenezei (naviko histologiniam tipui) įvertinti, kita dalis – gydymo taktikai ir prognozei įvertinti. Palyginimui, Santaros klinikos filiale Valstybiniame patologijos centre naudojami 238 imunožymenys (http://webus.vpc.lt/informacijos/).

11 pav. Naudotas tik vienas Ki67 imunožymuo: imunohistocheminė raiška sudėtiniame apgame

12 pav. Ki67 naudotas drauge su kitais imunohistocheminiais žymenimis. Žarnyno navikas.

Patvirtinta žarnos B ląstelių limfomos diagnozė (orig. pad. x40):

viršuje – Ki67 imunhistocheminė raiška žarnyno navike, ląstelių proliferacijos indeksas apie 30 proc., viduryje – CD20 teigiama reakcija visame navike, apačioje – CD3 teigiam a reakcija pavienėse

13 pav. Imunožymenų, drauge su kuriais buvo naudotas Ki67, kiekis, kai buvo nustatyta skirtingi

patologiniai pakitimai

(*p<0,05 lyginant gerybinių navikų ir kitų patologinių pakitimų grupes, *p<0,05 lyginant piktybinių ir gerybinių navikų grupes)

4 lentelė. Įmunožymenys, naudoti kartu su Ki67

Eil. Nr.

Žymens trumpinys

Apibūdinimas Diagnostikos sritis 1 BER4 Ląstelių membranos baltymas,

ekspresuojamas sveiko plokščio epitelio ir įvairių karcinomų

Plokščio epitelio ląstelės, plaučių, stemplės, odos navikai

2 CAL Kalretininas, viduląstelinis kalcį surišantis baltymas

Specifiškas žymuo mezoteliomose, germinacinių ląstelių navikuose 3 CD3 Diferenciacijos klasteris 3, T

limfocitų specifinis antikūnas T limfocitai 4 CD10 Diferenciacijos klasteris 10, yra

ląstelių paviršiaus metaloproteinazė, ekspresuojama ankstyvuosiuose limfoidinių pirmtakų ląstelėse ir mažoje grupėje nesubrendusių B limfocitų kaulų čiulpuose.

Ankstyvosios limfoidinių pirmtakų ląstelės. Naudojamas Burkitt limfomos, folikulinės limfomos, B limfocitų pirmtakų limfoblastinės leukemijos ir šviesių ląstelių inkstų

karcinomos diagnostikai.

5 CD20 Diferenciacijos klasteris 20, B limfocitų paviršinis aktyvuotas glikolizinintas fosfoproteinas

B limfocitai

6 CD34 Diferenciacijos klasteris 34, viengrandis transmembraninis baltymas

Naudojamas kraujagyslių ir limfinės sistemos navikų nustatymui ir leukemijų

subklasifikavimui, visų virškinimo trakto stromos navikų, dermatofibrosarkomos, solitarinių fibrozinių navikų diagnostikai.

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Kita Gerybiniai navikai Piktybiniai navikai

Kiti imunožymenys nenaudoti Vienas

Du

Trys ir daugiau

*

7 CD56 Diferenciacijos klasteris 5, nNervinių ląstelių adhezijos molekulė, homofilinis surišantis glikoproteinas

NK T limfocitai, neuroendokrininiai navikai ląstelės

8 CD68 Diferenciacijos klasteris 68, glikoproteinas, surišantis mažo tankio lipoproteinus

Makrofagai uždegiminiuose infiltratuose ir histiocitinės kilmės navikuose

9 CD138 Diferenciacijos klasteris 138, transmembraninis proteoglikanas

Mielominė liga 10 CDX2 Kaudalinio tipo homeobokso 2

baltymas, ekspresuojamas

virškinamojo trakto epitelio ląstelių

Virškinamojo trakto kilmės navikai

11 CHROM Chromograninas A, baltymas išskiriamas neuroendokrininės kilmės ląstelių

Neuroendokrininės kilmės navikai

12 CK5 Citokeratinas 5, baltymas, esantis daugelyje pokščio epitelio ląstelių

Nustatomas daugelyje epitelinių ir dvifazių mezoteliomų, naudojamas plokščialąstelinės karcinomos diagnozei

13 CK7 Citokeratinas 7, baltymas randamas

liaukinio epitelio ląstelėse. Teigiama reakcija leidžia atskirti plaučių, krūties liaukų epitelio ląsteles nuo storžarnės, prostatos karcinomos

14 ER Estrogeno receptoriai Krūties ir genitalijų navikai. Parodo, ar navikas priklausomas nuo estrogenų

receptorių, ar ne, ir ar bus efektyvus gydymas hormonų terapija

15 HER2 HER2 onkogeno ekspresuojamas baltymas

HER2 yra epidermio augimo faktoriaus receptoriaus šeimos narys, onkogenas. Signalo perdavimas per HER2 receptorius skatina ląstelių proliferaciją ir slopina apoptozę. Amplifikacija ir/ar padidėjusi šio geno raiška svarbi tam tikrų tipų krūties, skrandžio karcinomos patogenezėje ir progresavime, HER2 yra svarbus biologinis žymuo taikininei terapijai

16 HMW-CK

Didelės molekulinės masės citokeratinai, baltymų grupė randama visose plokščialąstelinio epitelio ląstelėse, kitų epitelių bazinėse dalyse

Prostatos adenokarcinomos diferencinėje diagnostikoje bazinio sluoksnio nustatymui

17 LCA Bendrasis leukocitų antigenas, žymuo kurį turi visos limfoidinės kilmės ląstelės

Limfoidinės kilmės navikai

18 p16 Tumoro supresijos baltymas Surogatinis ŽPV infekcijos žymuo 19 PANCK Bendras citokeratinų žymuo Visos epitelinės ląstelės, karcinomos 20 PRO Progesterono receptoriai Krūties ir genitalijų navikai. Parodo, ar

navikas priklausomas nuo estrogenų

receptorių, ar ne, ir ar bus efektyvus gydymas hormonų terapija

21 S100 Kalcį surišantis baltymas Teigiamai reaguoja nervų pluoštai, nevocitai, makrofagai. Naudojamas nervinės kilmės ir nevomelanocitinės kilmės navikams

diagnozuoti 22 SMA Lygiųjų raumenų aktinas,

dalyvaujanti ląstelės judėjime

23 SYN Synaptofizinas, baltymas,

ekspresuojamas neuroendokrininių ląstelių

Neuroendokrininės kilmės navikai

24 TTF1 Skydliaukės transkripcijos faktorius, daugiausiai ekspresuojamas

skydliaukėje ir plaučiuose

Būdingas pirminiams skydliaukės folikulinio epitelio navikams ir plaučių adenokarcinomai 25 VIM Vimentinas, baltymas

ekspresuojamas mezenchiminių ląstelių

Naudojamas mezenchiminės kilmės ląstelių identifikavimui

26 WT1 Wilmso naviko baltymas Wilmso navikas, kiaušidės seroziniai navikai

5.2. Ki67 raiškos pokyčiai

Poanalitinė fazė yra labai svarbi vertinant Ki67 raišką. Apskaičiuojamas Ki67 indeksas - pozityvių branduolių procentas. Įvairių studijų duomenimis, Ki67 indekso nustatymas gali būti atliekamas tiek mikroskopuojant “akimi”, tiek ir vertinant dokumentuotus histologinius laukus įprastiniu fotografavimu ar stiklelių skanavimu, taikant vaizdo analizės programas (2). Be to navikas gali būti heterogeniškas, todėl svarbu įvertinti visa histologinį pjūvį. Mūsų analizuojamame tyrime gydytojas patologas Ki67 indeksą vertino skaičiuodamas pozityvių ir visų pakitusių (dažniausiai navikinių) ląstelių branduolių kiekį. Atliekant vertinimą svarbus yra koreliacijos koeficientas tarp atskirų vertintojų ir to paties vertintojo pakartotinų tyrimų. Atlikti tyrimai atskleidė, kad yra gera

5 lentelė. Ki67 imunožymens raiška

Ki67 indeksas (proc.) Kiekis %

0 12 6,6 1-5 72 39,6 6-10 15 8,2 11-15 12 6,6 16-20 12 6,6 21-30 11 6,0 31-40 6 3,3 41-50 5 2,7 51-60 6 3,3 61-70 10 5,5 71-80 8 4,4 71-90 13 7,2 Iš viso 182 100,0

14 pav. Skirtinga Ki67 imunožymens raiška:

viršuje kairėje – Ki67 raiška neigiama, reaktyvūs pokyčiai galvos smegenyse (orig.pad. x20); viršuje dešinėje – Ki67 3-5 proc. (orig.pad. x40), patvirtinta tipinio karcinoido diagnozė; apačioje kairėje – Ki67 indeksas apie 50 proc., patvirtinta krūties karcinomos diagnozė (orig.pad. x20); apačioje dešinėje – Ki67

15 pav. Ki67 imunožymens raiška

koreliacija, kai Ki67 indeksas yra mažas arba didelis, ir problermatišku yra vertinimas, kai šio indekso reikšmės yra vidutinės (54).

Mūsų tyrimo duomenimis Ki67 indekso reikšmės svyravo nuo 0 (kai raiškos nebuvo) iki 90% (5 lentelė). Šis žymuo padeda atskirti piktybinius navikus nuo gerybinių: piktybiniuose navikuose

16 pav. Ki67 imunožymens raiška, kai buvo buvo nustatyta skirtingi patologiniai pakitimai

(*p<0,05 lyginant lyginant piktybinių navikų ir kitų patologinių pakitimų grupes, *p<0,05 lyginant piktybinių ir gerybinių navikų grupes)

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Kita Gerybiniai navikai Piktybiniai navikai

0 proc. 1-15 proc. 16-30 proc. daugiau 30 proc. * ** 0 proc. 6,1% 1-15 proc. 54,7% 16-30 proc. 12,7% daugiau 30 proc. 26,5%

Ki67 indeksas ženkliai didesnis, taip pat jis didėja, mažėjant piktybinio naviko diferencijacijos laipsniui, ir koreliuoja su metastazių atsiradimu ir naviko išplitimo stadija. Patologijos praktikoje naudojant šį žymenį drauge su kitais histologiniais navikų piktybiškumo požymiais gali būti nustatoma naviko recidyvo tikimybė (2, 55, 56). 2009 m. buvo primtas San Galeno konsensusas, kuriuo Ki67 indeksas laikomas svarbiu atrenkant papildomai chemioterapijai pacientes su hormonų receptoriams pozityvia krūties karcinoma (57).

Imunohistocheminio tyrimo pagalba nustatoma Ki67 ekspresija tampa “auksiniu” standartu, kai 10 ir 14 % pozityviai nusidažančių ląstelių traktuojama kaip prognozei nepalankus rodiklis (57).

Priklausomai nuo Ki67 indekso piktybiniai navikai gali būti klasifikuojami, kaip mažai (≤15 proc.), vidutiniškai (16-30 proc.), daug proliferuojantys (>30 proc.). Daugiau nei pusei (54,7%) mūsų tirtųjų Ki67 indeksas buvo iki 15 proc., 16-30 proc. – 12,7 % ir daugiau 30 proc. – 26,5 % (14, 15 pav.).

Daugiau nei pusei tirtųjų (52,6 %), kai buvo diagnozuoti piktybiniai navikai, Ki67 indeksas buvo daugiau 30 proc., 16-30 proc. – 21,1 % ir 1–15 proc. – 26,3 % (16 pav.). Ši tiriamųjų grupė statistiškai patikimai skyrėsi tiek nuo grupės, kai buvo diagnozuota gerybiniai navikai (p<0,05), tiek ir kai buvo nustatyta kiti patologiniai pakitimai (p<0,5).

Mūsų tyrimas atskleidė, kad Ki67 proliferacijos indeksas yra žymiai didesnis, kai diagnozuota piktybiniai navikai, tačiau skiriamoji riba nėra visiškai tiksli ir kiekvienu konkrečiu atveju reikėtų šį imunožymenį vertinti drauge su kitais navikų piktybiškumo požymiais.

6. IŠVADOS

1. Ki67 imunožymuo, kaip diagnostinis rodiklis nustatomas imunohistochemiškai, buvo dažniausiai vertinamas tiriant odos ir minkštųjų audinių, krūties ir moters lytinių organų bei limfinės sistemos organų biopsinę ir operacinę medžiagą.

2. Patologinių pakitimų histogenezei įvertinti ir gydymo taktikai patikslinti viena Ki67 žymens imunohistocheminė reakcija buvo atlikta drauge su viena kito imunožymens reakcija. Ki67 imunožymuo 47,8 % buvo naujamas be kitų imunožymenų, 17,6 % – drauge su vienu imunožymeniu, 21,4 % su dviem ir 13,2 % su trimis ir daugiau imunožymenimis.

3. Įvertinus Ki67 ir kitų imunožymenų raišką, 42,9 % patvirtinta piktybinių navikų, 38,5 % – gerybinių navikų ir 18,7 % – kiti patologiniai pakitimai.

4. Daugiau nei pusei (54,7%) tirtųjų Ki67 proliferacijos indeksas buvo mažas (iki 15 proc.) vidutinis (16-30 proc.) – 12,7 % ir didelis (daugiau 30 proc.) – 26,5 %. Piktybinių navikų Ki67 proliferacijos indeksas buvo didžiausias.

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Siekiant tiksliai įvertinti Ki67 imunožymens raišką, preanalitinėje fazėje svarbu tinkamai parinkti foninį dažymą hemotoksilinu.

2. Tikslinant patologijos tyrimo išvadą svarbu kompleksinis vertinimas: Ki67 ir kitų imunožymenų raiškos bei histologinių žymenų palyginamoji analizė.

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Laurinavičienė A, Smaliukienė R. Histologinių technologijų vadovas. Vilnius. 2007.

2. Li LT, Jiang G, Chen Q, Zheng JN. Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer. Molecular medicine reports 2015 11: 1566–72.

3. Ragab HM, Samy N, Afify M, Maksoud NAE, Shaaban HAM. Assessment of Ki-67 as a potential biomarker in patients with breast cancer. Journal of Genentic Enginneering and Biotechnology 2018 (in press).

4. Besusparis J, Plancoulaine B, Rasmusson A, Augulis R, Green AR, Ellis IO et al. Impact of tissue sampling on accuracy of Ki67 immunohistochemistry evaluation in breast cancer. Diagnostic Pathology 2016; 11: 82.

5. Wajed S A, Laird P W, DeMeester T R. DNA methylation: an alternative pathway to cancer. Annals of Surgery 2001;234:10–20.

6. Penault-Llorca F, Radosevic-Robin N. Ki67 assessment in breast cancer: an update. Pathology 2017; 49: 166–71.

7. Hunt, T., Nasmyth, K. Novak, B. The cell cycle. Philosophical Transactions of the Royal Society Biological Sciences 2011;366:3494–7.

8. Mildažienė V, Jarmalaitė S, Daugelavičius R. Ląstelės biologija. Kaunas. 2004.

9. Lodish K, Berk S, Matsudaira Z, Kaiser D. Molecular Cell Biology. Fifth Edition. New York: W. H. Freeman; 2003.

10. Lim S, Kaldis P. Cdks, cyclins and CKIs: Roles beyond cell cycle regulation. Development 2013;15:3079-93.

11. Uhlmann F, Bouchoux C, López-Avilés S. A quantitative model for cyclin-dependent kinase control of the cell cycle: revisited. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 2011;366(1584):3572–83.

12. Kim H, Bae S, Kim H, Jeong H, Hong S Yoon S. Usefulness of Ki-67 (MIB-1) immunostaining in the diagnosis of pulmonary sclerosing hemangiomas. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Series C: Immunology 2013;121:105–10.

13. Kuan S, Ren B, Brand R, Dudley B, Pai K. Neoadjuvant therapy in microsatellite-stable colorectal carcinoma induces concomitant loss of MSH6 and Ki-67 expression. Human pathology 2017;63:33-9. 14. Melling N, Kowitz M, Simon R, Bokemeyer C, Terracciano L, Sauter G, et al. High Ki67 expression is

an independent good prognostic marker in colorectal cancer. Journal of Clinical Pathology 2016;69:209-14.

15. Cuylen S, Blaukopf C, Politi A, Muller-Reichert T, Neumann B, Poser I, et al. Ki-67 acts as a biological surfactant to disperse mitotic chromosomes. Nature 2016;535:308–12.

antigen Ki-67 organises heterochromatin. eLife 2016;5:e13722.

17. Panteva M T, Salari R, Chong T. Direct observations of shifts in the β-sheet register of a protein-peptide complex using explicit solvent simulations. Biophysical Journal 2011;100:L50–L52.

18. Chen F, Song J, Di J, Zhang Q, Tian H, Zheng J. IRF1 suppresses Ki-67 promoter activity through interfering with Sp1 activation. Tumour Biology 2012;33:2217–25.

19. Ishibashi N, Maebayashi T, Aizawa T, Sakaguchi M, Nishimaki H, Masuda S. Correlation between the Ki-67 proliferation index and response to radiation therapy in small cell lung cancer. Radiation Oncology 2017;12:16.

20. Gerdes J, Endl E. The Ki67 protein: Fascinating Forms and as unknown function. Experimental Cell Reaserch 2000;257:231-7.

21. Kuan S, Ren B, Brand R, Dudley B, Pai K. Neoadjuvant therapy in microsatellite-stable colorectal carcinoma induces concomitant loss of MSH6 and Ki-67 expression. Human pathology 2017;63:33-39.

22. Clarke S, Calderon V, Bradford J. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry 2018;82:7-12.

23. Hegazy A, Daoud S, Ibrahim S, El-Atrebi K, Saker M, Abdel-Wahab N Role of Ki-67, P53 and Bcl-2 in Advanced Colorectal Carcinoma. Academic Journal of Cancer Research 2014;7:168–72.

24. Jernman J, Välimäki MJ, Louhimo J, Haglund C, Arola J. The Novel WHO 2010 Classification for Gastrointestinal Neuroendocrine Tumours Correlates Well with the Metastatic Potential of Rectal Neuroendocrine Tumours. Neuroendocrinology 2012;95:317-24.

25. Cho K G. Natural History, Growth Rates, and Recurrence. Meningiomas. London:Springer; 2009. p. 45-51.

26. Hu H Y, Liu H, Zhang J W, Hu K, Lin Y. Clinical significance of Smac and Ki-67 expression in pancreatic cancer. Hepatogastroenterology 2012;59(120):2640-3.

27. Siegel L, Miller KD, Fedewa SA, Ahnen DJ, Meester R, Barzi A, et al. Colorectal cancer statistics. CA: A Cancer Journal for clinicians 2017;67:177-93.

28. Hoang MP, Mihm M C Jr. Ancillary Technics In Diagnosing Melanocytic Lesion. Melanocytic Lesions. New York: Springer; 2014. p. 379-435.

29. Bertucci F, Finetti P, Roche H, Marisa L, Martin A, Blanc – Fournier C et al: Comparison of the prognostic value of genomic grade index, Ki67 expression and mitotic activity index in early node-positive breast cancer patients. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology 2013;24:625–32.

30. Nielsen P S, Riber-Hansen R, Raundahl J and Steiniche T. Automated quantification of MART1-verified Ki67 indices by digital image analysis in melanocytic lesions. Archives of Pathology & Laboratory Medicine 2012;136:627–34.

31. Machowska M, Wachowicz K, Sopel M, Rzepecki R. Nuclear location of tumor suppressor protein maspin inhibits proliferation of breast cancer cells without affecting proliferation of normal epithelial cells. BioMed Central cancer 2014;14:142.

32. Nielsen P S, Riber-Hansen R, Jensen TO, Schmidt H, Steiniche T. Proliferation indices of phosphor-histone H3 and Ki67: strong prognostic markers in a consecutive cohort with stage I/II melanoma. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology 2013; 26: 404–13.

33. Park J, Kim R, Nam J. Immunohistochemical analysis for therapeutic targets and prognostic markers in low-grade endometrial stromal sarcoma. International journal of gynecological cancer 2013; 23:81– 9.

34. Vogt N, Klapper W. Variability in morphology and cell proliferation in sequential biopsies of mantle cell lymphoma at diagnosis and relapse: clinical correlation and insights into disease progression. Histopathology 2013;62:334–42.

35. Chen J X, Deng N, Chen X, Chen L, Qiu S. A novel molecular grading model: combination of Ki67 and VEGF in predicting tumor recurrence and progression in non-invasive urothelial bladder cancer. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2012;13:2229–34.

36. Kimura T, Tanaka S, Haruma K, Sumii K, Kajiyama G, Shimamoto F, et al. Clinical significance of MUC1 and E-cadherin expression, cellular proliferation, and angiogenesis at the deepest invasive portion of colorectal cancer. International Journal of Oncology 2000;16:55–64.

37. Amin M B, Edge S, Greene F, Byrd D R, Brookland RK, Washington MK, et. Al. American Joint Committee on Cancer’s Cancer Staging Manual. 8th ed. New York: Springer; 2017. p:589-628. 38. Rinaldo A, Shaha A R, Patel S G, Ferlito A. Primary mucosal melanoma of the nasal cavity and

paranasal sinuses. Acta Otolaryngologica 2001;121:979–82.

39. Tuleta I, Bauriedel G, Steinmetz M, Pabst S, Peuster M, Welsch U et al. Apoptosis-regulated survival of primarily extravascular cells in proliferative active poststent neointima. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology 2010;19:353–60.

40. Fasching A, Heusinger K, Niklos M, Hein A, Bayer C, Rauh C et. al. Ki67, chemotherapy response, and prognosis in breast cancer patients receiving neoadjuvant treatment. BioMed Central cancer 2011; 11: 486.

41. Wajed S A, Laird P W, DeMeester T R. DNA methylation: an alternative pathway to cancer. Annals of Surgery 2001;234:10–20.

42. Zheng J N, Ma T X, Cao J Y, Sun X Q, Chen J C, Li W. et al. Knockdown of Ki-67 by small interfering RNA leads to inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human renal carcinoma cells. Life Sciences 2006;78:724–9.

Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology 2006;33:533–40.

44. Paulasova P, Pellestor F. The peptide nucleic acids (PNAs): a new generation of probes for genetic and cytogenetic analyses. Annales de Genetique 2004;47:349–58.

45. Demidov VV, Potaman VN, Frank-Kamenetskil MD, Egholm M, Buchard O, Sonnichsen S. Stability of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. Biochemical Pharmacology 1994;48:1310–3.

46. Moore CB, Guthrie EH, Huang MT, Taxman DJ. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology 2010;629:141–58.

47. Starborg M, Gell K, Brundell E, Höög C. The murine Ki-67 cell proliferation antigen accumulates in the nucleolar and heterochromatic regions of interphase cells and at the periphery of the mitotic chromosomes in a process essential for cell cycle progression. Journal of Cell Science 1996;109:143– 53.

48. Zhang P, Steelant W, Kumar M, Scholfield M. Versatile photosensitizers for photodynamic therapy at infrared excitation. Journal of American Chemical Society 2007;129:4526–7.

49. Vörös A, Csörgő E, Nyári T, Cserni G. An intra- and interobserver reproducibility analysis of the Ki-67 proliferation marker assessment on core biopsies of breast cancer patients and its potential clinical implications. Pathobiology 2013;80:111–8.

50. Cho-Vega JH. A diagnostic algorithm for atypical spitzoid tumors: guidelines for immunohistochemical and molecular assessment. Modern Pathology 2016; 29: 656–70.

51. Martin B, Paesmans M, Mascaux C, Berghmans T, Lothaire P, Meert AP, et al. Ki-67 expression and patients survival in lung cancer: systematic review of theliterature with meta-analysis. British journal of cancer. 2004; 91:2018–25.

52. Jonat W, Arnold N. Is the Ki-67 labelling index ready for clinical use? Annals of oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology 2011; 22: 500–2.