POLINKIO TROMBOZEI BIOLOGINIŲ ŽYMENŲ PAIEŠKA SERGANTIESIEMS LĖTINĖMIS MIELOPROLIFERACINĖMIS LIGOMIS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

Rūta Dambrauskienė

POLINKIO TROMBOZEI

BIOLOGINIŲ ŽYMENŲ PAIEŠKA

SERGANTIESIE

MS LĖTINĖMIS

MIELOPROLIFERACINĖMIS

LIGOMIS

Disertacija rengta 2012–2018 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Medicinos fakulteto Onkologijos instituto Onko-logijos ir hematoOnko-logijos klinikoje.

Mokslinė vadovė

prof. dr. Elona Juozaitytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B).

Konsultantas

doc. dr. Rolandas Gerbutavičius (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B). Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. habil. dr. Daiva Rastenytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B).

Nariai:

prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B); prof. dr. Kęstutis Petrikonis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B);

prof. dr. Sandra Lejniece (Rygos Stradinio universitetas, Latvija, biome-dicinos mokslai, medicina – 06B);

prof. dr. Dietger Walter Niederwieser (Leipzigo universitetas, Vokietija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B).

Disertacija ginama viešame Medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2019 m. vasario 8 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoni-nės Kauno klinikų Didžiojoje auditorijoje.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

Rūta Dambrauskienė

THROMBOSIS

BIOMARKERS IN PATIENTS WITH

CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE

DISEASES

Dissertation has been prepared at the Department of Oncology and Haematology of the Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2012–2018.

Scientific Supervisor

Prof. Dr. Elona Juozaitytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine

–

Consultant

Assoc. Prof. Dr. Rolandas Gerbutavičius (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B).

The Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences.

Chairperson

Prof. Habil. Dr. Daiva Rastenytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B).

Members:

Prof. Habil. Dr. Vaiva Lesauskaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B); Prof. Dr. Kęstutis Petrikonis (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B);

Prof. Dr. Sandra Lejniece (Riga Stradins University, Latvia, Biomedical Sciences, Medicine – 06B);

Prof. Dr. Dietger Walter Niederwieser (University of Leipzig, Germany, Biomedical Sciences, Medicine – 06B).

Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of Lithuanian University of Health Sciences on the 8th of February, 2019 at 1.00 PM in the Great Auditorium of the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kauno Klinikos.

TURINYS

ĮVADAS ... 10

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

1.1. Darbo tikslas ... 12

1.2. Darbo uždaviniai ... 12

1.3. Darbo mokslinis naujumas ... 12

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14

2.1. Lėtinių mieloproliferacinių ligų epidemiologija ... 14

2.2. Lėtinių mieloproliferacinių ligų etiopatogenezės molekuliniai aspektai ... 15

2.3. Lėtinių mieloproliferacinių ligų trombozinių komplikacijų etiopatogenezė ... 21

2.3.1 Kraujo ląstelių reikšmė vystantis hemostazės sutrikimui ... 22

2.3.1.1. Trombocitų vaidmuo ... 22

2.3.1.2. Eritrocitų vaidmuo ... 24

2.3.1.3. Leukocitų vaidmuo ... 25

2.3.1.4. Endotelio ląstelių vaidmuo ... 25

2.3.2. Plazmos žymenų reikšmė hemostazės sutrikimui ... 26

2.4 Lėtinių mieloproliferacinių ligų trombozės rizikos veiksniai ... 27

2.4.1. Amžius ir buvusi trombozė ... 27

2.4.2. Kraujo ląstelių skaičius ... 28

2.4.3. Mutacijos ... 29

2.4.4. Trombofiliniai veiksniai ... 30

2.4.5. Kardiovaskuliniai rizikos veiksniai ... 32

2.4.6. Trombocitų receptorių ir krešėjimo faktorių polimorfizmai ... 32

2.4.7. Antifosfolipidiniai antikūnai ... 35

2.5. Trombozinių komplikacijų epidemiologija ... 36

2.6. Trombozinių komplikacijų rizikos modeliai ... 40

3. DARBO METODIKA ... 41

3.1. Tiriamųjų atranka ... 41

3.2. Tyrimo eiga ... 44

3.3. Genetinis tyrimas ... 44

3.3.1. Genominės DNR išskyrimas ... 44

3.3.2. Trombocitų glikoproteinų Ia/IIa (c.807C>T), Ibα (Kozak c.-5T>C, VNTR ir c.5792C>T), IIb/IIIa (PIA 1/2), VI (c.13254T>C) genetinių polimorfizmų tyrimo metodika ... 45

3.3.3. Krešėjimo faktoriaus VII (c.-323P0/10), vVF (c.4751A>G) bei β-fibrinogeno (c.-148C>T) genetinių polimorfizmų tyrimo metodika ... 53

3.3.4. Genetinių mutacijų (krešėjimo faktoriaus V Leideno, protrombino G20210A, CALR, MPL) tyrimo metodika ... 57

3.4. Lupus antikoagulianto nustatymas ... 63

3.5. Antifosfolipidinių antikūnų nustatymas ... 64

3.5.1. Chemiliuminescencinis metodas (β2GP1 ir β2GP1-domeno-1

antikūnų nustatymas) ... 64

3.5.2. ELISA (Kardiolipino antikūnų nustatymas) ... 64

3.6. Statistinė duomenų analizė ... 66

4. REZULTATAI ... 68

4.1. Pacientų demografinių, klinikinių ir genetinių veiksnių ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 68

4.1.1. Pacientų demografinių ir klinikinių veiksnių palyginimas ir ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 68

4.1.2. Pacientų genetinių polimorfizmų analizė ir ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 70

4.1.2.1. Trombocitų receptoriaus GP Ia/IIa c.807C>T polimorfizmo analizė ir ryšys su trombozėmis ... 70

4.1.2.2. Trombocitų receptoriaus GP Ibα VNTR, Kozak c.-5T>C, c.5792 C>T Ko polimorfizmų analizė ir ryšys su trombozėmis ... 71

4.1.2.3. Trombocitų receptoriaus GP IIb/IIIa PIA1/2 ir GP VI c.13254T>C polimorfizmų analizė ir ryšys su trombozėmis ... 72

4.1.3. Pacientų von Vilebrando faktoriaus (c.4751A>G), VII krešėjimo faktoriaus (c.-323 P0/10) bei β-fibrinogeno (c.-148C>T) genetinių polimorfizmų analizė ir ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 74

4.1.3.1. Pacientų von Vilebrando faktoriaus (c.4751A>G) analizė ir ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 74

4.1.3.2. Pacientų β-fibrinogeno c.-148C>T analizė ir ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 74

4.1.3.3. Pacientų krešėjimo faktoriaus VII c.-323 P0/10 analizė ir ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 76

4.1.4. Pacientų genetinių mutacijų krešėjimo faktoriaus V Leideno, protrombino G20210A, CALR, JAK2 V617F, MPL) analizė ir ryšys su trombozinėmis komplikacijomis ... 79

4.1.4.2. JAK2 V617F, CALR ir MPL mutacijų analizė ir ryšys su trombozėmis ... 79

4.2. Klinikinių veiksnių, antifosfolipidinių antikūnų bei lupus antikoagulianto sąsajos su trombozėmis lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergantiems tiriamiesiems ... 82

4.2.1. Lupus antikoagulianto ir klinikinių veiksnių palyginimas bei lupus antikoagulianto sąsajos su trombozinėmis komplikacijomis. ... 82

4.2.2. Tiriamųjų antifosfolipidinių antikūnų duomenys: sąsajos su klinikiniais požymiais ir trombozinėmis komplikacijomis ... 84

4.3. Klinikinių veiksnių, antifosfolipidinių antikūnų bei genetinių polimorfizmų sąsajos prognozuojant trombozines komplikacijas lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis, sergantiems pacientams ... 89

5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 92

5.1. Klinikinių ir genetinių veiksnių sąsajos su trombozinėmis komplikacijomis lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergantiems tiriamiesiems ... 92

5.1.1. Klinikinių veiksnių palyginimas ir sąsajos su trombozinėmis komplikacijomis lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergantiems tiriamiesiems ... 92

5.1.2. Lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergančių tiriamųjų trombocitų receptorių GP genetinių polimorfizmų Ia/IIa (c.807C>T), Ibα (Kozak c.-5T>C, VNTR ir c.5792C>T), IIb/IIIa (PIA 1/2), VI (c.13254T>C) genotipų bei alelio dažnio palyginimas ir sąsajos su trombozinėmis komplikacijomis ... 93

5.1.3. Lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergančių tiriamųjų VII krešėjimo faktoriaus (c.-323 P0/10), β-fibrinogeno (c.-148C>T) bei vVF (c.4751A>G) polimorfizmų genotipų bei alelio dažnio palyginimas ir sąsajos su trombozinėmis komplikacijomis ... 96

5.1.4. Lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergančių tiriamųjų genetinių mutacijų (krešėjimo faktoriaus V Leideno, protrombino G20210A, JAK2 V617F, CALR, MPL) genotipų bei alelio dažnio palyginimas ir sąsajos su trombozinėmis komplikacijomis ... 98

5.1.5. Lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergančių tiriamųjų klinikinių veiksnių, antifosfolipidinių antikūnų bei lupus antikoagulianto sąsajų su trombozinėmis komplikacijomis aptarimas ... 100

IŠVADOS ... 104

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 105

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 106

STRAIPSNIAI, PUBLIKUOTI DISERTACIJOS TEMA ... 125

SUMMARY ... 147

PRIEDAI ... 178

PADĖKA ... 187

SANTRUMPOS

ADP – adenozino difosfatas

ADTL – aktyvintas dalinis tromboplastino laikas AFLA – antifosfolipidiniai antikūnai

AH – arterinė hipertenzija

AKA – kardiolipino antikūnai AKS – arterinis kraujo spaudimas Anti β₂GP1– β₂-glikoproteino-1 antikūnai ATF – adenozino trifosfatas

BCR-ABL – (angl. breakpoint cluster region-Abelson leukemia virus) genas, kuris susiformuoja po translokacijos tarp 9 ir 22 chromosomų ir koduoja BCR-ABL sintetinį baltymą

b-FGF – fibroblastų augimo faktorius beta

CALR – kalretikulinas

CD – cukrinis diabetas

CD11b – klasterio diferenciacijos molekulė CRB – C reaktyvinis baltymas

DNR – dezoksiribonukleorūgštis

DRVVT – tyrimas, naudojant atskiestus Russell’o angies nuodus

ECLAP – Europos mažų aspirino dozių sergantiems tikrąja policitemija, tyrimas EDTA – etilendiamino tetraacetatas

ELISA – imunofermentinis metodas Epo – eritropoetinas

ET – esencialinė trombocitemija

FERM – domenas (angl. N-terminal Band 4.1, ezrin, radixin, moesin)

fl – femtolitrai

FV – krešėjimo faktorius V

FVII – krešėjimo faktorius VII

FXa – aktyvus krešėjimo faktorius X

GM-CSF – granuliocitų ir makrofagų stimuliuojantis faktorius

GP – glikoproteinas

GS – galimybių santykis

Hb – hemoglobinas

HGF – hepatocitų augimo faktorius

Ht – hematokritas IgG – imunoglobulinas G IgM – imunoglobulinas M IL-10 – interleukinas 10 IL-4 – interleukinas 4 IL-6 – interleukinas 6 IL-8 – interleukinas 8

IPSET – Tarptautinis esencialinės trombocitemijos prognozės modelis

IPSET-T – (angl. International Prognostic Scoring System for Thrombosis in ET

(IPSET- thrombosis)) Tarptautinis esencialinės trombocitemijos

trombozės prognozės modelis JAK – Janus kinazė

JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos JH1 – tirozinkinazės domenas

JH2 – Janus kinazės homologiškas domenas LA – lupus antikoaguliantas

LDH – laktatdehidrogenazė LML – lėtinė mieloleukemija

LMPL – lėtinės mieloproliferacinės ligos

LSMUL – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė MCH – hemoglobino koncentracija eritrocite

MCV – vidutinis eritrocito tūris

MD – mikrodalelės

MDS – mielodisplazinis sindromas

MI – miokardo infarktas

MPL – mieloproliferacinio leukemijos viruso onkogenas MTHFR – metylentetrahidofolato reduktazė

NO – azoto oksidas

pg – pikogramas

PGR – dauginės polimerazės grandininė reakcija PI – pasiklautinasis intervalas

PMF – pirminė mielofibrozė

PSIP – praeinantis smegenų išemijos priepuolis

PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

RLU – santykiniai šviesos vienetai

SH2 – Scr homologiškas domenas

SN – standartinis nuokrypis

STAT – angl. signal transducer and activator of transcription TGF-𝛽 – transformuojantis augimo faktorius beta

TNF – tumoro nekrozės faktorius TNF-𝛼 – tumoro nekrozės faktoriaus alfa TP – tikroji policitemija

Tpo – trombopoetinas

TXA2 – tromboksanas A2

VEGF – kraujagyslių endotelio augimo faktorius VNP – vieno nukleotido polimorfizmas vWF – von Vilebrando faktorius χ2

– chi-kvadrato kriterijus

ĮVADAS

Lėtinės mieloproliferacinės ligos (LMPL), kitaip dar vadinamos neo-plazijomis (angl. myeloproliferative neoplasia), – tai grupė hematologinių ligų, kurios vystosi iš mielopoetinės ląstelės pirmtako. Šiuo metu pagal naujausią 2016 m. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) klasifikaciją, LMPL priklauso tikroji policitemija (TP), esencialinė trombocitemija (ET), pirminė mielofibrozė (PMF), lėtinė mieloleukemija (LML), lėtinė eozi-nofilinė, neutrofilinė leukemija ir kitaip neklasifikuojama LMPL [1].

TP, ET ir PMF dažnai kitaip dar vadinamos klasikinėms, BCR-ABL ((angl. breakpoint cluster region; Abelson leukemia virus) – genas, susifor-muojantis po translokacijos tarp 9 ir 22 chromosomų ir koduojantis BCR-ABL sintetinį baltymą) neigiamomis LMPL [2]. Bendrai visoms LMPL būdinga lėtinė, autonominė diferencijuotų kraujo ląstelių – eritrocitų, trombocitų, leukocitų hiperprodukcija, dėl ko ilgainiui vystosi piktybinio klono ekspansija kaulų čiulpuose ir už jų ribų [3,4]. LMPL sergančių pacientų išgyvenamumas skiriasi priklausomai nuo ligos. ET sergančių pacientų prognozė geriausia, nes išgyvenamumas prilyginamas sveikų žmonių populiacijai, atitinkančiai amžių ir lytį [4]. Kita vertus, tiek TP, tiek ET sergančių pacientų išgyvenamumas labai priklauso nuo ligos komp-likacijų, kurių viena pagrindinių yra trombozės.

Pirmą kartą šias ligas kartu sugrupavo mokslininkas Wiliamas Dama-shekas dar 1951 metais. 1972 m. buvo nustatyta, kad LMPL yra kloninės kilmės [5]. Įgyta somatinė mutacija multipotentinėje kamieninėje ląstelėje ar labai ankstyvame mieloidinės ląstelės pirmtake sukelia įvairių hemato-poetinių linijų diferenciacijos, proliferacijos ir reguliacijos sutrikimus. Ypač svarbi LMPL patogenezėje yra 2005 m. atrasta aktyvuojanti Janus kinazės 2 (angl. Janus kinase; JAK), kuri yra signalo perdavėjas, mutacija – JAK2 V617F [6–8]. JAK2 kinazė vaidina svarbų vaidmenį perduodant signalą iš mieloidinių ląstelių citokinų receptorių į ląstelės vidų. Per JAK2 kinazę yra stimuliuojami eritropoetino (Epo) ir trombopoetino (Tpo) receptoriai. Valino pakeitimas fenilaninu 1849-ojoje dezoksiribokleorūgšties (DNR) pozicijoje, 14-tame geno egzone, nulemia vieno iš kinazės domeno slopi-nimą, kai sutrinka citokinų receptorių signalizavimo kaskada. Priklausomai nuo to, ar mutacija įvyksta homodimeriniuose receptoriuose, ar heterodi-meriniuose, proliferacija gali sutrikti visose trijose mieloidinės eilės linijose [9]. Apie 99 proc. pacientų, sergančių TP, nustatoma JAK2 mutacija (95 proc. atvejų – JAK2 V617F, 4 proc. – egzono 12 mutacija). Iki 60 proc. ET sergančių pacientų ir iki 50 proc. sergančių PMF nustatoma JAK2 V617F mutacija [10]. Somatinė Tpo receptoriaus mutacija (MPL-W515),

atrasta 2006 m., nustatoma apie 3–8 proc. pacientų, sergančių ET ar PMF [11]. Naujausia mutacija, svarbi LMPL patogenezėje, atrasta 2013 m. – Kal-retikulino mutacija (CALR). Ji atitinkamai nustatoma 20 proc. ir 50 proc. pacientų, sergančių ET ir PMF [12,13]. Yra aptinkami net 36 Kalretikulino mutacijų variantai, tačiau dažniausios yra dvi: 1 tipo (52-bp delecija) – 65 proc. atvejų ir 2 tipo (5-bp insercija) – 32 proc. atvejų [14]. Šios dvi svarbios mutacijos daro įtaką klinikiniam LMPL vystymuisi, jų aptikimas paskatino vaistų inhibitorių kūrimą.

Įvairių klinikinių tyrimų duomenimis, pacientams, sergantiems ET, JAK2 V617F mutacija yra susijusi su didesne trombozės rizika, leukocitoze, didesniu hemoglobino lygiu, bet mažesniu trombocitų skaičiumi [15]. Ši mutacija kartu su leukocitoze ir paciento kardiovaskuliniais veiksniais (rūkymas, CD, AH) buvo įtraukta į sergančių ET pacientų trombozės rizikos klasifikaciją – IPSET bei IPSET-T (angl. International Prognostic Scoring

System for Thrombosis in ET (IPSET-thrombosis)). CALR mutacija

pa-cientams sergantiems ET, atvirkščiai, yra siejama su mažesne trombozės rizika, didesniu trombocitų skaičiumi, mažesniu leukocitų skaičiumi, mažesniu hemoglobino lygiu ir jaunesniu pacientų amžiumi [14, 15]. Pa-cientams, kurie serga PMF, CALR mutacija siejama su didesniu trombocitų skaičiumi, ne tokia ryškia anemija, mažesniu leukocitų skaičiumi, taip pat su jaunesniu amžiumi [16]. Be to, CALR mutacija ET sergantiems pacientams siejama su ilgesniu išgyvenamumu be trombozės, o sergantiems PMF – su ilgesniu bendru išgyvenamumu [13, 16, 17]. Papildomų serumo bei ląstelių žymenų, trombofilinių faktorių reikšmė yra vertinami prieštaringai. Atlik-dami šį tyrimą, tikrinome hipotezę, ar pacientams, sergantiems lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis, trombozinių komplikacijų atsiradimui gali turėti įtakos trombocitų receptorių glikoproteinų, trombofilinių faktorių, krešėjimo faktorių genų polimorfizmai, antifosfolipidinių antikūnų ir lupus antikoagulianto aptikimas bei jų tarpusavio sąveika.

1.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

1.1. Darbo tikslas

Nustatyti genetinių variantų ir trombofilinių rizikos veiksnių reikšmę trombozių išsivystymui lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergantiems pacientams.

1.2. Darbo uždaviniai

1. Ištirti trombocitų receptorių glikoproteinų Ia/IIa, Ibα, IIb/IIIa ir VI po-limorfizmus ir jų ryšį su trombozių išsivystymu.

2. Nustatyti krešėjimo faktorių polimorfizmų sąsajas su trombozėmis. 3. Išanalizuoti lėtines mieloproliferacines ligas sukeliančias genetines

mu-tacijas (CALR, MPL, JAK2 V617F) ir jų ryšį su trombozių išsivystymu. 4. Ištirti antifosfolipidinių antikūnų, lupus antikoagulianto bei krešėjimo

faktoriaus V Leideno ir protrombino mutacijų ryšį su trombozėmis. 5. Įvertinti sergančiųjų lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis klinikinių,

genetinių ir trombofilinių žymenų prognozinę reikšmę trombozių atsiradimui.

1.3. Darbo mokslinis naujumas

Duomenys apie lėtines mieloproliferacines ligas sukeliančių genetinių mutacijų, genų polimorfizmų, trombofilinių veiksnių ir hiperkoaguliacinių būklių reikšmę trombozių susidarymui yra prieštaringi. Literatūroje nagri-nėjami atskiri trombozių rizikos veiksniai, tačiau trūksta duomenų apie įvairių rizikos veiksnių sąveiką. Tiriant hiperkoaguliacines būkles ir pato-fiziologinius mechanizmus sergantiems lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis pacientams, siekiama atrasti naujus laboratorinius ir molekulinius rizikos veiksnius, turinčius įtaką trombozių formavimuisi.

Mūsų darbe pirmą kartą sergantiesiems lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis buvo tirta grupė genų polimorfizmų, kurie koduoja už hemostazę atsakingus trombocitų receptorius ir krešėjimo faktorius, o taip pat daly-vauja ir trombozės patogenezėje. Šio darbo metu buvo nustatytas dviejų po-limorfizmų sinergizmas ir jų įtaka pagrindinėms šių ligų komplikacijoms – trombozėms. Tyrimo duomenys parodė, kad krešėjimo faktoriaus VII c.-323 P0/P10 ir P10/P10, β fibrinogeno c.-148C>T CT ir trombocitų receptoriaus GP Ia/IIa c.807C>T TT genotipai didina trombozės galimybę lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergantiems pacientams. Be to, pirmą kartą

šiems pacientams nustatėme krešėjimo faktoriaus VII c.-323 P0/P10 ir P10/P10 polimorfizmo ryšį su atskiro arterinio baseino – smegenų arterijų trombozėmis. Krešėjimo faktoriaus VII c.-323 P0/P10 ir P10/P10 poli-morfizmas iki šiol buvo tirtas tik esencialine trombocitemija sergantiesiems, mes tyrėme jo ryšį su trombozėmis ir tikrąja policitemija sergantiems pacientams. Lėtinėmis mieloproliferacinėmis ligomis sergantiems pacien-tams ištyrėme antifosfolipidinius antikūnus ir jų sąsajas su trombocitų receptoriaus GP Ia/IIa c.807C>T polimorfizmu, esant trombozėms. Siekiant apibendrintai įvertinti įvairių klinikinių, genetinių ir trombofilinių žymenų prognozinę reikšmę trombozių atsiradimui, nustatėme, kad lėtinėmis mie-loproliferacinėmis ligomis sergantiems pacientams trombozinių kompli-kacijų prognozavimui yra reikšmingi antifosfolipidiniai antikūnai, krešėjimo faktoriaus VII -323 P0/P10 ir P10/P10 genotipai, JAK2 V617F mutacija ir β fibrinogeno c.-148C>T CT genotipas. Analizuodami sąsajas tarp įvairių žymenų, atskleidėme literatūroje neaprašytus sergančiųjų lėtinėmis mie-loproliferacinėmis ligomis trombozės rizikos veiksnius.

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Lėtinių mieloproliferacinių ligų epidemiologija

Tikroji policitemija (TP), esencialinė trombocitemija (ET) ir pirminė mielofibrozė (PMF) yra lėtinės mieloproliferacinės ligos, kurios yra gru-puojamos kartu dėl savo panašios patogenezės, klinikinių simptomų, komplikacijų bei gydymo. Daugelis mokslininkų jas priskiria BCR-ABL ((angl. breakpoint cluster region; Abelson leukemia virus) genas, susifor-muojantis po translokacijos tarp 9 ir 22 chromosomų ir koduojantis BCR-ABL sintetinį baltymą) neigiamoms LMPL [2, 18]. Joms visoms būdinga

JAK2 V617F mutacija, kuri nustatoma daugumai pacientų, sergančių TP, ir

apie pusei ET ir PMF sergančių pacientų [19]. Be to, PMF ir ET sergan-tiesiems dar būdinga Kalretikulino (CALR) ir trombopoetino receptorių mutacijos (MPL) [20].

Įvairių šalių vėžio registruose sergamumas LMPL registruojamas nuo 1970-ųjų, tačiau keičiantis šių ligų diagnostikos kriterijams, atradus naujas genetines mutacijas, sergamumo rodikliai šiek tiek keitėsi [21]. Pagal sergamumą šios lėtinės mieloproliferacinės ligos laikomos retomis onko-loginėmis ligomis [22]. Įvairių autorių duomenimis per metus užregist-ruojama 0,67 TP atv., 0,96–1,6 ET atv. ir 0,47 PMF atv. 100 tūkst. gyven-tojų [23]. Mokslininkai, išanalizavę Jungtinių Amerikos Valstijų (JAV) nacionalinį registrą ir surinkę epidemiologinius duomenis nuo 1973–2011 metų, nustatė 1,0 ET atv. 100 tūkst. gyventojų per metus moterims ir 0,8 atv. 100 tūkst. gyventojų per metus vyrams. TP nustatoma 0,8 atv. moterims ir 1,3 atv. vyrams; 0–0,4 PMF atv. 50–74 m. amžiaus pacientų grupėje 100 tūkst. gyventojų per metus [21]. JAV sergamumo rodikliai šiek tiek skyrėsi, priklausomai nuo rasės bei laikmečio. Ypač išaugo PMF sergamumas nuo 2000-ųjų, tai siejama su tobulesniais PMF diagnostikos metodais [7]. Vokietijos LMPL registro duomenimis, bendras sergamumas šiomis trimis ligomis siekė 1,53 atv. 100 tūkst. gyventojų 2013 m. [24]. Švedijos moks-lininkų duomenimis, TP sergamumas yra 1,97 atv., ET–1,55, o PMF 0,30 atv. 100 tūkst. gyventojų per metus [25]. Mažiausias sergamumas

užregist-ruojamas Japonijoje ir Izraelyje [26]. Apžvalginis straipsnis, kurio tikslas

buvo susisteminti sergamumo rodiklius Europos Sąjungoje, nurodo PMF sergamumą nuo 0,1 atv. iki 1 atv. 100 tūkst. gyventojų per metus. Serga-mumas TP svyravo nuo 0,4 iki 2,8 atv. 100 tūks. gyventojų per metus. ET numatomas sergamumas svyruoja tarp 0,38 ir 1,7 atv. 100 tūkst. gyventojų per metus. Autoriai pažymi, kad sergamumas LMPL didėja tarp vyresnio amžiaus žmonių [27].

Apibendrinant galima teigti, kad minėti skaičiai rodo šiek tiek skirtingą sergamumą įvairiose šalyse. Dauguma autorių sutaria, kad pastaruoju metu atradus naujus LMPL žymenis, šių ligų diagnostika pagerėjo. Be to, serga-mumas TP ir ET yra didesnis nei PMF.

2.2. Lėtinių mieloproliferacinių ligų etiopatogenezės molekuliniai aspektai

Šiuo metu žinoma, kad pagrindinės mutacijos sergant LMPL sukelia Janus kinazės (angl. Janus kinase, JAK) – signalo perdavėjo ir transkrip-cijos aktyvatoriaus (angl. signal transducer and activator of transcription, STAT) – baltymų komplekso aktyvavimą bei autonominę diferencijuotų ląstelių proliferaciją [3]. LMPL patogenezės mechanizmas molekuliniu požiūriu labiau paaiškėjo prieš 13 metų, kada buvo atrasta genetinė – JAK2 V617F – mutacija [6,8,19]. Pacientams, sergantiems TP, ji nustatoma iki 95 proc. atvejų, iki 60 proc. sergančių ET ir iki 50 proc. sergančių PMF [6, 8, 28]. JAK2 yra citoplazmoje esanti tirozinkinazė būtina eritropoetino, trombopoetino, granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus receptorių signalo perdavimui. Ji priklauso Janus kinazės baltymų kompleksui, kurį sudaro keturi nariai: JAK1, JAK2, JAK3 ir TYK2. JAK baltymai signalą perduoda per savo intraląstelines dalis – domenus (angl. domain), kurie yra sujungti su citokinų receptoriais. Visi JAK kinazių nariai turi analogišką struktūrą, kurią sudaro: FERM domenas (angl. N-terminal Band 4.1, ezrin,

radixin, moesin), sujungiantis JAK su citokino receptoriumi; Scr

homo-logiškas domenas 2 (SH2); JAK homohomo-logiškas domenas 2 (JH2), dar vadi-namas „pseudokinazės domenu“, bei enzimiškai aktyvus tirozinkinazės domenas (JH1) (2.2.1 pav.). Dauguma LMPL inicijuojančių mutacijų įvyks-ta JH2 domene [29]. Įvykusi V617F mutacija JH2 domene aktyvuoja JH1 kinazę. Kitais žodžiais, mutacija sumažina JH2 domeno autoinhibicinę funkciją, veikdamas per JH1 - JH2 konformacinius pakitimus ir adenozino trifosfato (ATF) prisijungimą [30]. Esant JAK2 V617F mutacijai, ląstelėje signalo perdavimas per JAK2 vyksta ir be atitinkamo citokino prisijungimo prie receptoriaus [29].

2.2.1 pav. JAK2 baltymo struktūra

A. JAK2 baltymo struktūra. Numeriai žymi aminorūgščių pozicijas JAK2 baltyme. Rodyklės parodo dažniausiai mutavusių regionų pozicijas. Autoinhibicinis JH2 domenas pažymėtas geltonai. FERM domenas (angl. N-terminal Band 4.1, ezrin,

radixin, moesin); JH1 ir JH2 – Jak homologiški domenai; SH2 – Scr homologiškas

domenas 2.

B. Eritropoetino receptoriaus ir JAK2 baltymo sąveika.

Eksperimentiniai tyrimai įrodė, kad JAK2 V617F yra aktyvuojanti mu-tacija ir jos ekspresija ląstelėse nulemia tam tikros funkcijos įgavimą [19]. Tikrajai policitemijai būdinga ir kita JAK mutacija, kuri įvyksta 12-ame egzone. Pastaroji nustatoma iki 3–4 proc. pacientų, kuriems nėra JAK2 V617F mutacijos ir kurie serga TP [31] (2.2.2 pav.).

2.2.2 pav. JAK ir CALR mutacijos

Trombopoetino receptoriaus somatinės (angl. missense) tipo mutacijos mieloproliferacinės leukemijos viruso onkogeno 10-e egzone (angl.

myelo-proliferative leukemia virus oncogene (v-MPL)) gali būti kelios. Pavyzdžiui, MPL-W515 aktyvuojanti mutacija nustatoma 3–8 proc. pacientų, sergančių

ET ir PMF [11]. Paveldima Tpo receptoriaus mutacija (MPL-S505N) susijusi su reta šeimine trombocitoze [11,32]. Tpo receptoriaus mutacijos yra somatinės mutacijos, kurioms įvykus, prasideda nuo Tpo nepriklau-somas signalo perdavimas ir megakariopoezės koregavimas [33]. Neseniai aprašytos dvi naujesnės Tpo receptoriaus mutacijos pacientams, sergantiems ET ir PMF, S204P ir Y591N. Joms įvykus, pastebimas nuo Tpo nepri-klausomas augimo ir signalo perdavimo ląstelėje sutrikimas, arba hiper-jautrumas Tpo [34].

Antra pagal dažnį somatinė mutacija, išskirtinai būdinga ET ir PMF, yra Kalretikulino (CALR) mutacija. Dažniausiai tai yra insercijos arba delecijos tipo mutacijos 9-tame geno egzone. Dažniausiai aptinkama 52 bazių (52-bp)

delecija, kuri pavadinta 1 tipo mutacija, ir 5 bazių (5-bp) insercija – 2 tipo mutacija [20]. Kartu jos sudaro apie 80 proc. visų CALR mutacijų. CALR mutacija nustatoma 20–35 proc. pacientų, sergančių ET ir, 5–40 proc. – PMF [12, 13]. Kalretikulinas yra kalcį prisijungiantis baltymas, esantis ląstelės endoplazminiame tinkle. Ląstelėse, kuriose įvykusi CALR mutacija, sutrikdomas intraląstelinio kalcio išsiskyrimas, glikoproteinų sekrecija, dėl ko sutrikdoma citokinų, receptorių, JAK-2 ir kitų signalizuojančių mole-kulių raiška ir aktyvacija. Ląstelėse, kurios ekspresuoja CALR egzono 9 mu-taciją, aktyvuojamas ir JAK/STAT kelias [12,13]. Įvykus CALR mutacijai, sintetinamas mutavęs baltymas su nauja baltymo C-terminalo (galinio) seka. Joje neigiamai įkrautos aminorūgštys yra pakeistos teigiamai įkrautomis aminorūgštimis. Mutavusiam CALR baltymui trūksta endoplazminio tinklo sulaikymo signalo ir sutrikdoma Ca2þ prisijungimo funkcija [20]. Visiškai tikslus mechanizmas, kaip CALR mutacija sukelia LMPL, kol kas nėra iki galo aiškus. CALR mutacija aktyvina signalo perdavimą per JAK2/STAT baltymų kompleksą megakariocitų ir granuliocitų pirmtakuose [12]. Kita vertus, nustatyta, kad LMPL sergantys pacientai, kurie neturi nė vienos iš minėtų trijų mutacijų, kitaip dar vadinami „trigubai-neigiamais” (angl. triple

negative), taip pat turi aktyvintą JAK2/STAT perdavimo signalą [35]. Jie

sudaro iki 10 proc. LMPL pacientų [13]. Be to, tiems pacientams, kurie turi

CALR mutaciją ir neturi JAK2 mutacijos pasiekiamas vienodas atsakas į

gydymą JAK inhibitoriais [20]. Tas dar kartą patvirtina, kad šių ligų pato-genezė nėra iki galo aiški. Aukščiau minėtos trys pagrindinės mutacijos yra tiesiogiai susijusios su hematopoetinių ląstelių hiperproliferacija. Jos verti-namos kaip pagrindinį vaidmenį ligos patogenezėje vaidinančios mutacijos arba ligą inicijuojančios mutacijos.

Pastaruoju metu daugėja duomenų apie papildomas somatines mutacijas, kurios yra svarbios LMPL patogenezei, nes sustiprina pagrindinių mutacijų poveikį. Daugiausia tai mutacijos genų, koduojančių įvairius epigenetinius reguliatorius, transkripcijos faktorius ar signalizuojančias molekules [5]. Epigenetinių reguliatorių mutacijos (TET2, DNMT3a, ASXL1, EZH2,

IDH1/2) nustatomos 5–30 proc. pacientų [36]. Jos atsako už greitesnį

nor-malios hematopoetinės ląstelės atsinaujinimą, nesukelia autonominio jau diferencijuotų ląstelių augimo, bet gali daryti įtaką klinikinėms ligos iš-raiškoms [3]. Papildomoms mutacijoms būdinga tai, kad savarankiškai, be ligą sukeliančių mutacijų, jos nesukelia LMPL. Jos taip pat dažnai aptin-kamos ir sergantiems kitomis hematologinėmis ligomis, pvz.: mielodi-plaziniu sindromu ar ūminėmis leukemijomis. Dauguma jų nuosekliai įgy-jamos ląstelėse, kurios jau turi vieną iš pagrindinių mutacijų ir tai dažnai susiję su ligos progresavimu (2.2.3 pav.) [37].

2.2.3 pav . P agr indi nė s i r papi ldom os lė tin ių m ie lo pr olife ra cin ių lig ų m ut ac ij os PV – tik ro ji po lic ite m ija ; P M F – p irm in ė m ie lo fib ro zė ; E T – e se nc ia lin ė tro m bo cite m ija ; JAK – J anus k in azė; C A LR – ka lr et ikul ina s.

Rečiau kai kuriems pacientams papildomos mutacijos atsiranda anksčiau už inicijuojančias mutacijas. Nustatyta, kad TET2 mutacijos atsiradimo seka susijusi su skirtingais ligos fenotipais ir skirtingomis komplikacijomis [38].

TET2 mutacijos atsiradimas pacientams, kuriems jau nustatyta JAK2

mutacija, susijęs su didesne trombozės rizika ir didesniu jautrumu JAK2 inhibitoriams in vitro. Be to, nustatyta, kad tokiems pacientams yra didesnė tikimybė susirgti TP nei ET [38]. Keli klinikiniai tyrimai, nagrinėję inici-juojančių ir papildomų mutacijų atsiradimo seką ir reikšmę pacientams, sergantiems LMPL, nustatė, kad dviejų ar daugiau papildomų mutacijų ap-tikimas reikšmingai sumažina bendrą išgyvenamumą ir padidina ligos trans-formacijos riziką [39].

Nepaisant to, kad LMPL sergantiems pacientams nustatomos skirtingos onkogeninės mutacijos, tikslus jų vaidmuo LMPL patogenezėje nėra visiškai aiškus. Nė viena iš JAK2 V617F, MPL-W515L/K ar CALR mutacijų nėra specifiška vienai LMPL ligai. Be to, vien tik kurios nors iš šių mutacijų buvimas nepaaiškina skirtingų klinikinių simptomų ir komplikacijų, kurios išsivysto LMPL sergantiems pacientams [3]. Kai kuriems pacientams JAK2 V617F mutacija atsiranda pakankamai vėlai, ligai progresuojant, kas rodo, kad yra kitų genetinių veiksnių, kurie atsakingi už kloniškumą, pacientams sergantiems LMPL [40, 41]. Pastaruoju metu daugėja įrodymų, kad kai kurie klinikiniai simptomai ir komplikacijos yra lėtinio uždegimo, kuris pasireiškia beveik visų LMPL atveju, pasekmė. Pacientams sergantiems LMPL uždegimo proceso sumažėjimas susijęs su klinikinių simptomų page-rėjimu. Tą rodo tai, kad gydymui vartojami JAK-inhibitoriai, sumažinę įvai-rių uždegiminių citokinų koncentracijas, pagerina pacientų gyvenimo ko-kybę ir sumažina su liga susijusius jų klinikinius simptomus [42].

Sergant LMPL, bet kuri mielopoetinė ląstelė gali priklausyti piktybiniam klonui: eritrocitai, megakariocitai, neutrofilai, monocitai. Limfocitai retai kada būna kloniniai sergant PMF [46]. Be to, sergantiems LMPL nustatoma padidėjusi citokinų – interleukino 6 (IL-6), interleukino 8 (IL-8), granu-liocitų ir makrofagų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus (GM-CSF), hepa-tocitų augimo faktoriaus (HGF), kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), fibroblastų augimo faktoriaus beta (b-FGF), ir transformuojančio augimo faktoriaus beta (TGF-𝛽) --- koncentracija. Kai kurių citokinų koncen-tracijos padidėjimas yra specifiškas tam tikroms LMPL [47]. Interleukino 4 (IL-4), interleukino 10 (IL-10), ir tumoro nekrozės faktoriaus alfa (TNF-𝛼) padaugėjimas nustatomas sergantiems ET, interleukino 11 (IL-11) padau-gėjimas siejamas su TP. PMF būdinga daug įvairių citokinų bei augimo fak-torių koncentracijos padidėjimas [48]. Kartais gali būti sunku LMPL atskirti nuo uždegimo, nes tipinis LMPL požymis yra leukocitozė ir trombocitozė, o

uždegimo mediatoriaus C-reaktyviojo baltymo (CRB) kiekis sergant LMPL taip pat būna padidėjęs [49]. Jo padidėjimas siejamas su didesne trombozės rizika sergant ET ir TP bei trumpesniu išgyvenamumu be leukemijos sergant PMF, be to, koreliuoja su JAK2 V617F koncentracija [49]. Nors nėra aišku, kaip JAK2 V617F klonas tiksliai indukuoja uždegimo procesą, papildomų mutacijų (IDH1/2 ir TET2) atsiradimas „kloninį uždegimą“ dar pasunkina, nes pažeidžia tam tikrų receptorių (IL-11R𝛼, TGF-𝛽R1) ekspresiją [44]. Dėl to prailgėja kloninių ląstelių išgyvenamumas ir padidėja uždegiminių citokinų išsiskyrimas, kurių taikinys yra kaulų čiulpų stromos ląstelės bei hematopoetiniai pirmtakai. Tai pat padidėja kloninių ląstelių rezistentiškumas augimo faktorių inhibitoriams [45, 50, 51]. Sergant LMPL mieloidinės ląstelės taip pat dalyvauja hipoksijos ar gydymo sukeltame „reaktyviniame“ uždegimo atsake, kuris gali būti kloninis ir nekloninis. Ląstelių kloninės populiacijos dydis priklauso nuo ligos: jis didelis sergant TP ir PMF, bet vidutinis ar mažas sergant ET. Vykstant imuniniam atsakui, kloninės ląstelės mažiau efektyvios nei sveikos, todėl imuninis atsakas bus mažiau efektyvus sergant TP ar PMF nei sergant ET [43].

Apibendrinant galima sakyti, kad atrastų ir dar tiriamų mutacijų nu-statymas diagnozės pradžioje leis atrinkti didelės rizikos LMPL sergančius pacientus, kurių liga yra linkusi greičiau progresuoti ir, kuriems bus galima parinkti tinkamą gydymą.

2.3. Lėtinių mieloproliferacinių ligų trombozinių komplikacijų etiopatogenezė

Trombozės patogenezė sergant LMPL yra daugiaveiksnė. Kai kurie trombozės rizikos veiksniai LMPL sergantiems pacientams skiriasi nuo trombozės rizikos veiksnių sveikų žmonių populiacijoje. Paciento rizikos veiksniai, tokie kaip amžius, nutukimas, buvusi trombozė, hipertenzija, hiperlipidemija, kraujo ląstelių skaičius – trombocitozė, leukocitozė, eri-trocitozė turi įtakos trombozės išsivystymui sergant LMPL [52, 53]. Kloninė kraujodaros ląstelių proliferacija, dėl kurios atsiranda ne tik kiekybinių, bet ir kokybinių leukocitų, trombocitų ir eritrocitų pakitimų ir jų tarpusavio sąveika, vaidina svarbų vaidmenį LMPL trombozės išsivystyme. Plazmoje cirkuliuojantys žymenys ir endotelio aktyvacijos produktai dar sustiprina protrombozinę LMPL būklę. Ieškant trombozinių komplikacijų išsivystymui svarbių klinikinių bei genetinių veiksnių, tirtos įvairios kraujo ląstelės, plazmos žymenys, LMPL inicijuojančios ir krešėjimo faktorių mutacijos, trombocitų receptorių, leukocitų žymenų vieno nukleotido polimorfizmai (VNP) (angl. Single nucleotide polymorphism), paciento veiksniai.

2.3.1. Kraujo ląstelių reikšmė vystantis hemostazės sutrikimui 2.3.1.1. Trombocitų vaidmuo

Trombocitai yra pagrindinės kraujo ląstelės, dalyvaujančios pirminėje hemostazėje. Paprastai kraujyje cirkuliuojantys trombocitai yra neaktyvūs ir nėra linkę prikibti prie subendotelio, kurį dar papildomai nuo trombocitų prikibimo apsaugo endotelio ląstelės. Sveikiems žmonėms, trombocitai dalyvauja pirminėje hemostazėje ir, pasibaigus jų gyvavimo laikui, yra suar-domi makrofagų blužnyje ir kepenyse [54]. Kraujagyslių subendoteliniame sluoksnyje yra gausu adhezinių baltymų, kuriems trombocitai turi recep-torius [55]. Trombocitų aktyvacija prasideda po kraujagyslės pažeidimo, sukelto traumos arba patologinio endotelio ląstelių pažeidimo [54]. Yra nustatyti ir papildomi veiksniai, turintys įtakos trombocitų atsako forma-vimuisi: amžius, pažeidimo gylis, hematokritas. Esant dideliam hemato-kritui (Ht), eritrocitai užima centrinę kraujagyslės dalį, o trombocitai stu-miami į periferiją, arčiau sienelės. Taip pat svarbus kraujo tėkmės greitis kraujagyslėje bei kraujagyslės spindis [55]. Aktyvuoti trombocitai sekre-tuoja savo granulių turinį ir sąveikauja vienas su kitu formuodami trombą [54, 55]. 2.3.1.1.1. pav. matoma, kaip subendotelinio sluoksnio atidengimas po kraujagyslės pažeidimo sukelia greitą cirkuliuojančių trombocitų sulė-tėjimą, leidžiantį receptoriais jiems sąveikauti su subendotelio kompo-nentais bei sukelti tolimesnę trombocitų aktyvaciją [54]. Aktyvuoti trom-bocitai pakeičia savo formą iš disko į sferą, taip įgaudami reaktyvų paviršių, gebantį prijungti kitas molekules. Po trombocitų aktyvacijos pastebima tankiųjų bei alfa granulių sekrecija ir egzocitozė [54]. Adhezinių baltymų (kitaip dar vadinamų ligandais), tokių kaip von Vilebrando faktorius (vVF) ir fibrinogenas, sekrecija iš trombocitų alfa granulių bei mediatorių – adenozino difosfato (ADP), serotonino sekrecija iš tankiųjų granulių kartu su tromboksano A2 (TXA2) gamyba ir sekrecija papildomai aktyvina trom-bocitus, skatindami trombo formavimąsi [54]. Visi trombocitų signalo per-davimo keliai sukelia trombocitų aktyvinimą ir integrinų sukibimo regu-liavimą, dėl to trombocitai stabiliai prikimba prie subendotelio ir įvyksta jų agregacija [54].

Pirminė trombocitų adhezija prasideda nuo trombocitų receptoriaus glikoproteino (GP) Ibα, kuris yra svarbaus receptorių komplekso GP Ib-IX-V, dalyvaujančio trombocitų adhezijoje bei signalo perdavime, dalis [56]. GP Ibα jungiasi prie vVF dėl ko susidariusi jungtis papildomai stabili-zuojama vVF ir įvairių integrinų jungtimis [55]. Šis procesas ypač būtinas greitos tėkmės kraujagyslėse (pvz.: koronaruose). vVF yra didelis baltymas,

saugomas trombocitų alfa granulėse, megakariocituose ir Weibelio–Paladžio kūneliuose endotelio ląstelėse [57]. Dalis vVF cirkuliuoja kraujo plazmoje ir yra susijęs su kolagenu bei lamininu subendoteliniame matrikse.

Antras labai svarbus žingsnis yra trombocitų receptoriaus GP VI ir kolageno sąveika, po kurios būna integrinų poslinkis bei mediatorių (ADP, ATP, TXA2) sekrecija, skatinanti tolimesnę trombocitų agregaciją [54]. GP Ibα prisijungimas prie vVF ir kolageno sukelia greitą trombocitų aktyvaciją, kurią dar pagreitina GP VI bei GP Ia/IIa jungimasis prie kolageno [58]. Trombocitai prie kolageno gali jungtis tiesiogiai per receptorius GP Ia/IIa ir GP VI arba netiesiogiai, per vVF ar kitus integrinus [54]. Įvairūs trombocitų integrinai adheziją prie kraujagyslės sienelės stabilizuoja papildomai sąvei-kaudami su ligandais, pvz.: integrinas GP IIb/IIIa jungiasi prie fibrinogeno ir fibronektino, GP Ia/IIa prie fibronektino ir kolageno, GP Ia/IIa – prie kolageno [59]. Po trombocitų adhezijos vyksta jų agregacija, kurią stimu-liuoja tiek fiziologiniai, tiek patologiniai trombocitų aktyvatoriai [55]. Audinių faktorius taip pat stimuliuoja ląstelių aktyvaciją. Labai greita kraujo tėkmė gali stimuliuoti trombocitų agregaciją per vVF prisijungimą prie trombocitų receptoriaus glikoproteino GP Ib-IX [37,55]. Šiame procese svarbiausias vaidmuo tenka GP IIb/IIIa, per kurį trombocitai susijungia tarpusavyje. Pastarieji taip pat gali prisijungti vVF, fibrinogeną ir kitus adhezinius glikoproteinus arba laukti kito aktyvuoto trombocito, kuris šį receptorių gali aktyvinti per ADP ir TXA2. Be to, yra ir alternatyvus trombocitų aktyvacijos kelias, kada jis gali prisijungti vVF ar fibrinogeną dar cirkuliuodamas. Tokiu atveju trombocito ir jo ligandų kompleksas tiesiogiai prisijungia prie kito trombocito per GP IIb/IIIa [55].

Nustatyta, kad pacientų, sergančių LMPL, cirkuliuojantys trombocitai yra aktyvuoti, nes jie išskiria didesnį kiekį paviršiaus P-selektinų ir audinių faktorių [60]. Ypač svarbu, kad tokie aktyvinti trombocitai matomi pa-cientams, sergantiems LMPL, kuriems buvo įvykusi trombozė [60]. Šiems pacientams taip pat būna didesnis neutrofilų ir monocitų, kurie yra fago-citavę trombocitus, skaičius [61]. Trombocitų aktyvacijos produktų gali būti aptinkama plazmoje ir šlapime [61–63]. Aktyvuoti trombocitai sudaro sąlygas susidaryti trombinui ant jų paviršiaus. Nustatyta, kad pacientams, sergantiems TP ir ET, trombocitų indukuotas trombino susidarymas yra ypač padidėjęs, jei jie turi JAK2 V617F mutaciją [64]. Šių pacientų nesu-brendę ir labai jauni trombocitai (retikuliniai trombocitai) pasižymi didesniu hemostatiniu aktyvumu, yra labiau reaktyvūs nei subrendę trombocitai ir koreliuoja su JAK2 V617F mutacija [65].

Pažeista kraujagyslė

2.3.1.1.1 pav. Trombocitai ir hemostazė

Kraujagyslės pažeidimo vietoje pirmiausia vyksta plazmos fibronektino (pFn) kaupimasis. Trombocitai taip pat gali išskirti fibronektiną iš savo intraceliulinių granulių.Trombocitų receptoriai prisijungia ligandus, tokius kaip VWF, kolagenas, aktyvuoja integriną αIIbβ3, dėl ko prijungiamas fibrinogenas ir sukeliama trombocitų agregacija. Ant trombocitų pavir-šiaus yra generuojamas trombinas ir toliau aktyvuojami trombocitai, o vėliau ir krešėjimo kaskada. Augant hemostatiniam trombui, fibrinas ir fibronektinas atlieka „užpildo“ vaidmenį tarp pažeistos kraujagyslės sienelės ir trombocitų sankaupos.

2.3.1.2. Eritrocitų vaidmuo

Sergant LMPL, o ypač TP, kuriai būdingas didelis hematokritas, trom-bozės rizika yra didesnė dėl kelių priežasčių. Kraujagyslėse, kur kraujo tėkmė lėtesnė, pvz., venose, svarbiausias predisponuojantis trombozės išsivystymo veiksnys yra padidėjęs kraujo klampumas. O kraujagyslėse, kur kraujo tėkmė greita, didelė eritrocitų masė „stumia” trombocitus prie krau-jagyslių sienelių, taip skatindama trombocitų aktyvaciją bei jų tarpusavio sąveiką [66]. Pearson su bendraautoriais įrodė, kad, kraujo Ht padidėjus daugiau nei 60 proc., iki 60 proc. padidėja ir trombozinių komplikacijų dažnis [67].

Be to, hematokrito padidėjimas nuo 10 iki 40 proc. padidina trombocitų agregaciją iki penkių kartų [68]. Nustatyta, kad, sergant ET ir TP, eritrocitų ląstelės membranose ir ląstelių viduje vyksta biocheminiai pakitimai, dėl kurių formuojasi eritrocitų ir leukocitų agregatai, sutrikdantys kraujo tėkmę [66, 68]. Pacientų, sergančių TP, eritrocitai pasižymi nenormaliu prikibimu prie subendotelio baltymo laminino [69]. Klinikinis tyrimas, kuriame dalyvavo 365 pacientai, įrodė, kad sergantys TP, tyrimo dalyviai patyrė mažiau kardiovaskulinių komplikacijų, jei jų hematokritas buvo mažesnis nei 45 proc. [70].

2.3.1.3. Leukocitų vaidmuo

Leukocitai, kaip ir eritrocitai, taip pat yra svarbūs kraujo krešėjimo proceso dalyviai LMPL sergantiems pacientams. Iš visų leukocitų pagrin-dinį vaidmenį uždegiminiame atsake bei kraujo krešėjimo aktyvacijoje vaidina neutrofilai [62]. Įrodyta, kad pacientų, sergančių TP ir ET, leukocitų paviršiaus antigenas CD11b yra ryškesnis, didesnis jo proteolitinių fermentų (elastazės) išskyrimas, tai daro juos aktyvesnius ir didina jų fagocitavimo galimybes. CD11b savo ruožtu toliau aktyvuoja trombocitus, formuojasi leukocitų ir trombocitų agregatai, kurie yra reikšmingi trombozės genezėje [71]. Yra įrodyta, kad LMPL sergantiems pacientams neutrofilų pakitimai koreliuoja su padidėjusia protrombininių žymenų (D-dimerų, trombino-antitrombino komplekso, vVF) koncentracija kraujo plazmoje [72]. Be to, yra nustatyta, kad padidėjęs leukocitų skaičius yra papildomas trombozės rizikos veiksnys pacientams, sergantiems LMPL [72].

2.3.1.4. Endotelio ląstelių vaidmuo

LMPL sergantiems pacientams nustatoma didelė cirkuliuojančių endo-telio ląstelių koncentracija kraujyje. Tai aktyvuotos, apoptozinės, ramybės būklės endotelio ląstelės ar jų pirmtakai [73]. Cirkuliuojančios endotelio ląstelės išskiria savo aktyvacijos žymenis: trombomoduliną, selektinus, vWF faktorių, kurie skatina ląstelių agregatų susidarymą [52, 74, 75]. Subrendusios endotelio ląstelės išskiria ir hemostatinius, ir fibrinolitinius faktorius [76]. Išskirdamos prostacikliną ir azoto oksidą (angl. Nitric Oxide; NO) jos reguliuoja kraujagyslių sienelės tonusą. Taip pat gamina trombo-moduliną ir baltymą C, kurie yra natūralūs antikoaguliantai [76]. Endo-geninio azoto oksido produkcijos sumažėjimas, leukocitų ir trombocitų są-veika su endoteliu taip pat sudaro sąlygas jo prokoaguliantiniam veikimui [74]. Todėl, norint palaikyti kraujagyslių homeostazę, yra reikalingas

adekvatus endotelio ląstelių skaičius, o jų sumažėjimas ar pažeidimas su-sijęs su trombozių išsivystymu [77]. Beje, visi širdies ir kraujagyslių ligų rizikos veiksniai: padidėjęs cholesterolio kiekis, cukrinis diabetas, rūkymas, netgi senėjimo procesai pažeidžia endotelio ląstelių funkciją ir skaičių.

2.3.2. Plazmos žymenų reikšmė hemostazės sutrikimui

Padidėjęs ląstelių kiekis ir jų aktyvacija yra svarbiausias hiperkoagu-liacijos pamatas sergant LMPL. Tai atsispindi ir tiriant padidėjusius ląste-lių – leukocitų, trombocitų ir endotelio aktyvumo žymenis kraujo plazmoje [78].

Perspektyviojo, klinikinio A.Falangos ir bendraautorių tyrimo su 37 ET sergančiais pacientais ir 34 sergančiais TP metu nustatytas reikšmingas leukocitų (CD11b, leukocitų šarminės fosfatazės, elastazės, plazmos mieloperoksidazės) ir endotelio ląstelių aktyvacijos žymenų kiekio (vWF ir trombomodulino) padidėjimas, palyginti su sveikais žmonėmis, kuriems trombozių nebuvo [71]. Stebint tuos pačius TP sergančius pacientus nu-statyta, kad ir leukocitų, ir trombocitų agregatų žymenų kiekio padidėjimas šiems pacientams yra reikšmingai didesnis nei sveikiems žmonėms. O leukocitų ir trombocitų agregatai savo ruožtu yra trombocitų aktyvacijos žymenys, dalyvaujantys trombogenezės mechanizme [62]. Be to, šių pa-cientų gydymas hidroksikarbamidu minėtų aktyvacijos produktų žymenų nesumažina [79]. Pastaruoju metu nauji duomenys rodo, kad ląstelių atidalijamos mikrodalalės (angl. microparticles, MD), įgytas baltymo C rezistentiškumas taip pat prisideda prie protrombozinės būklės sergant LMPL [52].

Mikrodalelės (MD) yra mažos ląstelės membranos pūslelės, kurios egzo-citozės būdu atidalijamos nuo plazminės membranos po ląstelių aktyvacijos ar apoptozės. Daugiausia MD atidalija trombocitai, tačiau jas taip pat išskiria eritrocitai, leukocitai, lygiųjų raumenų ląstelės, endotelio ląstelės ir vėžinės ląstelės [80, 81]. Manoma, kad MD, turėdamos prokoaguliantinių fosfolipidų sluoksnį, yra vienos iš svarbiausių komponentų trombogenezėje

in vivo, galinčios sutrikdyti kraujagyslinę hemostazę. Jų koncentracija

padidėja sergant trombozėmis bei piktybinėmis ligomis, taip pat ir LMPL [80]. Sinauridze su kolegomis nustatė, kad trombocitų MD turi nuo 50–100 kartų didesnį specifinį prokoaguliantinį aktyvumą nei patys aktyvuoti trombocitai [82]. Zhang ištyręs 92 pacientus, sergančius LMPL, nustatė, kad trombocitų, eritrocitų, endotelio ir audinių faktoriaus MD koncentracija, palyginti su kontrolinės grupės tiriamaisiais yra reikšmingai padidėjusi. Be to, pacientams, kuriems buvo įvykusios trombozinės komplikacijos, MD

koncentracija nustatyta didesnė nei tiems, kuriems trombozių nebuvo, kaip ir tiems, kurie buvo JAK2 V617F teigiami, palyginti su JAK2 V617F nei-giamais tiriamaisiais [83].

Sergant ET padaugėja trombocitų ir endotelio MD (išskiriančių trom-bocitų ir endotelio žymenis), tai rodo ląstelių aktyvaciją sergant ET. Be to, įrodyta, kad MD koncentracija koreliuoja su padidėjusia trombocitų ir endotelio žymenų (vVF) koncentracija [84].

LMPL sergantiems pacientams gali būti nustatoma sumažėjusi baltymo S ir baltymo C koncentracija. Įgytas baltymo C rezistentiškumo fenotipas yra nustatomas pacientams, sergantiems ET ir PV, ypač tiems, kuriems nu-statoma ir JAK2 V617F mutacija, kuri dar padidina trombozės riziką [85]. Įgytas baltymo C rezistentiškumas buvo dažniau aptinkamas ET pacientams, jau patyrusiems trombozines komplikacijas, nei tiems, kurie trombozinių komplikacijų nepatyrė [86]. Sumažėjusi laisvo baltymo S koncentracija yra pagrindinis baltymo C rezistentiškumą lemiantis veiksnys, kurio priežastis yra baltymo S skilimas, kurį sukelia trombocitų išskiriamos proteazės [87]. Jo skilimo produktų koncentracijos padidėjimas buvo pastebėtas pacien-tams, sergantiems ET, kuriems pasireiškė trombocitozė [88].

Kitų hemostazės faktorių sutrikimai yra labiau pastebimi JAK2 V617F turėtojams nei pacientams, kuriems šios mutacijos nėra [72].

Apibendrinant galima sakyti, kad, tiriant trombozinių komplikacijų išsi-vystymui reikšmingus veiksnius LMPL sergantiems pacientams, yra svarbus ne tik kuris nors vienas veiksnys, pvz., kraujo ląstelių skaičius, bet ir kelių veiksnių buvimas kartu ar jų tarpusavio sąveika.

2.4. Lėtinių mieloproliferacinių ligų trombozės rizikos veiksniai 2.4.1. Amžius ir buvusi trombozė

Daugiacentrio, perspektyviojo, klinikinio ECLAP (angl. The European

Collaboration on Low-Dose Aspirin in Polycythemia Vera study) tyrimo, kuriame dalyvavo 1638 pacientai iš 12 šalių, sergantys TP, autoriai išskyrė tris skirtingos trombozės rizikos pacientų grupes. Pacientams, kurie buvo vyresni nei 65 m. ir, kuriems buvo įvykusi trombozė, kardiovaskulinių komplikacijų dažnis buvo 10,9 per 100 paciento metų (angl. per 100-patient

year); vyresniems nei 65 m. ir trombozės nepatyrusiems trombozės rizika

buvo 5 per 100 paciento metų, o jaunesniems nei 65 m., kuriems buvo įvykusių trombozių – 4,9 per 100 paciento metų. O pacientams, kurie buvo jaunesni nei 65 m. ir kuriems nebuvo įvykusių trombozių, šis rodiklis tesiekė 2,5 [89]. Cerquazzi ir bendraautoriai, ištyrę 587 TP sergančius

pacientus, patvirtino vyresnį amžių bei buvusią trombozę kaip trombozės rizikos veiksnius [90]. Barbui, ištyręs, 891 pacientą sergantį ET, nustatė, kad amžius ir buvusi trombozė atitinkamai 1,5 ir 1,93 karto didino trom-bozės riziką per vidutiniškai 6,2 metus [91]. Retrospektyviajame Palandri ir bendraautorių tyrime nustatyta, kad vyresniems nei 75 m. ET sergantiems pacientams 10 m. trombozinių komplikacijų rizika buvo didesnė nei tiems, kurių amžius buvo tarp 60 ir 74 m., atitinkamai 30 proc. ir 21,9 proc. [92].

2.4.2. Kraujo ląstelių skaičius

Čekų perspektyviajame tyrime, kuriame dalyvavo 1179 pacientai, sergantys ET, nustatyta, kad padidėjęs trombocitų skaičius iki trombozės įvykio (vidutiniškai 453 × 109/_{L) yra papildomas trombozės rizikos} veiks-nys. O ryški trombocitozė, t.y. trombocitų skaičius daugiau nei 1500 × 109/L diagnozės nustatymo metu, priešingai, buvo susijusi su mažesniu trombozinių komplikacijų dažniu [93]. Kiti tyrėjai, atlikę du klinikinius tyrimus, trombocitų skaičiaus įtakos kadiovaskulinių komplikacijų išsi-vystymui nerado [89]. Kita vertus, yra įrodyta, kad pacientams, sergantiems ET, trombocitų skaičius didesnis nei 1000 × 109/L, padidina kraujavimo, o ne trombozės riziką [94]. Carobbio ir bendraautoriai nustatė, kad didelis trombocitų skaičius netgi sumažina arterinės trombozės riziką pacientams, sergantiems ET (GS 0,42; 95 proc. PI 0,22–0,78) [91]. Kiti autoriai, tyrę pacientus, sergančius ankstyvąja PMF, nustatė, kad trombocitozė, didesnė nei 870 × 109/L, buvo susijusi su mažesne tiek arterinės, tiek veninės trom-bozės rizika 264 pacientams (GS 0,44; 95 proc. PI 0,21–0,89) [95]. Campbell ir kolegų nuomone, didelis trombocitų skaičius apsaugo nuo trombozės dėl įgyto von Vilebrando faktoriaus nepakankamumo, būdingo sergantiems LMPL, kuriems yra ryški trombocitozė [94].

Leukocitozė yra nepriklausomas arterinės trombozės išsivystymo rizikos veiksnys, LMPL sergantiems pacientams. Skirtingi autoriai nurodo, kad ET sergantiems pacientams, leukocitų skaičius diagnozės metu yra nepriklau-somas rizikos veiksnys kardiovaskulinėms komplikacijoms išsivystyti [72,91]. Campbell ir kt. tyrinėję 776 ET sergančių pacientų kraujo rodiklius, pirminės trombocitemijos klinikiniame tyrime (angl. Primary

Throm-bocythemia 1 (PT1)), nustatė, kad arterinės ir veninės trombozės rizika

reikšmingai susijusi su leukocitoze, tačiau ne su trombocitų skaičiumi ar hematokritu. Be to, leukocitozė, kuri išsivysto ligos eigoje, taip pat galimai didina trombozės riziką [94]. Klinikiniame ECLAP tyrime buvo nustatyta, kad pacientams, sergantiems TP, leukocitų skaičius, didesnis nei 15 × 109/L, didina trombozės, ypač miokardo infarkto, riziką (GS 2,84; 95 proc. PI

1,25–6,46; p = 0,013) [96]. Tą patį patvirtino ir Tefferi su bendraautoriais, ištyrę 605 pacientus, sergančius ET [97]. Italų klinikiniame tyrime, kuriame dalyvavo 891 ET sergantis pacientas (diagnozė, pagal PSO kriterijus), nustatyta, kad leukocitozė, didesnė nei 11 × 109/L, buvo susijusi su didesne arterinės trombozės rizika (GS 1,7; 95 proc. PI 1,01–2,72; p = 0,044) [91]. Pacientams, sergantiems TP leukocitų kiekį, didesnį nei 11 × 109_{/L, kaip} trombozės rizikos veiksnį įrodė ir Cerquozzi su bendraautoriais, ištyrę 587 pacientus [90]. PMF sergantiems pacientams leukocitozė, didesnė nei 15 × 109/L, kartu su JAK2 V617F mutacija yra susijusios su didesne arterinės ir veninės trombozės rizika (GS 1,12; 95 proc. PI 1,00–1,25) [98]. O sergan-tiems ankstyva PMF, austrų mokslininkų duomenimis, leukocitų skaičius, susijęs su didesne trombozės rizika, yra daugiau kaip 11,2 × 109_/L

(GS 1,12; 95 proc. PI 1,00–1,25) [95].

Eritrocitozė ir didelis hematokritas taip pat yra susiję su kardiovasku-liniais įvykiais. Marchioli ir kt., ištyrę 365 pacientus, sergančius TP, gydytus flebotomija ir / ar hidroksikarbamidu, nustatė, kad pacientai, ku-riems buvo nustatytas didesnis hematokritas (45–50 proc.), patyrė dažnesnes trombozines komplikacijas ir didesnį su jomis susijusį mirtingumą nei pacientai, kurių Ht buvo mažesnis nei 45 proc. [70].

2.4.3. Mutacijos

JAK2 V617F mutacija ir jos įtaka trombozinėms komplikacijoms buvo

tyrinėjama daugelio LMPL mokslininkų grupių nuo pat šios mutacijos atradimo. Bang ir kt., daugiacentriame tyrime ištyrę 238 LMPL sergančius pacientus, nustatė, kad turintiems homozigotinį JAK2 V617F mutacijos variantą dalyviams dažniau išsivystė kardiovaskulinės komplikacijos nei tiems, kurie šios mutacijos neturėjo [99]. Cheung, ištyręs 60 pacientų, sergančių ET ir TP, nustatė, kad pacientai, turėję JAK2 V617F mutaciją, patyrė ir dažnesnes trombozines komplikacijas nei tie, kurie šios mutacijos neturėjo (62 proc. ir 26 proc., p = 0,009) [100]. Barbui ir bendraautoriai, tyrę 707 PMF sergančius pacientus, įrodė, kad JAK2 V617F mutacijos buvimas kartu su leukocitoze padidino trombozių dažnį 1,92 karto [98]. De Stefano ir kt. retrospektyviajame tyrime, kuriame dalyvavo 226 pacientai, sergantys ET, nustatė dažnesnes pilvo organų venų trombozes tarp tų, kuriems buvo JAK2 V617F mutacija, palyginti su pacientais, kuriems šios mutacijos nebuvo [101]. Dar kelis mokslinius tyrimus, nagrinėjančius JAK2 V617F mutacijos reikšmę trombozei, apibendrino Lussana, atlikusi sisteminę apžvalgą. Ji analizavo ET ir PMF sergančius pacientus ir nustatė, kad ET pacientai, kuriems buvo JAK2 V617F mutacija, patyrė beveik

dvigubai didesnę trombozės išsivystymo riziką, nei tie, kuriems šios mutacijos nebuvo [102]. Barbui, įtraukęs JAK2 V617F mutaciją į daugia-veiksnę analizę 891 ET pacientui, pastebėjo, kad mutacija trombozės riziką padidina dvigubai [15]. Todėl vėliau ši mutacija buvo įtraukta į trombozės rizikos grupės nustatymą ET pacientams, pagal kurią sprendžiama tolimesnė paciento stebėjimo ir gydymo taktika. De Stefano su bendraautoriais nu-statė, kad JAK2 V617F mutacija yra reikšminga pasikartojančioms trom-bozėms. Išnagrinėjęs 143 pacientų klinikinius duomenis, mokslininkas nu-statė, kad iš 98 pacientų, kuriems buvo JAK2 V617F mutacija, 64,4 proc. patyrė pasikartojančias trombozes. Be to, homozigotams buvo net šešis kartus didesnė rizika, nei pacientams, kuriems mutacijos nebuvo [103]. Kai kurie mokslininkai tyrė ir JAK2 V617F alelio kiekį. Vannucchi ir bendra-autoriai nustatė, kad JAK2 V617F alelio kiekis, didesnis nei 75 proc., buvo vertinamas kaip papildomas rizikos veiksnys trombozei vystytis pacientams, sergantiems TP [104].

Priešingai nei JAK2 V617F mutacija, CALR mutacija, nepaisant didesnio trombocitų skaičiaus, yra siejama su mažesne trombozės rizika, jaunesniu pacientų amžiumi, mažesne hemoglobino koncentracija. Pietra su bendra-autoriais išnagrinėję 1282 PMF ir ET atvejus, nustatė, kad iš 28 proc. pacientų, kuriems buvo CALR mutacija, 4,3 proc. pacientų 10 m. laikotarpiu išsivystė trombozinės komplikacijos, palyginti su 20,6 proc., kuriems buvo

JAK2 V617F mutacija [14]. Gangat ir bendraautoriai, tyrę 300 pacientų,

sergančių ET, nustatė, kad CALR mutacija reikšmingai mažina trombozines komplikacijas jaunesniems nei 60 m. pacientams [105].

2.4.4. Trombofiliniai veiksniai

Mokslininkas Poort ir bendraautoriai 1996 m. nustatė protrombino G20210A mutaciją (rs1799963), kuriai įvykus, padidėja trombino koncen-tracija kraujyje iki 25 proc. [106] Šios mutacijos A alelio ir veninių

trom-bozių riziką aprašė keli mokslininkai.Gisslinger ir bendraautoriai pastebėjo,

kad protrombino G20210A mutacija pacientams, sergantiems TP ir ET, buvo susijusi su veninėmis trombozinėmis komplikacijomis iki ligos diagnozės ir po jos nustatymo [107]. Be to, autoriai nustatė, kad ši mutacija buvo ypač dažna pacientams, kuriems buvo nustatyta pilvo organų venų trombozė. Duomenys dėl šios mutacijos ir arterinių trombozių ryšio yra prieštaringi. Olandų mokslininkas Franko, atlikęs metaanalizę, kur nagrinėjo protrombino G20210A mutacijos ir miokardo infarkto ryšį, nustatė, kad ji didina miokardo infarkto (MI) riziką 2,5 karto [108]. O kiek naujesnę meta-analizę atlikę JAV mokslininkas Kim su bendraautoriais, tyrę krešėjimo

faktoriaus V (FV) Leideno, protrombino G20210A ir metilentetrahid-rofolato reduktazės (MTHFR) 677C>T mutacijas, nustatė, kad jos didino

MI, išeminio insulto ir periferinių kraujagyslių trombozės riziką. Šioje

meta-analizėje buvo nustatyta, kad jaunesniems nei 55 m. pacientams ir mo-teriškos lyties pacientėms šis ryšys kiek stipresnis [109]. Austrų

moks-lininko Mannhalter tyrime ši mutacija buvo susijusi su praeinančiu smegenų

išemijos priepuoliu (PSIP), jaunesniems nei 60 m. vyrams [110].

Afshar-Kharghan ir bendraautorių tyrime protrombino G20210A mutacija buvo reikšmingai susijusi su vazomotoriniais simptomais pacientams, sergantiems ET ir TP [111].

Vidinė ir išorinė krešėjimo sistemos turi bendrą „kamieną“, į kurį įeina X, V ir II krešėjimo faktoriai. Krešėjimo faktorius V yra aktyvaus krešėjimo

faktoriaus X (FXa) kofaktorius ir vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant

krešėjimo procesą. FV yra sintetinamas kepenyse, jo taip pat nustatoma trombocitų granulėse. Kraujo plazmoje jis cirkuliuoja neaktyvus, jį aktyvina

trombinas arba FXa [112]. Jį neaktyvų vėl padaro aktyvintas baltymas C.

1993 m. mokslininkas Dahlbäckas aprašė šeimą, kurios nariams buvo

nustatytas rezistentiškumas aktyvintam baltymui C. Buvo nustatyta, kad

rezistentiškumas atsirado dėl FV Leideno taškinės mutacijos 506 pozicijoje,

kur arginino aminorūgštis pakeičiama glicinu [113]. Ši mutacija nustatoma

apie 5 proc. baltųjų populiacijos ir yra susijusi su veninėmis trombozėmis.

Jauni pacientai, patyrę trombozę anamnezėje, turėtų būti tiriami ar nesivysto trombofilija. Trifa ir bendraautoriai, tyrę 95 LMPL sergančius pacientus, nustatė, kad krešėjimo faktoriaus V Leideno mutacija reikšmingai susijusi ir su arterinėmis, ir su veninėmis trombozėmis [114]. Schwarz ir kt., čekų perspektyviajame ET tyrime išanalizavę 1179 pacientų duomenis, FV Leideno mutaciją pripažino kaip reikšmingą papildomą rizikos veiksnį veninių trombozių išsivystymui [93]. De Stefano, ištyręs 132 pacientus sergančius, LMPL, nustatė kad jaunesniems nei 60 m. pacientams, ser-gantiems ET, trombozės riziką dar padidina šalia JAK2 V617F mutacijos esantys trombofiliniai žymenys (krešėjimo faktoriaus V Leideno ir protrom-bino G20210A mutacijos) [115]. Panašius rezultatus aprašė ir Tevet su bendraautoriais. Ištyrę 192 pacientus, sergančius LMPL, jie nustatė, kad tiems, kuriems buvo JAK2 V617F mutacija, buvo 2,5 karto didesnė trom-bozės rizika, kurią dar padidino kartu esanti krešėjimo faktoriaus V Leideno mutacija [116].

Ruggeri ir bendraautoriai retrospektyviajame tyrime, kuriame dalyvavo 304 pacientai, sergantys ET ir TP, tyrė FV Leideno mutacijos dažnį. Tyrimo rezultatai parodė, kad krešėjimo faktoriaus V Leideno mutacijos paplitimas buvo panašus, kaip ir bendrojoje populiacijoje, tačiau šios mutacijos

vimas ET sergantiems pacientams padidina veninių trombozių pasikartojimo riziką [117].

2.4.5. Kardiovaskuliniai rizikos veiksniai

Kiekvienam pacientui kardiovaskuliniai rizikos veiksniai, t. y. arterinė hipertenzija (AH), hipercholesterolemija, rūkymas, cukrinis diabetas (CD) taip pat vaidina savo vaidmenį LMPL trombozės patogenezėje. Landolfi ir bendraautoriai nustatė, kad iš 169 TP pacientų vienam trečdaliui patyrusių trombozes buvo bent vienas širdies ir kraujagyslių ligų rizikos veiksnys. Autoriai nustatė, kad rūkymas buvo reikšmingai susijęs su miokardo infark-tu pacientams, sergantiems TP (GS 1,90; 95 proc. PI 1,15–3,14; p = 0,02) [96]. Alvarez-Larran ir bendraautoriai, tyrę 126 pacientus, sergančius ET, jaunesnius nei 40 m., nustatė, kad rūkymas buvo reikšmingai susijęs su blogesniu 10-ies metų išgyvenamumu be trombozės [118].

Hipercholesterolemija ir jos reikšmė trombozėms LMPL sergantiems pacientams buvo tyrinėta Besses ir bendraautorių. Hipercholesterolemija kartu su vyresniu nei 60 m. amžiumi bei buvusiomis trombozėmis, dau-giaveiksnėje analizėje buvo reikšmingi pakartotinės trombozės rizikos veiksniai [119]. Carobbio ir kt. nustatė, kad bent vieno iš kardiovaskulinių veiksnių (rūkymas, arterinė hipertenzija, cukrinis diabetas) buvimas padidino trombozės riziką pacientams, sergantiems ET [91]. Landolfi ir kt., stebėję 1638 pacientus vidutiniškai 2,7 metus, nustatė, kad rūkymas ir arterinė hipertenzija buvo reikšmingai susiję su 205 trombozinėmis kom-plikacijomis TP sergantiems pacientams [96]. Rūkymas, kaip trombozės rizikos veiksnys, pacientėms moterims buvo nustatytas ir Suomijos moks-lininkų tyrime, kuriame iš 70 sergančių ET pacienčių 60 proc., iš patyrusių trombozines komplikacijas rūkė [120]. Kardiovaskuliniai rizikos veiksniai (arterinė hipertenzija, rūkymas, cukrinis diabetas) kaip papildomas trom-bozės rizikos veiksnys buvo nustatytas ir Barbui tyrime, kuriame dalyvavo 891 pacientas, sergantis ET [15]. Cerquazzi ir bendraautoriai, ištyrę 587 TP sergančius pacientus, patvirtino hipertenziją, cukrinį diabetą ir hiperli-pidemiją kaip arterinės trombozės rizikos veiksnius [90].

2.4.6. Trombocitų receptorių ir krešėjimo faktorių polimorfizmai

Trombocitų receptorių ir kitų krešėjimo faktorių vieno nukleotido po-limorfizmai (VNP) yra pripažįstami kaip papildomi trombozės rizikos veiksniai įvairių mokslininkų klinikiniuose tyrimuose. Ir nors nagrinėti pacientams, sergantiems koronarine širdies liga ir smegenų kraujagyslių

trombozėmis, LMPL sergantiems pacientams literatūros duomenų yra mažai.

Kraujo krešėjimo procese trombocito prisijungimas prie I tipo kolageno skaidulų po kraujagyslės pažeidimo tiesiogiai priklauso nuo trombocito receptorių GP Ia/IIa tankumo. Jei jų tankis didelis, yra didesnė tikimybė trombozėms išsivystyti, ir atvirkščiai [121]. Yra nustatyta, kad trombocitų receptoriaus GP Ia/IIa (ITGA2 geno; žr. glikoproteinų ir juos koduojančių genų lentelę prieduose) c.807C>T T alelis yra susijęs su didesniu receptorių tankumu [122]. Keliose metaanalizėse tas pats T alelis buvo nustatytas kaip išeminio insulto rizikos veiksnys, tačiau dėl koronarinės širdies ligos išsivystymo rezultatai buvo prieštaringi [123,124]. Jimenez ir kt., tyręs šį polimorfizmą, sergantiems antifosfolipidiniu sindromu nustatė, kad ITGA2 c.807C>T TT genotipas buvo reikšmingai susijęs su arterinėmis trombo-zėmis šiems pacientams [162]. 229 pacientams sergantiems 2 tipo CD,

ITGA2 c.807C>T T alelis ir trombocitų receptoriaus GP IIb/IIIa PlA2 alelis (ITGB3 geno), o ypač jų derinys buvo papildomas arterinės trombozės ir miego arterijos aterosklerozės rizikos veiksnys [125]. Pirminės hemostazės metu trombocitų receptorius GP IIb/IIIa jungiasi prie vVF, fibrinogeno ir fibronektino. Pirminis šio receptoriaus polimorfizmas yra aminorūgšties prolino pakeitimas leucinu 33 pozicijoje (T1565C; PlA1/PlA2) [126]. P1A alelis susijęs su didesniu P-selektino, fibrinogeno tankumu ir didesniu receptoriaus aktyvumu, dėl ko stiprėja trombocitų agregacija [127]. Klinikinių tyrimų rezultatai nagrinėjant šį polimorfizmą ir trombozines ligas yra prieštaringi. Kelios metaanalizės, kuriose buvo analizuoti 46 tyrimai su pacientais, sergančiais koronarine širdies liga ir trombocitų receptoriaus polimorfizmu ITGB3 PlA2, nustatė jų tarpusavio ryšį. Be to, kai kuriuose tyrimuose šis polimorfizmas buvo siejamas su koronarinių arterijų stento restenoze [128,129]. Pirminė trombocitų adhezija prasideda nuo trombocitų receptoriaus GP Ibα, kuris jungiasi prie vVF. Yra žinomi keturi šio gliko-proteino GP1BA geno polimorfizmai. Kintamas tandemo pakartojimų skaičiaus (VNTR-A ir VNTR-D) polimorfizmas yra susijęs su trombocitų krešulio formavimusi [130]. Ozelo ir bendraautoriai, tyrę 180 pacientų, sergančių koronarine širdies liga, nustatė, kad VNTR-D alelis ir VNTR-CD genotipas buvo susijęs su didesne koronarinių kraujagyslių okliuzija nei VNTR-CC genotipas [131]. Šių polimorfizmų ryšį su išeminiu insultu tyrė daug autorių, vienas iš jų – Zhang, nustatęs, kad GP1BA geno VNTR-D alelis susijęs su aterotromboziniu insultu jo tirtoje kohortoje [132]. Trom-bocitų paviršiaus GP1BA geno polimorfizmas HPA-2 (Ko) susijęs su didesniu trombocitų afinitetu vVF [133]. Maguire ir bendraautorių atliktoje metaanalizėje, nagrinėjusioje 8 klinikinius tyrimus, kurių metu aiškintasi