FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
AGNĖ BIRŠTONAITĖ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ PASISKIRSTYMO SKIRTINGOSE LIEPŲ
ŢIEDŲ (FLOS TILIAE) ARBATŲ FRAKCIJOSE TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Raimondas Raudonis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof., dr. Vitalis Briedis 2016 m. birţelio
FENOLINIŲ JUNGINIŲ PASISKIRSTYMO SKIRTINGOSE LIEPŲ ŢIEDŲ (FLOS TILIAE) ARBATŲ FRAKCIJOSE TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Raimondas Raudonis
2016 m .
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė
2016 m. Agnė Birštonaitė
2016 m.
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10
1.1. Tilia L. genties augalų morfologiniai poţymiai ir paplitimas. ... 10
1.2 Liepų ţiedų vaistinė augalinė ţaliava. ... 12
1.3 Liepų ţiedų fitocheminė sudėtis. ... 13
1.3.1 Fenolinės rūgštys ... 13
1.3.2 Kvercetino dariniai. ... 14
1.3.3 Kempferolio dariniai. ... 16
1.3.4 Proantocianidinai. ... 17
1.3.5 Kiti junginiai ... 18
1.4 Liepų ţiedų panaudojimas medicinoje. ... 19
1.5 Fenolinių junginių ekstrakcija iš vaistinės augalinės ţaliavos. ... 22
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1 Tyrimo objektas. ... 24
2.2 Naudoti reagentai, medţiagos ir aparatūra. ... 24
2.3 Statistinis duomenų įvertinimas ... 24
2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 25
2.5 Tyrimo metodai. ... 25
2.5.1 Liepų ţiedų arbatų frakcinės sudėties įvertinimas. ... 25
2.5.2 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas. ... 25
2.5.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas. ... 26
2.5.4 Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas. ... 28
2.5.5 Liepų ţiedų fenolinių junginių tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu. ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.2 Fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekio nustatymas skirtingose liepų ţiedų
frakcijose. ... 31
3.3 Kokybinis ir kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas skirtingose liepų ţiedų frakcijose. ... 35
3.4 Skirtingų gamintojų arbatų frakcinės sudėties ir fenolinių junginių pasiskirstymo palyginimas. 42 4. IŠVADOS ... 45
5.PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 47
SANTRAUKA
A. Birštonaitės baigiamasis magistro darbas/ mokslinis vadovas lekt. dr. R. Raudonis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Fenolinių junginių pasiskirstymo skirtingose liepų ţiedų (Flos Tiliae) arbatų
frakcijose tyrimas.
Raktiniai ţodţiai: Tilia cordata, Tilia platyphyllos, Tilia vulgaris, Folin-Ciocalteu,
fenoliniai, flavonoidai, proantocianidinai, dalelių dydis.
Tyrimo tikslas: Nustatyti liepų ţiedų arbatų skirtingų frakcijų ekstrakcijos vandeniu
kinetiką ir kokybinę bei kiekybinę fenolinių junginių sudėtį.
Tyrimo objektas ir metodika: Objektas - vaistinėje įsigytos liepų ţiedų arbatos. Bendras
fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. Bendras flavonoidų ir proantocianidinų kiekis nustatytas spektrofotometriniais metodais. Individualūs fenoliniai junginiai identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Rezultatai: Didţiausiose frakcijose (>2,5 mm, 2 – 2,5 mm, 1,6 – 2 mm) nustatyti
didţiausi kiekiai fenolinių junginių ir proantocianidinų, tačiau maţesni flavonoidų kiekiai. Šioms frakcijoms optimalus fenolinių junginių ir proantocianidinų ekstrakcijos laikas yra 45 minutės, o maţesnių dalelių frakcijoms proantocianidinų išsiskyrimo laikas trumpesnis. Daugiausiai flavonoidų nustatyta frakcijose, kurių dalelių dydis maţesnis nei 0,9 mm. Optimalus flavonoidų ekstrakcijos laikas tarp frakcijų labai įvairus, svyruoja nuo 5 iki 45 minučių priklausomai nuo frakcijos.
Frakcijose, kurių dalelių dydis didesnis nei 2,5 mm nustatyta daugiau kvercitrino, hiperozido, kempferolio, astragalino bei katechino ir epikatechino. 1,6 – 2 mm ir 2 - 2,5 mm dydţio frakcijose nustatyta daugiau katechino ir epikatechino bei trans - tilirozido nei kitose frakcijose, tačiau jose maţesni galo r. ir flavonoidų (kvercitrino, hiperozido, astragalino, kempferolio) kiekiai. Maţiausios dalelės (<0,9 mm ) išsiskiria didţiausiais flavonoidų kiekiais. Nustatyta, kad vykdant ekstrakciją 100 °C vandeniu 45 minutes pasiekiama geresnė fenolinių junginių išeiga nei 70 proc. etanoliu (15 min), išskyrus kempferolį, kuris iš visų frakcijų etanoliu ekstrahavosi geriau nei vandeniu (p<0,05).
SUMMARY
A. Birštonaitė master thesis/ supervisor lect. dr. R. Raudonis/ Lithuanian University of Health sciences Faculty of Pharmacy Department of Pharmacognosy. – Kaunas.
Title: Assay of phenolic compounds distribution in different fractions of linden flower (Flos Tiliae)
teas.
Keywords: Tilia cordata, Tilia platyphyllos, Tilia vulgaris, Folin-Ciocalteu, phenolic compounds,
flavonoids, proanthocyanidins, particle size.
The aim: To determine qualitative and quantitative composition of phenolic compounds and
extraction with water kinetics in different fractions of linden flowers.
Object and methods: Object – linden flower teas bought in pharmacy. Total amount of phenolic
compounds were determined by spectrofotometric Folin-Ciocalteu method. Total flavonoids and proanthocyanidins amount were determined by spectrofotometric methods. Individual phenolic compounds were identified and quantified by high-performance liquid chromatography (HPLC).
Results: The largest amounts of phenolic compounds and proanthocyanidins but lower amount of
flavonoids were determined in the largest fractions (>2,5 mm, 2 – 2,5 mm, 1,6 – 2 mm). Optimal extraction time of phenolic compounds and proanthocyanidins for this fractions is 45 minutes, but for the fractions of smaller particle size extraction time is shorter. The biggest amount of flavonoids were determined in fractions, which particle size is smaller than 0.9 mm. Optimal extraction time of flavonoids very different among the fractions, it ranges between 5 and 45 minutes.
In fractions, which particle size is bigger than 2.5 mm, determined better amounts of quercitrin, hyperoside, kaempferol, astragalin, catechin and epicatechin. In particles, which size is between 1.6 mm and 2 mm and so between 2 mm and 2.5 mm, determined more catechin, epicatechin and trans- tiliroside than other particles, but also lower amounts of gallic acid and almost all flavonoids: quercitrin, hyperoside, astragalin, kaempferol. The smallest particles (<0.9 mm) stands for the biggest amounts of flavonoids (qercitrin, hyperoside, all derivatives of kaempferol). All investigated compounds of almost all fractions better extract with water than 70 percent ethanol, except kaempferol, which from all fractions better extract with ethanol that water (<0.05).
SANTRUMPOS
CNS – centrinė nervų sistema EE – epikatechino ekvivalentai
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija DMAC – 4 - dimetilaminocinamaldehidas GAE – galo rūgšties ekvivalentai
KE – kvercetino ekvivalentai
MSK – minimali slopinanti koncentracija RE – rutino ekvivalentai
ĮVADAS
Per pastaruosius 100 metų, chemiškai susintetintų vaistų vystymas ir masinė produkcija sukėlė revoliuciją sveikatos prieţiūroje daugelyje pasaulio šalių [1]. Nepaisant to, per paskutinius du dešimtmečius industrinėse valstybėse vėl padidėjo visuomenės susidomėjimas fitoterapija [2]. Pasauliniu mastu apytiksliai apskaičiuota, kad 80 procentų populiacijos naudoja vaistaţoles, besivystančiose šalyse šis skaičius gali siekti 95 procentus [3]. Pagal Nacionalinio papildomos ir alternatyvios medicinos centro apklausą fitoterapijos naudojimas buvo daţniausiai naudojama alternatyviosios medicinos rūšis (18,9 proc.) [4]. Apklausa JAV parodė, kad iš 21 923 suaugusiųjų 12,8 proc. naudoja bent vieną vaistaţolę [5].
Šiuo metu, vaistaţolės yra naudojamos lėtinių ir ūmių būklių papildomam gydymui bei palengvinti įvairiems negalavimams, tokiems kaip kardiovaskulinės ligos, prostatos problemos, depresija, uţdegimai, imuninės sistemos stiprinimas. Vaistaţolės gali būti apdorojamos ir vartojamos daugeliu skirtingų būdų ir formų (arbatos, sirupai, eteriniai aliejai, tepalai, balzamai, kapsulės, tabletės). Labiausiai išsivysčiusiose šalyse kartu su įprastiniais vaistais daţniausiai parduodami eteriniai aliejai, vaistaţolių ekstraktai ir vaistaţolių arbatos [2,6].
Liepų ţiedai jau maţiausiai 30 metų yra naudojami medicininiams tikslams [7]. Išdţiovinti liepų ţiedai nuo seno vartojami į vidų kaip arbata esant karščiavimui, gripui, virusinėms infekcijoms [8] , kaip papildoma priemonė viršutinių kvėpavimo takų kataro ir peršalimo, kurį lydi sausas, dirginantis kosulys, gydymui, prakaitavimui skatinti ar alergijos atvejais. Liepų ţiedų vaistinė augalinė ţaliava pasiţymi sedatyviniu poveikiu, todėl tradiciškai vartojama palengvinti nesunkiems psichinės įtampos simptomams [7]. Vieni iš junginių, lemiančių liepų ţiedų vaistinės augalinės ţaliavos farmakologinį poveikį, yra fenoliniai junginiai, flavonoidai: kvercetino ir kempferolio dariniai.
Kadangi uţ biologinį poveikį yra atsakingi fenoliniai junginiai, yra svarbu nustatyti kokie veiksniai ir kaip įtakoja jų ekstrakciją. Ţinant optimalų dalelių dydį, temperatūrą ir ekstrakcijos laiką, būtų galima reikšmingai pagerinti bioaktyvių junginių išeigą iš vaistinės augalinės ţaliavos ir taip sustiprinti pageidaujamą farmakologinį poveikį. Atlikti tyrimai parodė, kad ant vaistaţolių arbatų pakuočių gamintojų nurodytas paruošimo būdas daţnai yra neefektyvus ir neuţtikrina pilnos vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakcijos [9].
Darbo naujumas. Pirmą kartą komercinė liepų ţiedų arbata išskirstyta į frakcijas pagal
dalelių dydį ir įvertinta dalelių dydţio, ekstrakcijos trukmės ir temperatūros įtaka bendrai fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų išeigai atliekant ekstrakciją vandeniu. Iki šiol Lietuvoje nebuvo tyrimų įvertinančių kokybinę ir kiekybinę fenolinių junginių sudėtį komercinėje liepų ţiedų arbatoje. Nustatytos rekomendacijos liepų ţiedų arbatos gamybai, uţtikrinančios efektyvesnę veikliųjų medţiagų išeigą.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas - nustatyti liepų ţiedų arbatų skirtingų frakcijų ekstrakcijos vandeniu kinetiką
ir kokybinę bei kiekybinę fenolinių junginių sudėtį.
Darbo uţdaviniai:
1. Taikant paviršiaus atsako metodą nustatyti optimalius ekstrakcijos vandeniu proceso parametrus, įtakojančius fenolinių junginių išeigą iš liepų ţiedų arbatos.
2. Nustatyti liepų ţiedų arbatų skirtingų frakcijų ekstrakcijos vandeniu kinetiką bei suminį fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekį.
3. Nustatyti individualius fenolinius junginius ir jų kiekius skirtingose liepų ţiedų frakcijose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
4. Palyginti skirtingų gamintojų liepų ţiedų arbatų frakcinę ir kiekybinę fenolinių junginių sudėtis.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Tilia L. genties augalų morfologiniai poţymiai ir paplitimas.
Tiliaceae šeimai priklauso medţiai, krūmai ir kai kurios ţolės. Šeima turi apie 450 rūšių iš 40-50 skirtingų genčių [10,11]. Šiai šeima priklauso Tilia L. gentis, kuri turi apie 35-50 rūšių. Genčiai priklauso lapuočiai aukšti medţiai, daugiausiai natūraliai augantys šiaurės pusrutulyje [12].
Šioje literatūros apţvalgoje, daugiausiai dėmesio skiriama maţalapei liepai (Tilia cordata Miller), plačialapei liepai (Tilia platyphyllos Scop.) ir jų hibridui. Tilia cordata Mill. ir Tilia platyphyllos Ehrh. suformuoja natūralų hibridą, kai šios rūšys egzistuoja netoli viena kitos; šis hibridas yra ţinomas kaip paprastoji liepa Tilia x europaea L. arba Tilia x vulgaris Hayne [13,14]. Lietuvoje savaime auga ir dominuoja miesto ţeldynuose (70–90 %) maţalapė liepa – T. cordata Mill. Ţeldynuose rečiau auginama introdukuota liepa: europinė (T. x europea L.) (25 %) ir didţialapė (T. platyphyllos Scop.) (iki 15 %), rečiausiai grakščioji (I. x euchlora K. Koch) ir kitos rūšys bei veislės [15–17].
Tilia L. genties medţiai yra lapuoti, aukšti ar vidutinio aukščio, gali pasiekti 40 metrų aukštį ir 100-300 cm skersmenį [13,18–21]. T. cordata ir T. platyphyllos į aukštį auga lėtai, o jaunesniame amţiuje T. platyphyllos Scop. auga greičiau nei T. cordata Mill. [18]. Medţiai miškingose vietovėse uţauga aukštesni nei atvirose vietose, o medţių šakojimasis atvirose vietose prasideda arčiau ţemės nei miškuose [21]. Šie medţiai gali gyvuoti iki 500 metų [20], o kai kuriuose šaltiniuose minima, kad net iki 1000 metų [18]. Medţiai turi aiškų kamieną, kuris sudaro iki dviejų trečdalių viso aukščio [20]. Kamieno forma skerspjūvyje yra labai įvairi. Kai kurių liepų tipų jis apskritas, netgi senų medţių, o tuo tarpu kitų jis netaisyklingas su plačiomis briaunomis [13]. Liepos medţio ţievė yra lygi su įvairaus gylio ir formos plyšeliais, pilka ar šviesiai pilka [13,19].
Vainiko forma varijuoja tarp siauro ir labai plataus. Antros eilės šakos varijuoja nuo vertikalių iki beveik horizontalių. T. cordata Mill. ir T. platyphyllos Scop. šakelės daugiausia yra rudai rausvos, kai kurios ţalsvos ar pilkos, daţniausiai lygios, be plaukelių. Einamųjų metų ūglių spalvos intensyvumas svyruoja nuo raudonos iki rusvai geltonos, nuo smaragdinės ţalios iki rusvai pilkos. Šios spalvos labai priklauso nuo ūglio pozicijos ir tipo. Spalva yra ryškesnė ūgliuose, kurie yra saulėje [13,22]. Liepa yra lapus metantis medis, kurio lapai išdėstyti ant šakų dvejomis eilėmis. T. platyphyllos Scop. turi didesnius lapus nei T. cordata Mill. Maţalapės liepos lapalakščio ilgis svyruoja tarp 65,1 ir 89,8 mm, plačialapės liepos tarp 67,2- 149,7 mm. Visų lapų forma daugiau ar maţiau apvali. Paprastai jie prie pagrindo yra širdies formos ir su dantytu kraštu [13,19,22].
Liepos ţydi nuo birţelio galo iki liepos pradţios. Liepų ţydėjimo laikas skiriasi tarp rūšių. Pirmiausiai praţįsta T. platyphyllos Scop., po jos T. x vulgaris Hayne ir vėliausiai T. cordata
Mill. Liepos pradeda ţydėti nuo 30 metų amţiaus [13,20]. Ţiedai auga ant einamųjų metų ūglių,
paţastyse, plonose, ilgose viršūnėse. Ţiedai penkialapiai, geltonai balti. Vienas iš labiausiai būdingų šios genties bruoţų yra ilga, membraninė paţiedė, kelių centimetrų ilgio, prie kurios jungiasi pagrindinio ţiedyno stiebas. Ţiedai yra labai panašūs visoje gentyje ir pagal juos negalima nustatyti rūšies [19,23]. Vaisiai yra panašūs į riešutus, kuriuose būna iki trijų sėklų, lipniu, banguotu, briaunuotu ar lygiu apvalkalu. Apvalkalo storumas varijuoja tarp rūšių [13]. Rūšies identifikavimui yra naudojama lapų, ţiedų ir vaisių morfologija (1 lentelė) [13,20,24].
1 lentelė. Tilia L. genties augalų identifikavimui naudojami morfologiniai požymiai.
Bruoţas T. platyphyllos Scop. T. x vulgaris Hayne T. cordata Mill. Ūglių plaukuotumas Daug plaukelių Keletas plaukelių Nėra plaukelių Matomi pumpurų
ţvyneliai
2 3 3
Lapo forma Išgaubta Plokščia Nuo plokščio iki
įgaubto Lapo viršutinis paviršius Nuo lygaus iki
plaukuoto
Nuo lygaus iki plaukuoto
Lygus
Lapo apatinis paviršius Ţalias, padengtas paprastais, balkšvais plaukeliais
Nuo pilkšvo iki gelsvai ţalio, padengtas kintančiu kiekiu paprastų, dvigubų ir menturinių plaukelių.
Melsvai ţalias, lygus, išskyrus rusvos spalvos kuokštelius pagrindinių venų kampuose.
Trečios eilės venos apatiniame paviršiuje
Gerai matomos Daugiau ar maţiau matomos
Nematomos
Ţiedynai Kabantys Nuo kabančių iki
šiek tiek išsikišusių
Išsikišę ir daţnai atsikišę virš paţiedės
Ţiedų skaičius 2-5 3-10 4-10
Subrendusių vaisių tvirtumas
Sumedėję, sunku sutraiškyti tarp pirštų
Gerokai lengviau sutraiškomi tarp pirštų
Lengvai sutraiškomi tarp pirštų
Tiliaceae šeimai priklausantys medţiai, natūraliai auga daugiausiai šiaurės pusrutulyje, Azijoje, Europoje ir rytinėje Šiaurės Amerikoje. Tik keletas iš šių rūšių natūraliai auga Europoje:
kaukazinė liepa Tilia dasystyla (Stev.), sidabrinė liepa Tilia tomentosa (Moench.), paprastoji liepa (Tilia x vulgaris Heyne), maţalapė liepa T. cordata (Mill.) ir plačialapė liepa T. platyphyllos (Scop.) [14,25]. Paskutinės dvi rūšys dengia beveik visą Europos kontinentą išskyrus didelę dalį Skandinavijos. T. tomentosa, auga tik balkanų šalyse, ypatingai Jugoslavijoje, Bulgarijoe, Rumunijoe ir Graikijoje [14].
T. cordata Mill. ekologinė sritis Europoje yra labai plati. Ši rūšis gausiausiai auga nuo šiaurės rytų Prancūzijos iki Vokietijos vidurio ir nuo Lenkijos iki Rusijos vidurio ir šiaurės Ukrainos. Ji paplitusi Šveicarijos lygumose ir Austrijos, Čekijos ir vakarų Vengrijos ţemumose [20,26].
T. platyphyllos Scop. paplitimo plotas yra gana ribotas (2 pav.). Šie medţiai daţniausiai randami vietose, kuriose auga ir T.cordata Mill. [20]. T. platyphyllos auga centrinėje ir pietinėje Europoje, taip pat randama Danijoje ir pietų Skandinavijoje. Rečiau pasitaiko šiaurės Europoje [24,27].
Liepos auga turtingame, mezotrofiniame ar mezoeutrofiniame dirvoţemyje, vėsiame ar vidutiniškai drėgname. Tokie dirvoţemiai turi neutralią ar šarmingą reakciją. Liepos renkasi vietas, kuriose yra didesnis kalcio kiekis [28]. Medţiai mėgsta geras, molingas vietas, tačiau gali būti
randami ir smėlėtuose, nederlinguose dirvoţemiuose, nes yra atsparūs sausrai [20]. Maţalapė liepa toleruoja didesnes dirvoţemio drėgmės variacijas nei plačialapė liepa. Ji gali augti dirvoţemyje, kuriame yra maţai gruntinio vandens [25].
1.2 Liepų ţiedų vaistinė augalinė ţaliava.
Liepų ţiedų vaistinę augalinę ţaliavą sudaro sveiki, sudţiūvę T. cordata Miller, T. Platyphyllos Scop, T. vulgaris Heyne ţiedynai ar jų mišiniai. Liepų ţiedai turi silpną aromatinį kvapą ir silpną saldų bei gleivingą skonį [29]. Visos minėtos rūšys pasirenkamos dėl atitinkamos taninų ir gleivių sudėties ţieduose, kadangi jų kiekis lemia arbatų skonį. T. cordata Mill. ir T. platyphyllos Scop. turi santykinai daugiau taninų nei gleivių. Iš arbatų, kurios turi didesnį (2% ar daugiau) taninų kiekį ir maţą gleivių kiekį, paruošiamos skanesnės arbatos [19].
Ţiedynai yra gelsvai ţali. Pagrindinė ţiedynų ašis laiko lieţuvio formos paţiedę, plėvinę, gelsvai ţalią, beveik lygią, su centrine gysla, kuri yra prisijungusi maţdaug iki pusės jos ilgio su ţiedynkočiu. Ţiedynas daţniausiai susideda iš 2-7 ţiedų, retkarčiais iki 16. Taurėlapiai yra lengvai atskirti nuo apyţiedţio; jie yra iki 6 mm ilgio, jų viršutinis paviršius daţniausiai lygus, o apatinis paviršius ir jo kraštai stipriai plaukuoti. Penki lieţuvio formos ploni vainiklapiai yra gelsvai balti, iki 8 mm ilgio. Juose aiškiai matomas gyslotumas ir jų kraštai kartais yra padengti su izoliuotomis trichomomis. Daugelis kuokelių yra laisvi ir daţniausiai sudaro penkias grupes. Senesnė mezginė turi
piestelę su penkiaskilte purka. Pagal šiuos Europos Farmakopėjoje aprašytus morfologinius poţymius identifikuojama liepų ţiedų vaistinė augalinė ţaliava [29].
1.3 Liepų ţiedų fitocheminė sudėtis.
1.3.1 Fenolinės rūgštys
Sudėtis. Fenolinės rūgštys yra polifenoliniai junginiai, kurie gali būti suskirstyti į dvi pagrindines
grupes: hidroksibenzoinės rūgšties ir hidroksicinamo rūgšties darinius [30]. Liepų ţieduose nustatyti šie benzoinės rūgšties dariniai: p-hidroksibenzoinė rūgštis, protokatecho ir galo rūgštis; ir cinaminės rūgšties dariniai: p-kumaro rūgšties esteris, ferulo rūgšties esteris ir heksozidas, 5-hidroksiferulo rūgšties heksozidas, sinapo rūgšties esteris ir heksozidas, kavos rūgštis, chlorogeno rūgštis, vanilino rūgštis [7,31–33]. Lenkijoje surinktuose T. cordata ţieduose nustatyta: 0,19 ± 0,22 mg/g kavos rūgšties, 4,95 ± 2,21 mg/g chlorogeno rūgšties, 3,05 ± 1,46 mg/g p-kumaro rūgšties ir 6,81 ± 2,9 mg/g vanilino rūgšties [34].
Struktūros ypatumai. Benzoinės rūgštys turi septynis anglies atomus (C6-C1) ir yra paprasčiausios fenolinės rūgštys randamos gamtoje. Hidroksibenzoines rūgštis charakterizuoja karboksilo grupės pakaitas fenolyje. [35,36]. Monofenoliniai junginiai yra maţiau efektyvūs nei polifenoliniai junginiai. Protokatecho rūgštis turi dvi fenolines grupes orto padėtyje ir yra efektyvesnė nei monofenolis p-hidroksibenzoinė rūgštis. Galo rūgštis, turinti tris hidroksilo grupes, yra aktyvesnė nei protokatecho rūgštis [37]. Šios rūgštys daţniausiai randamos susijungę vandenyje tirpiais ryšiais su cukrais ar organinėmis rūgštimis ir yra tipiniai kompleksinių struktūrų, tokių kaip ligninai ir hidrolizuojami taninai, komponentai. Galo rūgštis yra pagrindinis galotaninų vienetas, o galo rūgštis su heksahidroksidifenolio liekanomis yra elagitaninų (hidrolizuojamų taninų) vienetai [38].
Cinaminės rūgšys turi devynis anglies atomus (C6-C3), tačiau randamos augaluose daţniausiai turi septynis anglies atomus. Šias medţiagas charakterizuoja molekulė, kurioje yra benzeno ţiedas, karboksilo grupė ir viena ar daugiau hidroksilo ir/ar metoksilo grupių [35,36]. Nustatyta, kad šių rūgščių oksidacinis efektyvumas padidėja prijungus vieną ar du metoksilo pakaitus į orto padėtį šalia hidroksilo grupės: sinapo rūgštis yra efektyvesnė nei ferulo rūgštis, o ši efektyvesnė nei p-kumaro rūgštis. Cinaminės rūgštys turi CH = CH-COOH grupę, kuri lemia didesnį šių rūgščių poveikį nei COOH grupė esanti benzoinių rūgščių struktūroje. Sinapo, kavos, ferulo ir p-kumaro rūgštys yra labiau aktyvios nei protokatecho ir p-hidroksibenzoinė rūgštys [37]. Cinaminės rūgštys daţniausiai yra randamos augaluose kaip kvino, šikimo ir tartarinės rūgšties esteriai. Pavyzdţiui, chlorogeninė rūgštis
yra kofeino rūgšties ir kvino rūgšties esteris. [35,36]. Lyginant kavos ir chlorogeno rūgšties antioksidantinį aktyvumą nustatyta, kad esterifikacija su kvino rūgštimi sumaţina šių rūgščių aktyvumą [37].
Poveikis. Fenolinės rūgštys pasiţymi gebėjimu surišti laisvuosius radikalus, kuris susijęs su
fenolinių rūgščių struktūroje esančiu hidroksilo grupių, prisijungusių prie aromatinio ţiedo, skaičiumi [39]. Nustatytas nuo laiko ir dozės priklausantis antiproliferacinis ir citotoksinis fenolinių rūgščių (protokatecho, kavos, galo rūgšties) poveikis prieš ţmogaus adenokarcinomos ir leukemijos ląstelių linijas. Atlikti tyrimai rodo, kad šis poveikis stipresnis esant didesniam OH grupių skaičiui [40].
Atlikti mikrobiologiniai tyrimai parodė, kad kai kurios fenolinės rūgštys gali pasiţymėti antimikrobiniu aktyvumu. p-hidroksibenzoinė rūgštis parodė aktyvumą prieš visas gram teigiamas lactobacillus grupės bakterijas: L. paraplantarum, L. fermentum, L. brevis ir L. coryniformis bei prieš patogeną S. aureus, nustatyta šios rūgšties MSK (minimali slopinanti koncentracija) prieš Escherichia coli bakteriją - 2,5 mmol/l, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae bakterijas- 5 mmol/l, Fusarium culmorum – 20 mmol/l. Protokatecho rūgštis parodė aktyvumą prieš L. paraplantarum ir S. aureus bakterijas; nustatyta MSK prieš E. coli – 10 mmol/l, B. cereus, L. monocytogenes – 5 mmol/l, F. Culmorum, S. cerevisiae - >20 mmol/l [41]. Ferulo ir kavos rūgšties antimikrobinis aktyvumas labai panašus, jų MSK prieš E. coli, B. cereus, L. monocytogenes, F. Culmorum yra 10 mmol/l [41,42].
1.3.2 Kvercetino dariniai.
Sudėtis. Pagrindiniai kvercetino dariniai nustatyti liepų ţiedų vaistinėje augalinėje ţaliavoje yra:
kvercetin-3-O-rutinozidas (rutinas), kvercetin-3-galaktozidas (hiperozidas) (randamas tik paţiedlapiuose) [43], kvercetin-3-O-gliukozidas (izokvercitrinas), kvercetin-3-O-ramnozidas (kvercitrinas) [32,43], 3,7-O-diramnozidas [32,33,43,44], 3-pentozidas,, kvercetin-3-O-gliukozido-7-O-ramnozidas [32,33].
Struktūros ypatumai. Kvercetino molekulė turi penkias hidroksilo grupes, kurių buvimas lemia
junginio biologinį aktyvumą ir galimybę sudaryti daug darinių. Struktūrinis kvercetino darinių pagrindas pavaizduotas 1 paveiksle. Kvercetino anglikonas turi 279 skirtingas glikozidines kombinacijas [45]. Pagrindinės kvercetino darinių grupės yra glikozidai ir eteriai, rečiau pasitaiko sulfatai ir prenilinti pakaitai [46].
1 pav. Struktūrinis kvercetino darinių pagrindas
Glikozidai. Kvercetin-O-glikozidai yra kvercetino dariniai su bent vienu O-glikozidiniu ryšiu. Daţniausia kvercetino glikozilinimo vieta yra hidroksilo grupė prie C-3 atomo. Kvercetino-3-O-glikozidai daţniausiai būna monosacharidai su gliukoze, galaktoze, ramnoze ar ksiloze [46]. Liepų ţieduose nustatyti kvercetino dariniai su gliukoze, galaktoze, ramnoze [32,33,43]. Augaluose gana daţnai nustatomas ir kvercetinas susijungęs su disacharidais, pvz. rutinas – kvercetin-3-O-ramnogliukozidas, kuris nustatytas ir liepų ţieduose. Kita glikozilinimo vieta daţnai pasitaikanti tarp kvercetino darinių yra hidroksilo grupė prie C-7 atomo. Kitas kvercetino darinių tipas yra C-glikozidai, tačiau jie retai nustatomi gamtoje. Daţniausiai C-glikozilinimas vyksta prie C-6 atomo.
Eteriai. Eteriniai ryšiai gali susidaryti tarp kiekvienos kvercetino molekulės hidroksilo grupės ir alkoholo, daţniausiai metanolio [46]. Šių kvercetino darinių liepų ţieduose nėra.
Poveikis. Rutinas ir kvercitrinas sudaro didţiąją dalį flavonoidų frakcijos (55,46%) liepų
ţieduose [43]. Paprasti dariniai, tokie kaip kvercetino monoglikozidai: gliukozidai ir 3-O-ramnozidai bei diglikozidas – rutinas, yra reikalingi organizmui pasisavinant ir panaudojant vitaminą C. Dėl savo antioksidantinio aktyvumo, rutinas apsaugo kepenų ląsteles ir slopina hemoglobino oksidaciją. Rutinas taip pat pasiţymi antiuţdegiminėmis savybėmis [46,47]. Manoma, kad rutino antiuţdegiminis aktyvumas pasireiškia dėl jo gebėjimo moduliuoti ASC (su apoptoze susijusio baltymo) komplekso išskyrimą, kuris medijuoja uţdegimą [48]. Naujausi tyrimai parodė jo plačias galimybes pritaikyti įvairių lėtinių ligų gydymui, tokių kaip vėţys, diabetas, hipertenzija ir hipercholesterolemija [49]. Rutinas pasiţymėjo reikšmingu antidiabetiniu aktyvumu, kadangi slopina uţdegiminius citokinus ir pagerina antioksidantų ir plazmos lipidų profilį. Jis gali būti naudingas kaip diabeto moduliatorius kartu su standartiniais antidiabetiniais vaistais [50]. Kitas tyrimas parodė, kad rutinas padidina nuo insulino priklausančio receptoriaus kinazės aktyvumą, taip skatindamas insulino impulso plitimą ir padidindamas gliukozės pernešėjų translokaciją bei gliukozės įsisavinimą [51]. Rutinas gali turėti terapinį potencialą neurodegerneracinių ligų, susijusių su oksidaciniu stresu, gydyme [52]. Jis gali būti efektyvus maţinant neurotoksiškumą, o jo neuroprotekcinis poveikis
pasireiškia per antioksidantinį aktyvumą [53]. Dėl šio poveikio ir antiuţdegiminio bei β-amiloidinius oligomerus maţinančio poveikio rutinas gali būti pritaikytas Alzheimerio ligos gydymui [54].
Atliktas antimikrobinis tyrimas prieš E.coli bakteriją parodė, kad kvercetinas pasiţymi stipresniu antibakteriniu aktyvumu nei liuteolinas, nors šiuos junginius skiria tik kvercetino molekulės trečioje padėtyje esanti hidroksilo grupė. Tai parodo, kad hidroksilo grupė C ţiedo 3 padėtyje yra svarbi flavonoidų antibakteriniam aktyvumui [55].
1.3.3 Kempferolio dariniai.
Sudėtis. Pagrindiniai kempferolio dariniai nustatyti liepų ţiedų vaistinėje augalinėje
ţaliavoje: cis ir trans (6-p-kumaroil)-gliukozidas (tilirozidas), kempferol-3-O-gliukozidas (astragalinas) [30–32,34,35], kempferol-3-pentosilheksozidas , kempferol-3-O-ramnozidas [30,31], kempferol-3-O-gliukozido-7-O-ramnozidas, kempferol-3,7-O-diramnozidas [30,32,35]. Astragalinas sudaro didelę dalį flavonoidų frakcijos (26,47 proc.) [32].
Flavonoidų kokybinė ir kiekybinė sudėtis paţiedlapiuose ir ţieduose skiriasi. Toker ir kt. atliktame tyrime buvo įvertinta T. platyphyllos Scop. ţiedų ir paţiedlapių flavonoidų kompozicija. Kvercetin-3,7-diramnozido plačialapės liepos ţieduose nustatyta 5,05 proc., kvercitrino 10,8 proc., izokvercitrino ir rutino 52,7 proc., astragalino 30,35 proc. flavonoidų sudėtyje. Flavonoidų kompozicija paţiedlapiuose skyrėsi, nustatyta: 26,25 proc. kvercetin-3,7-diramnozido, 12,98 proc. izokvercitrino ir rutino, 40,19 proc. kvercitrino, 3,59 proc. astragalino bei 4,53 proc. kempferol-3,7-diramnozdio, kurio ţieduose nebuvo aptikta [43,56]. Flavonoidų sudėtis gali skirtis ne tik priklausomai nuo liepos rūšies, bet ir nuo regiono, kuriame liepa auga. Meksikoje atliktame tyrime buvo nustatyti flavonoidai Tilia americana var. mexicana liepų ţieduose ir paţiedlapiuose, surinktuose skirtinguose regionuose. Kvercetin-3-pentozilheksozidas nustatytas Guerrero, Veracruz regionų ţaliavose, tačiau nerastas Hidalgo regiono ţaliavoje. Kvercetin-3-pentozilheksozidas aptiktas tik Guerrero regione surinktuose ţieduose. Kvercetin-3-pentozidas nustatytas tik Veracruz ir Guerrero regiuonuose surinktuose paţiedlapiuose [56].
Struktūros ypatumai. Kempferolio molekulė panaši į kvercetino, tačiau turi ne penkias,
o keturias hidroksilo grupes. Kempferolio anglikonas turi 347 skirtingas glikozidines kombinacijas. Kempferolio dariniai gali būti ramnozidai, diramnozidai, gliukozidai, galaktozidai, eteriai [45].
Poveikis. Korėjoje buvo atliktas tyrimas vertinantis kempferolio ir jo ramnozidų
biologinį aktyvumą. Nustatyta, kad kempferolis pasiţymi depigmentuojančiu ir antiuţdegiminiu poveikiu, tačiau kempferitrinas (kempferol-3,7-O-diramnozidas) nepasiţymi nei vienu iš šių poveikių. Išanalizavus struktūros ir aktyvumo ryšį nustatyta, kad kempferolio 3-hidroksilo grupė yra svarbus farmakoforas ir, kad papildomos ramnozės liekanos biologinį aktyvumą veikia neigiamai [57]. Kitas
atliktas tyrimas parodė, kad kempferolis pasiţymi stipresniu antibakteriniu aktyvumu prieš E.coli nei kvercetinas (minimali slopinamoji koncentracija 25 µg/ml ir 35 µg/ml atitinkamai). Kempferolis, patekęs į bakterijos lipidinio dvisluoksnio hidrofobinę dalį, sumaţina membranos pralaidumą ir taip sukelia antibakterinį poveikį [55]. Atliekant antioksidantinio aktyvumo tyrimą nustatyta, kad kempferolis pasiţymi stipriu antioksidantiniu poveikiu, tačiau maţesniu nei kvercetinas (apsauginis faktorius: 2,49 ir 11,5 atitinkamai) [58].
1.3.4 Proantocianidinai.
Sudėtis. Liepų ţieduose nustatyta daug katechinų ir proantocianidinų: katechinas ir
epikatechinas, katechino dimeras, procianidinas B2, procianidinas B4, prodelfinidinas C, procianidino trimeras I, procianidino tetrameras I, procianidino trimeras II, procianidino pentametras I, procianidino trimeras III (epikatechino trimeras), procianidino tetrameras (epikatechino tetrameras), procianidino pentametras II [32,33,59,60]
Struktūros ypatumai. Proantocianidinai priklauso taninų grupei ir dar yra vadinami
kondensuotais taninais. Taninai yra stipriai hidroksilintos struktūros ir gali suformuoti netirpius kompleksus su angliavandeniais ir baltymais. Proantocianidinai yra didelės molekulės polimerai sudaryti iš monomerinių vienetų flavan-3-olių ((+)katechino ir (-)katechino). Bendroje flavonoidų struktūroje jiems būdinga oksidacinė kondensacija tarp heterociklo C-4 atomo ir anglies C-6 ar C-8 atomų A ir B ţieduose. Proantocianidinai B1- B4, charakterizuojami C4-C8 ryšiu, yra daţniausiai sutinkami dimerai [61].
Poveikis. Taninai yra didelės struktūros ir turi keletą fenolinių hidroksilo grupių molekulės
paviršiuje, kurios lemia biologinį taninų aktyvumą. Laisvųjų radikalų surišimas yra vienas iš svarbių taninų poveikių. Šis poveikis atsiranda dėl taninų molekulių vandenilio radikalų atidavimo, kad susiformuotų stabilūs laisvieji radikalai.
Taninų gebėjimas susirišti su baltymais ir kitomis didelėmis molekulėmis lemia įvairų taninų biologinį poveikį. Toks surišantis poveikis svarbus lemiant taninų viduriavimą maţinantį bei antihemoraginį poveikį. Didelėmis koncentracijomis taninai daţnai inhibuoja fermentų veiklą, tačiau maţomis koncentracijomis - stimuliuoja, todėl poveikis priklauso nuo fermentų, taninų struktūros ir koncentracijos [62].
Kepenų steatozė (suriebėjimas) charakterizuojama kaip lipidų disreguliacija ir riebalų kaupimasis kepenyse, kuris sukelia oksidacinį stresą. Tyrimas buvo atliktas su ţiurkėmis, kurioms naudojant anglies tetrachloridą dirbtinai buvo sukelta kepenų steatozė, kuri atsiranda ţmonėms vartojantiems alkoholį. Ţiurkės buvo iš anksto gydomos proantocianidinais gautais iš vynuogių sėklų 7
dienas prieš anglies tetrachlorido vartojimą. Gydymas proantocianidinais papildomai buvo tęsiamas 2 savaites, po kurių buvo vertinami kepenų ir serumo paţeidimo mediatoriai, oksidacinis stresas ir histologiniai duomenys. Lyginant ţiurkes, kurios gavo tik anglies tetrachlorido ir tas, kurios papildomai gavo proantocianidinų, nustatyta, kad gydymas proantocianidinais efektyviai sumaţina lipidų kaupimąsi, kepenų bei DNR paţeidimą ir atstato antioksidantinių fermentų kiekį. Tolesni tyrimai parodė, kad proantocianidinai taip pat inhibuoja CYP2E1 fermentą kepenyse, o tai uţkerta kelią laisvųjų radikalų gamybai sukeltai anglies tetrachlorido [63].
Nustatyta, kad procianidinas B2 inhibuoja uţdegimą endotelio ląstelėse. Kinijoje atliktas tyrimas parodė, kad ţmogaus bambos venos endotelio ląstelėse procianidinas B2 reikšmingai slopina uţdegimo aktyvaciją ir inhibuoja kaspazės-1 aktyvaciją bei interleukinų-1 β sekreciją kaip atsaką lipopolisachariduose. Procianidinas B2 sumaţino ir lipopolisacharidų sukeltą laisvųjų deguonies rūšių gamybą ir aktyvinančio baltymo- 1 (AP-1) tranksripcinį aktyvumą. Šie rezultatai parodo, kad procianidinas B2 inhbuoja uţdegimo aktyvaciją endotelio ląstelėse slopindamas AP-1 ir pasiţymi kraujagysles apsaugančiu poveikiu [64].
Doksorobicinas yra efektyvus priešvėţinis vaistas, kurio naudojimą riboja toksinis poveikis širdţiai. Atliktas tyrimas parodė, kad išankstinis gydymas katechinu ir procianidinu B4 apsaugo kardiomiocitus prieš doksorubicino sukeltą toksiškumą, nes sumaţina reaktyvių deguonies rūšių gamybą bei apoptozinių ląstelių skaičių, sustabdo DNR fragmentaciją, reguliuoja apoptozę lemiančių baltymų gamybą ir inhibuoja apoptozę signalizuojančius kelius [65].
1.3.5 Kiti junginiai
Aminorūgštys: Alaninas, cisteinas, izoleucinas, leucinas, fenilalaninas, serinas [7,31].
Angliavandeniai: gleivių polisacharidai (3 proc.). Nustatytos penkios frakcijos: arabinozė,
galaktozė, ramnozė su maţesniu kiekiu gliukozės, manozė ir ksilozė; galakturoninė ir gliukuroninė rūgštys; lipai [7,31,66,67]. Gleivės, esančios daţniausiai randamos paţiedlapiuose susideda daugiausiai iš galaktomananų ir maţos dalies eterinių aliejų (0,02- 0,1 proc.) turinčių farnezolio, farnezilio acetato, geraniolio ir eugenolio, kurie suteikia vaistams charakteringą silpną kvapą, kuris yra stipresnis, kai ţiedai švieţi [68].
Eteriniai aliejai: alkanai (dekanas, heksadekanas, oktadekanas, dodekanas, tetradekanas,
heptadekanas), fenoliniai alkoholiai (2-fenoletanolis, cis-karveolis, p-cimen-8-olis) ir esteriai, terpenai: (monoterpenai: citralis, citronelalis, citronelolis, eugenolis ir jo esteris, limonenas, nerolis, α-pinenas, terpineolis; seskviterpenai: farnezolis) [7,69–72]. Eterinių aliejų komponentų kokybinė ir kiekybinė sudėtis skiriasi tarp liepų rūšių bei tarp ţiedų ir paţiedlapių [70,73]. T. cordata Mill. ţieduose nustatyta 0,8 proc. eterinio aliejaus, kuriame nustatyti 23 komponentai. Didţiausią procentinę eterinio aliejaus
dalį sudarė: trikozanas (31,3 proc.), heneikozanas (16,0 proc.), hotrienolis (11,5 proc.), pentakozanas (6,4 proc.), germakrenas D (5,4 proc.), heksahidrofarnezilacetonas (5,3 proc.) [69]. Nustatytas eterinio aliejaus kiekis T. platyphyllos Scop. ţieduose yra 0,03 proc., kuriame didţiausią procentinę dalį sudarė: heksadekanoinė rūgštis (25,0 proc.), trikozanas (19,2 proc.), pentakozanas (10,2 proc.), nonakozanas (7,1 proc.). Pagrindiniai komponentai eteriniame aliejuje, gautame iš T. cordata Mill. paţiedlapių, buvo: trikozanas (32,2 proc.), heinekozanas (21,5 proc.), nonakozanas (14,1 proc.), pentakozanas (7,8 proc.) iš T. platyphyllos Scop. paţiedlapių: heksadekanoinė rūgštis (27,8 proc.), kaur-16-enas (25,8 proc.), trikozanas (7,9 proc.). Buvo nustatytas reikšmingas T.cordata Mill. eterinių aliejų aktyvumas prieš Gram teigiamas bakterijas [70,73]
Liepose aptinkami saponinai, tokoferolis (fitosterolis) [7].
1.4 Liepų ţiedų panaudojimas medicinoje.
Liepų ţiedai jau maţiausiai 30 metų yra naudojami medicininiams tikslams [7]. Išdţiovinti liepų ţiedai nuo seno vartojami į vidų kaip arbata esant karščiavimui, gripui, virusinėms infekcijoms [8] , kaip papildoma priemonė viršutinių kvėpavimo takų kataro ir peršalimo, kurį lydi sausas, dirginantis kosulys, gydymui, prakaitavimui skatinti ar alergijos atvejais. Liepų ţiedų vaistinė augalinė ţaliava pasiţymi sedatyviniu poveikiu, todėl tradiciškai vartojama palengvinti nesunkiems psichinės įtampos simptomams [7], taip pat migrenos, isterijos, padidėjusio arterinio spaudimo, susijusio su ateroskleroze ir nervine įtampa, gydymui. Europos taryba yra įtraukusi liepų ţiedus į natūralių maisto daţiklių sąrašą [31].
Anksiolitinis poveikis. Anksiolitinis Tilia L. genties augalų ţaliavų (ţiedų, lapų) poveikis
priskiriamas kvercetino ir kempferolio dariniams [44]. Aguirre-Hernandez ir kiti atliko tyrimą su pelėmis, kuriame vertino heksano ir metanolinio T. americana var. mexicana Hardin ţiedų ekstraktų anksiolitinį ir sedatyvinį poveikį. Abu ekstraktai reikšmingai prailgino natrio pentobarbitalio hipnotinio veikimo laiką. Po 60 minučių pavartojimo metanolinis ekstraktas veikė stipriau nei heksano ekstraktas. Be to, buvo atlikti testai, kurie parodė reikšmingą nuo dozės priklausantį nerimą maţinantį poveikį, kuris panašus į diazepamo. Manoma, kad šį farmakologinį poveikį lemia liepų ţieduose esantys kempferolio ir kvercetinio dariniai. Šio tyrimo rezultatai parodo, kad T. americana var. mexicana ţiedai pasiţymi centrinę nervų sistemą (CNS) slopinančiu poveikiu ir patvirtina liepų ţiedų kaip anksiolitinių ir sedatyvinių medţiagų vartojimą tradicinėje medicinoje [56,74]. Herrera-Ruiz ir kt. atliktame tyrime su pelėmis taip pat buvo vertinamas T. americana var.mexicana anksiolitinis poveikis. Paţiedlapių metanolinis ekstraktas pasiţymėjo nuo dozės priklausančiu anksiolitiniu aktyvumu vartojant nuo 25mg/kg. Aktyviausioje frakcijoje ESC metodu buvo nustatyti tilirozidas,
kvercitrinas, rutinas, kempferolis ir kvercetinas ir buvo padaryta išvada, kad šie junginiai yra atsakingi uţ T. americana var. mexicana anksiolitinį poveikį [75]. Anksiolitiniu aktyvumu pasiţymi ne tik T. americana var. mexicana organiniai ekstraktai, bet ir vandeniniai, tačiau jų poveikis silpnesnis [76]. Nustatyta, kad T. petiolaris ţiedų etanolinis ekstraktas sukelia CNS slopinantį poveikį dėl sudėtyje esančių flavonoidų: izokvercitrino, kempferol-3-O-gliukozido-7-O-ramnozido, kvercetin-3-O-gliukozido-7-O-ramnozido [77]. Kvercetino ir kempferolio dariniai, kurie lemia anksiolitinį ir sedatyvinį poveikį, nustatyti ir T. cordat Mill. ţieduose [44].
Skausmą malšinantis poveikis. Martinez ir kitų atliktame tyrime buvo vertinamas T. americana
var. mexicana ţiedų skausmą malšinantis poveikis. Vandeniniai liepų ţiedų ekstraktai buvo veiksmingesni nei metanolio ar heksano ir dozuojant 300mg/kg sukėlė skausmą maţinantį poveikį, panašų į tramadolio 17,8mg/kg, kuris vartojamas gydyti artrito sukeltam skausmui. Chromatografinė aktyvių ekstraktų analizė parodė, kad ekstraktuose daug kvercetino darinių (kvercetin-O-pentosilheksozidas, kvercetin-3-O-gliukozido-7-O-ramnozidas, kvercetin-3-O-gliukozidas (izokvercitrinas), kvercetin-O-pentozidas,) ir kempferolio darinių (kempferinas, astragalinas, tilirozidas), manoma, kad jie gali būti atsakingi uţ šį poveikį. Šis tyrimas ne tik patvirtino liepų ţiedų skausmą maţinantį poveikį, bet ir nustatė, kad kvercetino sukeliamas uţdegiminį skausmą maţinantis poveikis susijęs su serotonino 5-HT1A receptoriais [78]. Toker ir kiti nustatė ir Tilia argentea DC skausmą maţinantį ir antiuţdegiminį poveikį vartojant 50mg/kg , kuris nesukelia toksiškumo ar skrandţio paţeidimų. Nustatyti pagrindiniai junginiai atsakingi uţ šį poveikį yra kempferol-3,7-O-diramnozidas ir kvercetin-3,7-O-kempferol-3,7-O-diramnozidas [79].
Riebalų pasisavinimą maţinantis poveikis. Slanc ir kiti atliko tyrimus, kurie parodo liepų ţiedų
potencialą maţinant nutukimą. Kasos lipazė yra fermentas, kuris padeda organizmui absorbuoti trigliceridus, todėl šio fermento inhibavimas sumaţina lipidų absorbciją. In vitro tyrimuose nustatyta, kad T. platyphyllos ţiedų ekstraktai gali inhibuoti kasos lipazės veiklą, todėl gali būti naudingi maţinant nutukimą. Šį poveikį lemia liepų ţiedų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai, kadangi išskirti iš ekstrakto taip parodė inhibicinį aktyvumą [80].
α-gliukozidazės ir α-amilazės fermentus inhibuojantis poveikis. Ranilla ir kiti tyrė tradiciškai
naudojamus augalus, nustatė jų fenolinių junginių profilį, antioksidantinį aktyvumą ir fermentus, kurie svarbūs hiperglikemijai ir hipertenzijai, inhibuojantį poveikį. T. platyphyllos ţiedų ekstraktas (paruoštas iš 2,5 mg ţaliavos) parodė didţiausią (100 proc.) inhibicinį potencialą prieš α-gliukozidazę ir buvo veiksmingas (75 proc.) net maţesne koncentracija (paruoštas iš 0,5 mg ţaliavos). Taip pat nustatytas ir kiaulės kasos α-amilazę blokuojantis poveikis (71 proc. 25 mg ţaliavos). Šis tyrimas parodė, kad T. platyphyllos ţiedai turi potencialą hiperglikemijos ir hipertenzijos prevencijai susijusiai su antro tipo diabetu, kadangi stipriai inhibuoja α-gliukozidazės ir α-amilazės fermentus [81].
Antiepilepsinis poveikis. Cardenas-Rodriguez ir kiti tyrė T. americana var. mexicana ţiedų ir lapų
organinių ir vandeninių ekstraktų antiepilepsinį poveikį. Liepų ţiedų metanoliniai ekstraktai tyrime su pelėmis reikšmingai sumaţino pentilenetetrazolio sukeltų traukulių sunkumą ir sumaţino oksidacinio streso lygį. Buvo nustatyta, kad metanolinis ir vandeninis ekstraktai yra efektyvūs prieš toninius priepuolius, tačiau metanolinis ekstraktas yra aktyvesnis prieš generalizuotus priepuolius ar mioklonijas. Atlikus aktyvių ekstraktų ESC analizę nustatyta, kad antiepilepsinį poveikį sukelia kvercetinas, rutinas ir izokvercitrinas [82].
Antiproliferacinis poveikis. Rodriguez Brizi ir kiti atliko Tilia x viridis (Bayer) Simonk
vandeninio ir etanolinio ekstraktų tyrimus siekdami įvertinti antiproliferacinį poveikį sveikiems ir vėţiniams limfocitams. Liepos ţiedų vandeninis ir etanolinis ekstraktai pasiţymėjo antiproliferaciniu poveikiu prieš abiejų tipų limfocitus, tačiau etanolinis ekstraktas buvo selektyvesnis vėţinių limfocitų inhibicijai. Šis ekstraktų poveikis siejamas su dideliu polifenolinių junginių kiekiu, dideliu superoksido dismutazės ir maţu peroksidazės aktyvumu, nes tai reguliuoja vandenilio peroksido kiekį [83]. Kitas panašus T. viridis ţiedų tyrimas atliktas Marrassini ir kt. taip pat patvirtino antiproliferacinį šios ţaliavos aktyvumą. Buvo nustatytas T. viridis ţiedų etanolinio ekstrakto antiproliferacinio aktyvumo santykis su antioksidantiniu aktyvumu. Laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas yra susijęs su gausia polifenoline sudėtimi [84]. Vandeninis, etanolinis ir dichlormetano T. cordata ţiedų ekstraktai (labiausiai aktyvus dichlormetano ekstraktas) selektyviai veikia vėţines ląsteles, sukelia jų apoptozę. Sveikas T lasteles šie ekstraktai veikė slopindami mitogeno sukeltą proliferaciją nepaveikdami gyvybingumo, parodė slopinantį, bet ne citotoksinį poveikį. Etanolinis ir dichlormetano T. cordata ţiedų ekstraktai selektyvesni vėţinėms ląstelėms nei vandeninis ekstraktas. Manoma, kad šis poveikis nulemiamas kempferolio ir kvercetino darinių [85].
Antibakterinis poveikis. Mokslininkai Fitsiou ir kt. hidrodistiliacijos metodu išskyrė eterinius
aliejus iš T. cordata paţiedlapių ir ţiedų bei tyrė šių aliejų antibakterinį aktyvumą. Įvertinus poveikį prieš Gram teigiamas ir Gram neigiamas bakterijas, buvo nustatyta, kad tik T. cordata paţiedlapių aliejus yra aktyvus prieš Gram teigiamas bakterijas [70].
Poveikis į muskarininius receptorius. Mohammed ir kt. atliko tyrimą, kurio tikslas buvo ištirti T.
cordata etanolinio ekstrakto poveikį ţarnynui. Tyrimas atliktas in vitro, naudojant jūrų kiaulyčių ţarnų lygiųjų raumenų ląsteles disperguotas kolagenazėje. Nustatyta, kad T. cordata ţiedų etanolinis ekstraktas sukelia ţarnyno lygiųjų raumenų kontrakciją veikdamas per muskarininius receptorius [86].
Visi tyrimai patvirtina, kad Tilia L. genties vaistinės augalinės ţaliavos farmakologinį poveikį nulemia gausi fenolinių junginių sudėtis, flavonoidai: kvercetino ir kempferolio dariniai.
1.5 Fenolinių junginių ekstrakcija iš vaistinės augalinės ţaliavos.
Augalinės ţaliavos surinkimas ir paruošimas. Šio etapo metu daţniausiai naudojama technika
yra dţiovinimas. Tinkamai apdorota tiriamoji ţaliava yra smulkinama ar homogenizuojama. Smulkinimo technika priklauso nuo ţaliavos konsistencijos ir kietumo. Smulkinimas naudojant pjaustymą yra paprastas ir nereikalauja sudėtingų įrankių, tačiau tai lemia, kad ţaliava susmulkinama skirtingo dydţio dalelėmis, todėl rekomenduojamas sijojimas [87]. Vienas iš svarbiausių veiksnių, lemiančių ekstrakcijos efektyvumą, yra dalelių dydis. Dalelių dydţio sumaţinimas padidina ekstrakcijos išeigą, kadangi padidina priėjimą prie paviršiaus ploto masės pernešimui. Ekstrakcijos greitis padidėja, nes kai dalelė maţesnė, sumaţėja ekstraktyvo difuzijos atstumas iš kietos medţiagos ir todėl reikia maţiau laiko, kad ekstraktyvas pasiektų paviršių [88]. Daugelis atliktų tyrimų su įvairiomis augalinėmis ţaliavomis patvirtina, kad kuo maţesnis dalelių dydis, tuo didesnė fenolinių junginių išeiga, pvz.: tiriant petraţolių ţaliavą nustatyta, kad didţiausia fenolinių junginių išeiga gaunama, kai dalelių dydis maţesnis nei 0,425mm – 22,9 mg GAE/g, o kai dalelės didesnės nei 2,0 mm – 18,3 mg GAE/g [89]; tyrimas su vaistinės dirvuolės, šalavijo ir kalninio dašio ţaliavomis taip pat parodė, kad kai dalelių dydis maţesnis nei 0,2 mm gauta fenolinių junginių išeiga didesnė nei kai dalelių dydis yra didesnis nei 0,3 mm [90].
Ekstrakcija. Ţaliava yra ekstrahuojama su specifiniu tirpikliu ar tirpiklių mišiniu. Tirpiklio
pasirinkimą įtakoja junginiai, kuriuos siekiama išekstrahuoti, kadangi augalų metabolitai daţnai aptinkami sudėtinguose kompleksiniuose mišiniuose, kuriuose esančios medţiagos turi skirtingą poliškumą ir hidrofobiškumą. Svarbiausios medţiagų grupės augaluose yra: maţo poliškumo (vaškai, terpenoidai), pusiau poliški (lipidai, fenoliniai junginiai, maţo poliškumo alkaloidai) ir labai poliški (poliniai glikozidai, alkaloidai, sacharidai, peptidai, baltymai). Pasirenkamas toks tirpiklis, kuris padidina ekstrahuojamos medţiagos poliškumą [87]. Atliktas tyrimas su ţaliosios arbatos lapais parodo, kaip tirpiklio parinkimas įtakoja fenolinių junginių išeigą. Po 60 minučių ekstrakcijos didţiausia fenolinių junginių išeiga gauta ekstrahuojant 80 proc. acetonu – 12,36 g/100 g, maţiausia - ekstrahuojant 80 proc. etanoliu – 6,85 g/100 g. Ekstrahuojant vandeniu gauta fenolinių junginių išeiga yra 9,21 g/100 g, o 80 proc. metanoliu – 7,09 g/100g [91].
Kitas svarbus veiksnys lemiantis ekstrakcijos kokybę yra temperatūra. Keliant temperatūrą ekstrakcijos išeiga didėja, kadangi pasikeičia tirpiklio savybės, sumaţėja jo klampumas, padidėja fenolinių junginių tirpumas ir difuzijos koeficientas bei padidėja masės pernešimo efektyvumas. Manoma, kad aukštesnė temperatūra suminkština augalo audinius ir susilpnina fenolinių junginių ryšius su baltymais ir polisacharidais. Tačiau aukštesnė temperatūra nei 100 laipsnių gali sukelti kai kurių medţiagų terminį suirimą [87,92]. Temperatūros parinkimas yra individualus kiekvienai ţaliavai
ir priklauso nuo naudojamo ekstrahento. Atliktas tyrimas su vaistinio šalavijo lapais parodė, kad naudojant ekstrahentu etanolį ar acetoną, geresnė fenolinių junginių išeiga pasiekiama atliekant ekstrakciją 60 laipsnių nei 90 laipsnių temperatūroje. Atliekant šios ţaliavos ekstrakciją vandeniu didesnė išeiga pasiekiama esant 90 laipsnių temperatūrai (5949 mg GAE/100 g) nei 60 laipsnių temperatūrai (5170 mg GAE/100 g) [93].
Fenolinių junginių išeigą taip pat įtakoja ekstrakcijos laikas, kurį renkantis reikia atsiţvelgti į naudojamą tirpiklį. Nustatyta, kad ekstrakcijai naudojant organinius tirpiklius išeiga maţėja didinant ekstrakcijos laiką: atlikus vaistinio šalavijo lapų ekstrakciją 30 proc. etanoliu fenolinių junginių kiekis po 30 minučių ekstrakcijos buvo 6278 mg GAE/100 g, o ekstrakciją vykdant 90 minučių sumaţėjo iki 5468 mg GAE/100 g; panašūs rezultatai gauti ir naudojant acetoną. Tačiau ekstrahentu naudojant vandenį po 90 minučių ekstrakcijos fenolinių junginių išeiga buvo didesnė (6168 mg GAE/100 g) nei po 30 minučių (5170 mg GAE/100 g) [93].
Siekiant, kad ekstrakcija būtų kuo našesnė, tikslinga atlikti ekstrakcijos tyrimus, kurių metu eksperimentiniu būdu nustatoma optimali eksrakcijos temperatūra, laikas, dalelių dydis bei tirpiklis.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas.
Tyrimo objektas – 2015 metais Lietuvos vaistinėse įsigytos skirtingų gamintojų liepų ţiedų arbatos (Arbata A, B ir C).
2.2 Naudoti reagentai, medţiagos ir aparatūra.
Naudoti reagentai, tirpikliai ir standartai: Folin & Ciocalteau reagentas , 4-dimetilaminocinamaldehidas, natrio karbonatas, acto rūgštis 99,8-100,5 proc. V/V, vandenilio chlorido rūgštis 37 proc., epikatechinas, galo rūgšties monohidratas, aliuminio chlorido heksahidratas įsigyti iš ,,Sigma Aldrich Chemie GmbH‘‘ (Taufkirchen,Vokietija), etilo alkoholis 96 proc. V/V įsigytas iš AB ,,Vilniaus degtinė‘‘ (Vilnius, Lietuva), heksametilentetraminas iš „Alfa Aesar“ (Massachusetts, JAV).
Aparatūra. Augalinė ţaliava išskirstyta į frakcijas naudojant sietų purtyklę ,,Retsch AS 200‘‘
(Haan, Vokietija). Augalinei ţaliavai sverti naudotos elektroninės svarstyklės ,,Sartorius CP64-0CE) (Goettingen, Vokietija). Ekstrakcijos metu temperatūra buvo palaikoma termostatu ,,IKA RCT basic‘‘ (Staufen, Vokietija). Bendras fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekis nustatytas naudojant spektrofotometrą ,,Spectronic Camspec M550‘‘ (Garforth, Anglija). Individualių junginių kokybinis ir kiekybinis nustatymas atliktas naudojant chromatografą Waters 2695 Alliance su diodų
matricos detektoriumi Waters 2998 (Milford, JAV).
2.3 Statistinis duomenų įvertinimas
Eksperimentinis ekstrakcijos sąlygų optimizavimas atliktas, naudojant Design-Expert v.7 (Mineapolis, JAV) paketą ir taikant paviršiaus atsako centriškai kompozicinį planą. Matematinio modelio patikimumas įvertintas pagal determinacijos koeficientą (R2
). Duomenys apdoroti ir statistiškai įvertinti naudojant programas ,,SPSS 17‘‘ (IBM, JAV) ir ,,MS Excel 2010‘‘ (Microsoft, JAV). Įvertinti ar skirtumai tarp dviejų imčių yra statistiškai reikšmingi naudotas Mann – Whitney U testas. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas jei p<0,05. Visi tyrimai atlikti 3 kartus, rezultatai išreikšti vidurkiu nurodant standartinį nuokrypį.
2.4 Tiriamųjų mėginių paruošimas
Visos arbatos naudojant purtyklę ir farmakopėjinius sietus išskirstytos į 7 frakcijas pagal dalelių dydį: >2,5 mm, 2 – 2,5 mm, 1,6 – 2 mm, 1,4 – 1,6 mm, 1,12 – 1,4 mm, 0,9 – 1,12 mm, <0,9 mm. Kiekvienos frakcijos ekstraktai gaminti santykiu 1:100. Atsveriama 0,01 g ţaliavos ir uţpilama 10 ml 100 °C temperatūros vandeniu arba 70 proc. etanoliu. Vandeniniai ekstraktai gaminami naudojant grįţtamąjį šaldytuvą,, reikalinga temperatūra palaikoma vandens vonelėje. Etanoliniai ekstraktai gaminami ultragarso vonelėje 15 minučių. Gauti ekstraktai filtruojami per vatą.
2.5 Tyrimo metodai.
2.5.1 Liepų ţiedų arbatų frakcinės sudėties įvertinimas.
Kiekvieno gamintojo arbata (5 skirtingos pakuotės) išskirstytos į frakcijas. Kiekvienos frakcijos dydis arbatoje įvertintas naudojantis šia formule:
PD = m1 / m2 x 100
PD- procentinė sudėtis (proc.); m1 – frakcijos masė (g).; m2- visos arbatos masė (g).
2.5.2 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas.
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometriniu metodu, ekstraktą veikiant Folin - Ciocalteu reagentu. Rezultatai įvertinami naudojant galo rūgšties kalibracinę kreivę.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: į kolbutę įpilama 0,4 ml vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto, 2 ml darbinio Folin – Ciocalteu reagento ir 1,6 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Mišinys laikomas 1 valandą ir matuojama spektrofotometru lyginant su palyginamuoju tirpalu esant 765 nm bangos ilgiui. Darbinis Folin – Ciocalteu reagentas ruošiamas 10 kartų praskiedţiant motininį reagentą distiliuotu vandeniu.
Lyginamojo tirpalo paruošimas: į buteliuką įpilama 0,4 ml distiliuoti vandens, 2 ml darbinio Folin – Ciocalteu reagento ir 1,6 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo.
Galo rūgšties kalibracinei kreivei gauti buvo paruošti 5 ţinomų skirtingų koncentracijų galo rūgšties vandeniniai tirpalai (0,01 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,075 mg/ml, 0,1 mg/ml). Jie buvo paruoši tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tik vietoj 0,4 ml vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto buvo pilama 0,4 ml minėtų koncentracijų tirpalų. Kalibracinė galo rūgšties kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 2 paveiksle.
2 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui sausos ţaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
GAE = (mg/ml).
C – galo rūgšties koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V – ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g).
2.5.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas.
Bendras flavonoidų kiekis nustatomas spektrofotometriniu metodu, ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu acto rūgštimi parūgštintoje terpėje. Rezultatai įvertinti naudojant rutino kalibracinę kreivę.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 5 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml paruošto vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo, 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir skiedţiama išgrynintu vandeniu iki ţymės, sumaišoma. Laikoma 30 min. ir matuojama spektrofotometru lyginant su palyginamuoju tirpalu esant 407 nm bangos ilgiui.
Palyginamojo tirpalo paruošimas: į 5 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml paruošto vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo ir skiedţiama išgrynintu vandeniu iki ţymės.
Rutino kalibracinei kreivei gauti buvo paruošti 5 ţinomų skirtingų koncentracijų rutino tirpalai (0,0625 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml) 70 proc. V/V etanolyje. Jie buvo paruoši tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tik vietoj 0,2 ml vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto buvo pilama 0,2 ml minėtų koncentracijų tirpalų. Kalibracinė kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 3 paveiksle.
3 pav. Rutino kalibracinė kreivė
Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) gramui sausos ţaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
RE = (mg/ml).
C – rutino koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V – ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g).
2.5.4 Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas.
Bendras proantocianidinų kiekis nustatytas ekstraktą veikiant 4 – dimetilaminocinamaldehido (DMAC) tirpalu druskos rūgštimi parūgštintoje terpėje. Rezultatai įvertinti naudojant epikatechino kalibracinę kreivę.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 2 ml DMAC reagento pridedama 20 µl tiriamojo vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto. Gautas mišinys laikomas 5 min. ir spektrofotometru matuojama mišinio absorbcija esant 640 nm bangos ilgiui.
Palyginamojo tirpalo paruošimas: į 2 ml DMAC reagento pridedama 20 µl distiliuoto vandens.
DMAC reagento (0,1 proc.) paruošimas: atsveriama 0,05 g DMAC ir ištirpinama 50 ml parūgštinto etanolio. Parūgštintas etanolis gaminamas sumaišant 12,5 ml koncentruotos druskos rūgšties, 12,5 ml distiliuoto vandens ir 75 ml 96 proc. V/V etanolio.
Epikatechino kalibracinei kreivei gauti buvo paruošti 5 ţinomų skirtingų koncentracijų epikatechino tirpalai (0,0125 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml) 96 proc. V/V etanolyje. Jie buvo paruoši tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tik vietoj 20 µl vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto buvo pilama 20 µl minėtų koncentracijų tirpalų. Kalibracinė epikatechino kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 4 paveiksle.
Suminis proantocianidinų kiekis išreiškiamas epikatechino ekvivalentais (EE) gramui sausos ţaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
EE = (mg/ml).
C – epikatechino koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V – ekstrakto tūris (ml); m - atsvertas vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g).
2.5.5 Liepų ţiedų fenolinių junginių tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu.
ESC analizei atlikti naudotas chromatografas su diodų matricos detektoriumi. Chromatografinis atskyrimas atliktas naudojant 5- μm ACE C18 analitinę kolonėlę (250 x 4,6 mm) su prieškolone 5-μm ACE C18 (20 × 4,0 mm) 25 °C temperatūroje. Mobili fazė sudaryta iš 1% (v/v) skruzdţių rūgšties (tirpiklis A) ir acetonitrilo (tirpiklis B). Optimizuota eliucijos programa: 0-20 min, 10-15%; 20-30 min, 15% B; 30-45 min, 15–30%; 45-55 min, 30–40%. Tėkmės greitis – 1ml/min. Injekcijos tūris – 10 μl. Fenolinių junginių tapatybė patvirtina pagal sulaikymo laiką ir spektrinius duomenis (λ = 200–600 nm), lyginant juos su ţinomais standartais. Rutino, hiperozido, astragalino, kvercitrino, kempferolio absorbcija gauta ir nustatyti junginių kiekiai esant 360 nm bangos ilgiui, trans – tilirozido ir cis – tilirozido – esant 320 nm bangos ilgiui, galo, protokatechino rūgštis, katechinas ir epikatechinas – esant 280 nm bangos ilgiui. Kiekybinė analizė buvo atlikta pagal kalibracines kreives injekuojant ţinomos koncentracijos (2,5 – 100 μg/ml) standartinius junginius.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Fenolinių junginių ekstrakcijos iš liepų ţiedų arbatų optimizavimas.
Optimaliems ekstrakcijos proceso parametrams (ekstrakcijos laikui ir temperatūrai), kurie veikia fenolinių junginių išeigą, nustatyti buvo naudojama paviršiaus atsako metodika. Naudojant ,,Design-Expert‘‘ programą sudarytas paviršiaus atsako metodologijos dizainas, apimantis 13 eksperimentų, padedantis nustatyti optimalią ekstrakcijos temperatūrą ir laiką. Buvo įvertinta dviejų kintamųjų: ekstrakcijos laiko (2-45 min.) ir ekstrakcijos temperatūros (25-100°C) įtaka suminei fenolinių junginių išeigai. Pagal modelio nurodytus derinius (laiką ir temperatūrą) buvo gaminami liepų ţiedų ekstraktai, kuriuose Folin-Ciocalteu metodu buvo nustatomas suminis fenolinių junginių kiekis.
Paviršiaus atsako modelis laikomas tinkamu, kai R2
vertė didesnė nei 0,80 [94]. Mūsų tyrime R2 reikšmė šiems atsako kintamiesiems buvo 0,9534, o tai parodo, kad sudarytas modelis patikimas. Ekstrakcijos parametrų poveikis fenolinių junginių išeigai buvo pavaizduotas sudarant paviršiaus atsako modelio grafiką (5 pav.). Trimačiame grafike pavaizduotas 3D paviršiaus plotas, rodantis ekstrakcijos laiko ir temperatūros įtaką fenolinių junginių išeigai. Fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga didėja didėjant ekstrakcijos laikui. Didėjant ekstrakcijos temperatūrai iki 100 °C fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga taip pat didėja. Tyrimas nebuvo atliekamas su aukštesne temperatūra, nes didesnei temperatūrai nei 100 ºC palaikyti reikia specialių sąlygų. Tolimesni tyrimai buvo vykdomi ekstrakciją atliekant 100 ºC temperatūroje. Suminis fenolinių junginių kiekis iš liepų ţiedų varijavo nuo 2,27 iki 63,96 mg GAE/g, priklausomai nuo tiriamų parametrų lygio. Maksimali išeiga 63,96 ±1,29 mg GAE/g (p<0,05) pasiekta esant 100 °C temperatūrai ir 45 minučių ekstrakcijos trukmei.
Bendro fenolinių junginių kiekio priklausomybę nuo ekstrakcijos laiko ir temperatūros parodo antro laipsnio lygtis,
Y= 0,18394 – 0,17585 * X1 + 0,070515 * X2 + 0,013256 * X1 * X2
Y – bendras fenolinių junginių kiekis; X1 – laikas;
5 pav. Trimatis atsako paviršiaus grafikas, vaizduojantis temperatūros ir trukmės įtaką fenolinių junginių išeigai
Tyrimas atliktas su vidutinio dydţio (1,4-1,6 mm) dalelėmis. Įtraukus į matematinį modelį dar vieną kintamajį - dalelių dydį - modelis tapo nepatikimas, dėl galimai skirtingos frakcijų bioaktyvių junginių sudėties. Dėl šios prieţasties, toliau atlikti skirtingų frakcijų ekstrakcijos kinetikos tyrimai.
3.2 Fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekio nustatymas
skirtingose liepų ţiedų frakcijose.
Liepų ţiedų arbata yra nevienalytė, ją sudaro skirtingo susmulkinimo dalelės, todėl atliktas tyrimas, kurio metu tirta ar skirtingo dydţio dalelės kaupia skirtingus junginius ir jų kiekius. Vaistinėje pirkta liepų ţiedų arbata sietais buvo išskirstyta į 7 frakcijas pagal dalelių dydį: >2,5 mm , 2 – 2,5 mm, 1,6 – 2 mm, 1,4 – 1,6 mm, 1,12 – 1,4 mm, 0,9 – 1,12 mm, <0,9 mm. Iš šių frakcijų buvo gaminami skirtingos ekstrakcijos trukmės ekstraktai, kuriuose buvo spektromofometriškai vertinamas
suminis fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų ir proantocianidinų kiekis. Atlikta ekstrakcija etanoliu ir gauti fenolinių junginių kiekiai palyginti su vandeninių ekstraktų rezultatais.
Fenoliniai junginiai. Fenolinių junginių kiekiai skirtingų frakcijų ekstraktuose
pavaizduoti 6 paveiksle. Nustatyta, kad frakcijos, kuriose dalelių dydis 1,6 - 2 mm, 2 - 2,5 mm ir > 2,5 turi daugiau fenolinių junginių nei kitos frakcijos (p<0,05). Didţiausias fenolinių junginių kiekis (ilginant ekstrakcijos laiką nenustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas) nustatytas frakcijoje, kurios dalelių dydis nuo 2 iki 2,5 mm po 45 minučių ekstrakcijos – 63,31 ± 1,41 mg GAE/g. Kitose frakcijose fenolinių junginių kiekis svyravo nuo 32,76 iki 55,66 mg GAE/g. Maţiausias kiekis nustatytas frakcijoje, kurios dalelių dydis nuo 1,12 mm iki 1,4 mm dydţio. Mūsų tyrime nustatyti fenolinių junginių kiekiai daug didesni nei A. Corciovos ir kt. mokslininkų tyrime – 7,23 mg/g. Tokį didelį skirtumą galėjo įtakoti skirtingas ekstrakcijos metodas, minėtame tyrime iš vaistinėje įsigytų liepų ţiedų buvo gaminama infuzija (30 min. laikoma uţpylus kambario temperatūros vandeniu) [9]. Mokslininkai Graikijoje gavo panašius į mūsų atlikto tyrimo rezultatus – 61,33 mg GAE/g liepų ţiedų arbatos, įsigytos vaistinėje [33]. Mokslininkai Portugalijoje T.cordata ţiedus susmulkinę 2-5 mm dalelėmis po 10 min. ekstrakcijos 100 °C temp. gavo 16,79 mg GAE/g fenolinių junginių [95], o mūsų atliktame tyrime iš stambiausių dalelių (>2 mm ) po 10 min. ekstrakcijos gauta fenolinių junginių išeiga labai panaši - apie 15-19 mg GAE/g.
Visų frakcijų ekstraktuose, išskyrus 1,6 – 2 mm dydţio, po 45 minučių nenustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas ilginant ekstrakcijos laiką (p>0,05). 1,6 – 2 mm dydţio frakcija didţiausią statistiškai reikšmingą kiekį pasiekia po 15 minučių (p<0,05). Pastebėta, kad kuo maţesnis dalelių dydis, tuo greičiau vyksta ekstrakcija. Iš smulkiausios frakcijos dalelių, kurių dydis maţesnis nei 0,9 mm, po 5 minučių buvo pasiektas didţiausias, lyginant su kitomis frakcijomis, fenolinių junginių kiekis, kuris sudaro 54,69 proc. viso fenolinių junginių kiekio. Stambiausios dalelės (>2 mm) ekstrahavosi lėčiau nei kitos dalelės, nepaisant to, kad jose fenolinių junginių kiekis didţiausias, po 5 minučių ekstrakcijos fenolinių junginių išeiga buvo tik 20,75 proc. (>2,5 mm dalelių) ir 20,91 proc. (2 – 2,5 mm dalelių). Tai galima paaiškinti, kad kuo maţesnė dalelė, tuo didesnis paviršiaus plotas su ekstrahentu pasiekiamas.
Ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį, ekstrakcijos išeiga maţesnė (p<0,05) nei vandeninių ekstraktų – nuo 10,87 iki 16,99 mg GAE/g. Rumunijoje atliktame tyrime, T. cordata ţiedus ekstrahuojant 10 min. 70 proc. etanoliu, rezultatai panašūs, nustatytas fenolinių junginių kiekis – 11,2 mg GAE/g. [95]. S. Demiray ir kiti atliko tyrimą su T. argentae liepų ţiedais, kurio rezultatai parodė, kad didesnė nei vandeninių ekstraktų fenolinių junginių išeiga pasiekiama ekstrahuojant ţaliavą 70 proc. acetonu [96]. Lenkijoje atliktas tyrimas su T. cordata ţiedais parodė, kad didesnė fenolinių junginių išeiga pasiekiama ekstrahuojant ne vandeniu, o metanoliu [97].
