LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA Aleksandra Kubiliūtė
SIRT1 koncentracijos ir SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833, genų polimorfizmų
sąsajos su regos nervo uždegimu
Medicinos programos vientisųjų studijų Baigiamasis magistro darbas
Darbo mokslinė vadovė: prof. dr. R. Liutkevičienė
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 4
3. PADĖKA ... 8
4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8
6. SANTRUMPOS ... 9
7. SĄVOKOS ... 10
8. ĮVADAS ... 11
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 13
10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
10.1 Regos nervo uždegimas ... 14
10.2 Epidemiologija ... 14 10.3 Etiologija ir klasifikacija ... 15 10.4 Patofiziologija ... 16 10.5 Klinika ... 16 10.6 Diagnostika ... 17 10.7 Gydymas ... 19 10.8 Sirtuinų reikšmė ... 20
10.9 SIRT1 genas ir jo polimorfizmai ... 22
11. METODIKA... 23
11.1 Tyrimo planavimas ... 23
11.2 Tyrimo objektas ... 23
11.3 Tiriamųjų atranka ... 23
11.4 Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas išskyrimas druskų nusodinimo metodu... 25
3
11.4.2 Tirpalų paruošimas ... 26
11.4.3 DNR išskyrimo eiga ... 28
11.5 DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru ... 29
11.6 VNP nustatymas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu ... 30
11.6.1 TL – PGR etapai ... 30
11.6.2 TL – PGR metodas ... 31
11.6.3 Genotipavimo proceso eiga ... 31
11.7 SIRT1 baltymo koncentracijos nustatymas ELISA metodu ... 33
11.7.1 ELISA metodas ... 33
11.7.2 ELISA tyrimo eiga ... 33
11.8 Statistinė analizė ... 34
12. REZULTATAI ... 36
12.1 SIRT1 koncentracijos sąsajos su regos nervo uždegimu ir išsėtine skleroze ... 36
12.2 SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų sąsajos su RNU ... 38
12.3 SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų sąsajos su RNU pagal lytį ir sergamumą IS ... 43
13. REZULTATŲ APTARIMAS ... 56
14. IŠVADOS ... 58
15. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 59
4
1. SANTRAUKA
Baigiamojo magistro darbo autorė: Aleksandra Kubiliūtė
Baigiamojo magistro darbo pavadinimas: SIRT1 koncentracijos ir SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 genų polimorfizmų sąsajos su regos nervo uždegimu.
Darbo tikslas: Nustatyti SIRT1 koncentracijos kraujo serume ir SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų sąsajas su regos nervo uždegimo pasireiškimu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti SIRT1 koncentracijos kraujo serume sąsajas su regos nervo uždegimu (RNU) ir išsėtine skleroze (IS).
2. Ištirti SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų dažnį pacientams, sergantiems RNU ir kontrolinės grupės asmenims ir nustatyti šių polimorfizmų įtaką RNU pasireiškimui.
3. Ištirti SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų dažnį ir pasireiškimo galimybę pacientams, sergantiems RNU ir kontrolinės grupės asmenims pagal lytį bei sergantiems ir nesergantiems IS.
4. Nustatyti SIRT1 koncentracijos kraujo serume ir SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų sąsajas su RNU pasireiškimu.
Tyrimo metodai ir dalyviai: Ištyrėme 79 RNU sergančius ir 225 sveikus asmenis. RNU sergančius asmenis suskirstėme į sergančius IS (n = 30) ir nesergančius IS (n = 43), 6 RNU sergantys asmenys neturėjo duomenų, patvirtinančių IS diagnozę. Iš tiriamųjų periferinio kraujo leukocitų išskyrėme DNR ir atlikome genotipavimą tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu. SIRT1 koncentracijai nustatyti naudojome ELISA rinkinį. Gautus duomenis įvertinome naudodami statistinę programą „IBM SPSS Statistics 26.0“.
Tyrimo rezultatai: Nustatėme, kad SIRT1 rs3758391 C/T genotipas yra statistiškai reikšmingai dažnesnis sergantiems RNU (p = 0,007) ir 2 kartais didina RNU pasireiškimo galimybę kodominantiniame (p = 0,007), dominantiniame (p = 0,011) ir viršdominantiniame (p = 0,008) modeliuose. Galimybė pasireikšti RNU, sergant IS, didėja 3 kartus pagal dominantinį (p = 0,010), 2 kartus pagal viršdominantinį (p = 0,032) modelius, esant bent vienam T aleliui didėja 1,2 karto (p = 0,015). SIRT1 rs7895833 polimorfizmo A/G genotipas yra dažnesnis sergantiems RNU (p = 0,001) ir 2,5 karto kodominantiniame (p = 0,001), 2 kartus dominantiniame (p = 0,006) ir viršdominantiniame (p < 0,001) modeliuose didina galimybę pasireikšti RNU. Galimybė pasireikšti RNU su IS didėja 4 kartus pagal kodominantinį (p < 0,001), dominantinį (p = 0,001) bei viršdominantinį (p < 0,001) modelius ir 2 kartus esant bent vienam G aleliui (p = 0,013).
5 Išvados: SIRT1 rs3758391 ir rs7895833 polimorfizmai yra susiję su RNU ir RNU, sergant IS, vystymusi.
6
2. SUMMARY
Author: Aleksandra Kubiliūtė
Title: SIRT1 Concentration and SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 Gene Polymorphisms Link to Optic Neuritis
Aim: To evaluate SIRT1 concentration in blood serum and SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polymorphisms association with development of optic neuritis.
Objectives:
1. To evaluate the link between SIRT1 concentration in blood serum, optic neuritis (ON) and multiple sclerosis (MS).
2. To identify SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polymorphism frequency in patients with ON and healthy subjects and evaluate their influence in development of ON.
3. To identify SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polymorphism frequency and occurrence in patients with ON and healthy subjects based on their gender and MS morbidity.
4. To evaluate the link between SIRT1 concentration in blood serum and SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polymorphisms in all subjects, patients with ON and healthy subjects.
Methods: We investigated 79 patients with ON and 225 healthy subjects. We divided ON patients into 2 subgroups of patients with MS (n = 30) and patients without MS (n = 43). 6 ON patients did not have sufficient data for MS diagnosis and were excluded from both subgroups. Subjects DNA was extracted from peripheral blood leucocytes and genotyped by real-time polymerase chain reaction method. We analyzed the results with „IBM SPSS Statistics 26.0” program.
Results: We discovered that SIRT1 rs3758391 C/T genotype frequency was significantly higher in ON patients (p = 0.007) and had 2-fold increased odds for ON development in co-dominant (p = 0.007), dominant (p = 0.011) and over-dominant (p = 0.008) models, 3-fold increased odds for ON with MS development in dominant (p = 0.010), 2-fold increased odds in over-dominant (p = 0.032) models and each T allele was associated with 1.2-fold increased odds for ON with MS development (p = 0.015). We also discovered that SIRT1 rs7895833 A/G genotype frequency was significantly higher in ON patients (p = 0.001) and had 2.5-fold increased odds for ON development in co-dominant (p = 0.001), dominant (p = 0.006) and over-dominant (p < 0.001) models, 4-fold increased odds for ON with MS development in co-dominant (p < 0.001), co-dominant (p = 0.001), over-co-dominant (p < 0.001) models and each G allele was associated with 2-fold increased odds for ON with MS development (p = 0.013).
7 Conclusions: We discovered that SIRT1 rs3758391 and rs7895833 polymorphisms are associated with ON and ON during MS development.
8
3. PADĖKA
Noriu padėkoti baigiamojo mokslinio darbo vadovei Profesorei Rasai Liutkevičienei už supratingą bendravimą, pagalbą bei įžvalgius pastebėjimus ir patarimus. Dėkoju Alvitai Vilkevičiūtei, Gretai Gedvilaitei ir Kristei Kaikarytei už supažindinimą su darbo laboratorijoje metodais, pagalbą ir konsultavimą atliekant tyrimą.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autorei interesų konflikto nebuvo.5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Baigiamojo magistrinio darbo tyrimui atlikti gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas Nr.: BE-2-102, išduotas 2019 m. (priedas Nr. 1).
9
6. SANTRUMPOS
AIC – Akaike informacinis kriterijus (angl. Akaike information criterion) DNR – deoksiribonukleininė rūgštis
EDTA – etilendiamintetraacetatas
ELISA – imunofermentinis antikūnų ar antigenų nustatymo metodas (angl. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
GS – galimybių santykis
HWE – Hardžio – Vainbergo pusiausvyra (angl. Hardy – Weinberg Equillibrium) IS – išsėtinė sklerozė
IQR – tarpkvartilinis plotis (angl. Interquatile Range) LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikos MRT – magnetinio rezonanso tyrimas
NAD - nikotinamido adenino dinukleotidas OKT – optinė koherentinė tomografija
ONTT – „Regos nervo uždegimo gydymo tyrimas“ (angl. „Optic Neuritis Treatment Trial“) PGR – polimerazės grandininė reakcija
PI – pasikliautinasis intervalas RND – regos nervo diskas RNR – ribonukleininė rūgštis RNU – regos nervo uždegimas
SDS – natrio dodecilsulfatas (ang. Sodium Dodecil Sulphate) SIRT1 – baltymas sirtuinas 1
SIRT1 – sirtuiną 1 koduojantis genas
TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija VNP – vieno nukleotido polimorfizmas
10
7. SĄVOKOS
Aleliai (aleliniai genai) – skirtingi geno variantai, susidarantys dėl mutacijų lytinėse ląstelėse. Dischromatopsija – spalvų pojūčio (matymo ar suvokimo) sutrikimas.
DNR (deoksiribonukleininė rūgštis) – molekulė, sudaryta iš dviejų spirale susisukusių polinukleotidinių grandinių, kurioje užkoduota gentinė informacija apie organizmo funkcijas, augimą, vystymąsi ir reprodukcines savybes.
Genas – DNR molekulės dalis, koduojanti informaciją apie polipeptido ar baltymo aminorūgščių seką. Genotipas – paveldėjimo sąlygoti du vieno geno aleliai.
Nukleotidas – organinė molekulė, sudaryta iš nukleotido ir fosfato. Monomerinis polinukleotidinės grandinės vienetas.
Skotoma – regos lauko sritis, kurioje iš dalies arba visiškai suprastėjęs regos aštrumas, aplink ją esant nesutrikusiam matymui.
Vieno nukleotido polimorfizmas – taškinės mutacijos nulemtas vieno nukleotido pasikeitimas kitu DNR sekoje.
11
8. ĮVADAS
Regos nervo uždegimas (RNU), kitaip dar vadinamas uždegimine optine neuropatija, yra viena dažniausių regos nervo pažeidimo priežasčių jauname amžiuje. Izoliuotas regos nervo uždegimas priskiriamas retų ligų grupei pagal ORPHANET koduotę. Dažniausiai RNU sukelia demielinizacijos procesas, susijęs su išsėtine skleroze (IS), tačiau etiologija gali būti susijusi ir su autoimuninėmis, infekcinėmis, trauminėmis bei kitomis priežastimis [1]. Ši patologija daugiau būdinga jaunoms moterims, pasireiškia 18 – 45 m. amžiuje, nors, priklausomai nuo kilmės, RNU stebimas ir vaikams, vyrams, jaunesniems nei 18 m. ar vyresniems nei 50 m. pacientams [2].
Išskiriamos dvi pagrindinės RNU formos. Tipinis RNU pasireiškia vienpusiu skausmingu regos sutrikimu bei pakitusiu spalvų matymu, ir yra siejamas su IS. 20 proc. atvejų jis yra pirmas IS simptomas, o kartais – vienintelis demielinizacijos sąlygotų pakitimų požymis, tuomet jis vadinamas kliniškai izoliuotu sindromu [3]. Pagal vieno išsamiausių regos nervo neurito tyrimų „Optic Neuritis Treatment Trial“ (ONTT) rezultatus, tikimybė IS pasireikšti per 5 metus nuo pirmojo RNU epizodo yra 30 proc., o per 15 metų nuo izoliuotų RNU simptomų pradžios, ši tikimybė padidėja iki 50 proc. [4]. Tipiniam RNU nebūdingi simptomai, jų pasireiškimas vaikams ar vyresniems suaugusiems, kuomet kilmės priežastis nėra IS, priskiriami atipinei formai [5].
Pagrindinis RNU diagnostikos metodas, taip pat turintis prognostinę vertę, yra galvos smegenų ir akiduobių magnetinio rezonanso tyrimas (MRT) su kontrastu. Nors MRT pritaikymo galimybės tobulėja, regos nervo pakitimai stebimi jau pažengus ligai [6]. Nustačius RNU diagnozę pagal radiologinius požymius ir įvertinus demielinizacijos išplitimo tikimybę, kol kas nėra pakankamai efektyvių priemonių, kurios sustabdytų šių patologijų progresavimą [7].
Dėl šios priežasties, vis daugiau dėmesio skiriama genetinių veiksnių pritaikymo galimybėms gydant neurodegeneracines ligas. Vienas iš genetinių veiksnių – sirtuinų homologams priskiriamas SIRT1 baltymas ir jį koduojantis SIRT1 genas. Sirtuinai, tai nuo nikotinamido adenino dinukleotido priklausomos III klasės histonų deacetilazės. SIRT1 funkcijos apima DNR reparaciją, medžiagų apykaitą, procesus mitochondrijose, senėjimą ir apoptozę. Šis baltymas nustatomas visuose žinduolio organizmo audiniuose, taip pat ir tinklainėje bei kitų akies struktūrų sudėtyje. Atlikus eksperimentinius tyrimus su gyvūnais, stebėtas suaktyvinto SIRT1 baltymo neuroprotekcinis poveikis, sergant RNU. Teigiama, jog SIRT1 aktyvatorių vartojant intravitrealiai ar „per os“ sumažėja tinklainės ganglinių ląstelių nykimas bei padidėja nugaros smegenų aksonų tankis pelėms. Taip pat, padidėjęs SIRT1 kiekis nustatytas smegenų baltojoje medžiagoje esančių IS būdingų plokštelių sudėtyje, o sumažėjęs – periferinio kraujo ląstelėse IS atkryčių
12 metu. Tai leidžia numatyti, jog moduliuojant SIRT1 koncentraciją būtų galima tikėtis teigiamo terapinio demielinizaciją slopinančio poveikio [8,9].
Kol kas nėra ištirtos SIRT1 polimorfizmų sąsajos su RNU, tačiau aprašoma polimorfizmų reikšmė
SIRT1 ekspresijos pokyčiams sergant kitomis ligomis [10,11]. Atlikdami šį tyrimą, norime įvertinti trijų SIRT1 polimorfizmų bei SIRT1 baltymo koncentracijos ryšį su regos nervo uždegimo ir išsėtinės sklerozės
13
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Nustatyti SIRT1 koncentracijos kraujo serume ir SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų sąsajas su regos nervo uždegimo pasireiškimu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti SIRT1 koncentracijos kraujo serume sąsajas su regos nervo uždegimu ir išsėtine skleroze. 2. Ištirti SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų dažnį pacientams, sergantiems regos nervo uždegimu ir kontrolinės grupės asmenims ir nustatyti šių polimorfizmų įtaką regos nervo uždegimo pasireiškimui.
3. Ištirti SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų dažnį ir pasireiškimo galimybę pacientams, sergantiems regos nervo uždegimu ir kontrolinės grupės asmenims pagal lytį bei sergantiems ir nesergantiems išsėtine skleroze.
4. Nustatyti SIRT1 koncentracijos kraujo serume ir SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų sąsajas su regos nervo uždegimo pasireiškimu.
14
10. LITERATŪROS APŽVALGA
10.1 Regos nervo uždegimas
Regos nervo uždegimas (RNU) – tai demielinizacijos ir uždegimo sukeltas regos nervo pažeidimas, pasireiškiantis dažniausiai vienpusiu skausmingu regos sutrikimu bei pakitusiu spalvų matymu (1 paveikslas) [5,12]. RNU kilmė gali būti sąlygota demielinizuojančių optinio neuromielito spektro ligų, sisteminių autoimuninių pažeidimų, infekcijų, toksinų poveikio, genetinių ligų, tačiau dažniausiai siejama su išsėtine skleroze (IS) [13].
1 pav. Regos nervo uždegimas ir demielinizacija [12] (adaptuota pagal „Naturarl Eye Care“)
10.2 Epidemiologija
Moterys RNU serga du kartus dažniau nei vyrai, ši liga labiau paplitusi tarp europiečių bei amerikiečių, būdingesnė baltaodžių rasei. Didžiausia rizika pasireikšti RNU yra 18 – 45 m. amžiuje, nors pasitaiko sergančių vaikų bei vyresnių suaugusiųjų [2,14]. Pagal vietovę, sergančiųjų daugiau tarp
15 aukštutinių platumų gyventojų, o pagal metų laiką RNU dažniausiai prasideda pavasarį [15,16]. Per metus nustatomi 1,5 – 5,1 RNU atvejai 100 tūkst. gyventojų, deja, gali būti, jog dalis atvejų neužregistruojami dėl jau anksčiau diagnozuotos IS vertinant regos sutrikimus kaip tiesioginę šios ligos išraišką [1].
10.3 Etiologija ir klasifikacija
Ligos forma, kuomet regos sutrikimų priežastis yra IS, vadinama tipine, tuo tarpu atipinė siejama su platesne etiologija. Atipinį RNU sukelti gali optinio neuromielito spektro ligos, sisteminės jungiamojo audinio bei kitos autoimuninės ligos, tokios kaip sisteminė raudonoji vilkligė, sarkoidozė, vaskulitai [17]. Infekcijos, sąlygotos B. burgdorferi, T. pallidum, B. henselae, įprastai žinomų kaip Laimo ligos, sifilio ir katės įdrėskimo ligos sukėlėjų, taip pat ir kitos infekcinės priežastys, priskiriamos atipinės formos etiologiniams veiksniams [18]. Nustatyta, jog atitinkamų žmogaus leukocitų antigeno alelių nešiojimas, pavyzdžiui, HLA DRB1*15, yra predisponuojantis veiksnys pasireikšti RNU bei IS [19]. Tiriami ir kiti genetiniai veiksniai, tarp jų ir SIRT1 bei jį koduojantis genas, kurie gali būti susiję su patologiniais procesais, sąlygojančiais regos nervo uždegimą [20]. Daugeliu atveju RNU etiologija lieka neaiški, tuomet jis įvardijamas kaip idiopatinis. RNU klasifikacija pateikta 2 paveiksle [13,17].
16 10.4 Patofiziologija
Tikslus patogenezinis RNU mechanizmas nėra pakankamai ištirtas, tačiau manoma, jog pagrindinis veiksnys yra sutrikęs nervinio signalo perdavimas aksonuose dėl ganglinių ląstelių žūties. Aksonai pažeidžiami uždegimo metu, kai imuninio atsako aktyvuojami T limfocitai pereina kraujo – smegenų barjerą ir iš periferijos patekę į centrinę nervų sistemą sukelia mielino destrukciją, aksonų degeneraciją ir neuronų žūtį. Šiuos procesus indukuoja atsipalaidavę citokinai ir kiti uždegimo mediatoriai, vyksta atidėta IV tipo hipersensityvinė reakcija. Manoma, jog sutrikęs kraujo – smegenų barjero pralaidumas lemia regos nervo pažeidimo proceso pradžią [21]. Šie pažeidimai stebimi atlikus optinės koherentinės tomografijos (OKT) tyrimą, kuriame nustatomas tinklainės ganglinių ląstelių sluoksnio išplonėjimas sukeltas aksonų pažaidos ir nykimo. Tokio pobūdžio degeneracinis procesas gali lemti sunkų ar negrįžtamą regos funkcijos sutrikimą [22].
10.5 Klinika
Kliniškai RNU irgi skirstomas į tipinį ir atipinį. Tipiniam RNU būdingas ūmus ar poūmis, dažniau vienpusis regos sutrikimas, kuris pasireiškia pablogėjusiu regos aštrumu, besiliejančiu vaizdu, difuziniu ar lokalizuotu regos lauko iškritimu (dažnai centrinėmis skotomomis) bei sutrikusiu spalvų suvokimu (dischromatopsija) (3 pavekslas) [23–25]. Dischromatopsija pasireiškia ankstyvoje RNU stadijoje ir jos pobūdis gali būti nevienodas ar kisti ligos eigoje. ONTT duomenimis, ūmioje stadijoje stebėta mėlynos ir geltonos, o po 6 mėnesių – raudonos ir žalios spalvų matymo sutrikimas, tačiau kituose tyrimuose dominuojantis spalvų juslės sutrikimas nebuvo nustatytas [17]. Regos sutrikimą lydi buko, maudžiančio pobūdžio retroorbitalinis ar temporalinis skausmas, kurį pacientai dažnai sumaišo su galvos skausmu. Skausmas sustiprėja akies judesių metu dėl uždegimiško nervo įsitempimo [23]. Rega pablogėti gali per kelias valandas, įprastai simptomai progresuoja iki savaitės, dviejų [26]. Atslūgus uždegimui, kelių savaičių laikotarpyje nuo RNU pasireiškimo pradžios simptomai pradeda mažėti ir apie 90 proc. pacientų vienerių metų bėgyje Sneleno lentelėje mato 5 eilutes ar daugiau [17]. RNU būdinga vienfazė eiga, tačiau aprašoma atvejų, kuomet regos sutrikimas blogėja nenuosekliai, pasikartoja atkryčiai, kurių metu ligos simptomai atsinaujina ar pablogėja [27].
17 3 pav. Tipiniai RNU simptomai [25]
(adaptuota pagal „Verywell Health/Cindy Chung“)
Atipinis RNU nustatomas pasireiškus nebūdingiems simptomams, kai regos sutrikimas yra abipusis, neskausmingas, stebimas vaikams ir paaugliams iki 18 m. ar vyresniems nei 50 m. amžiaus pacientams. Paprastai regos aštrumo sumažėjimas būna didesnis, užsitęsia ilgiau nei kelias savaites ir remisija gali būti nepasiekiama nei spontaniškai, nei pavartojus vaistų [5]. Tokiam RNU būdingi dažni ligos atkryčiai ir neigiamas atsakas į gydymą gliukokortikoidais [18].
10.6 Diagnostika
Stebint būdingų simptomų derinius RNU gali būti įtariamas jau iš klinikinių požymių, tačiau diagnozės patikslinimui reikalingi papildomi tyrimai (5 paveikslas) [28]. Regos nervo disko (RND) edema pasireiškia tik vienam ketvirtadaliui pacientų, todėl akių dugno tyrimas įtariant RNU nesuteikia pakankamai duomenų. Perimetrijoje galimi įvairūs akipločio pakitimai, kurie nustatomi 97 proc. pacientų. Dažniausiai pasireiškiantis difuzinis regos netekimas, nustatomas 48 proc. pacientų. Centriniai akipločio defektai nustatomi dažniau nei periferiniai, tačiau periferiniai – greičiau atsistato. Centrinės ir centrocekalinės skotomos pasireiškia 8 proc. atvejų. Taip pat nustomi nervinių skaidulų pluošto spaudimo pakenkimai bei
18 altitudiniai akipločio pakitimai. Altitudiniai akipločio pakitimai nustatomi 20 proc., ir įvairūs kiti tipai sudaro 23 proc. Chiazminiai ir retrochiazminiai akipločio pakitimai yra retesni ir aptinkami tik 3 proc. žmonių. Sveikoje akyje atsitiktiniai akipločio pakitimai taip pat yra dažni, o akipločio atsistatymas dažniausiai yra geras (4 paveikslas) [24]. Ūminėje RNU stadijoje OKT stebimas sustorėjęs tinklainės nervinių skaidulų sluoksnis, vėliau pereinantis į nervinių skaidulų bei ganglinių ląstelių sluoksnio išplonėjimą dėl uždegimo sukeltos aksonų demielinizacijos ir degeneracijos. Regos sukeltų potencialų tyrimu nustatomas aksonų demielinizacijos sąlygotas prailgėjęs potencialo atsakas ir sumažėjusi bangų amplitudė. Deja, šių tyrimų duomenų nepakanka RNU priežasčiai diferencijuoti, gydymo efektyvumui įvertinti ar regos funkcijos atsistatymo laipsniui numatyti [28–30].
Jautriausias tyrimas RNU diagnostikoje yra galvos smegenų bei akiduobių MRT su kontrastu. Jo metu stebimas optinio nervo intraorbitalinio segmento paburkimas ir signalo intensyvumo padidėjimas T2 rėžime ankstyvose RNU stadijose bei kontrasto kaupimasis uždegimo srityje, kuris matomas daugiau nei 90 proc. atvejų, jei tyrimas atliekamas per 3 sav. nuo simptomų pasireiškimo pradžios [6]. Esant pakitimams abipus, padidėjusio intensyvumo signalui apimant >50 proc. regos nervo ar jo intrakranijinę dalį, reikėtų įtarti atipinį RNU [26]. MRT nustačius kitus smegenų baltosios medžiagos pažeidimus, įvertinus jų skaičių, dydį, pasiskirstymą laike bei erdvėje ir šiems pažeidimams atitinkant McDonald kriterijus, patvirtinama ir IS diagnozė [31].
Pasireiškus atipiniams RNU simptomams, papildomai atliekamas ne tik galvos, bet ir nugaros smegenų MRT bei nugaros smegenų skysčio tyrimas, kuriame vertinamas limfocitų skaičius, baltymo kiekis, imunoglobulinas G, oligokloninės grandinės bei antikūnai prieš akvaporiną-4 ir prieš mielino oligodendrocitų glikoproteiną. Likvoro tyrimo duomenys derinami su pakitimais kraujyje, kurie taip pat reikšmingi įtariant infekcinės kilmės RNU [32,33].
4 pav. RNU būdingi akipločio defektai: A – centrinis akipločio defektas, B – centrocekalinė skotoma, C – nervinių skaidulų pluošto spaudimo pakenkimas, D – altitudiniai akipločio pakitimai [24]
19 5 pav. Tipinio ir atipinio regos nervo uždegimo diagnostikos algoritmas [28].
RNU – regos nervo uždegimas, IS – išsėtinė sklerozė, RND – regos nervo diskas, KT – kompiuterinė tomografija, MRT – magnetinio rezonanso tomografija.
10.7 Gydymas
Tipinio ir atipinio RNU gydymo taktika pavaizduota 6 paveiksle [28]. Siekiant suvaldyti ūmų RNU epizodą skiriamas medikamentinis gydymas intraveninio metilprednizolono pulsterapija ir po jos sekantis palaikomasis geriamojo prednizolono kursas. ONTT duomenimis, tokia schema pagreitino regos funkcijos
20 atsistatymą, tačiau ilgalaikio poveikio regos pagerėjimui vartojant intraveninį prednizoloną, lyginant su geriamuoju ar net placebu, nebuvo stebėta [4,34]. Bet kokiu atveju, vien geriamojo prednizolono skirti nerekomenduojama dėl ankstyvų RNU atkryčių rizikos, kurie per 6 mėn. nuo šių vaistų vartojimo pradžios, gali pasireikšti dvigubai dažniau negu nevartojant jokių vaistų [35].
Intraveninis imunoglobulinas ir plazmaferezės turi teigiamą poveikį derinant su steroidų pulsterapija bei atipinio RNU atvejais, kai nestebima atsako į gydymą gliukokortikoidais [36,37]. Atipinėms formoms gydymas parenkamas pagal etiologiją, esant infekcinei kilmei skiriama antibiotikoterapija ar priešvirusiniai preparatai pagal sukėlėją [1].
Šiuo metu daugėja duomenų, jog SIRT1 aktyvatoriai gali apsaugoti nuo centrinės nervų sistemos neuronų, tarp jų ir tinklainės ganglinių ląstelių, žūties [38,39]. Nemažai ištyrinėtas natūralus SIRT1 aktyvumą didnantis fenolis rezveratrolis, esantis vynuogėse ir raudoname vyne. Regos nervo neuritą turinčioms pelėms suleidus šio aktyvatoriaus intravitrealiai, stebėtas nuo dozės priklausomas apsauginis poveikis tinklainės ganglinėms ląstelėms. Tiriami SRT vaistai, pasižymintys daug kartų galingesniu nei reservatrolio poveikiu, aktyvuojančiu SIRT1, ir vertinamas jų neuroprotekcinis poveikis [9,40]. Užtikrinus SIRT1 aktyvatorių efektyvumą, saugumą bei bioprieinamumą, ateityje šie vaistai gali tapti vienu pagrindinių RNU gydymo aspektų, atitolinančių ne tik RNU, bet ir IS išsivystymo riziką.
6 pav. Tipinio ir atipinio regos nervo neurito gydymo taktika [28].
10.8 Sirtuinų reikšmė
Sirtuinai, kitaip vadinami „tyliaisiais informacijos reguliatoriais”, yra priskiriami III klasės histonų deacetilazėms ir yra evoliucijos metu išlikusios nuo nikotinamido adenino dinukleotido (NAD)
21 priklausomos baltymų deacetilazės šeimos dalis. Dėka savo fermentinio aktyvumo jie moduliuoja tam tikrus baltymus, metabolinius fermentus bei transkripcijos faktorius, sutrikdydami lizino acetilizavimą [39,41]. Sirtuinai žmogaus organizme turi platų poveikio spektrą: reguliuoja DNR pažaidų ištaisymą, riebalų diferenciaciją, gliukoneogenezę, jautrumą insulinui, riebalų rūgščių oksidaciją, neurogenezę, uždegiminius bei vėžinius procesus, senėjimą. Nustatyti septyni sirtuinų homologai (SIRT1 – SIRT7), būdingi žinduoliams, kurių funkcijos bei vieta ląstelėje pavaizduoti 7 paveiksle [39].
7 pav. Sirtuinų vieta ląstelėje ir funkcija [39,42].
Plačiausiai ištyrinėtas ir aprašytas sirtuinas SIRT1, lokalizuojasi ląstelės branduolyje ir citoplazmoje [43]. SIRT1 pasižymi sąveika su transkripcijos faktoriais ir apoptozės reguliatoriais, kuri nulemia įtaką DNR reparacijai, medžiagų apykaitai, procesams mitochondrijose, senėjimui bei apoptozei. Pavyzdžiui, deacetilindamas transkripcijos faktorių p53, SIRT1 slopina jo veikimą ir, tuo pačiu, apoptozės genų ekspresiją. Tai lemia padidėjusį ląstelių išgyvenamumą. O mitochondrijų funkcijos ir antioksidantų apykaita yra skatinama per SIRT1 aktyvuojamą PGC-1α transkripcijos faktorių, kuris yra atsakingas už šiuos procesus [39,44].
SIRT1 randamas visuose žinduolio organizmo audiniuose, tačiau, svarbu paminėti, jog šis baltymas nustatomas tinklainės bei kitų akies struktūrų ląstelių branduolyje bei citoplazmoje. Tiriant pelių tinklaines, SIRT1 nustatytas tinklainės pigmentinio epitelio ląstelių bei melanocitų branduoliuose, o Jalliffa ir autoriai pateikė duomenis apie SIRT1 lokalizaciją išoriniame bei vidiniame branduoliniame ir ganglinių ląstelių,
22 formuojančių regos nervą, tinklainės sluoksniuose [45]. Manoma, jog viena svarbiausių SIRT1 funkcijų akies struktūroms yra tinklainės ir regos nervo apsauga nuo degeneracinių procesų bei šio baltymo reikšmė akies kamieninių ląstelių atsinaujinimo ir senėjimo procesams. Be to, tyrimų su gyvūnais metu stebėtas suaktyvinto SIRT1 poveikis, apsaugantis nuo akių ligų, tokių kaip katarakta, tinklainės degeneracija, regos nervo uždegimas bei kraujagyslinio dangalo uždegimas [9,39].
10.9 SIRT1 genas ir jo polimorfizmai
SIRT1 koduoja 10 chromosomos ilgajame petyje, 21.3 pozicijoje (10q21.3) esantis SIRT1 genas (8 paveikslas) [46,47].
8 pav. SIRT1 geno vieta [47]
(adaptuota pagal „National Center for Biotechnology Information – Gene“)
Šio geno ekspresijos pokyčiai, kurie dažnai įvyksta oksidacinio streso metu, lemia SIRT1 baltymo poveikį organizmui. Tyrimuose stebėta, jog padidėjusi SIRT1 ekspresija prailgina išgyvenamumą, žmogaus mezenchiminėse bei kitose kamieninėse ląstelėse skatina proliferaciją ir suaktyvina ląstelės ciklą, o eksperimentinio regos nervo neurito tyrime SIRT1 ekspresijos padidėjimas lėmė funkcinį regos atsistatymą po 28 dienų nuo sukelto RNU pradžios. Priešingai, esant sumažėjusiam šio geno aktyvumui, proliferacija sulėtėja ir užsiveda mezenchiminių kamieninių ląstelių senėjimo procesai, hemopoetinių kamieninių ląstelių genomas praranda stabilumą, padidėja jų DNR jautrumas pažaidoms, sutrinka ląstelių diferenciacija į aukštesnį lygmenį [9,44,48].
Skirtingos SIRT1 vieno nukleotido polimorfizmų (VNP) variacijos taip pat turi ryšį su įvairių ligų pasireiškimu. VNP yra paveldėjimo sąlygotas genomo lokuso variantas, kuris gali nesukelti jokio funkcinio pakitimo arba, priklausomai nuo jo pasireiškimo vietos, turėti poveikį genų ekspresijai ar baltymo amino rūgščių pasikeitimui [49]. Šiame tyrime nagrinėtų SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 VNP ryšys su
23 RNU ir IS anksčiau nebuvo tirtas, tačiau stebėtos šių polimorfizmų sąsajos su psichikos sutrikimais, autoimuninėmis ligomis, vėžiu [11,50–52].
11. METODIKA
11.1 Tyrimo planavimas
Baigiamojo magistro darbo tyrimas atliktas LSMU Neuromokslų instituto Oftalmologijos laboratorijoje. Pirmiausia buvo analizuotas temos aktualumas, ieškant informacijos duomenų bazėse. Atrinkti ir išnagrinėti tyrimai apie regos nervo neuritą, jo ryšį su išsėtine skleroze, SIRT1 baltymą ir jo ryšį su regos nervo neuritu, SIRT1 geną, vieno nukleotido polimorfizmus, jų įtaką SIRT1 ekspresijai. Vėliau, įvertinus laboratorijos technines galimybes ir užsakius tyrimui reikalingus reagentus, buvo suplanuota baigiamojo magistro darbo eiga ir pradėtas tyrimas.
11.2 Tyrimo objektas
Tyrimo metu ištirti SIRT1 rs3758391, rs3818292, rs932658 polimorfizmai bei nustatyta SIRT1 koncentracija sergantiems regos nervo uždegimu su išsėtine skleroze ir be išsėtines sklerozės bei kontrolinės grupės asmenims.
11.3 Tiriamųjų atranka
Baigiamojo magistro darbo tyrimui atlikti gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas (Nr. BE-2-102) (1 priedas). Visi į tyrimą įtraukti asmenys pasirašė informuoto asmens sutikimo formą.
24 Į šį tyrimą įtraukėme visus atrankos kriterijus atitinkančius RNU sergančius pacientus, kurie lankėsi LSMUL KK Oftalmologijos klinikoje 2012 01 – 2020 10 07. Kontrolinę grupę sudarėme iš sveikų asmenų, kurie atvyko į LSMUL KK Akių ligų kliniką, profilaktiniam oftalmologiniam ištyrimui, atsižvelgiant į sergančių RNU grupės amžių ir lytį. Tiriamųjų grupių atrankos kriterijai nurodyti 9 paveiksle.
9 pav. Sergančiųjų RNU ir kontrolinės grupių atrankos kriterijai. RNU – regos nervo uždegimas, MRT – magnetinio rezonanso tomografija.
Tyrimo eigoje suformavome pacientų, sergančių RNU, ir kontrolinę grupes, jas suskirstėme į moterų ir vyrų grupes. Sergančių RNU grupę suskirstėme į pacientų, sergančių IS, ir pacientų, nesergančių IS, grupes. Iš visų 79 RNU sergančių pacientų 6 neturėjo duomenų, kurie patvirtintų IS diagnozę. Tiriamųjų grupės pavaizduotos 10 paveiksle.
10 pav. Tiriamųjų suskirstymas į grupes. RNU – regos nervo uždegimas, IS – išsėtinė sklerozė.
25 SIRT1 koncentracijos nustatymui atsitiktiniu būdu parinkome 47 tiriamuosius, 23 sergančių RNU grupės ir 24 kontrolinės grupės tiriamuosius. Iš atrinktų sergančių RNU grupės tiriamųjų, 16 priklausė sergančių IS grupei, 7 priklausė nesergančių IS grupei. Tiriamųjų suskirstymas į grupes SIRT1 koncentracijos nustatymui pavaizduotas 11 paveiksle.
11 pav. Tiriamųjų suskirstymas į grupes SIRT1 koncentracijos nustatymui. RNU – regos nervo uždegimas, IS – išsėtinė sklerozė.
11.4 Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas išskyrimas druskų nusodinimo metodu
Deoksiribonukleininę rūgštį (DNR) išskyrėme iš periferinio veninio kraujo, kurį surinkome į vakuuminius mėgintuvėlius su etilendiamintetraacetatu (EDTA), siekiant išvengti mikrokrešulių susidarymo ir DNR degradacijos. Genominę DNR išskyrėme iš leukocitų DNR druskų nusodinimo metodu.
11.4.1 Priemonės ir reagentai
Priemonės:
1. Automatinės pipetės „Eppendorf Research“ 1 – 1000 µl (Eppendorf AG, Vokietija) 2. Antgaliai 1 – 1000 µl
26 4. Mikrocentrifuga „Eppendorf Centrifuge“ (Eppendorf AG, Vokietija)
5. Plastikiniai, 50 ml talpos centrifuginiai mėgintuvėliai
6. Ependorf tipo 2 ml talpos mėgintuvėliai (Eppendorf AG, Vokietija) 7. Termomaišyklė „Thermo-Shaker TS-100“ (Biosan, Latvija)
8. Magnetinė maišyklė „BioSan Bio Magnetic Stirrer MMS–3000” (Biosan, Latvija) 9. Elektroninės svarstyklės „KERN 440 – 35N“ (KERN, Vokietija)
10. Ph-metras „Mettler Toledo Five Easy FE 20” (Mettler Toledo, Šveicarija)
11. Traukos spinta „Airstream Class II biohazard Safety Cabinet“ (ESCO, Singapūras)
Reagentai:
1. 155 mM amonio chloridas (NH4Cl) „Roti stoch“ (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija) 2. 10 mM kalio bikarbonatas (KHCO3) (Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Vokietija) 3. 1 mM ir 2 mM etilendiamintetraacetatas (EDTA) (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija) 4. 10 mM tris–vandenilio chloridas (Tris HCl) (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija) 5. 400 mM natrio chloridas (NaCl) (Merck KGaA, Vokietija)
6. Natrio dodecilsulfato (SDS) milteliai (AppliChem, Vokietija)
7. Chloroformas stabilizuotas su 155 ppm anilenu (Scharlau Chemie S.A., Ispanija) 8. Proteinazė K (Thermo Fisher Scientific, Lietuva)
9. 96 proc. ir 70 proc. etilo alkoholis (AB „Stumbras“, Lietuva) 10. NaCl (Merck KGaA, Vokietija)
11. TE buferis „Roti Stoch“ (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija)
11.4.2 Tirpalų paruošimas
Prieš pradedant DNR išskyrimą druskų nusodinimo metodu, paruošėme lizės I buferį, kurio pagalba įvyksta eritrocitų hemolizė, lizės II buferį, suardantį leukocitų sieneles, 10 proc. natrio dodecilsulfato (SDS) tirpalą, kuris veikia kaip detergentas ir suardo ląstelių ir branduolių lipidines membranas bei 6 M NaCl tirpalą, naudojamą baltymų nusodinimo etape. Tirpalų ir buferių paruošimo eiga aprašoma 1 – 4 lentelėse.
27 1 lentelė. Lizės I buferio paruošimas.
Lizės I buferio paruošimas
Reagentas Kiekis Eiga
NH4Cl 8,29 g 1. Supilti visus reagentus į 1000 ml kolbą ir užpilti distiliuotu H2O iki 1000 ml žymės.
KHCO3 1 g 2. Maišyti tirpalą magnetine maišykle, kol
ištirps visi reagentai.
1 mM EDTA 292,20 mg 3. Išmatuoti tirpalo pH ir skiesti naudojant NaOH ar HCl tirpalus, kol bus pH 7,4.
Distiliuotas H2O Iki 1000 ml 4. Atšaldyti iki 4°C ir laikyti šaldytuve.
2 lentelė. Lizės II buferio paruošimas. Lizės II buferio paruošimas
Reagentas Kiekis Eiga
Tris HCl 1,567 g 1. Supilti visus reagentus į 1000 ml kolbą ir užpilti distiliuotu H2O iki 1000 ml žymės.
NaCl 23,37 g 2. Maišyti tirpalą magnetine maišykle, kol
ištirps visi reagentai.
2 mM EDTA 584,40 mg 3. Išmatuoti tirpalo pH ir skiesti naudojant NaOH ar HCl tirpalus, kol bus pH 8,2.
28 3 lentelė. 10 proc. natrio dodecilsulfato (SDS) tirpalo paruošimas.
10 proc. natrio dodecilsulfato (SDS) tirpalo paruošimas
Reagentas Kiekis Eiga
SDS milteliai 50 g 1. Suberti SDS miltelius į graduotą indą ir užpilti distiliuotu H2O iki 500 ml žymės. 2. Maišyti tirpalą magnetine maišykle, kol milteliai ištirps.
Distiliuotas H2O Iki 500 ml 4. Laikyti kambario temperatūroje.
4 lentelė. 6 M NaCl tirpalo paruošimas. 6 M NaCl tirpalo paruošimas
Reagentas Kiekis Eiga
NaCl milteliai 175,38 g 1. Suberti NaCl miltelius į graduotą indą ir užpilti distiliuotu H2O iki 500 ml žymės. 2. Maišyti tirpalą magnetine maišykle (išlieka nuosėdos, nes tirpalas persotintas)
Distiliuotas H2O Iki 500 ml 4. Laikyti kambario temperatūroje.
11.4.3 DNR išskyrimo eiga
Tiriamųjų kraujo mėginius, laikomus vakuuminiuose mėgintuvėliuose su EDTA -70°C temperatūroje, atšildėme šaldytuve prie 4°C temperatūros. Atšilusius mėginius perpylėme į 15 ml talpos centrifugai pritaikytus mėgintuvėlius. Į juos pylėme lizės I buferio, centrifugavome 4°C temperatūroje 3000
29 aps./min greičiu 15 min. Nupylėme supernatantą, paliekant nuosėdas, tai yra nusėdusius leukocitus, ant mėgintuvėlio dugno. Plovimą kartojome 3 – 4 kartus.
Toliau į mėgintuvėlius su nusėdusiais leukocitais pylėme 6 ml lizės II buferio, 150 µl 10 proc. SDS tirpalo ir 10 µl baltymus hidrolizuojančios proteinazės K. Lengvais sukamaisiais judesiais mėgintuvėlių turinį sumaišėme. Inkubavome 55°C 10 min. Mėgintuvėlius papildėme 1 ml 6M NaCl. Uždarius, mėgintuvėlius stipriai supurtėme. Šio etapo metu denatūravo baltymai, tirpinami lipidai bei cholesterolis. Traukos spintoje įpylėme chloroformo, vėl išmaišėme. Centrifugavome 16°C temperatūroje 3200 aps./min greičiu 20 min.
Po centrifugavimo mėgintuvėliuose stebėjome denatūruotų baltymų plėvele perskirtą tirpalą: apatinėje dalyje – organinę fazę, kurioje liko baltymai, o viršutinėje – vandeninę fazę su DNR ir druskomis. Į naujus mėgintuvėlius perkėlėme supernatantą, surinktą steriliu pipetės antgaliu. Santykiu 1:1 įpylėme atšaldyto 96 proc. etanolio ir pavarčius mėgintuvėlį DNR iškrito į nuosėdas, dėl savybės netirpti alkoholyje. Mėgintuvėlyje stebėjome baltas DNR sankaupas siūlų pavidalu. Steriliu pipetės antgaliu DNR siūlus surinkome ir perkėlėme į ependorfinius mėgintuvėlius su 70 proc. etanoliu. Centrifugavome 14680 aps./min greičiu kelias minutes. DNR nusėdo į mėgintuvėlio dugną, pipete surinkome etanolį, palikome tik DNR. Etanolio likučius išgarinome įdėję mėgintuvėlius į 37°C termomaišyklę. DNR tirpinimui įpylėme 100 µl eliucijos buferio ir palikome šaldytuve (4-6°C) per naktį, kad pilnai ištirptų. Išskirtą DNR laikėme -20°C temperatūroje.
11.5 DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru
Prieš atliekant tikro laiko polimerazės grandininę reakciją (TL – PGR), nustatėme DNR koncentraciją ir atskiedėme iki reikiamos darbinės koncentracijos. DNR koncentraciją matavome spektrofotometru ,,Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis“.
Koncentracijos matavimas spektrofotometru yra pagrįstas tirpalo absorbcijos, arba kitaip, optinio tankio nustatymu ultravioletinių (UV) bangų ilgyje. Šiuo metodu gali būti išmatuojami DNR, RNR, oligonukleotidų ir mononukleotidų kiekiai gryname vandenyje ar buferiniuose tirpaluose. Nukleino rūgštys absorbuoja 260 nm ilgio UV bangas, o 280 nm ilgio UV bangas sugeria baltyminės priemaišos, likusios po DNR išskyrimo. Įvertinus santykį tarp DNR ir baltymų absorbcijos, nustatomas DNR grynumas, šis santykis turėtų būti apie 1,8. Esant didesniam baltymų priemaišų kiekiui jis būna didesnis nei 1,8, o mažesnis nei 1,8 santykis yra lemiamas RNR priemaišų.
30 Pamatavę koncentraciją, DNR mėginius atskiedėme iki darbinės koncentracijos (10 ng), kuri visiems mėginiams turi būti identiška siekiant gauti tikslius rezultatus.
11.6 VNP nustatymas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu
Genų polimorfizmų (rs3818292, rs3758391, rs7895833) tyrimą atlikome tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos (TL-PGR) metodu.
11.6.1 TL – PGR etapai
TL-PGR sudaro 3 cikliškai pasikartojantys etapai:
• DNR denatūracija. Vyksta 92ºC temperatūroje, kurioje nutrūksta vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių ir DNR grandinės viena nuo kitos atsiskiria, sudarydamos po dvi viengrandes DNR.
• Pradmenų hibridizacija. 40 – 60ºC temperatūroje pradmenys vandenilinėmis jungtimis jungiasi prie jiems komplementarių viengrandžių DNR sričių.
• Elongacija. Vyksta 72ºC temperatūroje, dalyvaujant katalizuojančiam fermentui Taq polimerazei, kuri sintetina matricinei DNR komplementarią grandinę. Naujai grandinei susintetinti panaudojami PGR reakcijos mišinyje esantys mononukleotidai.
Cikliškai kartojantis denatūracijos, hibridizacijos ir elongacijos etapams, DNR kiekis didėja eksponentiškai.
TL – PGR sąlygos polimorfizmų genotipų nustatymui nurodytos 5 lentelėje.
5 lentelė. TL – PGR sąlygos rs3758391, rs3818292, rs932658 polimorfizmų genotipavimui.
Polimorfizmas TL – PGR sąlygos rs3818292 95ºC 10 min 45 ciklai: 92ºC 15s 60ºC 90s rs3758391 rs7895833
31 11.6.2 TL – PGR metodas
Genotipavimą atlikome tikro laiko PGR gausintuvu ,,StepOne Plus“ (,,Applied Biosystems“, JAV). Naudojome „Applied Biosystems“ sukurtus pradmenis ir molekulinius žymenis. Kiekvienai reakcijai naudojome 1,5 µl tiriamųjų DNR ir 8,5 µl PGR mišinio, kurio sudėtis nurodyta 6 lentelėje. Bendras mišinio tūris kiekviename plokštelės šulinėlyje buvo 10 µl.
6 lentelė. PGR mišinio sudėtis vienam mėginiui ir visai plokštelei.
Reagentai 1 mėginys, μl 96 mėginiai, μl
Genotipavimo reagentų mišinys „TaqMan Universal Master Mix II, no UNG“
(„Applied Biosystems“, Lietuva)
5 μl 480 μl
Vanduo be nukleazių („Thermo Fisher
Scientific“, Lietuva) 3,25 μl 312 μl
Pradmenų su molekuliniais zondais (rs3818292, rs3758391, rs7895833) rinkiniai, („Applied Biosystems“, JAV )
0,25 μl 24 μl
Viso (TL – PGR mišinio) 8,5 μl 816 μl
11.6.3 Genotipavimo proceso eiga
PGR mišinį paruošėme 96 mėginiams, kaip nurodyta 6 lentelėje. Po 8,5 µl mišinio įpylėme į kiekvieną plokštelės šulinėlį ir po 1,5 µl tiriamųjų DNR įpylėme į 95 šulinėlius. Paskutinį 96 šulinėlį palikome kaip neigiamą kontrolę ir į jį įpylėme 1,5 µl sterilaus vandens. Plokštelę užklijavome specialia optine plėvele ir centrifugavome, kad pasišalintų oro burbuliukai ir mėginiai tolygiai nusistovėtų. Į tikro laiko termociklerį įdėjome paruoštą plokštelę, pasirinkome „Alelių nustatymo“ programą.
32 Genotipavimas truko 2,5 valandos pagal 5 lentelėje nurodytas sąlygas, tuomet vertinome gautus rezultatus. „StepOne software v2.3” programa buvo nustatyti pasirinktų polimorfizmų genotipai tiriamiesiems ir skirtingos spalvos taškais pavaizduoti homozigotiniai pagal vieną ar kitą alelį bei heterozigotiniai genotipai, pavyzdys pateiktas 12 paveiksle. Naudodami gautus rezultatus atlikome statistinius skaičiavimus.
33 11.7 SIRT1 baltymo koncentracijos nustatymas ELISA metodu
SIRT1 koncentracijos nustatymą atlikome ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) metodu, naudojant „Abcam’s” „ab171573 – SIRT1 (Sirtuin1) SimpleStep ELISA Kit” rinkinį [53].
11.7.1 ELISA metodas
Šis tyrimas yra pagrįstas imunofermentine reakcija tarp antigenų ir antikūnų ir naudojamas kiekybiniam antikūnų, antigenų, baltymų, glikoproteinų bei hormonų nustatymui. SIRT1 baltymo specifinių antigenų susijungimą su rinkinyje esančiais antikūnais pagal „sumuštinio“ (angl. „sandwich“) tipą nustatėme kolorimetriškai. SIRT1 koncentraciją išmatavome spektrofotometru.
11.7.2 ELISA tyrimo eiga
Prieš naudojimą visus reagentus turi būti atšildėme iki kambario temperatūros (18-25°C). Pagal protokolą paruošėme 1X ląstelių išgavimo buferį PTR, 1X plovimo buferį PT ir antikūnų „kokteilį“ – sugavimo ir nustatymo antikūnų tirpalą.
Standartinį tirpalą (50 ng/ml) paruošėme sumaišant SIRT1 liofilizuotą rekombinantinį baltymą su 1 ml 1X ląstelių išgavimo buferio PTR. Tirpalą 10 min palaikėme kambario temperatūroje ir dar kartą permaišėme. Iš eilės sunumeravome 8 mėgintuvėlius, kurie sudarė skirtingų koncentracijų kalibracinę kreivę. Į 1 mėgintuvėlį įpylėme 100 μl 1X išskyrimo buferio PTR ir po 150 μl į 2 – 8 mėgintuvėlius. 400 μl standartinio tirpalo, kuriame buvo SIRT1 baltymo, įpylėme į 1 mėgintuvėlį ir išmaišėme. Toliau iš 1 mėgintuvėlio pylėme 150 μl tirpalo į 2 mėgintuvėlį, iš 2 mėgintuvėlio pylėme 150 μl į 3 mėgintuvėlį ir tokia tvarka tęsėme iki 7 mėgintuvėlio (13 paveikslas). Į 8 mėgintuvėlį standartinio tirpalo nepylėme, jis liko be baltymo ir buvo vertinamas kaip neigiama kontrolė.
34 13 pav. Skirtingos koncentracijos tirpalų kalibracinės kreivės paruošimas [53]
(adaptuota pagal „Abcam’s“ „ab171573 – SIRT1 (Sirtuin1) SimpleStep ELISA Kit“ protokolą)
Paruošėme plokštelę su tyrimui reikalingu šulinėlių kiekiu. Į kiekvieną iš jų įpylėme po 50 μl antikūnų „kokteilio“ ir po 50 μl tiriamųjų mėginių – kraujo serumo, taip pat, po 50 μl standartinių tirpalų atitinkamai pasirinktoje plokštelės vietoje. Standartiniai tirpalai ir mėginiai buvo tiriami po du pakartojimus. Plokštelę sandariai užklijavome plėvele ir inkubavome plokštelių purtyklėje 400 aps./min greičiu 1 valandą kambario temperatūroje. Pasibaigus inkubavimui, kiekvieną šulinėlį išplovėme 350 μl 1X plovimo buferiu PT, visą plokštelės turinį išpylėme ir šį veiksmą pakartojome tris kartus. Po paskutinio plovimo plokštelę nusausinome padėję ją ant švaraus popierinio rankšluosčio. Tuomet, į kiekvieną šulinėlį įpylėme 100 μl TMB substrato ir inkubavome plokštelių purtyklėje 400 aps./min greičiu 10 minučių tamsioje aplinkoje. Vykstančiai imunofermentinei reakcijai užfiksuoti į kiekvieną šulinėlį įpylėme 100 μl sustabdymo tirpalo, plokštelę 1 minutei įdėjome į plokštelių purtyklę, kad tirpalai susimaišytų. Gavome galutinius reakcijos bandinius, kuriuose ant šulinėlių dugno buvo prisitvirtinęs SIRT1 baltymas. Absorbciją matavome mikroplokštelių skaitytuvu 450 nm bangų ilgyje, o koncentraciją apskaičiavome naudodami kalibracinę kreivę, kurią parengėme pagal naudotus standartinius tirpalus.
11.8 Statistinė analizė
Statistinę duomenų analizę atlikome „IBM SPSS Statistics 26.0“ kompiuterine programa. Duomenis pateikiame realiaisiais skaičiais (procentais), požymiams, kurie neatitiko normaliojo skirstinio kriterijų, naudojome aprašomosios statistikos charakteristikas: medianą, tarpkvartilinį plotį (IQR). SIRT1 polimorfizmų genotipų pasiskirstymą vertinome pagal Hardžio – Vainbergo pusiausvyros dėsnį. SIRT1
35 polimorfizmų genotipų ir alelių pasiskirstymo homogeniškumui palyginti taikėme χ² ir Fisher tikslųjį testą pagal vienpusį ir dvipusį kriterijų. Dvinarės logistinės regresijos metodu įvertinome RNU pasireiškimą pagal galimybių santykį (GS), nurodant jį su 95 proc. pasikliautinuoju intervalu (PI). Atlikome dvinarės logistinės regresijos analizę atsižvelgdami į paveldėjimo modelius ir įvertinome GS RNU pasireiškimui pagal lytį ir sergamumą IS. Naudojome Akaike informacinį kriterijų (AIK) pagal mažiausią jo vertę vertindami tinkamiausią paveldėjimo modelį. Lygindami SIRT1 koncentraciją skirtingose grupėse naudojome Mano – Vitnio U testą. Skirtumus vertinome kaip statistiškai reikšmingus, kai p reikšmė buvo < 0,05.
36
12. REZULTATAI
Tyrimui atlikti panaudojome 304 asmenų duomenis. Tiriant pasirinktų genų polimorfizmų dažnius, suformavome dvi tiriamųjų grupės. Sergančių RNU grupę sudarė 79 asmenys, iš jų 26 vyrai (32,9 proc.) ir 53 moterys (67,1 proc.). Kontrolinę grupę sudarė 225 asmenys, iš jų 91 vyras (40,4 proc.) ir 134 moterys (59,6 proc.). Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp vyrų ir moterų sergančių RNU ir kontrolinėje grupėje nebuvo nustatytas (p = 0,236). Sergančių RNU amžiaus mediana buvo 37 metai, kontrolinės grupės – 32 metai. Tiriamųjų grupės pagal amžių statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p = 0,066). Tyrime dalyvavusių asmenų pasiskirstymas pagal lytį ir amžių pateiktas 7 lentelėje.
7 lentelė. Imties charakteristikos.
Charakteristika
Grupė
p reikšmė Sergančių RNU grupė
N = 79 Kontrolinė grupė N = 225 Vyrai, n (proc.) 26 (32,9) 91 (40,4) 0,236 Moterys, n (proc.) 53 (67,1) 134 (59,6)
Amžiaus mediana (IQR) 37 (23) 32 (17) 0,066
RNU – regos nervo uždegimas; IQR – tarpkvartilinis plotis; p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (statistiškai reikšminga, kai p < 0,05);
12.1 SIRT1 koncentracijos sąsajos su regos nervo uždegimu ir išsėtine skleroze
Nustatėme SIRT1 koncentraciją kontrolinės grupės asmenų ir sergančių RNU kraujo serumuose. Lyginant SIRT1 koncentraciją sergančių RNU ir kontrolinėje grupėse, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme (mediana (IQR): 2,130 ng/ml (1,68) vs. 2,130 ng/ml (0,61) atitinkamai, p = 0,856). SIRT1 koncentracija tiriamųjų grupėse pavaizduota 14 paveiksle.
37 RNU – regos nervo uždegimas; p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (statistiškai reikšminga, kai p < 0,05);
14 pav. SIRT1 koncentracija tiriamųjų grupėse
Palyginome SIRT1 koncentraciją sergančių RNU, kurie serga IS ir kurie neserga IS, kraujo serumuose. Šiose dviejose grupėse statistiškai reikšmingų skirtumų taip pat nenustatėme (mediana (IQR): 3,821 ng/ml (4,35) vs. 2,124 ng/ml (0,61) atitinkamai, p = 0,593). SIRT1 koncentracija IS sergančių ir IS nesergančių RNU pacientų grupėse pavaizduota 15 paveiksle.
38 IS – išsėtinė sklerozė; p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (statistiškai reikšminga, kai p < 0,05);
15 pav. SIRT1 koncentracija IS sergančių ir IS nesergančių RNU pacientų grupėse
Lyginant SIRT1 koncentraciją sergančių RNU, kurie serga IS, ir kontrolinėje grupėse statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme (mediana (IQR): 3,821 ng/ml (4,35) vs. 2,130 ng/ml (0,61) atitinkmai, p = 0,695). Statistiškai reikšmingai nesiskyrė sergančių RNU, kurie neserga IS, ir kontrolinės grupės SIRT1 koncentracija (mediana (IQR): 2,124 ng/ml (0,61), 2,130 ng/ml (0,61) atitinkamai, p = 0,989).
12.2 SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų sąsajos su RNU
Tyrimo metu nustatėme SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų ir alelių dažnius, kuriuos palyginome sergančių RNU ir kontrolinėje grupėse. Kontrolinėje grupėje genotipų ir alelių pasiskirstymas atitiko Hardžio – Vainbergo pusiausvyrą (p>0,001).
Sergančių RNU ir kontrolinėje grupėse SIRT1 rs3818292 polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p=0,067; p=0,383 atitinkamai) (8 lentelė).
39 Lyginant sergančių RNU ir kontrolinę grupes, statistiškai reikšmingai skyrėsi SIRT1 rs3758391 polimorfizmo C/C ir C/T genotipų pasiskirstymai. C/C genotipas buvo retesnis, o C/T genotipas dažnesnis sergančių RNU nei kontrolinėje grupėje: 39,2 proc. vs. 56,0 proc., p = 0,010; 53,2 proc. vs. 36,0 proc., p = 0,007 atitinkamai. Alelių dažniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p = 0,062) (8 lentelė).
Taip pat, statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas lyginant SIRT1 rs7895833 polimorfizmo A/A ir A/G genotipų pasiskirstymus. A/A genotipas buvo retesnis, o A/G genotipas dažnesnis sergančių RNU nei kontrolinėje grupėje: 57,0 proc. vs. 73,8 proc., p = 0,007; 41,8 proc. vs. 20,9 proc., p = 0,001 atitinkamai. Alelių A ir G dažniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p = 0,069) (8 lentelė)
40 8 lentelė. SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų ir alelių dažniai. Polimorfizmas Genotipas/ Alelis Dažnis Kontrolinė grupė, n (proc.) N=225 HVE p reikšmė
Sergančių RNU grupė, n (proc.) N=79 p reikšmė rs3818292 Genotipas A/A 192 (85,3) 0,003 62 (78,5) 0,067 A/G 28 (12,4) 17 (21,5) G/G 5 (2,2) 0 (0) Iš viso 225 (100) 79 (100) Alelis A 412 (91,6) 141 (89,2) 0,383 G 38 (8,4) 17 (10,8) rs3758391 Genotipas C/C 126 (56,0)1 0,334 31 (39,2)1 0,024 C/T 81 (36,0)2 42 (53,2)2 T/T 18 (8,0) 6 (7,6) Iš viso 225 (100) 79 (100) Alelis C 333 (74,0) 104 (65,8) 0,062 T 117 (26,0) 54 (34,2) rs7895833 Genotipas A/A 166 (73,8)3 0,001 45 (57,0)3 0,001 A/G 47 (20,9)4 33 (41,8)4 G/G 12 (5,3) 1 (1,3) Iš viso 225 (100) 79 (100) Alelis A 379 (84,2) 123 (77,8) 0,069 G 71 (15,8) 35 (22,2)
RNU – regos nervo uždegimas, p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05); HVE p reikšmė – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio – Vainbergo dėsnį (skirtumai laikomi reikšmingais, kai p < 0,001); 1 – p = 0,010; 2 – p = 0,007; 3 – p = 0,007; 4 – p = 0,001;
41 Atlikome SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų dvinarės logistinės regresijos analizę sergančių RNU ir kontrolinėje grupėse. Rezultatai pateikti 9 lentelėje.
Nustatėme, jog SIRT1 rs3758391 polimorfizmo C/T genotipas, lyginant su C/C genotipu, 2 kartus didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,108; 95 proc. PI 1,226 – 3,622; p = 0,007), C/T ir T/T genotipai kartu, lyginant su C/C genotipu, 2 kartus didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 1,971; 95 proc. PI 1,168 – 3,324; p = 0,011) bei C/T genotipas, lyginant su C/C ir T/T genotipais kartu, RNU pasireiškimo galimybę irgi didina 2 kartais (GS = 2,717; 95 proc. PI 1,566 – 4,712; p = 0,008) (9 lentelė).
Taip pat, SIRT1 rs7895833 polimorfizmo A/G genotipas, lyginant su A/A genotipu, 2,5 karto didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,590; 95 proc. PI 1,489 – 4,506; p = 0,001), A/G ir G/G genotipai kartu, lyginant su A/A genotipu, 2 kartais didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,126; 95 proc. PI 1,245 – 3,631; p = 0,006) ir A/G genotipas, lyginant su A/A ir G/G genotipais kartu, 2 kartais didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,717; 95 proc. PI 1,566 – 4,712; p < 0,001) (9 lentelė).
42 9 lentelė. SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų sąsajos su RNU
pasireiškimu.
Polimorfizmas Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p reikšmė AIK
rs3818292 Kodominantinis A/A 1 0,064 1 345,990 A/G 1,880 (0,865 – 3,664) G/G – Dominantinis A/A 1 0,160 348,426 A/G + G/G 1,595 (0,832 – 3,060) Recesyvinis AA + A/G 1 1 347,296 G/G – Viršdominantinis A/A + G/G 1 0,053 346,261 A/G 1,929 (0,990 – 3,758) Adityvinis G 1,275 (0,718 – 2,264) 0,407 349,667 rs3758391 Kodominantinis C/C 1 0,007 0,553 344,935 C/T 2,108 (1,226 – 3,622) T/T 1,355 (0,496 – 3.698) Dominantinis C/C 1 0,011 343,729 C/T + T/T 1,971 (1,168 – 3,324) Recesyvinis C/C + C/T 1 0,909 350,322 T/T 0,945 (0,361 – 2,473) Viršdominantinis C/C + T/T 1 0,008 343,274 C/T 2,018 (1,201 – 3,391) Adityvinis T 1,482 (0,999 – 2,199) 0,051 346,545 rs7895833 Kodominantinis A/A 1 0,001 0,574 338,196 A/G 2,590 (1,489 – 4,506) G/G 0,574 (0,025 – 7.691) Dominantinis A/A 1 0,006 342,826 A/G + G/G 2,126 (1,245 – 3,631) Recesyvinis AA + A/G 1 0,158 347,368 G/G 0,228 (0,029 – 1,779) Viršdominantinis A/A + G/G 1 <0,001 337,908 A/G 2,717 (1,566 – 4,712) Adityvinis G 1,470 (0,950 – 2,276) 0,084 347,415
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05); GS – galimybių santykis; PI – pasikliautinasis intervalas; AIK – Akaike informacinis kriterijus;
43 12.3 SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų sąsajos su RNU pagal lytį ir sergamumą IS
Palyginome SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų ir alelių pasiskirstymą sergančių RNU ir kontrolinėje grupėse pagal lytį.
Lyginant sergančių RNU ir kontrolinę grupes, SIRT1 rs3818292 ir rs3758391 polimorfizmų genotipų dažniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė nei vyrų, nei moterų grupėse. Tų pačių polimorfizmų alelių dažniai nei vyrams, nei moterims taip pat statistiškai reikšmingai nesiskyrė (10 lentelė).
Statistiškai reikšmingai skyrėsi SIRT1 rs7895833 polimorfizmo A/A ir A/G genotipų dažniai moterims. A/A genotipas buvo retesnis, o A/G genotipas dažnesnis sergančių RNU nei kontrolinės grupės moterims: 56,6 proc. vs. 74,6 proc, p = 0,022; 41,5 proc. vs. 20,9 proc., p= 0,006 atitinkamai. Vyrų grupėse statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme. Alelių dažniai nei vyrų, nei moterų grupėse statistiškai reikšmingai nesiskyrė (10 lentelė).
44 10 lentelė. SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų ir alelių dažniai
sergantiems RNU pagal lytį. Polimorfizmas Genotipas Dažnis
Vyrai p reikšmė Moterys p reikšmė Kontrolinė grupė, n (proc.) N=91 Sergančių RNU grupė, n (proc.) N=26 Kontrolinė grupė, n (proc.) N=134 Sergančių RNU grupė, n (proc.) N=53 rs3818292 A/A 80 (87,9) 21 (80,8) 0,788 112 (83,6) 41 (77,4) 0,492 A/G 7 (7,7) 5 (19,2) 21 (15,7) 12 (22,6) G/G 4 (4,4) 0 (0) 1 (0,7) 0 (0) Alelis A 167 (91,8) 47 (90,4) 0,755 245 (91,4) 94 (88,7) 0,412 G 15 (8,2) 5 (9,6) 23 (8,6) 12 (11,3) rs3758391 Genotipas C/C 48 (52,7) 10 (38,5) 0,385 78 (58,2) 21 (39,6) 0,056 C/T 32 (35,2) 13 (50) 49 (36,6) 29 (54,7) T/T 11 (12,1) 3 (11,5) 7 (5,2) 3 (5,7) Alelis C 128 (70,3) 33 (63,5) 0,346 205 (76,5) 71 (67,0) 0,594 T 54 (29,7) 19 (36,5) 63 (23,5) 35 (33,0) rs7895833 Genotipas A/A 66 (72,5) 15 (57,7) 0,067 100 (74,6)1 30 (56,6)1 0,014 A/G 19 (20,9) 11 (42,3) 28 (20,9)2 22 (41,5)2 G/G 6 (6,6) 0 (0) 6 (4,5) 1 (1,9) Alelis A 151 (83,0) 41 (78,8) 0,495 228 (85,1) 82 (77,4) 0,074 G 31 (17,0) 11 (21,2) 40 (14,9) 24 (22,6)
RNU – regos nervo uždegimas; p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05); 1 – p = 0,022; 2 – p = 0,006;
45 Atlikome SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų dvinarės logistinės regresijos analizę sergančių RNU ir kontrolinėje grupėse pagal lytį. Rezultatai pateikti 11 ir 12 lentelėse.
Stebėjome, kad SIRT1 rs7895833 polimorfizmo A/G genotipas, lyginant su A/A genotipu, 2,5 karto didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,547; 95 proc. PI 1,005 – 6,459; p = 0,049) ir A/G genotipas, lyginant su A/A ir G/G genotipais kartu, beveik 3 kartais didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,779; 95 proc. PI 1,099 – 7,028; p = 0,031) vyrams (11 lentelė).
Vertinant rezultatus moterų grupėje, išsiaiškinome, jog SIRT1 rs3758391 polimorfizmo C/T genotipas, lyginant su C/C genotipu, 2 kartais didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,198; 95 proc. PI 1,130 – 4,277; p = 0,020), C/T ir T/T genotipai kartu, lyginant su C/C genotipu, 2 kartais didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,122; 95 proc. PI 1,109 – 4,060; p = 0,023) bei C/T genotipas, lyginant su C/C ir T/T genotipais kartu, vėlgi, RNU pasireiškimo galimybę didina 2 kartais (GS = 2,096; 95 proc. PI 1,100 – 3,995; p = 0,025) (12 lentelė).
Taip pat, SIRT1 rs7895833 polimorfizmo A/G genotipas, lyginant su A/A genotipu, daugiau nei 2,5 karto didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,619; 95 proc. PI 1,312 – 5,230; p = 0,006), A/G ir G/G genotipai kartu, lyginant su A/A genotipu, 2 kartais didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,255; 95 proc. PI 1,156 – 4,399; p = 0,017) ir A/G genotipas, lyginant su A/A ir G/G genotipais kartu, beveik 3 kartus didina galimybę pasireikšti RNU (GS = 2,68; 95 proc. PI (1,352 – 5,340); p = 0,005) moterims (12 lentelė).
46 11 lentelė. SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų sąsajos su RNU
pasireiškimu vyrams.
Polimorfizmas Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p reikšmė AIK
rs3818292 Kodominantinis A/A 1 0,115 1 123,561 A/G 2,721 (0,784 – 9,443) G/G – Dominantinis A/A 1 0,354 125,135 A/G + G/G 1,732 (0,542 – 5,531) Recesyvinis AA + A/G 1 1 123,901 G/G – Viršdominantinis A/A + G/G 1 0,098 123,358 A/G 2,857 (0,824 – 9,906) Adityvinis G 1,134 (0,455 – 2,825) 0,788 125,881 rs3758391 Kodominantinis C/C 1 0,163 0,715 125,976 C/T 1,950 (0,763 – 4,982) T/T 1,309 (0,308 – 5,564) Dominantinis C/C 1 0,202 124,228 C/T + T/T 1,786 (0,733 – 4,353) Recesyvinis C/C + C/T 1 0,939 125,945 T/T 0,949 (0,244 – 3,689) Viršdominantinis C/C + T/T 1 0,173 124,106 C/T 1,844 (0,764 – 4,450) Adityvinis T 1,326 (0,714 – 2,460) 0,371 125,162 rs7895833 Kodominantinis A/A 1 0,049 1 121,054 A/G 2,547 (1,005 – 6,459) G/G – Dominantinis A/A 1 0,152 123,941 A/G + G/G 1,936 (0,784 – 4,781) Recesyvinis AA + A/G 1 1 122,844 G/G – Viršdominantinis A/A + G/G 1 0,031 121,416 A/G 2,779 (1,099 – 7,028) Adityvinis G 1,267 (0,614 – 2,611) 0,522 125,551
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05); GS – galimybių santykis; PI – pasikliautinasis intervalas; AIK – Akaike informacinis kriterijus;
47 12 lentelė. SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų sąsajos su RNU
pasireiškimu moterims.
Polimorfizmas Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p reikšmė AIK
rs3818292 Kodominantinis A/A 1 0,272 1 225,119 A/G 1,561 (0,705 – 3,455) G/G – Dominantinis A/A 1 0,322 224,006 A/G + G/G 1,490 (0,677 – 3,280) Recesyvinis AA + A/G 1 1 224,294 G/G – Viršdominantinis A/A + G/G 1 0,262 223,741 A/G 1,575 (0,712 – 3,485) Adityvinis G 1,379 (0,648 – 2,937) 0,405 224,285 rs3758391 Kodominantinis C/C 1 0,020 0,526 221,480 C/T 2,198 (1,130 – 4,277) T/T 1,592 (0,379 – 6.690) Dominantinis C/C 1 0,023 219,682 C/T + T/T 2,122 (1,109 – 4,060) Recesyvinis C/C + C/T 1 0,905 224,948 T/T 1,089 (0,271 – 4,377) Viršdominantinis C/C + T/T 1 0,025 219,862 C/T 2,096 (1,100 – 3,995) Adityvinis T 1,684 (0,995 – 2,849) 0,052 221,181 rs7895833 Kodominantinis A/A 1 0,006 0,593 218,788 A/G 2,619 (1,312 – 5,230) G/G 0,556 (0,064 – 4.798) Dominantinis A/A 1 0,017 219,336 A/G + G/G 2,255 (1,156 – 4,399) Recesyvinis AA + A/G 1 0,415 224,157 G/G 0,410 (0,048 – 3,492) Viršdominantinis A/A + G/G 1 0,005 217,111 A/G 2,687 (1,352 – 5,340) Adityvinis G 1,627 (0,933 – 2,837) 0,086 222,068
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05); GS – galimybių santykis; PI – pasikliautinasis intervalas; AIK – Akaike informacinis kriterijus;
48 Toliau vertinome SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų ir alelių pasiskirstymą sergančių RNU ir kontrolinėje grupėse, sergantiems ir nesergantiems išsėtine skleroze.
Lyginant sergančių RNU bei IS ir kontrolinę grupes, SIRT1 rs3818292 polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Priešingai, lyginant SIRT1 rs3818292 ir rs932658 polimorfizmų genotipų ir alelių dažnius tose pačiose grupėse, nustatėme statistiškai reikšmingus skirtumus (13 lentelė).
SIRT1 rs3758391 polimorfizmo C/C, C/T ir T/T genotipai lyginant sergančių RNU bei IS ir
kontrolinę grupes (p = 0,023). C/C genotipas buvo retesnis, o C/T genotipas dažnesnis sergančių RNU bei IS nei kontrolinės grupės asmenims: 30 proc. vs. 60 proc., p = 0,007; 56,7 proc. vs. 36 proc., p = 0,029 atitinkamai. Taip pat, T alelis buvo dažnesnis sergančių RNU ir IS nei kontrolinės grupės tiriamiesiems: 41,7 proc. vs 26,0 proc., p = 0,011 (13 lentelė).
Statistiškai reikšmingus skirtumus nustatėme lyginant SIRT1 rs932658 polimorfizmo A/A, A/G ir G/G genotipų pasiskirstymus sergančių RNU ir IS ir kontrolinėje grupėse (p = 0,001). A/A genotipas buvo retesnis, o A/G genotipas dažnesnis sergančių RNU ir IS nei kontrolinės grupės asmenims: 43,4 proc. vs. 73,8 proc., p = 0,001; 53,3 proc. vs. 20,9 proc., p < 0,001 atitinkamai. Taip pat, G alelis buvo dažnesnis sergantiems RNU ir IS, lyginant su kontroline grupe: 30,0 proc. vs. 15,8 proc., p = 0,006 (13 lentelė).
Palyginus RNU sergančiuosius, kurie neserga IS, su kontroline grupe, SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų ir alelių dažniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (13 lentelė).
49 13 lentelė. SIRT1 rs3818292, rs3758391, rs7895833 polimorfizmų genotipų ir alelių dažniai
sergantiems RNU, kurie serga ir kurie neserga IS.
Polimorfizmas Genotipas Dažnis
Kontrolinė grupė, n (proc.) N=225 Sergančių RNU grupė, sergantys IS, n (proc.) N=30 p reikšmė Sergančių RNU grupė, sergantys IS, n (proc.) N=43 p reikšmė rs3818292 A/A 192 (85,3) 23 (76,7) 0,243 34 (79,1) 0,250 A/G 28 (12,4) 7 (23,3) 9 (20,9) G/G 5 (2,2) 0 (0) 0 (0) Alelis A 412 (91,6) 53 (88,3) 0,408 77 (89,5) 0,544 G 38 (8,4) 7 (11,7) 9 (10,5) rs3758391 Genotipas C/C 126 (56,0)1 9 (30,0)1 0,023 20 (46,5) 0,270 C/T 81 (36,0)2 17 (56,7)2 21 (48,8) T/T 18 (8,0) 4 (13,3) 2 (4,7) Alelis A 333 (74,0) 35 (58,3) 0,011 61 (70,9) 0,554 G 117 (26,0) 25 (41,7) 25 (29,1) rs7895833 Genotipas A/A 166 (73,8)3 13 (43,4)3 0,001 29 (67,4) 0,107 A/G 47 (20,9)4 16 (53,3)4 14 (32,6) G/G 12 (5,3) 1 (3,3) 0 (0) Alelis A 379 (84,2) 42 (70,0) 0,006 72 (83,7) 0,907 G 71 (15,8) 18 (30,0) 14 (16,3)
RNU – regos nervo uždegimas; IS – išsėtinė sklerozė; p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05); 1 – p = 0,007; 2 – p = 0,029; 3 – p = 0,001; 4 – p < 0,001;
