CHROMOSOMINIŲ ABERACIJŲ ĮTAKA GALVIJŲ REPRODUKCINĖMS SAVYBĖMS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS FAKULTETAS

BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTAS

GINTARĖ ŢALIAGIRYTĖ

CHROMOSOMINIŲ ABERACIJŲ ĮTAKA GALVIJŲ REPRODUKCINĖMS

SAVYBĖMS

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: dr. Natalja Makštutienė

2

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas: „Chromosominių aberacijų įtaka galvijų reprodukcinėms savybėms“

1. Yra atliktas mano pačios:

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje:

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

Gintarė Ţaliagirytė

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ

LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Gintarė Ţaliagirytė

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

Dr. Natalja Makštutienė

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE

Prof. dr. Ilona Miceikienė

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

3

TURINYS

1.1. Galvijų kariotipas ir chromosomos ... 10

1.2. Chromosominės aberacijos ... 11

1.2.1. Chromosomų struktūros pakitimai ... 14

1.2.2. Chromosomų skaičiaus pakitimai ... 18

1.3. Chromosominių aberacijų atsiradimo prieţastys ... 21

1.3.1. Gamtinės ir dirbtinės mutacijos... 21

1.3.2. Fiziniai mutagenai ... 21

1.3.3. Cheminiai mutagenai... 22

1.3.4. Biologiniai mutagenai ... 22

1.4. Galvijų chromosominės ligos ... 22

1.5. Chromosominių aberacijų įtaka galvijų reprodukcinėms savybėms ... 23

2.TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 25

2.1. Tyrimų medţiaga ... 25

2.2. Tyrimų schema ... 26

2.3. Tyrimų metodai ... 27

2.3.1. Chromosominių preparatų tyrimo metodika ... 27

2.3.2. Medţiagos ir įranga ... 29

2.3.3. Chromosominių preparatų vertinimas ... 29

2.4. Statistinė duomenų analizė ... 30

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 31

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36

IŠVADOS ... 39

LITERATŪRA ... 40

4

SANTRUMPOS

X, Y – lytinės chromosomos bp – bazių pora

DNR – dezoksiribonukleininė rūgštis

ISCNDA – tarptautinė citogenetinių tyrimų standartizacijos konferencija Rob – Robertsono translokacija

BP – branduolio perdavimas PP – pakartotinis persileidimas

LSMU VA – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Veterinarijos akademija pH – vandenilio jonų (H+) koncentracijos tirpale matas

FGA – fitohemagliutinas

LH – konservantas Lithium heparin KCl – kalio chloridas

PCB – polichlorintas bifenilas S1 – spraga vienoje chromatidėje S2 – spraga abiejose chromatidėse

D1 – delecija (trūkis vienoje chromatidėje) D2 – delecija (trūkiai abiejose chromatidėse) F – fragmentas

Ţ – ţiedinė chromosoma Dic – dicentrikas

P – poliploidija Tr – trisomija

5

SANTRAUKA

Autorius: Gintarė Ţaliagirytė.

Darbo tema: chromosominių aberacijų įtaka galvijų reprodukcinėms savybėms. Raktiniai ţodţiai: chromosomos, aberacijos, kariotipas, galvijų reprodukcija. Darbo vadovas: Natalja Makštutienė.

Atlikimo vieta: magistrinis darbas atliktas 2011–2013 metais. Tyrimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijoje, Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.

Darbo objektas: citogenetinė analizė atlikta 26 karvėms iš Giraitės galvijų fermos, 12 karvių su reprodukcijos sutrikimais ir 14 karvių be reprodukcijos sutrikimų (kontrolinė grupė). Tyrimai atlikti standartiniu citogenetiniu laboratorijoje modifikuotu metodu.

Darbo apimtis: 47 puslapiai. Darbe pateiktos 4 lentelės, 10 paveikslų.

Darbo tikslas: įvertinti chromosominių aberacijų įtaką galvijų reprodukcinėms savybėms.

Darbo uţdaviniai: surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie chromosominius pakitimus ir jų poveikį galvijų reprodukcijai. Paruošti ir ištirti galvijų chromosomų preparatus. Įvertinti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimus bei jų įtaką reprodukcinėms savybėms.

Rezultatai ir aptarimas: ištyrus karves, kurioms nustatyti reprodukcijos sutrikimai, buvo identifikuoti ir chromosomų struktūros, ir chromosomų skaičiaus pakitimai. Didţiąją dalį chromosomų struktūros pakitimų, t. y. 38,2 proc., sudarė spragos vienoje chromatidėje (S1), 16,9 proc. spragos abiejose chromatidėse (S2) ir 16,9 proc. – chromatidţių trūkiai (D1). Fragmentai (F) sudarė 12,4 proc. Maţiausią dalį chromosomų struktūros aberacijų, t. y. 2,2 proc., sudarė ţiedinės chromosomos (Ţ) ir 2,2 proc. – chromosomų trūkiai (D2). Iš chromosomų skaičiaus pakitimų rasta 7,9 proc. poliploidijų (P). Ištyrus karves, kurioms nenustatyti reprodukcijos sutrikimai, taip pat buvo identifikuoti tiek chromosomų struktūros, tiek skaičiaus pakitimai. Iš chromosomų struktūros pakitimų nustatyta: 28,6 proc. spragų vienoje chromatidėje (S1), 11,4 proc. chromatidţių trūkių (D1), 11,4 proc. fragmentų (F), 8,6 proc. spragų abiejose chromatidėse (S2). Ţiedinių chromosomų ir dicenrikų nenustatyta. Iš chromosomų skaičiaus pakitimų aptikta 34,3 proc. poliploidijų (P) ir 2,9 proc. trisomijų (Tr). Karvių grupėje, turinčių reprodukcijos sutrikimų, ląstelių su pakitimais pasitaiko 3,3 karto daţniau (p<0,001) nei kontrolinėje grupėje, atitinkamai 10,4 proc. ir 3,2 proc. Bendra išvada: Tyrimų metu nustatytas aukštas chromosominių anomalijų daţnis rodo potencialią problemą, susijusią su reprodukcinių savybių pablogėjimu, t. y. sumaţėjusiu veršelių skaičiumi vadoje bei padidėjusiu negyvų gimusių veršelių skaičiumi.

6

SUMMARY

Author: Gintarė Ţaliagirytė.

The theme: influence of chromosomal aberrations on reproductive features of cattle. The keywords: chromosomes, aberration, caryotype, cattle reproduction.

The supervisor of the work: Natalja Makštutienė.

The place: this Master work was written in 2011–2013. The research was carried on at LSMU Faculty of Veterinary Medicine, Biological Systems and Genetic Research Department, K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.

The Object of the work: cytogenetic analysis was performed on 26 cows from animal farm in Giraitė, 12 cows with reproductive disorder and 14 cows with no reproductive disorder (the control group). The research was performed by standard citogenetical approach modified in laboratory. The extent of the work: 47 pages. There are 4 tables and 10 pictures included.

The aim of the work: to evaluate the influence of chromosomal aberrations on reproductive features of the cattle.

The tasks of the work: to collect and analyze scientific literature on chromosomal changes and their impact on reproduction of cattle. To prepare and investigate the preparation of cattle chromosomes, estimate the structural and numeral variations of chromosomes and their influence on reproductive characteristics.

The results and their discussion: after the examination of the cows with reproductive disorders the structural and numeral variations of chromosomes were identified. The major part of structural variations in chromosomes, i.e. 38.2%, consisted of gaps in one chromatid (S1), 16.9% of gaps in both chromatids (S2), 16.9% of cracks in chromatids (D1) and 12.4% of fragments (F). The least part (2.2%) of structural aberrations of chromosomes consisted of circular chromosomes (Ţ) and 2.2% of cracks in chromosomes (D2). There were 7.9% of poliploidies (P) found in numeral variations of chromosomes. There were also identified both the structural and numerical variations of chromosomes after examining the cows with no reproduction disorders. These structural variations of chromosomes were identified: 28.6% of gaps in one chromatid (S1), 11.4% of cracks (D1) in chromatids, 11.4& of fragments (F), 8.6% of gaps in both chromatids (S2). There were no circular chromosomes and dicentrics found. There were 34.3% of poliploidies (P) and 2.9% of trisomies (Tr) found. A number of reproductive disorder and variations in the cells in the group of cows with reproduction disorders is 3.3 times bigger (p<0,001) then in the control group, 10.4% and 3.2% respectively.

7

The conclusion: a high rate of chromosomal anomalies identified during the research shows a potential problem related to deterioration of reproductive properties, i.e. decreased number of calves in crop and increased number of born dead calves.

8

ĮVADAS

Galvijininkystė yra viena iš pagrindinių ţemės ūkio šakų. Galvijininkystės plėtrai šalyje yra palankios gamtinės sąlygos, susiformavusios gyvulių auginimo tradicijos, sukaupta patirtis (Jukna, 1998). Genetika galvijininkystėje vaidina vis didesnį vaidmenį, kadangi tyrinėjant galvijų kariotipą išssiaiškinama nemaţai genetinių pokyčių, kurie turi įtakos galvijų produktyvumui, sveikatingumui ir reprodukcinėms savybėms. Galvijų reprodukciniai sutrikimai (išsimetimai, ankstyva vaisiaus rezorbcija, mumifikacija ir kt.) sukelia didelių ekonominių nuostolių gyvulių augintojams (Malakauskas, Rutkauskas, 2006).

Genetinių anomalijų pasitaiko gana daţnai. Maţdaug trečdalis visų veršiukų dėl įvairių prieţasčių nugaišta, nemaţai jų nugaišta dėl genetinių nukrypimų. Kai taip nutinka, nukenčiama ekonomiškai. Tobulinant galvijininkystę, viena pagrindinių kliūčių yra ţinių apie chromosomų paveldėjimo dėsnius, įvairias genetines ligas bei chromosomines anomalijas stoka. Dėl menkiausio chromosomų skaičiaus ar struktūros nukrypimo atsiranda įvairūs sutrikimai, kurie laikui bėgant gali baigtis mirtimi. Vienas iš būdų chromosomų anomalijoms aptikti – kariotipo analizė. Kariotipo analizės metu aptikus genetinių nukrypimų ir, jei įmanoma, paskyrus gydymą, galima išsaugoti galvijus ir taip padidinti bendrą vaisingumą (Khatun et al., 2011).

Atlikus kariotipo tyrimą, galima suskaičiuoti chromosomas ir ištirti, ar nėra jų struktūros pakitimų, kurie gali informuoti apie esamus genetinius pokyčius, susijusius su padidėjusia susirgimo rizika. Daugiausia kariotipo testų atliekama jaučiams, kadangi dirbtinio apvaisinimo metu kyla pavojus, kad populiacijoje pasitaikys chromosomų anomalijų (Ashari et al., 2012). Šiais laikais citogenetikai yra „apsiginklavę“ galingais įrenginiais, galinčiais charakterizuoti kariotipus ir išsamiau ištirti esminius anomalijų pagrindus. Chromosomų patikrinimas gali sumaţinti embrioninį ir letalinį mirtingumą iki 20–30 proc. (Khatun et al., 2011).

9

Darbo tikslas: įvertinti chromosominių aberacijų įtaką galvijų reprodukcinėms savybėms.

Darbo uţdaviniai:

1. Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie chromosominius pakitimus ir jų poveikį galvijų reprodukcijai.

2. Paruošti ir ištirti galvijų chromosomų preparatus.

3. Įvertinti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimus bei jų įtaką reprodukcinėms savybėms.

Darbo praktinė reikšmė: citogenetiniai tyrimai turėtų būti naudojami kaip diagnostinė priemonė, siekiant nustatyti karvių reprodukcinių savybių pablogėjimo prieţastis.

Darbo struktūra: santrauka (lietuvių, anglų kalba), įvadas, literatūros apţvalga, tyrimo metodika ir organizavimas, rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados, literatūra, priedai. Darbe pateiktos 4 lentelės, 10 paveikslų. Darbo apimtis 47 puslapiai.

10

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Galvijų kariotipas ir chromosomos

Kiekvienos rūšies chromosomų skaičius yra specifinis, o kiekviena naminių galvijų (Bos taurus) somatinė ląstelė turi 60 chromosomų (2n), mofologiškai apibūdinamų akrocentrinėmis, išskyrus submetacentrines lytines chromosomas (Schmutz, 1991; Ashari et al., 2012). Gametose būna uţkoduota pusė genetinės informacijos (n), o apvaisinimo metu jos papildo viena kitą – viena kiekvienos chromosomos pora įgyjama iš mamos, kita – iš tėvo pusės. Individų genomų pakitimai, kurių nebuvo ankstesnėse kartose, gali atsirasti atsitiktinai pasireiškus mutacijai, chromosomų persitvarkymams ar DNR technologijų sukeltoms manipuliacijoms (Maria et al., 2004). Vykstant gametogenezei, chromosomos pereina mejozės stadiją, kurios metu kiekviena lytinė ląstelė pagamina 4 spermatozoidus su 30 chromosomų, kurių kiekviena yra buliaus, arba 1 kiaušinėlis su trimis poliniais kūneliais iš karvės. Bulius gali perduoti savo X arba Y chromosomą spermatozoidui, taigi, būtent jis nulemia veršiuko lytį. Karvė perduoda vieną iš savo X chromosomų (Ashari et al., 2012).

Chromosomų išsidėstymas pagal ilgį ir formą vadinamas kariotipu (Lightner, 2008; Ashari et al., 2012), o grafinis jų vaizdas – idiograma. Rūšinę kariotipo specifiką lemia: chromosomų skaičius, dydis ir forma (Paulauskas ir kt., 2003). Kariotipas atlieka svarbų vaidmenį paveldimumo procesuose. Ištyrus kariotipą galima nustatyti anatomines, morfologines ir fiziologines chromosomų savybes (Ashari et al., 2012). Atliekant kariotipo analizę siekiama nustatyti chromosominius pakitimus, susijusius su genetiniais sutrikimais (Khatun et al., 2011).

Galvijų kariotipą sudaro 60 chromosomų (1 pav.), 29 poros autosomų ir 1 pora lytinių chromosomų (Gallagher et al., 1999; Basrur et al., 2001; Issa et al., 2006; Abdullah et al., 2009; Khatun et al., 2011). Karvės chromosomų rinkinio citogenetinė formulė yra 2n=60=58 A + XX, o buliaus 2n=60=58 A + XY. Kariotipą sudaro 29 poros akrocentrinių autosomų, X chromosoma yra didelis submetacentrikas, Y chromosoma – maţas submetacentrikas (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007; Ashari et al., 2012). Lytinių chromosomų centromera yra chromosomos centre, X didesnė uţ Y (Rubio et al., 2003; Jantarat et al., 2009).

Kariotipavimas naudojant skaitmeninius atvaizdus yra galvijų chromosomų imitavimas remiantis tikrais galvijų genetiniais tyrimais. Jo metu chromosomos sugrupuojamos į pilną kariotipą ir sudaroma regimybė, tarsi būtų dirbama su genetinės analizės programa. Chromosomų skaičiaus ir struktūros pokyčių analizė gali būti atliekama pagal tarptautinius ISCNDA reikalavimus, taikomus

11

naminių gyvūnų kariotipavimui. Pakitimų laipsnis turėtų būti stebimas pro optinį, 1000 kartų vaizdą didinantį mikroskopą su integruota didelės skiriamosios gebos kamera (Beraradino et al., 1990).

1 pav. Karvės kariotipas be pakitimų (Autorė G. Ţaliagirytė)

1.2. Chromosominės aberacijos (mutacijos)

Chromosominės aberacijos – tai būklės, kurias sukelia chromosomų skaičiaus ar struktūros pakitimai (Ashari et al., 2012). Jonizuojančioji spinduliuotė, cheminės medţiagos (alkilinantys junginiai, aldehidai, peroksidai, hidroksilaminai, antimetabolitai ir kt.) gali sukelti įvairių tipų pirmines DNR paţaidas: viensiūlius ir dvisiūlius DNR trūkius, apurininius ir apirimidininius saitus, DNR – DNR ir DNR baltymų sąsiuvas, timino dimerus, interkaliacijas ir kt. Šių pirminių paţaidų likimas ląstelėje yra dvejopas: 1) paţaidos reparuojamos ir atstatoma normali DNR struktūra; 2) paţaidos transformuojasi į genų ir (arba) chromosomų mutacijas. Tik dvisiūliai DNR trūkiai tiesiogiai sukelia chromosomų aberacijas. Visų kitų DNR pirminių paţaidų vietose vykstant replikacijai ir (arba) reparacijai pirmiausia turi atsirasti dvisiūliai DNR trūkiai, o šie ir sukels chromosomų aberacijas (Paulauskas ir kt., 2003).

Dauguma cheminių medţiagų sukelia pirmines DNR paţaidas, kurioms virsti chromosominėmis aberacijomis būtina DNR replikacija. Tai nuo S stadijos priklausomos medţiagos. Jos indukuoja tik chromatidinio tipo aberacijas, nesvarbu kurioje ląstelės ciklo stadijoje buvo indukuota pirminė DNR paţaida (Paulauskas ir kt., 2003).

12

Pagal pokyčių pobūdį chromosomų mutacijos skirstomos į viduchromosomines ir tarpchromosomines:

 viduchromosominės mutacijos yra delecijos, duplikacijos, inversijos, insercijos, viduchromosominės translokacijos;

 tarpchromosominių mutacijų yra vienas tipas – tarpchromosominės translokacijos (Rančelis, 2000).

Pagal prigimtį, pobūdį ir padarinius mutacijos skirstomos į kelias grupes, o tai padaryti galima įvairiais būdais. Daţniausiai taikoma mutacijų klasifikacija pateikta 2 paveikslėlyje.

13

Pagrindinės mutacijų savybės:

1. Pokyčiai atsiranda staiga, šuoliškai. Pokyčių turinčio individo tėvai jų neturėjo arba dalis to individo kūno ląstelių yra pakitę naujai.

2. Mutacijos yra tiksliai apriboti pokyčiai. Nesusidaro nepertraukiamų kintamumo eilių, būdingų variaciniam kintamumui (modifikacijoms).

3. Mutacijų pagrįstų poţymių kitimų kryptis yra įvairi. Taigi mutacijos gal būti ir naudingos, ir ţalingos.

4. Naujos mutacijų formos išlieka pastovios kartų sekoje.

5. Dėl mutacijos pakitusiame organizme gali įvykti nauja mutacija, lemiant naują organizmo savybę (tiesioginė mutacija) arba pradinės organizmo savybės atkūrimą (grįžtamoji mutacija).

6. Kadangi mutacijos įvyksta labai retai, naują mutaciją daţniausiai galima aptikti tik ištyrus didelį skaičių individų (Kučinskas, 2001).

Chromosomų aberacijas galima suskirstyti į dvi pagrindines grupes: chromatidinio ir chromosominio tipo. Priklausomai nuo mainų jos klasifikuojamos smulkiau (3 pav.) (Paulauskas ir kt., 2003).

3 pav. Chromosomų aberacijų kaitos schema (Paulauskas ir kt., 2003) Paprastos

Chromosominio tipo aberacijos Chromatidinio tipo

aberacijos

Mainų tipo Paprastos

Viduchromosominės Tarpchromosominės

Vidupetės Tarp skirtingų pečių Simetrinės Asimetrinės

Nepilnos Pilnos

14

1.2.1. Chromosomų struktūros pakitimai

Išoriniai veiksniai (radiacija, kai kurios organinės ir cheminės medţiagos, virusai) gali sukelti chromosomų trūkius. Kartais sutrūkusių chromosomų galai nebesusijungia taip, kaip buvo, todėl chromosomų sandara pakinta (Kathun et al., 2011). Struktūriniai pakitimai individualiose chromosomose atsiranda dėl chromosomos dalies, kuri gali būti pašalinta „stabdymo“ (delecija), prisijungimo prie homologinės chromosomos (padvigubėjimai), apsisukimo ir prisijungimo dar kartą (inversijos) arba apsikeitimo su kitos nehomologinės chromosomos dalimi (translokacijos). Kai struktūriniai chromosomų pakitimai neveikia genetinės medţiagos praradimo ar įgijimo, jie laikomi „genetiškai subalansuotais“ ir iš esmės nepasireiškia nešiotojo fenotipe, tačiau yra tikimybė, kad neaptikti išplis populiacijoje (Maria et al., 2004).

4 pav. Chromosomų struktūros pakitimai (http://www.brusselsgenetics.be/p_396.htm)

Acentriniai fragmentai (1 lentelė). Tai poriniai įvairaus dydţio fragmentai. Retais atvejais jie matomi šalia chromosomos, nuo kurios atitrūko, daţniausiai kaip savarankiški elementai. Kartais matomi labai maţi būdingos sferinės formos poriniai fragmentai („minutės“) – tai intersticinės delecijos (1 lentelė), iš chromosomos vidurio iškritę nedideli segmentai. Kai šie segmentai pakankamai dideli, iš jų gali susidaryti acentriniai ţiedai (Paulauskas ir kt., 2003).

Delecija Duplikacija Inversija

Translokacija Insercija

15

Acentriniai ţiedai (1 lentelė). Tai poriniai ţiedo formos chromatidţių segmentai, neturintys centromeros. Atsiranda įvykus intersticinei delecijai viename chromosomos petyje ir susijungus intersticinio segmento galams. Pro mikroskopą matomi aštuoniukės formos struktūros arba poriniai ovalinės formos dariniai (Paulauskas ir kt., 2003).

Dicentrinės ir policentrinės chromosomos (asimetriniai mainai). Tai tarpchromosominiai mainai, kuriems įvykus formuojasi di – ar policentrinės chromosomos ir acentriniai fragmentai. Daţniausiai būna dicentrinės chromosomos. Jos lengvai identifikuojamos (Paulauskas ir kt., 2003).

Delecija (4,5 pav.). Tai chromosomos dalies iškritimas. Iš chromosomų galų iškritę segmentai yra lipnūs savo galais, todėl gali sudaryti ţiedą (ţiedinė chromosoma) (Nicholas, 2010). Stambios delecijos letalios, kartais naudingos. Galvijams būdinga X chromosomos delecija, lemianti reprodukcijos sutrikimus (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

5 pav. Pakitęs karvės kariotipas: X chromosomos delecija (Autorė G. Ţaliagirytė)

Duplikacija (4 pav.) yra chromosomų mutacija, kai kuris nors chromosomos segmentas padvigubėja, patrigubėja ir pan. Kartais tokie pasikartojantys chromosomos segmentai yra išsidėstę paeiliui – vienas paskui kitą (Kučinskas, 2001).

Inversija (4 pav). Tai tokio tipo aberacija, kai chromosomos fragmentas pasisuka 1800 kampu (Paulauskas ir kt., 2003). Galvijams aptinkamos 14 ir lytinės X chromosomos pericentrinės inversijos (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

16

Skiriamos dviejų tipų chromosomų inversijos:

 paracentrinės inversijos – abu trūkio ir susijungimo taškai yra tame pačiame chromosomos petyje;

 pericentrinės inversijos – trūkio taškai yra priešingose centromeros pusėse (Paulauskas ir kt., 2003).

Insercija (4 pav.). Atsiranda įvairiais būdais įsiterpus svetimai DNR. Mejozėje jos sudaro kilpas, panašias į delecijų. Tik šiuo atveju atvirkščiai: nehomologinį „atliekamą“ segmentą turi pakitusi chromosoma (Rančelis, 2000). Galvijams aptinkama 16 chromosomos insercija, įtakojanti reprodukcijos sutrikimus (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

Spraga (priedas 1) – tai baltyminio chromosomos apvalkalo paţeidimas, nenutrūkstant DNR grandinėlei (Kučinskienė, Miceikienė 2002). Spragos yra nepilnos chromosomos struktūros paţeidimai, kurie arba yra reparuojami, arba išsivysto į chromosomines ar chromatidines delecijas (Krasnopiorova, Miceikienė 2007).

Ţiedinės chromosomos (1 lentelė) – tai ţiedo formos struktūros, turinčios centromerą. Jos atsiranda paţeidus abu chromosomos pečius. Paprastai ţiedinę chromosomą „lydi“ porinis fragmentas (Paulauskas ir kt., 2003).

Translokacijos (4 pav.) – chromosomų mutacijos, kai įvykus trūkiams pasikeičia segmento vieta toje pačioje chromosomoje, segmentas persikelia iš vienos homologinės chromosomos į kitą šioms apsikeičiant segmentais arba persikelia iš vienos nehomologinės chromosomos į kitą nehomologinę chromosomą, pastarosioms apsikeičiant segmentais (Kučinskas, 2001).

Translokacijos skirstomos:

 viduchromosominės – kai chromosomos segmentas pakeičia vietą iš vienos vietos į kitą toje pačioje chromosomoje arba iš vienos homologinės į kitą homologinę chromosomą;

 tarpchromosominės – kai chromosomos segmentas perkeltas iš vienos nehomologinės chromosomos į kitą nehomologinę chromosomą;

 Robertsono translokacijos – atsiranda susiliejant nehomologinių chromosomų centromeroms (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

Galvijams daţniausiai nustatomos lytinių chromosomų anomalijos ir pirmos bei dvidešimt devintos chromosomų susijungimai – translokacijos. Šie chromosomų pakitimai turi įtakos apvaisinimo galiai, embrionų mirtingumui ir palikuonių produktyvumui (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

Reciprokinės translokacijos (simetriniai mainai). Šių aberacijų realizacijai būtini trūkiai dviejose chromosomose ir reciprokiniai (abipusiai) mainai distaliniais acentriniais fragmentais. Tai stabilios aberacijos. Standartiniu būdu daţytuose preparatuose reciprokinės translokacijos

17

atpaţįstamos tik tais atvejais, kai mainuose dalyvaujantys skirtingų chromosomų fragmentai yra nevienodo ilgio – neįprasto ilgio ir formos chromosomos. Įvykus trūkiams centromeriniuose rajonuose, galimos viso peties translokacijos. Jeigu tokiuose mainuose dalyvauja akrocentrinės chromosomos, vyksta Robertsono tipo translokacijos (Paulauskas ir kt., 2003).

Robertsono translokacijos (rob) yra daţnas chromosomų pasikeitimas vietomis, pastebėtas ţmonių (Nielsen, Wohlert, 1991), augalų (Friebe et al., 2005), pelių (Saferali et al., 2010) ir naminių gyvulių organizmuose (Fries, Popescu, 1999). Galvijams aptinkamos šios translokacijos: 1/8, 1/29, 8/13, 8/15, 10/11, 20/24, Y/17 (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007), 2/28, 15/25, 7/21, 4/20, 16/18, 16/20, 4/10 ir kitos translokacijos (Qu et al., 2012).

Daţniausiai pasitaikanti yra Robertsono translokacija tarp 1 ir 29 chromosomos (1/29) (Rubio et al., 2003; Kakampuy et al., 2007; Postiglioni et al., 2011). Robertsono translokacija daţniausiai būdinga mėsinių galvijų veislėms, kurios buvo atgabentos iš Europos ţemyno (Rubio et al., 2003). Robertsono translokacija (1/29) yra labiausiai paplitusi chromosominė anomalija tarp Europos ir Amerikos Kreolų veislės galvijų (Schifferli et al., 2003). Urugvajaus Kreolų veislės galvijų organizmuose monocentrinės Robertsono translokacijos (1/29) atvejų koeficientas yra 4 proc., o nuo 4 proc. iki 10 proc. rob atvejų koeficientas vyrauja tarp mėsinių ir pieninių galvijų veislių (King, 1991; Postiglioni et al., 1996). Robertsono translokacija lemia didţiulės submetacentrinės autosomos susiformavimą ir bendrą chromosomų skaičiaus sumaţėjimą, tačiau dėl jos jokia genetinė medţiaga neprarandama. Pirmą kartą rob buvo aptikta prieš 40 metų Švedijoje, ir pasauliniu mastu aprašyta maţiausiai 30 galvijų veislių (Maria et al., 2004). Daţniausiai Robertsono translokacijos pasireškia: karvėms – sumaţėjęs apsivaisinimas (jei apsivaisina, tai embrionas ţūsta per 90 dienų), kiaušialąstės su defektais, pasikartojanti ruja, buliams – sumaţėjusi spermatozoidų koncentracija spermoje, sutrikusios reprodukcinės savybės (Lorenzi et al., 2012). Robertsono translokacijos nešiotojai yra fenotipiškai normalūs, tačiau jie turi vaisingumo problemų (Rubio et al., 2003; Lorenzi et al., 2012), dėl kurių didesnis patelių skaičius apvaisinamas dirbtiniu būdu, o pastojusiųjų skaičius sumaţėja (Maria et al., 2004). Paţiūrėjus į karvę ar bulių neįmanoma nustatyti, ar jie yra nešiotojai. Tačiau norint nustatyti, ar galvijai turi tokių problemų, galima atlikti chromosomų testą, vadinamą kariotipavimu. Jei sukergus karves ir bulius, daugiau nei 10 proc. abortuojasi arba nepastoja, reikėtų atlikti galvijų kariotipavimą, kad būtų įsitikinta, ar jie nėra translokacijų nešiotojai (Maria et al., 2004).

18

1 lentelė. Chromosominio tipo aberacijų susidarymo schema (Paulauskas ir kt., 2003)

Ciklo fazė Aberacijų tipas G0 ; G1 S ; G2 M 1. Acentriniai fragmentai

X

l l

X

X

X

X

X

1.2.2. Chromosomų skaičiaus pakitimai

Dar viena daţniausiai pasitaikanti chromosomų mutacija – chromosomų skaičiaus pakitimai. Chromosomų skaičiaus pakitimai sukelia vaisingumo ir gyvulių vystymosi problemų (Ashari et al., 2012).

Genomo mutacijos – pakitęs chromosomų skaičius. Jos skirstomos taip:

 Poliploidija (priedas 2), kai chromosomų skaičius kinta ištisais kartotiniais chromosomų rinkiniais. Poliploidija priklausomai nuo to, kaip ji atsiranda, skirstoma taip: autopoliploidija, kai įvyksta endomitozė – padvigubėjusios chromosomos, bet nesusidaro dukteriniai branduoliai, neišsiskiria, arba susilieja dvi tokių pačių genomų somatinės ląstelės; alopoliploidija, kai skirtingų rūšių genomai susilieja įvairiais tolimosios hibridizacijos, tarp jų ir tolimųjų taksonų somatinių ląstelių hibridizacijos, būdais (Rančelis, 2000).

Poliploidijos atveju nėštumas paprastai baigiasi abortu. Tie organizmai, kurie išgyvena, būna su sunkiomis vystymosi ydomis. Retais atvejais gimsta triploidinis vaisius (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

19

 Aneuploidija (heteroploidija), kai pakinta (sumaţėja – hipoploidija arba padidėja – hiperploidija) pavienių chromosomų skaičius.

Aneuploidija atsiranda dėl trijų prieţasčių:

1) Chromosomų neišsiskyrimo keliaujant dukterinėms ląstelėms į polius;

2) Chromosomų atsilikimo (turi daug bendro su pirmąja prieţastimi, irgi netaisyklingai paskirstomos dukterinės chromosomos);

3) Endoreprodukcijos – reiškinio, kai padvigubėja tik pavienės chromosomos arba jų dalys (Rančelis, 2000).

Chromosomų skaičiaus mutacijų prieţastis yra chromosomų neatsiskyrimas per mejozę (aneuploidijos) arba vienos kiaušialąstės apvaisinimas dviem ar daugiau spermatozoidų (poliploidijos). Kai chromosomos neatsiskiria vykstant mitozei, organizmas tampa mozaikišku, t. y. jame susidaro vienas ląstelių klonas, kuriame chromosomų skaičius normalus, o kituose klonuose chromosomų skaičius yra aneuploidinis (Kučinskas, 2001).

Bulių spermatogenezė trunka maţdaug 60 dienų, ir vyksta nuo lytinio brendimo pradţios iki gana senyvo amţiaus, nors bendras sėklos kiekis gali ir sumaţėti. Karvių ovogenezė prasideda tada, kai ji pati dar būna embrionas, ir nutrūksta jai pasenus. Šis procesas baigiasi tik tada, kai atsiskiria trys poliniai kūneliai. Dėl šio ilgam sustabdyto mejozinio proceso kiaušinėliai yra labiau linkę į chromosomų skaičiaus klaidas, nei sėkla. Manoma, kad kai karvė sulaukia 9 metų amţiaus, klaidų koeficientas pradeda proporcingai didėti (Kathun et al., 2011).

Mejozės metu chromosomos poruojasi, tuomet po vieną chromosomą iš kiekvienos poros patenka į kiekvieną gametą. Jei tai neįvyksta tinkamai, tai toks procesas vadinama neatsiskyrimu. Jam įvykus viena gameta gauna 31 chromosomą, o kita – 29, abiejose jų skaičius nevienodas. Daugybės abiejų gametų genų skaičius yra netinkamas, kadangi kiekvienoje chromosomoje yra šimtai genų. Veršiukas, išsivystęs iš sėklos arba kiaušinėlio, kuriame buvo 29 chromosomos, turi „monosomiją“, t. y. vieną vienos chromosomos kopiją vietoj įprastų dviejų. Veršiukas, išsivystęs iš sėklos arba kiaušinėlio, kuriame buvo 31 chromosoma, turi „trisomiją“, t. y. tris vienos chromosomos kopijas vietoj įprastų dviejų (Gallagher et al., 1999). Veršiukai, turintys monosomiją, abortuojasi ankstyvoje embriono stadijoje, o veršiukai, turintys trisomiją, abortuojasi kiek vėliau (Salam et al., 2002). Taigi, vyresnėms nei 9 metų karvėms yra didesnė rizika abortuotis, nes jos labiau linkusios turėti chromosominių problemų. Jų tikimybė visoms telyčioms ir karvėms yra maţdaug 1 proc. Apsigimimai, turintys įtakos sudėtinėms sistemoms organizme, kyla dėl nesuderintų sudėtinių genų, o tai daţniausiai įvyksta dėl chromosomų skaičiaus klaidų (Bayomi et al., 2011).

20

Chromosomų skaičiaus klaidų aptinkama tiek lytinių chromosomų, tiek autosomų struktūroje, taip pat gali būti klaidingas ir jų skaičius (Ashari et al., 2012). Nors manoma, kad autosomų nukrypimai pasitaiko daţniau nei lytinių chromosomų, labiau paplitusios yra chromosomų struktūros anomalijos, kylančios dėl lytinių chromosomų ydų. Zigotų atrofija atsiranda dėl autosomų anomalijų, o lytinių chromosomų trūkumai paprastai turi įtakos dauginimosi sistemos vystymuisi ir funkcionavimui (Khatun et al., 2011).

Dauguma atvejų, kai lytinėse chromosomose aptinkama chromosomų skaičiaus klaidų nėra mirtini, tačiau tai kenkia vaisingumui. Embrionas, iš tėvo paveldėjęs tik vieną Y chromosomą ir nei vienos X chromosomos iš patelės, abortuojasi. X chromosoma būna didelė ir savyje turi daug gyvybiškai svarbių genų (Rubio et al., 2003). Lytinių chromosomų skaičiaus pakitimai lemia reprodukcijos sutrikimus: lytinių organų neišsivystymą, lytinių organų nebuvimą, nevaisingumą, skirtingų lyčių fenotipo buvimą (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

Daţnai nevaisingumas ir sterilumas būna citogenetinės ligos padariniai, ypač lytinių chromosomų aneuploidija (pvz., XO, XXX, XXY). Daţniausiai pasitaikanti anomalija – vienos lytinės chromosomos trūkumas (Krumrych et al., 2009). Gyvuliai, kuriems trūksta lytinės chromosomos, vadinami monosomikais. Jų kariotipas apibūdinamas kaip 59, XO – O simboliu paţymint X chromosomos trūkumą. Ši liga vadinama Turnerio sindromu. Visi XO individai turi moteriškos lyties fenotipą (Salam et al., 2002). Labiausiai paplitęs chromosominių anomalijų tipas – autosomų ir lytinių chromosomų trisomija (6 pav.). Patelės būna vaisingos, o palikuonys – su normaliu kariotipu ir trisomikai (2n=61, XXX). Daţnai XXX turintys individai būna vislūs ir atsiveda jauniklių, kurių kariotipai būna normalūs (Sysa et al., 1998; Switonski, 1998).

21

1.3. Chromosominių aberacijų atsiradimo prieţastys

Anomalūs kariotipai atsiranda dėl chromosomų replikacijos, ar apvaisinimo klaidų arba dėl ankstyvos apvaisinto kiaušinėlio segmentacijos. Pastebėta, kad daugeliu atvejų sveiki ir (arba) vaisingi gyvuliai turi anomalius kariotipus, o daugelis sergančių ar nevaisingų gyvulių turi visiškai normalius kariotipus (Khatun et al., 2011).

Mutacijų atsiradimo procesas vadinamas mutageneze. Pagal tai, kaip vyksta mutagenezė (natūraliai, be aktyvaus ţmogaus įsikišimo ar ţmogaus sąmoningai sukeliama), mutacijas galima skirstyti į gamtines ir dirbtines. Ir vienos, ir kitos daţniausiai atsiranda dėl tų pačių mutagenų poveikio. Mutagenais vadinami veiksniai, sukeliantys mutacijas. Mutagenais būna cheminiai junginiai, fiziniai ir biologiniai veiksniai. Daţniausiai tai jonizuojančioji spinduliuotė, kiti fiziniai veiksniai (pvz., aukšta temperatūra), įvairios cheminės medţiagos, virusai, bakterijos. Mutagenai veikia organizmą bet kuriuo jo raidos momentu – pradedant gameta ir baigiant suaugusiu organizmu (Rančelis, 2000).

1.3.1. Gamtinės ir dirbtinės mutacijos

Gamtinės (savaiminės) mutacijos yra spontaninės, jos atsiranda dėl neţinomų prieţasčių (pavyzdţiui, homologinių chromosomų neišsiskyrimo mejozėje). Dirbtines (indukuotas) mutacijas sukelia ţinomi veiksniai (jonizuojanti spinduliuotė, aukšta temperatūra, bakterijos ir kt.) (Chen et al., 1999).

1.3.2. Fiziniai mutagenai

Įvairių rūšių spinduliavimas, radiacija, švitinimas sukelia mutacijas. Švitinimo padarinys – laisvųjų radikalų susidarymas, kurie yra labai reaktyvūs ir skaido daugelį organinių medţiagų, tarp jų ir nukleorūgštis. Mutacijas gali sukelti ir UV spinduliai šviesos fotonai, bei aukšta temperatūra. Daţniausiai šių veiksnių poveikis nedidelis, nes organizmas turi apsauginius mechanizmus (Machaty et al., 1993).

Mutageninį jonizuojančiosios spinduliuotės poveikį 1927–aisiais įrodė JAV genetikas H. J. Maleris (Kučinskas, 2001). Mutacijas sukelia visų rūšių jonizuojančioji spinduliuotė (Rentgeno spinduliai, y spinduliai, neutronai, a ir (3 dalelės)). Ji gali sukelti ir paveldimuosius, ir nepaveldimuosius organizmo pokyčius. Mutageninis jonizuojančiosios spinduliuotės poveikis

22

įvairus ir daţnai sukelia skirtingus chromosomų pokyčius: pavienės chromosomos gali sulipti, sutrūkinėti, gali įvykti ląstelių poliploidizacija (Kučinskas, 2001).

1.3.3. Cheminiai mutagenai

Cheminiams mutagenams priskiriamos įvairios sunkiųjų metalų druskos, alkaloidai, peroksidai ir kitos cheminės medţiagos. Jiems būdinga slenkstinė koncentracija, stimuliuojantis maţų koncentracijų poveikis, padidėjęs atsparumas veikiant ilgą laiką (adaptacija). Mutagenai paţeidţia DNR, kai kurie – mikrovamzdelių baltymus (sąlygoja poliploidiją) (Yoshizawa et al., 1999).

Ištyrus gyvulius zonoje, kuri yra arti rafinavimo fabriko bombarduotame Novi Sade, gauti rezultatai parodė, kad tokie chromosomų pakitimai, kaip delecijos ir ţiedinės chromosomos, yra tam tikrų genotoksinių medţiagų pasekmės. Tokie struktūriniai pokyčiai, kaip izo chromatidţių trūkiai, buvo atrasti penktojoje chromosomų poroje. Iš 100 ištirtų metafazių 37 proc. turėjo minėtus pakitimus. Buvo nustatyta, kad šie chromosomų struktūros pokyčiai įvyko dėl ţalingų medţiagų, atsiradusių aplinkoje dėl nebaigto deginti aliejaus, poveikio (Košarčic et al., 2005).

1.3.4. Biologiniai mutagenai

Biologiniams mutagenams priskiriami virusai, kai kurių organizmų (ypač pelėsių) toksinai. Virusų mutageniškumas yra viena iš mutacinių periodų prieţasčių, kai labai padidėja mutacijų daţnis (Rančelis, 2000). Labai stiprus mutagenas gali būti egzogeninė DNR – svetimo organizmo DNR (insercinė mutacija) (Chen et al., 1999).

1.4. Galvijų chromosominės ligos

Paveldima patologija gali pasireikšti įvairiomis organų ir audinių anomalijomis, abortais, vislumo sumaţėjimu, įvairiais funkciniais negalavimais arba medţiagų apykaitos ligomis. Veterinarinėje patologinėje genetikoje skiriamos dvi susirgimų grupės, t. y. chromosominės ligos ir geninės ligos. Gyvulių chromosominės ligos daţniausiai sukelia įvairius reprodukcinius sutrikimus. Ţenklūs gametų genetiniai defektai, ypač chromosomų skaičiaus pakitimai ir daugybinės aberacijos, sąlygoja nevaisingumą. Maţi gametų genetiniai defektai sąlygoja anomalijas, abortus, lytinių organų išsivystymo ir lytinio ciklo sutrikimus (Miceikienė ir kt., 2007).

23

Chromosominės ligos – svarbus savaiminio ir pakartotinio persileidimo (PP) sukėlėjas (Rubio et al., 2003). Genetinės ligos gali pakenkti gyvulininkystei. Galvijai serga tokiomis genetinėmis ligomis, kaip Turnerio sindromas, Klainfelterio sindromas, Gaucher liga, Šeimyninė adenominė polipozė, Tay –Sachso liga, Robertsoninės translokacijos, taip pat gali gimti du veršiukai (Khatun et al., 2011).

Palikuonis, paveldėjęs tik vieną X chromosomą iš savo motinos ir nė vienos chromosomos iš savo tėvo, išgyvena (2n=59, XO). Tokia telyčia būna sterili. Jai išsivystys tik nefunkcionuojančios gonados, netinkamos kiaušidės, jai nevyks ovuliacija. Ši būklė vadinama Turnerio sindromu (Salam et al., 2002).

Palikuonis, paveldėjęs 2 X chromosomas ir Y chromosomą iš savo tėvų, laikomas 61, XXY ir serga Klainfelterio sindromu. Paprastai juo serga jaučiai, kurių sėklidės yra nepakankamai išsivysčiusios, o gyvulys daţniausiai būna sterilus, tačiau kitais atţvilgiais jis yra sveikas. Atlikus spermos patikrinimą, turėtų paaiškėti, kad jautis jos visiškai negamina (Kathun et al., 2011). Senesnėms nei 9 metų karvėms kyla didesnė persileidimo rizika, kadangi jos yra labiau linkusios turėti chromosomų skaičiaus pakitimo ir ląstelės nesidalijimo problemų (Arifuzzaman, 2003; Rubio et al., 2003).

Palikuonis, paveldėjęs tris X chromosomas, turi X lytinės chromosomos trisomiją ir kariotipą 61, XXX. Tokios patelės gali daugintis. Nustatyta, kad jos nesiabortuos daţniau nei normalios karvės (Kathun et al., 2011).

Frimartinizmas – chromosominis defektas, kuriuo pasiţymi telyčios, turinčios jaučio bruoţų (Kathun et al., 2011). Tai organizmo būsena, kai tas pats individas turi dviejų tipų ląsteles – vyriško ir moteriško kariotipo. Toks reiškinys – vadinamas mozaikiškumu. Tokių gyvulių lytiniai organai būna išsivystę normaliai. Vis tik yra manoma, kad šių gyvulių nereikėtų naudoti veisimui, nes jų sperma yra prastos kokybės, o apvaisinimo procentas prastesnis nei normalių gyvulių (Miceikienė ir kt., 2007).

1.5. Chromosominių aberacijų įtaka galvijų reprodukcinėms savybėms

Tam tikras skaičius genetiškai nulemtų pakitimų tiesiogiai veikia galvijų vaisingumą ir dauginimosi rezultatus (Maria et al., 2004 ). Svarbiausias anomalių kariotipų poveikis yra jų įtaka susilpnėjusiai dauginimosi funkcijai, maţinant ar visiškai sunaikinant galimybes gaminti funkcines lytines ląsteles ar lemiant embriono ţūtį (Khatun et al., 2011).

Sėkmingas veršelio išnešiojimas visas 280–285 dienas priklauso nuo daugelio faktorių (Aniulis, Klimaitė, 2005). Išsimetimas – tai mirusio embriono išmetimas iš gimdos nepasibaigus

24

veršingumo laikotarpiui. Daţniausiai vaisius išsimeta iki tol, kol embrionas nusileidţia į gimdą ir joje prisitvirtina, tai vadinama embriono ţūtimi (Pikelis, 2005). Išsimetimai gali baiktis gemalo rezorbcija, mumifikacija, maceracija ar įvykti jo rescencija (emfizeminis vaisius) (Aniulis, Klimaitė, 2005).

Literatūros duomenimis, chromosominių aberacijų daţnį be organizmo individualių savybių, veikia ir galvijų amţius bei veislė. Kuo gyvuliai vyresni, tuo chromosominių aberacijų daţnis didesnis, nes ląstelės su amţiumi praranda chromosomų paţaidų reparacines savybes (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007). Vyresnėms karvėms daţniau pasitaiko netaisyklinga vaisiaus padėtis, daugiavaisiškumas, nuovalų, placentos uţsilaikymas ir kiaušidţių cistos (Ţilaitis, 2007).

Galvijų dvynių gimimas yra sudėtingas kompleksas, susijęs su gyvulių vislumu ir sveikata. Dvynių gimimas yra susijęs su tokiais ekonominiais nuostoliais, kaip abortas, sudėtingas gimdymas, gimę maţesnio svorio jaunikliai ir sumaţėjęs išgyvenusių naujagimių skaičius (Fricke, Wiltbank, 1999; Karlsen et al., 2000). Maţdaug 92 proc. heteroseksualių dvynių patelių būna visiškai nevaisingos, o jų lytiniai organai vystosi nenormaliai (Khatun et al., 2011). Mėsinių veislių karvėms dvyniai gimsta daţniau negu pieninėms (Jukna, 2006).

Galvijų kariotipo sandaros ir skaičiaus pakitimai sukelia reprodukcinius sutrikimus, turi įtakos fenotipo išraiškai, selekcijų programai ir genofondo stabilumui. Pastebėti įvairūs dauginimosi sutrikimų aspektai: negausi vada, embrionų mirtingumas, daţnai pasikartojantis apvaisinimas, abortai, negyvagimiai bei mumifikavęsi, nukrypimais pasiţymintys jauni embrionai ir įvairių rūšių sterilumas (Slavika et al., 2006).

Chromosomų skaičiaus ir sandaros pakitimai yra aprašyti daugelio mokslininkų. Chromosomų skaičiaus pakitimai gali neigiamai paveikti visą chromosomų rinkinį (euploidija), kas ypač pastebima vis daţniau uţsimezgant embrionams, kadangi gemalo vystymo sistema apima daug manipuliacijų genomais, pavyzdţiui, branduolio perdavimą (BP). Manoma, kad tokios rūšies nukrypimas yra susijęs su ankstyva gemalo netektimi ir pakartotiniu poravimusi. Kitais atvejais paveikiama tik viena chromosomų pora (aneuploidija). Autosomų aneuploidijos daţniau pasitaiko prenatalinio laikotarpio metu ir yra daugiausiai atsakingos uţ persileidimus pirmojo nėštumo trimestro metu. Lytinių chromosomų aneuploidija daţniau pasitaiko postnatalinio laikotarpio metu (Maria et al., 2004).

25

2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS

2.1. Tyrimų medţiaga

Kraujo mėginiai buvo paimti iš 26 juodmargių karvių LSMU VA praktinio mokymo – bandymo centro, Giraitės galvijų fermos. Karvės buvo suskirstytos į 2 grupes: 12 karvių, kurios turėjo reprodukcijos sutrikimų (2 lentelė) ir 14 karvių be reprodukcijos sutrikimų (kontrolinė grupė). Tiriamos karvių grupės buvo laikomos vienodomis sąlygomis, buvo vienodo amţiaus. Tyrimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijoje, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje. Tyrimui kraujas imtas į sterilius vakuuminius mėgintuvėlius su heparinu (MBI Fermentas, Lietuva VT100H). Ruošiant chromosomų preparatus, kraujo mėginiai 72 val. kultivuoti terpėje RPMI – 1640 MEDIUM (Sigma, USA) su mitogenu lektinu (Sigma, USA). Limfocitų kultūra buvo apdorota kolchicinu (Sigma, USA), vėliau – hipotoniniu tirpalu (Sigma, USA 0,075 M KCl). Chromosomos buvo fiksuotos metanolio ir ledinės acto rūgšties mišiniu (3:1). Prieš vertinant chromosomos buvo daţomos Gimzos daţais (Sigma, USA, 0,4 proc.). Chromosomų preparatai tirti ir analizuoti optiniu mikroskopu „Nikon“ su imersiniu objektyvu. Kiekvienam individui buvo tiriama iki 100 metafazių.

2 lentelė. Tirtų karvių reprodukcijos sutrikimai Karvės nr. Reprodukcijos sutrikimai

1. Abortavosi

2. Gimė negyvi dvyniai (susisukę) 3. Negyvagimis (gimęs negyvas) 4. Negyvagimis (gimęs negyvas) 5. Abortavosi

6. Gimė tos pačios lyties dvyniai (telyčaitės) 7. Abortavosi

8. Gimė tos pačios lyties dvyniai (veršiukai) 9. Negyvagimis (gimęs negyvas)

10. Negyvagimis (gimęs negyvas)

11. Susilaikė nuovalos, gimė didelis veršiukas 12. Gimė skirtingų lyčių dvyniai

26

2.2. Tyrimų schema

Metafazinių chromosomų ruošimui atlikti šie etapai:

Medţiagos paėmimas Transportavimas Kultivavimas Fiksavimas Veikimas hipotoniniu tirpalu Veikimas kolchicinu

Preparatų gamyba ant objektyvinių stiklelių

27

2.3. Tyrimų metodai

Chromosomų tyrimams panaudojamos įvairios metodikos, bet daţniausiai naudojamas standartinis citogenetinis chromosomų tyrimo metodas, kuriuo kariotipas vertinamas apţiūrint chromosomų rinkinius optiniu mikroskopu arba analizuojant šių rinkinių nuotraukas. Svarbiausias ir sunkiausias uţdavinys – identifikuoti chromosomas (Janušauskas ir kt., 1997).

Citogenetiniai metodai naudojami šiais tikslais:

 Tiriant chromosomų skaičiaus ir struktūros pokyčius veislėse, linijose, šeimose;

 Tiriant chromosominių pokyčių ryšį su gyvulių reprodukcinėmis savybėmis, produktyvumu, gyvybingumu, atsparumu ligoms;

 Atliekant chromosominių markerių paieškas ir juos panaudojant gyvulių selekcijoje;

 Nustatant embrionų lytį ir chromosominius pakitimus;

 Įvertinant fizinių, cheminių ir biologinių faktorių – mutagenų poveikį genomui;

 Nustatant gyvūnų frimartinizmą ir chromosomines ligas;

 Sudarant chromosominius ţemėlapius (Kučinskienė, Miceikienė, 2002).

Tyrimas atliktas standartiniu citogenetiniu metodu (Kučinskienė, Miceikienė, 2002). Atliekant karvių citogenetinį vertinimą buvo imtas periferinis kraujas. Tyrimui buvo naudojamos periferinio kraujo ląstelės – limfocitai. Daţniausiai šios ląstelės analizuojamos metafazės stadijoje (Paulauskas ir kt., 2003). Kraujo limfocitai buvo kultivuoti pagal metodiką, kuri aprašyta sekančiame skyriuje.

2.3.1. Chromosomų preparatų tyrimo metodika

Chromosomų preparatai ruošiami iš periferinio kraujo, naudojant ląstelių dalijimąsi skatinančią medţiagą – mitogeną.

1. Kraujo mėginio paėmimas. Kraujas imamas 10 ml vakuuminiais mėgintuvėliais su konservantu Lithium heparin (LH).

2. Terpės paruošimas leukocitų audinių kultūrai. 10 mėginių ruošiama 40 ml terpė, į kurią įlašinta 0,05 ml darbinio kanamicininio tirpalo (tirpalas gaunamas 5000000 v.v. kanamicino atskiedus 10 ml fiziologinio tirpalo) ir fitohemagliutinino 0,4 ml darbinio tirpalo (darbinis tirpalas ruošiamas 5 mg FGA flakono turinį atskiedus 5 ml terpės, laikomas uţšaldytas). 3. Į sterilius 30 ml buteliukus įpilama po 4 ml paruoštos terpės.

28

4. Mėgintuvėliai su 10 ml heparinizuoto kraujo centrifuguojami 1500 aps./min. greičiu 25 minutes.

5. Švirkštu nutraukiamas viršutinis centrifūgato sluoksnis su leukocitų mase ir perkeliama (1 ml) į buteliuką su terpe.

6. Kultivuojama termostate (380 C temperatūroje) 72 val.

7. Likus 2 val. iki kultivavimo pabaigos, įlašinama 0,02 ml kolchicino drbinio tirpalo (darbinis tirpalas ruošiamas 10 ml kolchicino ištirpus 50 ml fiziologinio tirpalo).

8. Po 72 val. kultivavimo buteliukų turinys perpilamas į centrifūginius mėgintuvėlius ir centrifuguojama 1000 aps./min. greičiu 10 minučių.

9. Vandens siurbliu nutraukiamas skaidrus centrifugatas ir paliekama apie 1 ml nuosėdų.

10. Ant gerai suplaktų nuosėdų uţpilama 8 ml 380 C temperatūros hipotoninio tirpalo (hipotoninis tirpalas ruošiamas: 250 ml distiliuoto vandens ir 1,387g KCl). Gerai sumaišoma ir hipotonizuojama termostate 15 min.

11. Atliekama priešfiksacija. Pipete įpilama 1 ml šalto fiksaţo (fiksaţui imama 3 dalys metanolio ir 1 dalis ledinės acto rūgšties), gerai išmaišoma ir centrifuguojama 1000 aps./min. greičiu 10 min.

12. Rusvas, skaidrus centrifugatas vandens siurbliu nusiurbiamas paliekant apie 1 ml nuosėdų. 13. Ant gerai suplaktų nuosėdų lėtai uţpilama (6–7 ml) šalto fiksaţo, gerai sumaišoma.

Fiksuojama 20 min. laikant šaldytuve.

14. Centrifuguojama 1000 aps./min. greičiu 10 min., nusiurbiamas skaidrus centrifugato sluoksnis, nuosėdos gerai suplakamos, uţpilama nauja porcija fiksaţo, sumaišoma.

15. Pakartotinai centrifuguojama, skaidrus centrifugatas nusiurbiamas, uţpilama nauja porcija fiksaţo (5–6 ml). Mėgintuvėliai uţdaromi guminiais kamščiais ir laikomi šaldytuve.

16. Centrifuguojama 10 min. 1000 aps./min. greičiu, nusiurbiamas viršutinis centrifugato sluoksnis, paliekant apie 1 ml sluoksnį, gerai suplakama, uţpilama naujo fiksaţo (6–7 ml), pakartotinai centrifuguojama, nusiurbiamas viršutinis centrifugato sluoksnis, paliekant 1 ml. Gerai sumaišoma ir gaminami preparatai.

17. Chromosomų preparatai gaminami ant švarių, nuriebalintų ir distiliuotu vandeniu perplautų objektyvinių stiklelių. Ląstelių suspencija (4–5 lašai) lašinama ant objektinio stiklelio, palenkto 20–300 kampu iš 60–80 cm aukščio.

18. Preparatai dţiovinami termostate.

19. Daţymas. Chromosomų preparatai daţomi 5 proc. Gimzos daţais Sorenseno fosfatiniame buferyje (pH = 6,7). Sorenseno buferį sudaro dvi dalys (50,8 ml A + 49,2 ml B).

29

A tirpalas: 0,075 N KH2PO4

1000 ml – 9,078 g B tirpalas: 0,075 N Na2HPO4

1000 ml – 9,464 g

Chromosomų preparatai daţomi 10 min. Po to preparatai plaunami po tekančiu vandeniu, tepinėliai išdţiovinami ir paţymimi. Nudaţyti preparatai gali būti laikomi neribotą laiką. Chromosomų preparatai tiriami optiniu mikroskopu imersinio objektyvo pagalba. Šis metodas tinkamas kiekybinei chromosomų analizei ir kai kurioms chromosomų bei chromatidţių aberacijoms nustatyti (Kučinskienė, Miceikienė, 2002).

2.3.2. Medţiagos ir įranga

Chromosominei analizei atlikti buvo naudojama tokia įranga: mikroskopas, termostatas, centrifūga, šaldytuvas, švirkštai (1, 5, 10, 20 ml), mikrodozatoriai, spiritinė lemputė, plastikiniai 15 ml (kultūros auginimo) mėgintuvėliai, centrifūginiai 10 ml konusiniai mėgintuvėliai, objektiniai stikleliai, stovelis mėgintuvėliams, menzūrėlės. Ląstelių kultūros auginimui būtini sterilūs indai.

Medţiagos: mitybinė terpė (RPMI 1640), gliutaminas, mitogenas – fitohemagliutinas, antikoaguliantas – heparinas, antibiotikas – gentomicinas, kalio chlorido tirpalas, ledinė acto rūgštis, etanolis, metanolis, daţai – Gimza, imersinis aliejus mikroskopavimui.

2.3.3. Chromosomų preparatų vertinimas

Vizualinė chromosomų analizė atliekama optiniu mikroskopu. Maţuoju padidinimu (objektyvas 10x, 20x, okuliaras 10x, 12x) surandama metafazė, o didţiuoju – imersiniu objektyvu (90x,100x) metafazė yra vertinama.

Chromosomų preparatams keliami šie reikalavimai: metafazė turi būti apvalios ar šiek tiek ovalios formos. Chromosomos visame metafazės plote turi būti vienodai išsibarstę, jos neturi dengti viena kitą ar persikryţiuoti. Chromosomos turi būti optimaliai spiralizuotos, chromatidės turi būti atskirai viena nuo kitos ir centromeros srityje neatsiskyrę.

Chromosomų preparatų analizės duomenys registruojami specialioje lentelėje. Lentelę sudaro 100 kvadratėlių. Kiekvienas jų atitinka vieną metafazę. Tiriant preparatą į kiekvieną kvadratėlį įrašomi visi duomenys apie tiriamą metafazę, t. y. chromosomų skaičių ir chromosomų pakitimus. Kiekvienam individui tiriama iki 100 metafazių.

30

Kiekviename rinkinyje buvo stebimi ir registruojami šie kokybiniai ir kiekybiniai chromosomų pokyčiai:

1. Poliploidija (3n, 4n..) 2. Aneuploidija (2n ± 1, 2..)

3. Chromosominės aberacijos: chromatidţių trūkiai (delecija D1), chromosomų trūkiai

(delecija D2), fragmentai (F), ţiedinės chromosomos (Ţ), dicentrikai (Dic), spragos (S1, S2).

2.4. Statistinė duomenų analizė

Iš lentelės duomenų apskaičiuojami šie rodikliai:

1. Bendras proc. ląstelių su pakitimais – suskaičiuota kiek ląstelių turi aberacijas, ir apskaičiuotas proc. Jei vienoje ląstelėje yra du ar daugiau pakitimų, ji suskaičiuota kaip viena ląstelė.

2. Chromatidţių trūkiai (delecija D1) proc. – suskaičiuota kiek yra D1 (t.y. vienos chromatidės

trūkių) ir apskaičiuotas proc. Jei vienoje ląstelėje yra du ar daugiau pakitimų, ji suskaičiuota kaip viena ląstelė.

3. Chromosomų trūkiai (delecija D2) proc. – suskaičiuota kiek yra D2 (t.y. dviejų chromatidţių

trūkių) ir apskaičiuotas proc. Jei vienoje ląstelėje yra du ar daugiau pakitimų, ji suskaičiuota kaip viena ląstelė.

4. Fragmentų (F) proc. – suskaičiuota kiek yra fragmentų ir apskaičiuotas proc. Jei vienoje ląstelėje yra du ar daugiau pakitimų, ji suskaičiuota kaip viena ląstelė.

5. Ţiedinių chromosomų (Ţ) ir dicentrikų (Dic) proc. – suskaičiuotas ţiedinių chromosomų ir dicentrikų kiekis ląstelėse ir apskaičiuotas proc.

6. Spragų (S1 ir S2) proc. – suskaičiuota kiek yra spragų (S1 – kai spraga matoma vienoje

chromatidėje ir S2 – kai spraga matoma abiejose chromatidėse, skaičiuojant S kaip dvi

spragas) ir apskaičiuotas proc.

7. Aberacijų skaičius tenkantis vienai ląstelei – suskaičiuota kiek yra iš viso rasta aberacijų pas tiriamą individą. Gautas bendras skaičius dalintas iš analizuotų ląstelių skaičiaus.

Statistinė duomenų analizė atlikta skaičiuokle – Microsoft Office Ecxel 2010. Skirtumų tarp grupių vidutinių aberacijų daţnių statistinis reikšmingumas įvertintas Stjudento kriterijumi. Duomenys laikomi patikimais pagal Stjudentą, kai p < 0,05 (Juozaitienė, Kerzienė, 2001). Aberacijų paplitimo daţniai skirtingose grupėse palyginti naudojant 2

31

3. TYRIMŲ REZULTATAI

Chromosominių aberacijų poveikis galvijų reprodukcinėms savybėms tirtas nustatant kiekvienos karvės ląstelių su aberacijomis skaičių bei spektrą.

Iš viso ištirta 1959 ląstelės: 856 ląstelės 12 karvių su reprodukcijos sutrikimais ir 1103 ląstelės 14 karvių be reprodukcijos sutrikimų. Karvių, turinčių reprodukcijos sutrikimų, grupėje ląstelių su pakitimais pasitaiko 3,3 karto daţniau (p<0,001) nei kontrolinėje grupėje, atitinkamai 10,4 proc. ir 3,2 proc. (3 lentelė).

3 lentelė. Chromosominių aberacijų kiekis ląstelėse

Karvių grupė

Ištirta Nustatytas ląstelių su chromosominėmis aberacijomis kiekis Vidutinis ląstelių su pakitimais skaičius vienam tirtam gyvuliui karvių, sk. ląstelių sk. karvių, proc. Bendras ląstelių sk. su pakitimais, proc. Su reprodukcijos sutrikimais 12 856 100 10,4 7,4 Be reprodukcijos sutrikimų (kontrolinė gr.) 14 1103 100 3,2 2,5

Diagramoje (7 pav.) matyti, kad net 100 proc. tirtų karvių, turinčių reprodukcijos sutrikimų, nustatyta spragos vienoje chromatidėje (S1), taip pat nemaţas procentas karvių turėjo chromatidţių trūkius (D1), t. y. 91,7 proc. Tačiau daugiau chromosomų skaičiaus pakitimų aptikta kontrolinėje grupėje: poliploidijų (P) nustatyta 64,3 proc. tirtų karvių, taip pat 7,1 proc. karvių nustatyta trisomija (Tr). Nors šios karvės neturėjo reprodukcijos sutrikimų, bet jos pasiţymėjo kitais sutrikimais (maţu produktyvumu).

32 71,4 28,6 21,4 21,4 64,3 0,0 7,1 0,0 7,1 100,0 91,7 83,3 75,0 50,0 25,0 16,7 16,7 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 S1 D1 S2 F P Dic D2 Ţ Tr % Be reprodukcijos sutrikimų Su reprodukcijos sutrikimais

7 pav. Karvių, kurioms nustatytos chromosominės aberacijos, kiekis (proc.)

Vidutinis chromosominių aberacijų daţnis tarp tirtų karvių įvairavo: karvių su nustatytais reprodukcijos sutrikimais grupėje nuo 0 iki 0,0401 (p<0,001) ir nuo 0 iki 0,0111 karvių, kurios neturėjo reprodukcijos sutrikimų, grupėje. Vidutinis chromosominių aberacijų daţnis vienai ląstelei – 0,1041 aber./ląst. (p<0,001) karvių su reprodukcijos sutrikimais grupėje ir 0,0321 aber./ląst. (p<0,001) karvių be reprodukcijos sutrikimų grupėje (4 lentelė).

4 lentelė. Chromosominių aberacijų daţniai tirtose karvių grupėse

Aberacijos

Su reprodukcijos sutrikimais Be reprodukcijos sutrikimų

p Vidutinis aberacijų daţnis Pasikliautinis 95% intervalas Vidutinis aberacijų daţnis Pasikliautinis 95% intervalas S1 0,0401 0,0315 – 0,0487 0,0094 0,0061 – 0,0128 <0,001 S2 0,0179 0,0103 – 0,0255 0,0027 0 – 0,0056 <0,01 D1 0,0174 0,0125 – 0,0223 0,0034 0,0005 – 0,0064 <0,001 D2 0,0024 0 – 0,0055 0,0008 0 – 0,0022 F 0,0125 0,0072 – 0,0178 0,0038 0 – 0,0081 <0,05 P 0,0083 0,003 – 0,0135 0,0111 0,0058 – 0,0163 Tr 0 0,0009 0 – 0,0027 Ţ 0,0024 0 – 0,0056 0 Dic 0,0031 0 –0,0064 0 Aber./ląst. 0,1041 0,0936 – 0,1146 0,0321 0,024 – 0,0403 <0,001

33

Atlikus abiejų karvių grupių chromosominių aberacijų daţnių palyginimą (8 pav.) nustatyta, kad chromosomų struktūros pakitimų daţniai ţenkliai didesni karvių, turinčių reprodukcijos sutrikimų, grupėje, lyginant su karvių be reprodukcijos sutrikimų grupe. O iš diagramos matyti, kad chromosomų skaičiaus pakitimų daţnis neţymiai didesnis kontrolinėje, t. y. karvių be reprodukcijos sutrikimų grupėje.

8 pav. Chromosominių aberacijų daţnių palyginimas tirtose karvių grupėse

Ištyrus karvių, kurioms nustatyti reprodukciniai sutrikimai, chromosominių aberacijų spektrą (9 pav.) nustatyta ir chromosomų struktūros, ir skaičiaus pakitimų. Didţiąją dalį chromosomų struktūros pakitimų, t. y. 38,2 proc., sudarė spragos vienoje chromatidėje (S1), 16,9 proc. – spragos abiejose chromatidėse (S2) ir 16,9 proc. – chromatidţių trūkiai (D1). Maţiausią dalį chromosomų struktūros aberacijų, t. y. 2,2 proc., sudarė ţiedinės chromosomos (Ţ) ir 2,2 proc. – chromosomų trūkiai (D2). Aptikta chromosomų skaičiaus pakitimų – poliploidijų (P), jų rasta 7,9 proc. Esant dideliam poliploidijų skaičiui, nėštumas paprastai baigiasi abortu (Košarčić et al., 2006). Net 55,1 proc. chromosominių paţaidų sudarė spragos (S1; S2), t. y. nepilnas chromosomos struktūros paţeidimas, kuris gali būti reparuojamas arba išsivystyti į chromosomines ar chromatidines delecijas (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

34 S1 38,2% S2 16,9% D1 16,9% D2 2,2% F 12,4% P 7,9% Tr 0% Ţ 2,2% Dic 3,4%

9 pav. Karvių su reprodukciniais sutrikimais chromosominių aberacijų spektras

Ištyrus kontrolinės karvių grupės chromosominių aberacijų spektrą (10 pav.) taip pat nustatyta ir chromosomų struktūros, ir skaičiaus pakitimų. Didţiąją dalį chromosomų struktūros pakitimų, t. y. 28,6 proc., sudarė spragos vienoje chromatidėje (S1), 11,4 proc. – fragmentai (F) ir 11,4 proc. – chromatidţių trūkiai (D1). Maţiausią dalį chromosomų struktūros aberacijų, t. y. 2,9 proc., sudarė chromosomų trūkiai (D2). Šioje grupėje iš chromosominių aberacijų daugiausia aptikta chromosomų skaičiaus pakitimų, rasta net – 34,3 proc. poliploidijų (P), taip pat aptikta viena trisomija (Tr), kuri sudarė 2,9 proc. chromosomų skaičiaus pakitimų. Ţiedinių chromosomų (Ţ) ir dicentrikų (Dic) šioje grupėje nenustatyta.

35 S1 28,6% S2 8,6% D1 11,4% D2 2,9% F 11,4% P 34,3% Tr 2,9% Ţ 0% Dic 0%

36

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Galvijų, kaip ir kitų ţemės ūkio gyvulių, populiaciniai citogenetiniai tyrimai nėra labai daţnai atliekami, nes yra imlūs laikui ir lėšoms. Chromosominių aberacijų daţnis nerodo gyvulio sveikatingumo būklės tiesiogiai, bet nusako organizmo genomo nestabilumą. Literatūros duomenimis, Prancūzijoje ištirta apie 5000 galvijų, Šveicarijoje ir Vengrijoje – po 3000 gyvulių. Jungtinėse Valstijose 2000 galvijų ištyrė N. S. Fechheimer ir F. E. Eldrige, Australijoje 1100 galvijų tyrė C. R. Halnan. Afrikoje ištirta tik 500 galvijų, Pietų Amerikoje – maţdaug tiek pat, Lietuvoje – apie 2000 (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

Mūsų atliktų tyrimų rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų gautais rezultatais, tiriant bei nustatant chromosominių aberacijų įtaką galvijų reprodukcinėms savybėms. Egipte, Zagazig Universitete, mėginant nustatyti chromosominių anomalijų vaidmenį maţinant Holšteino fryzų veislės karvių nevaisingumą, buvo atlikti citogenetiniai reprodukcinių sutrikimų turinčių galvijų tyrimai. Buvo ištirta 31 Holšteino fryzų veislės karvė, iš kurių dvylika buvo kliniškai lytiškai normalios, nenėščios karvės – kontrolinė grupė, aštuonios pakartotinai apvaisintos karvės, šešios nerujojančios karvės ir penkios karvės, kurioms daţnai iškrinta vagina. Siekiant aptikti chromosomines anomalijas, buvo ištirta maţdaug 50 metafazių. Rezultatai parodė, kad bendras chromosomų skaičiaus pakitimų procentas pakartotinio apvaisinimo grupėje siekė 19,95 proc., o chromosomų struktūros pakitimų skaičius buvo didţiausias ir siekė 62 proc. Nerujojančių karvių chromosomų skaičiaus pakitimų procentas siekė 21 proc. Šie rezultatai buvo daug aukštesni, nei kontrolinės grupės. Karvių, kurioms daţnai iškrinta vagina, chromosomų skaičiaus pakitimų procentas buvo 13,6 proc., o kitų chromosomų struktūros pakitimų skaičius siekė 40 proc. (El– Bayomi et al., 2011). Nustatyta, kad karvės, kurioms itin daţnos chromosomų aberacijos, yra nevaisingos (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007). Galima daryti išvadą, kad galvijų citogenetiniai tyrimai turėtų būti naudojami kaip diagnostinė priemonė, siekiant nustatyti maţo vaisingumo prieţastis.

Voivodinoje, Veterinarijos institute Novi Sade, buvo atlikti 10 metų trukę tyrimai. Kiaulių, galvijų ir arklių ūkiuose buvo atlikta citogenetinė gyvulininkystės atestacija. Buvo atrasti ne tik tokie chromosomų nukrypimai, kaip gausi poliploidija ir aneuploidija, bet ir struktūrinės translokacijos, delecijos, insercijos, inversijos, ţiedinės chromosomos ir kitos mutacijos. Atlikus analizę paaiškėjo, kad iš 535 dauginimosi sutrikimais pasiţyminčių gyvūnų, 48 gyvulių kariotipuose nustatyta chromosomų struktūros ir skaičiaus pakitimų. 150 gyvulių buvo pastebėta silpna mitozinė veikla. Daugiausia pakitimų buvo atrasta kiaulių (35 gyvuliai) ir galvijų ūkiuose (13 gyvulių), o ţirgynuose atrasti kitokie kariotipų pakitimai ir reprodukciniai nukrypimai. Taip pat

37

nustatyti chromosomų skaičiaus pakitimai, tokio tipo poliploidijos: 4n=76 XY, XY.XY.XY ir 5n=95 XY, taip pat tokio tipo aneuploidijos: 2n C 38 XY, XX ir 2n > 60 XX . Buvo nustatyta, kad poliploidija pasiţymintys gyvuliai (9 proc.) – daţnai persileisdavo (Košarčić et al., 2006). Mūsų tyrimo metu taip pat aptiktas nemaţas procentas poliploidijų, t. y. jomis pasiţymėjo 7,9 proc. karvių, turinčių reprodukcijos sutrikimų, ir 34,3 proc. karvių be reprodukcijos sutrikimų.

1996–2000 m. buvo atlikti chromosomų skaičiaus ir struktūros pakitimų citogenetiniai tyrimai penkiuose ūkiuose ir dviejuose veisimo centruose Serbijoje. Buvo ištirtas 371 veisiamas gyvulys (215 patinų ir 156 patelės), iš kurių 267 buvo Holšteino fryzų veislės (193 patinai ir 74 patelės), 62 Simentalio veislės (17 patinų ir 45 patelės) ir 42 Pilkosios stepių veislės (5 patinai ir 37 patelės). Remiantis tarptautiniais naminių gyvulių kariotipizavimo standartais, buvo taikoma limfocitų kultivavimo ir kariotipo analizė. Tyrimo tikslas buvo patikrinti veisiamų gyvulių genetinius duomenis chromosominiame lygmenyje. Buvo atrasti tokie kariotipų pokyčiai: 6 Holšteino fryzų veislės gyvuliai turėjo chimeras 2n=60, XX/XY, o Simentalių veislėje aptikta viena Robertsono translokacija. Tokie chromosomų struktūros pakitimai, kaip delecijos ir ţiedinės chromosomos, buvo atrasti dviejuose Holšteino fryzų veislės ir Simentalio veislės gyvuliuose bombarduotoje Serbijos zonoje. Pilkosios stepių veislės gyvuliai turėjo normalų kariotipą. Iš viso 9 gyvuliams buvo nustatyti pakitimai (2,42 proc.), o 362 kariotipai buvo normalūs, iš viso 97,57 proc. (Košarčić et al., 2005). Pagal gautus rezultatus galima daryti išvadą, kad citogeninę veisiamų gyvulių atestaciją reikėtų tęsti, siekiant apsaugoti genofondą galvijų ūkiuose.

2004 m. Lietuvoje buvo atlikti citogenetiniai tyrimai 77 veisliniams buliukams. Chromosominių aberacijų daţnis tarp tirtų individų įvairavo nuo 0 iki 0,09 aber./ląst., spragų – nuo 2 iki 17 proc. Vidutinis tirtos imties aberacijų daţnis buvo 0,04 aber./ląst., atskirų individų ląstelių su pakitimais įvairavo nuo 3 iki 28 proc., vidutinis imtyje – 13,04 proc. Ištyrus chromosominių aberacijų spektrą, chromatidţių trūkiai sudarė 16 proc., fragmentai – 8 proc., o chromosomų trūkiai ir ţiedinės chromosomos – po 2 proc. Net 72 proc. visų rastų paţaidų sudarė spragos (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007). Mūsų tyrimo rezultatai taip pat rodo didelį spragų kiekį, net 55.1 proc. karvių ląstelėse su reprodukciniais pakitimais. Didelis spragų kiekis byloja apie genomo nestabilumą, koreliuoja su blogomis galvijų reprodukcinėmis savybėmis. Daug ląstelių su spragomis (21 proc.) rasta karvių servis periodu. Terminalinių chromatidţių delecijų, apimančių daugelį chromosomų, daţnai aptinkama nuolat abortus patiriančių karvių ląstelėse (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007).

Robertsono translokacijos (rob), į kurias įeina 1 ir 29 chromosomos, yra daţniausiai pasitaikanti chromosominė anomalija tarp mėsinių galvijų veislių. Yra įrodytas neigiamas šios anomalijos poveikis galvijų vaisingumui (Qu et al., 2012). Romunijoje buvo atlikti 25 metus trukę

38

galvijų citogenetiniai tyrimai, kurių metu buvo ištirti 2364 buliai nuo 1975 metų iki 2000 metų. Tyrimų metu identifikuotos šios translokacijos: 12 galvijų 1/29 chromosomos Robertsono

translokacija, taip pat nustatyta po vieną translokacijos atvejį tarp 3/27, 5/23, 11/21, 14/20 chromosomos (Nicolae, Popescu, 2001). Taip pat 1/29 chromosomos translokacija galvijų tarpe buvo aptikta Norvegijoje, Jungtinėse Valstijose, Italijoje, Vokietijoje, Prancūzijoje, Didţiojoje Britanijoje ir kitose šalyse. Lietuvoje dviems buliams taip pat buvo aptikta 1/29 chromosomos Robertsono translokacija (Krasnopiorova, Miceikienė, 2007). Mūsų tyrimų metu Robertsono

39

IŠVADOS

1. Citogenetinė galvijų chromosomų analizė – labai svarbi priemonė, padedanti išsiaiškinti galvijų reprodukcinių savybių pablogėjimo prieţastis.

2. Karvių, kurioms nustatyti reprodukcijos sutrikimai, grupėje chromosominių aberacijų daţnis įvairavo nuo 0 iki 0,0401 (p<0,001). Vidutinis pakitusių ląstelių kiekis – 10,4 proc.

3. Karvių, kurioms nenustatyti reprodukcijos sutrikimai, grupėje chromosominių aberacijų daţnis įvairavo nuo 0 iki 0,0111. Vidutinis pakitusių ląstelių kiekis – 3,2 proc.

4. Karvių, kurioms nustatyti reprodukcijos sutrikimai, grupėje didţiąją dalį chromosominių aberacijų, t. y. 38,2 proc., sudarė spragos vienoje chromatidėje, 16,9 proc. – spragos abiejose chromatidėse, 16,9 proc. – chromatidţių trūkiai, 12,4 proc. – fragmentai, 3,4 proc. – dicentrikai, 2,2 proc. – ţiedinės chromosomos ir 2,2 proc. – chromosomų trūkiai. Poliploidinės ląstelės sudarė 7,9 proc.

5. Karvių be reprodukcijos sutrikimų grupėje nustatyta: 28,6 proc. spragų vienoje chromatidėje, 11,4 proc. – chromatidţių trūkių, 11,4 proc. – fragmentų, 8,6 proc. – spragų abiejose chromatidėse ir 2,9 proc. – chromosomų trūkių. Taip pat nustatyta 34,3 proc. poliploidinių ląstelių ir 2,9 proc. – trisomijų.

6. Karvių, turinčių reprodukcijos sutrikimų, grupėje ląstelių su pakitimais rasta 3,3 kartais daţniau (p<0,001) nei kontrolinėje grupėje.

7. Tyrimų metu nustatytas aukštas chromosominių anomalijų daţnis rodo ryšį su reprodukcinių savybių pablogėjimu, t. y. sumaţėjusiu veršelių skaičiumi vadoje bei padidėjusiu negyvų gimusių veršelių skaičiumi.