LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS ONKOLOGIJOS INSITUTAS
APOPTOZĖJE DALYVAUJANČIŲ TP53 IR BBC3 GENŲ FUNKCINIŲ
POLIMORFIZMŲ PROGNOSTINĖ VERTĖ SERGANT ANKSTYVU
KRŪTIES VĖŽIU
MAGISTRINIS BAIGIAMASIS DARBAS
Darbą atliko: Dovydas Verikas Darbo vadovė: gyd. Erika Korobeinikova Darbo konsultantė: Prof. dr. Rasa Ugenskienė
TURINYS
SANTRAUKA... 4
SUMMARY... 6
PADĖKA ... 8
INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8
SANTRUMPOS ... 9
SĄVOKOS ... 10
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
Krūties vėžio problema, prognozės veiksniai ... 13
Apoptozės reikšmė krūties vėžio vystymuisi ir prognozei ... 14
TP53 geno ir koduojamo baltymo vaidmuo pacientėms, sergančioms krūties vėžiu ... 18
BBC3 geno ir koduojamo baltymo vaidmuo krūties vėžio patogenezėje ... 21
TYRIMO METODIKA ... 24
Tyrimo planavimas ... 24
Tyrimo objektas ... 24
Tiriamųjų atranka... 24
Pacientų ligos sekimas tyrimo metu ... 30
Duomenų analizės metodai ... 30
REZULTATAI ... 31
1. Tiriamosios imties apibūdinimas bei BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmų pasiskirstymas tiriamųjų grupėje ... 31
2. BBC3 rs2032809ir TP53 rs1042522 polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis ... 32
3. BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmų sąsajos su išgyvenamumu ... 37
REZULTATŲ APTARIMAS... 44
Rezultatų, gautų tiriant TP53 rs1042522 polimorfizmą, aptarimas... 44
Rezultatų, gautų tiriant BBC3 rs2032809 polimorfizmą, aptarimas ... 46
IŠVADOS ... 49
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 50
SANTRAUKA
Autorius: Dovydas Verikas Mokslinis vadovas: gyd. Erika Korobeinikova Darbo pavadinimas: Apoptozėje dalyvaujančių TP53 ir BBC3 genų funkcinių polimorfizmų
prognostinė vertė sergant ankstyvu krūties vėžiu (KV).
Tyrimo tikslas: Nustatyti apoptozėje dalyvaujančius funkcinius TP53 ir BBC3 genų polimorfizmus
ir jų sąsajas su ankstyvo KV eiga.
Tyrimo uždaviniai:
1. Įvertinti genų TP53 ir BBC3 polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymą tiriamosioms, sergančioms ankstyvu KV;
2. Išanalizuoti šių polimorfizmų sąsajas su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis; 3. Nustatyti šių polimorfizmų vertę, prognozuojant ankstyvu KV sergančių pacienčių
išgyvenamumą.
Tyrimo metodai: Įtraukta 171 ankstyvu (I–II stadijos) KV serganti pacientė. Genominė DNR buvo
išskirta iš periferinio kraujo leukocitų. Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) ir elektroforezės metodais buvo ištirti du funkciniai apoptozėje dalyvaujančių genų vieno nukleotido polimorfizmai (VNP): TP53 rs1042522 ir BBC3 rs2032809. Įvertintas alelių ir genotipų dažnių pasiskirstymas. Chi kvadrato ir regresinės analizės metodais įvertintos tirtų polimorfizmų sąsajos su žinomais KV prognostiniais veiksniais: pacienčių amžiumi diagnozės nustatymo metu (≤ 40 m./ > 40 m.), naviko dydžiu (≤ 2 cm/ > 2–5 cm), limfmazgių būkle (teigiami/ neigiami), estrogenų receptorių (ER) būkle (teigiama/ neigiama), progesterono receptorių (PR) būkle (teigiama/ neigiama), HER2 būkle (teigiama/ neigiama) bei naviko diferenciacijos laipsniu (G1+G2/ G3). Kaplan–Meiero išgyvenamumo analize bei Kokso regresijos modeliais įvertinta polimorfizmų įtaka laikui iki ligos atkryčio (LLA), laikui iki metastazavimo (LM) bei bendram išgyvenamumui (BI).
Tyrimo rezultatai: Nustatytas polimorfizmų alelių ir genotipų dažnių pasiskirstymas: TP53
rs1042522 G alelis 77 %, C – 23 %, GG genotipas 59 %, CG – 35 %, CC – 6 %; BBC3 rs2032809 A alelis 53 %, G – 47 %, AG genotipas 48 %, AA – 29 %, GG – 23 %. Nustatyta, jog TP53 rs1042522 overdominantinis (CG) genotipas yra statistiškai reikšmingai susijęs su jaunesniu pacienčių amžiumi (p=0,03) ir didesniu pradiniu naviku (p=0,04), tačiau neturi įtakos pacienčių išgyvenamumui. BBC3 rs2032809 recesyvinis AA genotipas yra susijęs su vyresniu pacienčių amžiumi (p=0,042), o overdominantinis AG genotipas, lyginant su kitais genotipais, lėmė 5,11 kartų didesnę ligos atkryčio riziką (p < 0,0001), 4,80 kartų didesnę metastazių išsivystymo riziką (p=0,001) bei 8,24 karto didesnę mirties riziką (p=0,001).
Išvados: Tyrimo metu BBC3 geno rs2032809 polimorfizmo genotipas AG buvo dažniausias, o
rečiausias GG. Tiriant TP53 geno rs1042522 polimorfizmą, dažniausias genotipas buvo GG, rečiausias – CC. Remiantis šio tyrimo rezultatais, TP53 rs1042522 funkcinis polimorfizmas yra susijęs su krūties vėžio išsivystymu ankstesniame amžiuje ir didesniu pirminio naviko dydžiu, o BBC3 rs2032809 polimorfizmas yra siejamas su krūties vėžio išsivystymu vyresniame amžiuje. BBC3 rs2032809 polimorfizmas yra nepriklausomas blogos KV prognozės veiksnys, lemiantis ankstyvesnį ligos atkirtį, metastazavimą bei trumpesnį ankstyvu KV sergančių pacienčių išgyvenamumą.
SUMMARY
Author: Dovydas Verikas Scientific supervisor: MD Erika Korobeinikova
Title: Prognostic value of apoptosis-related gene TP53 and BBC3 functional polymorphisms in
early-stage breast cancer.
Aim of the study: To estimate apoptosis-related gene TP53 and BBC3 functional polymorphisms
and their associations with prognosis of early-stage breast cancer (BC).
Research objectives:
1. To evaluate allele and genotype distributions of TP53 and BBC3 gene polymorphisms in subjects with early-stage BC;
2. To analyse the associations of these polymorphisms with clinical and morphological characteristics of the tumour;
3. To determine the prognostic value of these polymorphisms for survival outcomes in early-stage BC.
Methods: 171 patients with early-stage (stage I-II) BC were enrolled. Genomic DNA was isolated
from peripheral blood leukocytes. Two functional single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the apoptosis-related genes have been analysed using polymerase chain reaction (PCR) and electrophoresis: TP53 rs1042522 and BBC3 rs2032809. Frequency distribution of the alleles and genotypes was evaluated. Chi-square and regression analyses were used to evaluate the associations between the investigated polymorphisms and known BC prognostic factors: patient age at diagnosis (≤ 40 years/> 40 years), tumour size (≤ 2 cm / >2–5 cm), lymph node status (positive/ negative), estrogen receptor (ER) status (positive/ negative), progesterone receptor (PR) status (positive/ negative), HER2 status (positive/ negative) and tumour differentiation grade (G1 + G2/ G3). Kaplan-Meier's survival analysis and Cox regression models were used to evaluate the impact of analysed polymorphisms on recurrence-free survival, metastasis-free survival, and overall survival.
Study results: Frequency distribution of alleles and genotypes: TP53 rs1042522 G allele 77%, C
23%, GG genotype 59%, CG 35%, CC 6%; BBC3 rs2032809 A allele 53%, G 47%, AG genotype 48%, AA 29%, GG 23%. The TP53 rs1042522 overdominant (CG) genotype was statistically significantly associated with younger patient age at diagnosis (p = 0.03) and larger tumour size at the baseline (p = 0.04) but did not influence patient survival. The recessive AA genotype of BBC3 rs2032809 is associated with older patient age (p = 0.042), and the overdominant AG genotype
resulted in a 5.11 times higher risk for relapse (p <0.0001), a 4.80 times higher risk for developing metastases (p = 0.001) and 8.24 times higher risk for death (p = 0.001).
Conclusions: In the study, the genotype AG of the rs2032809 BBC3 gene was the most common
meanwhile the rarest was GG genotype. In the TP53 gene rs1042522 polymorphism, the most frequent genotype was GG and the rarest was CC. According to the results of this study, TP53 rs1042522 functional polymorphism is associated with earlier breast cancer development and larger tumour size, whereas BBC3 rs2032809 polymorphism is associated with older age of disease onset. The BBC3 rs2032809 polymorphism was an independent prognostic factor for recurrence-free survival, metastasis-free survival and overall survival in early-stage BC.
PADĖKA
Labai dėkoju savo magistro vadovei – gyd. Erikai Korobeinikovai už paskatinimą gilintis į naujas mokslo sritis, perteiktas žinias ir nuolatinę pagalbą, motyvaciją ir suteiktas galimybes tobulėti bei siekti mokslinių rezultatų. Taip pat nuoširdžiai noriu padėkoti LSMU MA MF Onkologijos instituto Onkologijos mokslo laboratorijos darbuotojai Agnei Bartnykaitei už pagalbą atliekant genetinius tyrimus.
INTERESŲ KONFLIKTAS
Rašant šį darbą, autoriui interesų konflikto nebuvo.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Etikos komitetas išdavęs bioetikos leidimą atlikti tyrimą: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centras.
Leidimo numeris: BEC–MF–411
SANTRUMPOS
• BBC3 – BCL–2 surišantis komponentas 3 (angl. BCL-2 binding component 3) • BCL–2 – B ląstelių limfoma 2 (angl. B-cell lymphoma 2)
• BI – bendrasis išgyvenamumas • DNR – deoksiribonukleorūgštis • DKIS – duktalinės karcinomos in situ • ER – estrogeno receptorius
• EZH2 – angl. enchancer og zeste homolog 2 • G – naviko diferenciacijos laipsnis (angl. grade)
• HER2 – žmogaus epidermio augimo faktoriaus 2-ojo tipo receptorius (angl. human epidermal growth factor receptor 2)
• JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos • KV – krūties vėžys
• LLA – laikas iki ligos atkryčio
• LM – laikas iki metastazių atsiradimo
• LSMU KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno Klinikos • M – metastazės (angl. metastasis)
• N – limfmazgiai (angl. nodes)
• PGR – polimerazės grandininė reakcija
• PI – pasikliautinieji intervalai (angl. confident interval) • PR – progesterono receptorius
• PUMA – p53 baltymo reguliuojamas apoptozės moduliatorius (angl. p53 upregulated modulator of apoptosis)
• RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas • SR – santykinė rizika (angl. hazard ratio)
• ŠS – šansų santykis (angl. odds ratio) • T – pirminis navikas (angl. tumor)
• TAD – transkripcijos aktyvacijos domenas
• TNF – Tumoro nekrozės faktorius (angl. tumor necrosis factor) • TP53 – naviko baltymas p53 (angl. tumour protein p53)
SĄVOKOS
• Apoptozė – morfologinė genetiškai programuotos ląstelės mirties išraiška.
• Chemoterapija – gydymas citostatiniais preparatais, slopinančiais vėžio ląstelių augimą, dauginimąsi arba naikinančiais jas.
• Menopauzė – menstruacijų nebuvimas ir estrogenų sintezės kiaušidėse mažėjimas.
• Metaanalizė – kiekybinė statistinė kelių atskirų, bet panašių eksperimentų ar tyrimų, analizė siekiant gauti bendrus statistiškai reikšmingus duomenis.
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis 2018 metais pasaulyje nustatyta daugiau kaip 2 milijonai naujų KV atvejų ir daugiau kaip 600 tūkstančių mirčių dėl KV. Lietuvoje ir pasaulyje krūties vėžys yra dažniausia moterų onkologinė liga. Lietuvoje vėžio registro duomenimis KV sąlygoja virš 500 mirčių per metus (2012 m. duomenys). Šiuo metu vis labiau ieškoma naujų predikcinių bei prognostinių KV veiksnių, siekiant ne tik individualizuoti pacienčių gydymą, bet ir pagerinti išgyvenamumą, gyvenimo kokybę.
Šis tyrimas prisideda prie prognostinių KV biologinių žymenų paieškos. Mes pasirinkome analizuoti ląstelės programuotos mirties (apoptozės) procesuose dalyvaujančių TP53 (angl. tumour protein p53) ir BBC3 (angl. BCL-2 binding component 3), dar žinomas kaip PUMA (angl. p53 upregulated modulator of apoptosis) genų funkcinius vieno nukleotido polimorfizmus (VNP). Šių genų koduojami baltymai BBC3 ir TP53 skatina proapoptogeninių veiksnių aktyvinimą, stabdo apoptozę slopinančius mechanizmus ir taip lemia programuotą ląstelės žūtį. BBC3 ir p53 baltymai yra svarbūs, vykstant KV karcinogenezės procesams, ir žinomi kaip naviką supresuojantys veiksniai. Remiantis ankstesnių autorių duomenimis, funkciniai polimorfizmai BBC3 ir TP53 genuose gali sąlygoti mažesnę genų koduojamų baltymų gamybą, kuri ankstesnių tyrimų duomenimis turi neigiamos įtakos KV eigai. Literatūroje yra pavienių studijų, nagrinėjančių pasirinktų BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmų įtaką krūties vėžio eigai, tačiau jų rezultatai
nevienareikšmiški, dauguma tyrimų buvo mažos imties. Mūsų tyrimas unikalus tuo, kad pirmą kartą šių polimorfizmų dažnis, įtaka KV prognozei ir jų sąsaja su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis vertinama homogeniškoje ankstyvu KV sergančių moterų grupėje. Manome, kad, atlikę šį tyrimą, galime identifikuoti naujus KV prognostinius biologinius žymenis, kurie ateityje padėtų individualizuoti ir gerinti ankstyvu KV sergančių pacienčių gydymą.
Tyrimas organizuotas, atsižvelgiant į kitų autorių tyrimuose paskelbtą metodiką. BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmai buvo išskirti iš tyrime dalyvavusių pacienčių kraujo
leukocitų. DNR amplifikacija atlikta polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodu, genotipų vertinimas – PGR – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (PGR–RFIP) metodu, o rezultatų frakcionavimas atliktas naudojantis elektroforeze. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti BBC3 rs2032809 ir
TP53 rs1042522 polimorfizmus ir įvertinti jų sąsajas su klinikinėmis bei morfologinėmis KV
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas
Nustatyti apoptozėje dalyvaujančių p53 ir BBC3 genų polimorfizmus ir jų sąsajas su KV eiga.
Tyrimo uždaviniai
1. Įvertinti p53 ir BBC3 genų polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymą tiriamosioms, sergančioms ankstyvu KV;
2. Išanalizuoti šių polimorfizmų sąsajas su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis; 3. Nustatyti šių polimorfizmų vertę, prognozuojant ankstyvu KV sergančių pacienčių
LITERATŪROS APŽVALGA
Krūties vėžio problema, prognozės veiksniai
Onkologinės ligos yra viena iš aktualiausių šių laikų visuomenės sveikatos problemų, bloginančių žmonių išgyvenamumo rodiklius ir didinančių sveikatos apsaugos priežiūrai skiriamus finansinius įsipareigojimus. KV yra antra pagal dažnumą onkologinė liga, pagal naujų atvejų atsiradimą 2018 m. nusileidžianti tik plaučių vėžiui, o pagal mirtingumą KV yra penktoje vietoje tarp onkologinių susirgimų [1]. Pasaulio sveikatos organizacija pažymi, kad KV kasmet suserga apie 2,1 mln. moterų, 2018 m. nuo šios ligos mirė 627 tūkst., o 2011 m. 508 tūkstančiai [2,3]. Didėjantis sergamumas ir mirtingumas įrodo, kad ši problema nėra suvaldyta. Tikėtina, kad 2050 m., jeigu nebus imtasi veiksmų, pagerinančių ankstyvąją diagnostiką ir prevenciją, KV sergamumo rodikliai didės ir beveik 3,1 milijono moterų kasmet susirgs KV [4]. Remiantis Lietuvos higienos instituto pateiktais duomenimis, Lietuvoje 2018 m. iš viso nuo piktybinių navikų mirė 3604 moterys, iš jų daugiausia – nuo krūties piktybinių navikų (14,5 %). Tarp visų darbingo amžiaus moterų net 7,5 % mirė nuo KV [5]. Lietuvos vėžio registro duomenimis, 41,6 % naujų KV atvejų Lietuvoje diagnozuojama ankstyvoje I–II stadijoje [6]. Remiantis skirtingais šaltiniais, net ir diagnozavus ankstyvą ligą, atkryčio dažnis svyruoja tarp 10–30 % [7,8]. Jei liga lokalizuota tik krūtyje, per 5 metus nuo diagnozės nustatymo dėl KV miršta apie 1 % moterų. Vis dėlto, esant pažeistiems sritiniams limfmazgiams, 5 metus išgyvena tik apie 86 % pacienčių [9]. Taigi KV išlieka labai aktuali problema, net jei nustatoma ankstyvoje vėžio stadijoje.
KV prognozę lemia įvairūs veiksniai, klinikinėje praktikoje dažniausiai naudojami yra: TNM klasifikacija (angl. The TNM Classification of Malignant Tumours), naviko histologinis tipas, diferenciacijos laipsnis, pacientės amžius diagnozės nustatymo metu, estrogeno receptorių (ER) bei progesterono receptorių (PR) būklė, žmogaus epidermio augimo faktoriaus 2-ojo tipo receptoriaus (HER2) (angl. human epidermal growth factor receptor 2) geno amplifikacija ir Ki-67 proliferacijos žymens ekspresija. Taip pat yra išskiriami keli prognostiškai skirtingi KV tipai [10, 11]: 1) Luminalinis A vėžio tipas, nustatomas pagal ER ekspresiją kartu esant santykinai mažai proliferacijai; 2) Luminalinis B vėžio tipas, nustatomas pagal santykinai aukštą proliferaciją arba žemą PR ekspresiją; 3) HER2 teigiamas KV tipas aktyviai ekspresuoja HER2, tačiau neturi estrogenų ar progesteronų receptorių; 4) Trigubai neigiamas tipas pasireiškia tuomet, kai nėra išreikšta nei vieno iš šių receptorių ekspresija. Taip pat klinikinėje praktikoje pacienčių prognozei bei galimam atsakui
į gydymą įvertinti naudojami ir multigeniniai testai tokie kaip Oncotype DX, MammaPrint, PAM 50, Endopredict ir kiti [12]. Nepaisant vis tobulėjančios ankstyvo KV diagnostikos, ligos atkryčio dažniai išlieka aukšti. Vis dar stebima nemažai atvejų, kuomet navikai, kurie, remiantis žinomais klinikiniais ir morfologiniais biologiniais žymenimis, įvertinti kaip geros eigos, visgi agresyviai progresuoja ir metastazuoja. Iš dalies tai galėtų būti paaiškinama aukštu KV genetiniu heterogeniškumu, todėl vis daugiau tyrimų tikslas yra naujų genetinių prognozės žymenų paieška.
Vieno nukleotido polimorfizmai (VNP) kaip vieni iš potencialių genetinių prognozės žymenų dar nėra naudojami klinikinėje praktikoje, tačiau labai plačiai tyrinėjami ir vis daugiau publikacijų skelbiama šia tema. Kelios didžiausios studijos jau įrodė, jog VNP tokiuose genuose, kaip FGFR2, NQO1, LOC, SULTIE1, TGF, TNFSF10, PTGS2, yra nepriklausomi KV prognozės veiksniai [13,14]. Nepaisant to, kad pavieniai VNP turi santykinai nedidelę įtaką KV pacienčių išgyvenamumui, sugrupavus atskirus prognostinius VNP yra pradedamos kurti jų paletės, kurios ateityje turės didelę klinikinio pritaikymo galimybę. Taigi potencialių prognostinių VNP paieška šiuo metu yra svarbus klinikinių tyrimų šioje srityje etapas.
Apibendrinant KV yra dažniausia moterų onkologinė liga. Net ir ankstyvo KV atkryčių ir mirtingumo rodikliai išlieka aukšti, o žinomi prognostiniai žymenys nepakankamai efektyvūs. Taigi būtina naujų prognostinių biologinių žymenų paieška, siekiant optimizuoti KV pacienčių, kurioms reikalingas agresyvesnis gydymas, atranką ir pagerinti jų išgyvenamumą. Atsižvelgiant į ankstesnių autorių duomenis, VNP yra vieni iš potencialių naujų KV prognozės žymenų, todėl tikslingi tolesni kokybiški tyrimai įvairiose KV pacienčių populiacijose. Mes pasirinkome analizuoti apoptozės procesuose dalyvaujančių genų VNP analizę, šio pasirinkimo priežastys pateikiamos tolimesniuose skyriuose.
Apoptozės reikšmė krūties vėžio vystymuisi ir prognozei
Apoptozė normaliame krūties audinyje
Ląstelės gyvenimo ciklas yra skirstomas į tris fazes: ląstelės proliferaciją, diferenciaciją bei apoptozę. Apoptozė yra būtina ląstelės ciklo dalis, kuri reguliuoja ląstelių dauginimąsi ir gali būti sukelta tiek fiziologinių, tiek patologinių procesų [15]. Apoptozės metu ląstelė susitraukia, praranda ryšį su greta esančiomis ląstelėmis ir netenka paviršinių struktūrų (mikrogaurelių ir ląstelinių jungčių), svarbių joms funkcionuoti aplinkoje. Šį procesą galima padalinti į dvi atskiras dalis. Pirmosios fazės metu vyksta branduolio fragmentacija, chromatino kondensacija, ląstelės mažėjimas
ir susitraukimas. Šios stadijos metu ląstelė suyra į membranos apsuptus mažus fragmentus, vadinamus apoptoziniais kūneliais. Antroje fazėje šios struktūros yra atskiriamos nuo epitelio ir yra prisijungiamos kitų ląstelių, kur prasideda in vitro autolizė, veikiant fagosomoms bei virškinant ląstelių lizosominiams fermentams [16-18]. Šis procesas nesukelia ląstelinio imuninio atsako audinyje ir yra natūralus žmogaus organizme vykstantis procesas.
Apoptozės mechanizmas gali būti aiškinamas išsamiau remiantis ląstelės viduje vykstančiomis reakcijomis, kurioms įtakos turi ekstraląsteliniai arba intraląsteliniai signalai. Šis metodas išskiria 3 etapus: 1. Iniciacijos fazė: ląstelė patiria išorinės aplinkos veikiamą stresą arba ląstelės viduje inicijuojamas apoptozės mechanizmas pradeda signalų virtinę per vidinį arba išorinį kelią; 2. Reguliacijos fazė: šie signalai yra susumuojami ir yra nusprendžiama, ar pradedama apoptozė, ar ne; 3. Mirties fazė: jos metu aktyviai veikia kaspazės ir ląstelės yra apsupamos aplinkinių fagocitinių ląstelių [17].
Natūraliai vykstanti apoptozė užtikrina normalų ląstelių santykį tarp ląstelių dauginimosi ir mirties. Kaip ir visuose gyvų organizmų audiniuose apoptozė krūties audinyje vyksta nuolatos, tačiau moterų organizme yra specifinių ypatumų priklausomų nuo lyties, kurie yra susiję su krūties audinyje vykstančia apoptoze [19]. Nėštumo metu krūties latako paviršiuje esančios liaukinės epitelio ląstelės proliferuoja, kad suformuotų naujus kanalėlius, kurie galėtų pasiekti ląsteles ir surinkti motinos pieną. Motinai nustojus maitinti krūtimi ir pienui nebesigaminant, vyksta aktyvi prieš nėštumą atsiradusių ląstelių apoptozė ir papildomi kanalėliai, susiformavę nėštumo metu, nyksta, o krūties kanalėliai sugrįžta į prieš nėštumą buvusią būklę. Kiti, tik moterims būdingi krūties audinio pokyčiai, vyksta menstruacinio ciklo metu. Menstruacinio ciklo metu apoptozė vyksta terminaliniame latake, kartu proliferuojant liaukinio epitelio ląstelėms, keletą dienų prieš menstruacinį ciklą, o sparčiausia apoptozė vyksta menstruacinio ciklo pabaigoje.
Apoptozės reikšmė krūties vėžio vystymesi
Apoptozė yra viena svarbiausių ląstelės gyvavimo ciklo fazių. Veikiant rizikos veiksniams (endogeniniams ir egzogeniniams) vyksta ląstelių karcinogeninė stimuliacija – yra pažeidžiama ląstelės genetinė struktūra. Tai lemia tolesnę veiksmų kaskadą: yra pažeidžiami ląstelių prigimtiniai signaliniai ryšiai, ji nebegali pati susitvarkyti pažeistos DNR struktūros, todėl apoptozė šioje ląstelėje vykti negali. Ląstelių daugėja ir susiformuoja ikivėžinė būklė – atipinė duktalinė hiperplazija (ADH). Ji yra pirminis patologinio proceso žymuo, kurį nustačius prasideda aktyvi krūties audinio stebėsena. Įrodyta, kad ilgalaikis estrogenų vartojimas yra siejamas su šios būklės formavimusi [20-22]. Naujausi tyrimai patvirtina, kad EZH2 (angl. enchancer og zeste homolog 2) onkogeno ekspresija,
kuri slopina ląstelės apoptozę, yra predikcinis veiksnys, lemiantis ADH virtimą invazine karcinoma [20]. Ligos metu vyksta aktyvi intraduktalinė kloninė epitelio ląstelių proliferacija, kuri yra panaši į toliau progresuojančios patologijos duktalinės karcinomos in situ (DKIS, angl. ductal carcinoma in citu) histologinį vaizdą [23]. Šios dvi būklės tarpusavyje skiriasi labai nežymiai, todėl gali būti painiojamos. Priimta manyti, kad ADH metu nėra pakankamo navikinių ląstelių išsivystymo arba patologinių ląstelių kiekio, kurie pagrįstų blogesnę diagnozę – DKIS.
Laikui bėgant, iš ADH vystosi DKIS – būklė, laikoma neinvaziniu vėžiu, dar literatūroje minima kaip „nulinė KV stadija“. Histologiškai DKIS atrodo kaip neoplastinė epitelinių ląstelių proliferacija į pieno liaukų arba pieno kanalėlių sistemą, tačiau histologinio tyrimo metu nėra nustatomas pažeistų ląstelių perėjimas per išorinę membraną į gilesnius krūties audinius [23]. Radiologiškai ši būklė nustatoma mamografijos metu krūtyje pastebėjus mikrokalcinatus, krūties audinio sutankėjimas arba abu radinius. Jeigu patikros programos metu yra nustatomi pokyčiai, kurie kelia įtarimą dėl galimos DKIS, yra atliekama biopsija, skirta patologinei būklei patvirtinti arba atmesti [24]. Nuo pirmųjų pokyčių krūties audinyje iki kliniškai pasireiškusio KV praeina daugiau negu 30 metų, todėl procesas yra gana lėtas – tai pagrindžia patikros programų reikalingumą ir efektyvumą.
Apoptozės procesas DKIS ir KV metu pagreitėja. Jau XX a. paskutiniame dešimtmetyje mokslininkai nustatė, kad aktyvi apoptozė yra susijusi su DKIS ir navikinėmis būklėmis. A. Gandhi ir autoriai tyrime skaičiavo apoptozės indeksą (šis rodiklis išreiškiamas apoptotinių ląstelių procentu lyginant visas navikines ląsteles) DKIS pacientų populiacijoje [24]. Buvo palygintos dvi grupės, suskirstytos pagal DKIS: pirmoji buvo žemo laipsnio DKIS (ląstelės yra panašios į tipines ląsteles) ir vidutinio laipsnio DKIS (audinio ląstelės dauginasi greičiau ir yra mažiau panašios į normalias ląsteles), o kita grupė – didelio laipsnio DKIS (šios ląstelės dalinasi labai sparčiai ir yra nepanašios į sveikąsias ląsteles). Pastebėta, kad apoptozės indeksas buvo didesnis tiems pacientams, kuriems buvo nustatytas DKIS. Ši tendencija pagristų teiginį, kad ląstelėms greitai proliferuojant spartėja ir apoptozės mechanizmas, t.y. sutrinka kontrolės mechanizmai, atsakingi už ląstelių gyvavimą. Allan D. ir kolegos nustatė, kad santykinis apoptozės sumažėjimas, palyginus su vykstančia ląstelių mitoze normaliame krūties audinyje, yra galimai susijęs su KV – karcinomos – formavimusi moterims prieš menopauzę [25]. Apoptozės proceso sulėtėjimas gali sąlygoti ląstelių didėjimą, genetiškai pakitusių ląstelių, kurios lemtų neoplastinius audinio pokyčius, atsiradimą. Jau minėtų autorių, D. Allan bei A. Ghandi ir kolegų, tyrimai nustatė, kad apoptozė vyksta intensyviau krūties ikivėžinėse ir vėžinėse ląstelėse kartu su aktyviai vykstančia navikinių ląstelių proliferacija, todėl yra tikslinga manyti, kad apoptozės mechanizmas ne visai išnyksta, o kaip tik pradeda nekontroliuojamai vykti [25,26]. Tai
leidžia teigti, kad yra specifinių genų, kurie veikia šiuo ląstelės ciklo metu ir yra atsakingi už ląstelės proliferaciją. Jie veikia per tarpląstelinius ir intraląstelinius signalus.
Apoptozė kaip krūties vėžio prognostinis žymuo
Nustatyta, kad, vertinant pacienčių išgyvenamumą, svarbų vaidmenį atlieka apoptotinių ląstelių skaičius. Nors apoptozės indeksas naudojamas skaičiuoti apoptozės apimtį navikinėse ląstelėse, šis matmuo tapo vienu iš prognostinių žymenų, kuris gali numatyti pacientės išgyvenamumą [26]. Apoptozės indeksas ir jo reikšmė išgyvenamumui KV atveju buvo nagrinėtas GJ Zhang studijoje, kurioje nustatyta, kad pacientai, kuriems apoptozės indeksas buvo mažas, turėjo statistiškai reikšmingai geresnį bendrąjį išgyvenamumą ir ilgesnį laiką iki ligos atsinaujinimo [27]. JS de Jong ir kolegos taip pat tyrė apoptozės ryšį su išgyvenamumu, o jų studija parodė, kad net daugiamatėje regresinėje analizėje šis matmuo buvo reikšmingas nepriklausomai nuo kitų prognozės žymenų [28]. Didesnis apoptozės indeksas buvo lyginimas su sumažėjusiu pacienčių išgyvenamumu, o statistinis reikšmingumas buvo panašus kaip didesnis naviko dydis ar nustatyta navikinių ląstelių infiltracija į limfmazgius.
Apoptozės indeksas nėra vienintelis su pacienčių prognoze siejamas biologinis žymuo, jų išskiriama net keli, tačiau pagrindiniai – p53 genas, BCL–2 (angl. B-cell lymphoma 2) baltymų šeima (į kurią įeina ir BBC3 baltymas), FAS ligandas, citokeratinas, citochromas 5, aktyviosios kaspazės 2, 3, 7 ar 8 [29]. Jie yra tiesiogiai susiję su apoptozės mechanizmu ir turi tiesioginį ryšį su pacienčių išgyvenamumu. BCL–2 šeimos baltymai reguliuoja išorinį kelią ląstelės apoptozės inicijavimo fazės metu (nuo ląstelės mitochondrijų priklausomą kelią), todėl BCL–2 šeimos baltymų slopinimu yra pagrindžiami vaistai, skiriami vėžio gydymui [30]. YH Eom publikuotas tyrimas rodo, kad BCL–2 ekspresija buvo susijusi su pacienčių, sergančiu KV, jaunu amžiumi, ER ir PR buvimu, HER2 onkogeno nebuvimu [31]. Pacienčių, turėjusių didesnę BCL–2 geno ekspresiją, laikas iki simptomų pasikartojimų buvo reikšmingai ilgesnis kaip ir laikas iki ligos atkryčio. Rezultatai pagrindžiami efektyviu gydymu, taikant hormonų terapiją pacientėms, turinčioms PR ir ER. X Yang parengta metaanalizė atskleidė, kad aukšta kaspazių 3 ekspresija daugiamatėje regresinėje analizėje buvo nepriklausomas veiksnys, reikšmingai pabloginantis pacienčių išgyvenamumą [32]. J Yang metaanalizė patvirtina aukšto citokeratino 18 kiekio kraujo serume ir blogesnės pacienčių prognozės sąsajas su agresyvesniu, greitai infiltruojančiu naviku [33]. Tyrimai įrodo, kad šie biologiniai apoptozės žymenys gali prognozuoti pacienčių išgyvenamumą, tačiau kol kas jų naudojimas medicinos praktikoje yra apribotas, nes nėra standartizuotų testų, be to, išauga pacienčių diagnostikos
kaštai. Todėl naujų, efektyvių ir statistiškai patikimų prognostinių biologinių žymenų paieška vis dar išlieka aktuali.
TP53 geno ir koduojamo baltymo vaidmuo pacientėms, sergančioms krūties vėžiu
TP53 genas ir jo koduojamas baltymas, jų funkcija ir ryšys su prognoze
TP53 genas, kuris koduoja p53 baltymą buvo atrastas 1979 metais [34]. TP53 yra lokalizuotas 17 chromosomos trumpajame petyje 13.1 lokuse. Šis genas yra laikomas vienu iš pagrindinių organizmo genų, dalyvaujančių kancerogenezės procese. Dėl savo savybės saugoti genomą nuo mutacijų jis yra vadinamas naviko formavimąsi slopinančiu genu [35].
Geno struktūra:
1. N-galo transkripcijos aktyvacijos domenas (TAD), kuris aktyvuoja transkripcijos faktorius; 2. Aktyvacijos domenas (AD2), kuris yra atsakingas už apoptozės inicijavimą;
3. Aminorūgšties prolino praturtintas domenas, kuris svarbus apoptozės aktyvinimui. Veikia per branduolio transportavimą per baltymo mitogeno aktyvinamą baltymo kinazę (angl. mitogen-activated protein kinase, MAPK);
4. Centrinis DNR surišantis domenas (angl. DNA-binding domain). Šis regionas atsakingas už p53 geno represorių LMO3 surišimą [36];
5. Branduolio lokalizacijos signalas (angl. nuclear localization signaling) – aminorūgščių seka, kuri atsakinga už baltymų transportą į ląstelės branduolį;
6. Homo–oligomerizacijos domenas (OD), svarbus p53 aktyvumui in vivo; 7. C–galas, kuris prislopina DNR surišančio domeno jautrumą.
TP53 geno koduojamas transkripcijos faktorius p53 reaguoja į įvairius aplinkos veiksnius, kurie reguliuoja tikslinius genus ir pradeda ląstelės ciklo sustabdymą, DNR pažaidos taisymą, angiogenezę ar apoptozės reguliavimą. Apoptozę jis veikia per ne ląstelės dalijimosi metu citoplazmoje vykstančius procesus. Ląstelės neveikiant išoriniams ir vidiniams stresiniams faktoriams, p53 kiekis joje yra nedidelis, o neaktyvios formos jis išlaikomas dėl ubikvitino ligazės MDM2 (angl. mouse double minute 2) veikimo. Ubikvitino ligazė MDM2 slopina p53 transkripcinį aktyvumą ir, prisijungdama prie p53 ligazės, skatina jo sunykimą [37]. Veikiant stresiniams veiksniams, p53 yra aktyvinimas pavienių kinazių. Šiuo metu yra išskiriami trys keliai, kuriais manoma, kad genas yra aktyvinamas: a) nuo ataksijos–telangektazijos mutavusį (angl. ataxia– telangectasia mutated [ATM])/ žmogaus Rad53 homologą veikiančio, priklausomas kelias, kuris
aktyvinamas dėl DNR dvigrandės struktūros pažaidos; b) nuo INK4 geno alternatyvaus produkto priklausomas kelias; c) priklausomas nuo ultravioletinių spindulių ir kitų citotoksinių priešvėžinių veiksnių, tačiau yra nepriklausomas nuo kitų kelių [38]. Stresinių veiksnių buvimas lemia p53 aktyvaciją ir padidėjusį jo kiekį ląstelėje.
Pagal geno aktyvinimą yra skiriami du tipai: mutavęs TP53 genas ir laukinio tipo TP53 (angl. wild–type TP53). Mutavęs p53 sumažina baltymo veikimą, naikindamas fosforilintas šio baltymo formas, tuo tarpu laukinio tipo p53 didina MDM2 aktyvumą, kuris savaime slopina geno ekspresiją [39]. TP53 geno tipas navikinių ligų atveju yra biologinis žymuo, galintis prognozuoti laiką iki ligos atsinaujinimo bei pacienčių išgyvenamumą. Y. Pan ir bendraautorių tyrimas parodė, kad pacientėms, kurių ląstelėse nustatyti antigenai prieš p53, turėjo blogesnius išgyvenamumo rodiklius (daugiamatėje regresinėje analizėje pacientės, kurios sirgo trigubai neigiamu KV tipu, turėjo 4 kartus didesnį šansą, kad navikas recidyvuosis, 3,5 karto trumpesnį laikotarpį iki recidyvo nustatymo ir net 20 kartų blogesnį išgyvenamumą stebėjimo laikotarpiu) [40]. N. A. Ungerleiderio ir kolegų atliktas tyrimas, kuriame buvo lyginti laukinio tipo TP53 ir mutacinis TP53, parodė, kad pacienčių, kurios turėjo laukinio tipo TP53 ir buvo gydomos chemoterapija, išgyvenamumas buvo reikšmingai blogesnis nei pacienčių, kurios turėjo matavusį TP53 [41].
TP53 geno vieno nukleotido polimorfizmai
Vieno nukleotido polimorfizmai (VNP) yra dažniausiai nustatomos DNR sekos variacijos, kurios apima vieno nukleotido poros pokyčius bei gali lemti skirtingas fenotipines išraiškas. Normaliame žmogaus genome jų yra apie 5 milijonus. VNP paaiškina pakitusios DNR paveldėjimą tarp kartų. Nors ne visi VNP yra susiję su ligų vystymusi, yra įrodyta, kad kai kurių pasireiškimas yra siejamas su ligos vystymusi, atsaku į skiriamą gydymą, arba aplinkos veiksnius. Pastaruoju metu medicinoje VNP tampa plačiau naudojami kaip biologiniai žymenys prognozuoti ligų atsiradimą ar sergančiojo išgyvenamumą.
Funkciniai VNP p53 gene yra dažniausiai randami introne [42]. Nors iki galo nėra aišku, kokias funkcines ypatybes suteikia VNP buvimas šioje vietoje, yra manoma, kad VNP veikia p53 geno funkciją per padidėjusį mutantiškumą dėl keičiamos DNR sekos, padidėjusio splaisingo, pakitusio transkripcijos ar transliacijos stabilumo [43,44]. Tačiau MM. Candeias savo tyrime pateikė kitą teoriją, kad yra iki šiol nenustatytas ryšis tarp TP53 iRNR ir MDM2 [45]. TP53 iRNR regionas, koduojantis jungimąsi prie MDM2, reaguoja tiesiogiai su MDM2 RING domenu. Tai slopina E3 ligazės aktyvumą ir aktyvina p53 iRNR transliaciją. Esant su navikiniu procesu siejamomis VNP mutacijomis TP53, iRNR slopina jos prisijungimą prie MDM2, o tai pasireiškia sumažėjusiu p53
baltymo aktyvumu. Įrodyta, kad duplikacijos TP53 gene padidina įvairių navikų pasireiškimo dažnį labiau nei genetiniai pokyčiai kituose genuose [46]. Pagrindiniai VNP, kurie siejami su navikinių ląstelių formavimusi, yra rs17878362: introno 3 duplikacija arba kitaip PIN3 (angl. polymorphism in intron 3), rs1800371: (dar žinomas kaip Pro47Ser) ir rs1042522: (dar žinomas kaip Pro72Arg).
TP53 rs17878362 geno polimorfizmas tyrimuose vertinamas įvairių navikinių susirgimų atveju, nes manoma, kad šis VNP paaiškina blogesnį pacientų išgyvenamumą bei gali būti siejamas su įvairių vėžinių procesų blogesnėmis baigtimis. C. Sagne metaanalizėje analizavo tyrimus, susijusius su PIN3 polimorfizmu ir trijų lokalizacijų navikais: storosios žarnos, plaučių ir krūties [47]. Polimorfizmas turėjo įtakos storosios žarnos vėžiui ir riziką didino 67 % tarp homozigotinių A2A2 pacientų, o KV imtyje nustatytas beveik penktadaliu didesnis sergamumas tarp heterozigotų A1A2 pacientų, taip pat stebėta tendencija, kad KV rizika yra padidėjusi tarp pacientų, turinčių A2 alelį. Analizėje taip pat buvo pateikta pacientų genotipo ir tautybės koreliacija. Buvo pastebėta, kad indų tautybės asmenys, turintys A2A2 genotipą, turėjo didesnę riziką susirgti onkologinėmis ligomis, tuo tarpu Šiaurės Europoje ir Viduržemio jūros šalyse navikinis procesas dažnesnis buvo tarp pacientų, turinčių A1A2 genotipą. Kita metaanalizė teigia, kad šio VNP radimas didelių imčių klinikiniuose tyrimuose yra pakankamai jautrus, todėl galima teigti apie navikinio audinio formavimosi galimybę krūties audinyje [46].
Nepaisant to, kad p53 polimorfizmas rs1800371: Pro47Ser yra laikomas retu polimorfizmu ir jį nagrinėjančiu studijų nėra daug, jo buvimas gali būti siejamas su KV premenopauzinėje Afrikos moterų populiacijoje (šansų santykis 1,72) [48]. Šio polimorfizmo veikimas pagrįstas aminorūgšties prolino pasikeitimu į seriną. Prolinas yra svarbus, kad būtų atpažįstamas tiesioginių prolino kinazių p38 MAPK (angl. p38 mitogen-activated protein kinases) [49]. Šis pokytis lemia sumažėjusį p53 tikslinių genų– p53AIP1 ir BBC3 – aktyvinimą bei sumažėjusią apoptozės raišką. Šis VNP siejamas ne tik su onkologiniais procesais, tačiau ir su Hašimoto tiroiditu, atviro kampo glaukoma bei spina bifida [50,51].
Visgi daugiausiai studijų yra atlikta nagrinėjant rs1042522: Pro72Arg polimorfizmą. Tyrimai atskleidė, kad laukiniame p53 geno tipe prolino pakeitimas argininu yra siejamas su aktyvesne apoptoze negu nepakitęs variantas. Šis pakitimas turi didesnį potencialą reaguoti su MDM2 [52]. Mutantiniame p53 geno variante šis VNP yra laikomas vidiniu geno modifikatoriumi. Priešingai nei laukinio tipo gene mutantiniame tipe Arg72 alelis siejamas su p73 geno inicijuotos apoptozės slopinimu [53]. Atliktose studijose, nagrinėjančiose storosios žarnos, plaučių, galvos ir kaklo navikų populiacijas, mutantiniame geno p53 variante argininas buvo statistiškai dažniau nustatomas nei prolinas. Duomenys apie šio VNP pasireiškimą tarp pacienčių, sergančių KV, yra prieštaringi ir priklauso nuo tiriamųjų imties: Japonijos moterų pomenopauzinėje populiacijoje šis VNP buvo
nepriklausomas veiksnys susirgti KV, JAV Rytų pakrantės moterų populiacijoje šis polimorfizmas 32 % didino KV riziką, tačiau Vokietijoje atliktoje studijoje jokių sąsajų nebuvo rasta [54-56]. Kadangi nėra atliktų tyrimų nagrinėjančio rs1042522: Pro72Arg polimorfizmą Lietuvos moterų populiacijoje, šiame darbe jis buvo pasirinktas kaip vienas iš VNP.
BBC3 geno ir koduojamo baltymo vaidmuo krūties vėžio patogenezėje
BBC3 genas ir jo koduojamas baltymas, jų funkcija
Apie BBC3 geną (angl. BCL-2 binding component 3), kitaip vadinamą PUMA (angl. p53-upregulated modulator of apoptosis), pirmieji straipsniai pasirodė 2001 metais J. Yu ir bendraautorių komandos [57]. Šio geno atradimas buvo siejamas su p53 baltymu, o veikimo mechanizmą spėjo kaip tiesioginį su TP53 genu siejamos apoptozės inicijavimą. BBC3 yra lokalizuotas 19 chromosomos ilgajame petyje 13.32 lokuse [58]. Šis genas susideda iš 4 egzonų: pirmasis turi 2 dalis – 1A ir 1B egzonus, o antrasis yra pradžios kodonas. 1A egzonas sudarytas iš didelio tankio guanino ir citozino nukleotidų. Yra nustatyti du BBC3 trasnskripcijos tipai: PUMA– ir PUMA–, tačiau iki šiol skirtumų atrasta nedaug, o BCL–2 geną jie abu veikia vienodai [59].
BBC3 geno veikimas aiškinamas apoptozės proceso paspartinimu navikiniame audinyje, veikiant ląstelės citoplazmoje esančias mitochondrijas. Baltymo struktūra yra prisitaikiusi atlikti ląstelės apoptozės funkciją: BH3 struktūra yra reikalinga jungtis su BCL–2 šeimos baltymais, o C– galas turi hidrofobinį domeną, kuris lemia lokalizaciją mitochondrijose. BBC3 genas lemia programuotą ląstelių mirtį, veikdamas dviem keliais: sukeldamas ląstelės mitochondrijos žūtį ir veikdamas per BCL–2 šeimos baltymus. BBC3 veikia apoptozę netiesiogiai aktyvuodamas BAX/BAK per BCL–2 baltymų šeimą. Prisijungdamas C galu, šis genas slopina BCL–2, BXL–2 ar BCL–XL aktyvumą per BH3 domeną. Sumažėjus BCL–2 baltymų šeimos aktyvumui, skatinama mitochondrijų disfunkcija ir apoptogenetinių baltymų (citochromo C, apoptozę sukeliančio faktoriaus [angl. apoptosis-inducing factor [AIF]) aktyvinimą [60]. Šie baltymai sukelia kaspazių aktyvumo padidėjimą ir taip tiesiogiai veikia apoptozę. Kitas kelias per ląstelės mitochondrijų membranų padidėjusį laidumą skysčiui ir depoliarizaciją, mitochondrijų apoptogenetinių baltymų (citochromo C, AIF, SMAC) išskyrimą, o tai lemia kaspazių aktyvaciją, kas programuoja ląstelių žūtį.
Tyrimų, nagrinėjančių BBC3 geno prognostinę vertę KV sergančioms pacientėms, beveik nėra atlikta. CG Roberts atlikta studija analizavo pacienčių, sergančių KV, šio geno prognostinę vertę
jas gydant su tamoksifenu (estrogenų receptorių moduliatoriumi) [61]. Autoriai nustatė, kad aukšto laipsnio BBC3 geno raiška buvo susijusi su ER ekspresija, mažu naviko diferenciacijos laipsniu ir dydžiu. Šio geno aukšto laipsnio ekspresija išliko nepriklausomas mirties, sukeltos KV, veiksnys. Kiti tyrėjai nustatė, kad egzistuoja BBC3 ir HER2 ryšys [62]. Didesnis BBC3 geno reguliuojamo baltymo kiekis buvo nepriklausomas faktorius, lemiantis HER2 aktyvaciją, sąveikaujantis kartu ir mitochondrijos, ir ne mitochondrijos lygmeniu. Fosforilintas BBC3 genas buvo rastas tarp tų pacienčių, kurios turėjo padidėjusią HER2 produkciją ir sirgo KV. Autoriai tyrė vaistų, skiriamų gydyti HER2 ekspresuojantį KV, potencialų veikimo mechanizmą. Atlikta studija iškėlė hipotezę, kad tirozino fosforilinimui atsparus BBC3 geno variantas kartu su BH3 mimetikais gali reikšmingai padidinti chemoterapijai skiriamų vaistų efektyvumą, gydant KV sergančias pacientes su išreikštu HER2 aktyvumu. Nors ir yra duomenų, kad geno raiška gali turėti įtakos pacienčių išgyvenamumui, tačiau nebuvo analizuoti polimorfizmai, kurie lemtų blogesnę prognozę šios populiacijos tiriamiesiems, todėl šios informacijos vis dar trūksta.
BBC3 geno vieno nukleotido polimorfizmai
Kadangi BBC3 genas vis dar yra mažai ištirtas, šiuo metu esančių polimorfizmų literatūroje aprašyta nedaug, o jų sąsajos su KV patogeneze bei prognostine verte yra žinoma dar mažiau. Dabar labiausiai analizuotas BBC3 geno rs2032809 polimorfizmas. Z. Zhou ir autoriai, analizavę šį polimorfizmą su 16 ŽPV virusu asocijuota kaklo bei galvos plokščiųjų ląstelių karcinoma, pastebėjo tendenciją, kad GG genotipas buvo asocijuotas su mažesne raiška nei GA/AA genotipai [63]. Autoriai iškėlė hipotezę, kad šie polimorfizmai skirtingai reguliuoja tranksripcijos faktorių galimybę susirišti su BBC3 baltymo promotoriumi. Nustatyta, kad šio polimorfizmo A alelis stipriau jungdavosi prie branduolinių baltymų nei G alelis. Tai rodo galimai skirtingą branduolio transkripcijos veiksnių surišimo afinitetą.
Literatūroje aprašytos BBC3 geno sąsajos su prostatos vėžiu. J. Oh analizavo šio polimorfizmo ypatumus tarp pacientų, sergančių prostatos vėžiu, ir taikyto gydymo komplikacijų [64]. Būtent šis polimorfizmas buvo nustatytas, kaip turintis sąsajų su tolimųjų metastazių išsivystymu pacientams ilguoju stebėjimo laikotarpiu. Ši tyrėjų grupė nustatė, kad šis genas yra galimas biologinis žymuo gastrointestinalinėms ir genitourinalinėms tolimosioms komplikacijoms po spindulinės terapijos. Nustatyta, kad AA genotipas 3 metų laikotarpyje buvo siejamas su blogesnėmis seksualinės funkcijos išeitimis nei kiti genotipai. M. A. Gingerich ir kolegos šį polimorfizmą tyrė tarp pacientų, sergančių galvos ir kaklo navikais, susijusiais su ŽPV 16 serovariantu [65]. Tyrimas parodė, kad BBC3 polimorfizmas gali būti rizikos veiksnys tarp niekada nerūkiusių, nevartojusių alkoholio,
jaunų pacientų, sergančių kaklo ir galvos, ar pacientų, kuriems diagnozuoti ryklės navikai. Kadangi BBC3 geno rs2032809 polimorfizmas turi nustatytą funkcinę reikšmę ir yra žinomos jo sąsajos su kitais navikais, šis polimorfizmas buvo pasirinktas tolesnei analizei mūsų krūties vėžio pacienčių kohortoje.
TYRIMO METODIKA
Tyrimo planavimas
Prieš pradedant tyrimą buvo atlikta literatūros apžvalga ir mokslinių tyrimų bei straipsnių analizė, siekiant išsiaiškinti KV epidemiologinius ypatumus, dažniausiai su KV siejamus genus bei jų polimorfizmus, BBC3 ir TP53 genus bei jų reikšmę klinikiniams veiksniams bei tolimoms išeitims. Nagrinėjant literatūrą, buvo nustatyta, kad didelės apimties analizuojančių tolimąjį pacienčių išgyvenamumą tyrimų, nagrinėjančių BBC3 ir TP53 genų polimorfizmus, nebuvo atlikta, todėl vieningos nuomonės, kaip genai sąlygoja KV eigą, nėra. Šio tyrimo metu buvo nuspręsta nagrinėti BBC3 geno rs2032809 polimorfizmą ir TP53 geno rs1042522 polimorfizmą bei jų įtaką KV morfologinėms išraiškoms bei pacienčių išeitims po paskirto gydymo. Tyrimas vyko Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų (LSMUL KK) ligoninės Onkologijos ir hematologijos klinikoje, o tiksliniai tyrimai šiam darbui buvo atliekami LSMU Medicinos akademijos Medicinos fakulteto Onkologijos instituto Onkologijos mokslo laboratorijoje.
Tyrimo objektas
BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 genų polimorfizmai ankstyvu KV sergančioms pacientėms.
Tiriamųjų atranka
Į tyrimą buvo įtrauktos 171 pacientės, sergančios ankstyvos stadijos KV bei gydytos LSMU ligoninėje Onkologijos ir hematologijos klinikoje. Tyrimui atlikti buvo gautas bioetikos leidimas Nr. BEC–MF–411. Įtraukimo į tyrimą kriterijai:
• Pilnametės pacientės (> 18 m.);
• Diagnozuotas ankstyvos (I–os ar II–os) stadijos KV: T1 N0, T2 N0, T1 N1, T2 N1;
• Pacientės, sutikusios dalyvauti tyrime bei pasirašiusios sutikimo formą po to, kai buvo supažindintos su tyrimo eiga.
Į tyrimą neįtrauktos pacientės, turinčios kitų onkologinių ar kitų sunkių gretutinių ligų, kurios galėtų sąlygoti trumpesnį pacienčių išgyvenamumą stebėjimo laikotarpiu.
Tyrimo metodai
1.1. Klinikiniai ir patomorfologiniai naviko duomenys
Į tyrimą įtrauktos pacientės, kurių periferinio kraujo mėginiai ir klinikiniai duomenys buvo saugomi LSMU MA MF OI Onkologijos mokslo laboratorijoje, pasirašiusios informuotą sutikimą (Nr. BE-2-10), gavus BEC–MF–411 bioetikos leidimą.
Buvo įvertintos tirtų polimorfizmų sąsajos su žinomais KV prognostiniais veiksniais: pacienčių amžiumi diagnozės nustatymo metu (≤ 40 m./ > 40 m.), naviko dydžiu (≤ 2 cm/ > 2–5 cm), limfmazgių būkle (teigiama/ neigiama), estrogenų receptorių (ER) būkle (teigiami/neigiami), progesterono receptorių (PR) būkle (teigiami/neigiami), HER2 būkle (teigiama/neigiama) bei naviko diferenciacijos laipsniu (G1+G2/ G3).
1.2. DNR išskyrimas iš kraujo
Panaudojant silikagelio kolonėlių metodą („GeneJET Genomic DNA Purification Kit [ThermoFisher]“ DNR išskyrimo rinkinys), buvo išskirta DNR iš kraujo leukocitų. DNR išskyrimas vyko dviem etapais: buvo atliktas ląstelių lizavimas ir DNR išvalymas bei eliucija.
A. Lizavimui reikalingi reagentai (200 μl kraujo, 20 μl proteinazės K ir 20 μl RNazės A) maišant ir purtant buvo supilti į sterilų centrifuginį mėgintuvėlį bei palikti 2 minutėms kambario temperatūroje. Tuomet į mėgintuvėlį buvo pripilta 200 μl lizės buferio (PureLinkGenomic Lysis/ Binding Buffer) bei dar kartą sumaišoma. Mėgintuvėlis buvo inkubuojamas 55 oC temperatūroje 10 minučių. Po to į esamą mišinį buvo įpilta 200 μl 96–100 % etanolio, o tada dar kartą suplakama ir maišoma.
B. DNR išvalymas ir eliucija buvo atliekami naudojant PureLink® Spin Column išvalymo kolonėles. Paruoštas lizuotas mišinys buvo perkeliamas ant kolonėlių, o šios buvo įstatomos į skysčių surinkimo mėgintuvėlį. Pradedamas centrifugavimas 10 000 xg per minutę greičiu. Procedūrai pasibaigus, skysčių surinkimo mėgintuvėlis pakeistas tuščiu. Tuomet ant DNR išvalymo kolonėlės buvo pilama 500 μl DNR plovimo buferio 1 (DNA Wash Buffer 1) bei kartojamas centrifugavimas 10 000 xg per minutę greičiu. Skystis išpilamas iš surinkimo mėgintuvėlio ir vėl įstatoma DNR išvalymo kolonėlė, ant kurios pilama 500 μl DNR plovimo buferio 2 (DNA Wash Buffer 2). Paskutinį
kartą kartojamas centrifugavimas 3 minutes 12 000 xg greičiu. DNR išvalymo ir eliucijos proceso metu išskirta DNR perkeliama į naują mėgintuvėlį.
1.3. BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 genų polimorfizmų nustatymas 1.3.1. Polimerazės grandininė reakcija
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) buvo naudojama amplifikuoti genų BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmus. Šiam procesui naudotas vienodas mišinys abiejų genų polimorfizmų atvejais (1 lentelė). Į kiekvieną PGR mėgintuvėlį pilta 23 µl PGR mišinio ir 2 µl DNR. Remiantis kitų autorių atliktomis studijomis, buvo pasirinkti tiesioginiai ir atvirkštiniai pradmenys abiem polimorfizmams (2 ir 3 lentelės) [63,66]. PGR reakcijų programa ir eiga pateikiama 4 ir 5 lentelėse.
1 lentelė. Genų polimorfizmams tirti naudoto PGR mišinio sudėtis
Reagentas Kiekis, µl (1 mėginiui) H2O 19,3 10x DreamTaq buferis 2,5 dNTP (10 mM) 0,5 Pradmuo F (20 pmol/µl) 0,3 Pradmuo R (20 pmol/µl) 0,3
DreamTaq polimerazė (5U/µl) 0,1
2 lentelė. BBC3 geno rs2032809 polimorfizmui nustatyti naudotos pradmenų sekos
Pradmuo Pradmens seka
Tiesioginis (F) 5′–GAATAATCGGGGAAAGCGAAAGAAG –3′
Atvirkštinis (R) 5′–AGTGTGGGGCTGGCTGAGTAAG–3′
3 lentelė. TP53 geno rs1042522 polimorfizmui nustatyti naudotos pradmenų sekos
Pradmuo Pradmens seka
Tiesioginis (F) 5′–TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA–3′
4 lentelė. BBC3 geno rs2032809 polimorfizmui nustatyti naudota PGR programa
Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
94 ºC 5 min – 94 ºC 30 s 35 58 ºC 45 s 72 ºC 30 s 72 ºC 7 min – 4 ºC ∞ –
5 lentelė. TP53 geno rs1042522 polimorfizmui nustatyti naudota PGR programa
Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
95 ºC 3 min – 95 ºC 25 s 40 61,8 ºC 35 s 72 ºC 25 s 72 ºC 7 min – 4 ºC ∞ –
1.3.2. PGR–RFIP metodas BBC3 geno rs2032809 polimorfizmui nustatyti
BBC3 geno rs2032809 polimorfizmui nustatyti buvo naudojamas restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (RFIP) metodas. Tyrimo metu naudota restrikcijos endonukleazė MboII. PGR metu buvo pagausintas 191 bp dydžio fragmentas. Tyrimo metu karpymui PGR–RFIP metodu buvo naudojama 5 µl RFIP mišinio ir 10 µl PGR produkto (sudėtis pateikiama 6 lentelėje), reakcija vyko 1–16 val., o jos metu buvo užtikrinta optimali – 37 oC temperatūra. A alelis reakcijos metu kerpamas į du fragmentus: 157 bp ir 34 bp, o G alelis liko nekirptas.
6 lentelė. BBC3 geno rs2032809 polimorfizmui RFIP mišinio sudėtis
Reagentas Kiekis, µl
(1 mėginiui)
H2O 3,75
Restrikcijos endonukleazė MboII (5 U/µl) 0,75
1.3.3. PGR–RFIP metodas TP53 geno rs1042522 polimorfizmui nustatyti
TP53 geno rs1042522 polimorfizmui nustatyti buvo naudojamas restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (RFIP) metodas. Tyrimo metu naudota restrikcijos endonukleazė BstUI. PGR metu buvo pagausintas 199 bp dydžio fragmentas. Tyrimo metu karpymui PGR–RFIP metodu buvo naudojama 5 µl RFIP mišinio ir 10 µl PGR produkto (sudėtis pateikiama 7 lentelėje), reakcija vyko 1–16 val., o jos metu buvo užtikrinta optimali – 37 oC temperatūra. G alelis reakcijos metu kerpamas į du fragmentus: 113 bp ir 86 bp, o C alelis liko nekirptas.
7 lentelė. TP53 geno rs1042522 polimorfizmui RFIP mišinio sudėtis
Reagentas Kiekis, µl (1 mėginiui)
H2O 3,75
10x buferis R 1
Restrikcijos endonukleazė BstUI (10 U/µl) 0,75
1.3.4. DNR elektroforezė
Elektroforezė buvo naudojama frakcionuojant PGR–RFIP metodu gautus produktus. Elektroforezė buvo atliekama horizontalioje vonelėje, naudojant 3 % agarozės gelį. Buvo paruoštas 1xTBE buferis (50 ml 1xTBE buferio atskiesta su 450 ml distiliuoto vandens). Tuomet buvo pagamintas gelis iš 1 g agarozės ir 50 ml 1xTBE buferio. Kaitinant gautą mišinį, buvo laukta, kol ištirps agarozė ir mišinys taps skaidrus. Į jį buvo įlašinta 5 μl etidžio bromido ir viskas išmaišyta iki tolygaus pasiskirstymo. Mišinys buvo supilamas į rėmelį ir paliekamas stingti. Mišiniui atvėsus ir sustingus rėmelis buvo įdėtas į elektroforezės vonelę, kurioje galiausiai buvo užpiltas 1xTBE buferiu.
Elektroforezės eiga:
• Į pirmąjį šulinėlį buvo leidžiama 3,5 μl molekulinės masės žymens. Tiek tiriant TP53 geno rs1042522 polimorfizmą, tiek ir BBC3 geno rs2032809 polimorfizmą, buvo naudojamas GeneRuler Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva)
molekulinės masės žymuo. Į likusius šulinėlius buvo leidžiama 15 μl PGR mišinio ir 3 μl LoadingDye (6x) užnešimo dažo.
• Elektroforezė buvo atliekama esant 130 V įtampai. Tiriant abu polimorfizmus elektroforezė truko 30–40 min.
• Panaudojant gelių dokumentavimo sistemą („ClearView UV transiluminator“, Cleaver Scientific Ltd., Didžioji Britanija), elektroforezės rezultatai buvo vizualizuojami transiliuminatoriuje UV šviesoje:
o 1 paveikslėlyje – TP53 alelių elektroforegrama: 1 takelyje – mėginys, kuriame nustatytas genotipas CC (199 bp fragmentas), 6 ir 10 takeliuose – CG genotipas (199, 113 ir 86 bp fragmentai), 2–5 ir 7–9 takeliuose – GG genotipas (113 ir 86 bp fragmentai).
o 2 paveikslėlyje – BBC3 alelių elektroforegrama: 2 ir 3 takeliuose – mėginiai, kuriuose nustatytas genotipas AA (157 ir 34 bp fragmentai), 1, 4–6, 8–11, 13 takeliuose – AG genotipas (191, 157 ir 34 bp fragmentai), 7, 12, 14, 15 takeliuose – GG genotipas (191 bp fragmentas). Kairėje pusėje nurodyti molekulinės masės žymens DNR fragmentų dydžiai.
1 paveikslėlis. TP53 geno rs1042522 alelių elektroforegrama.
Pacientų ligos sekimas tyrimo metu
Pacientės sekimo atskaitos tašku buvo laikoma data, kai buvo atlikta naviką patvirtinanti
biopsija. Laikas iki ligos atkryčio (LLA) vertintas kaip laikas nuo atskaitos taško iki vietinio ar tolimojo ligos atsinaujinimo (kuris įvyko pirmas). Laikas iki metastazavimo (LM) buvo įvardijamas kaip laikas nuo biopsijos datos iki tolimųjų metastazių išsivystymo nustatymo datos. Bendru išgyvenamumu (BI) buvo laikytas laikas nuo pirminės biopsijos iki mirties dėl bet kurios priežasties (onkologinės ar neonkologinės mirties diagnozės).
Duomenų analizės metodai
Tyrimo metu buvo nustatyti TP53 geno rs1042522 polimorfizmo bei BBC3 geno rs2032809 polimorfizmo alelių bei genotipų dažnis išreikšti santykiu. Buvo vertintas genotipų ir alelių pasiskirstymo atitikimas Hardžio – Veinbergo dėsniui. Klinikinių bei morfologinių ir išgyvenamumo ryšis su polimorfizmu buvo analizuojamas taikant daugialypį paveldėjimo modelį. Tirtų genų polimorfizmų ryšiui su klinikiniais ir morfologiniais duomenimis bei išgyvenamumu nustatyti buvo naudojamas Pirsono Chi–kvadrato testas, o rezultatai išreiškiami dažniu bei procentais. Nustatyti šansų santykiai (ŠS) buvo pateikiami kartu su 95 % pasikliautinaisiais intervalais (PI), jiems nustatyti naudota logistinė regresija. Išgyvenamumo analizė buvo atliekama naudojant vienmatę Kokso proporcingų rizikų regresinę analizę. Nustatyta santykinė rizika (SR) buvo pateikiama kartu su 95 % PI. Tie polimorfizmai, kurie buvo reikšmingi vienmatėje regresinėje analizėje, buvo įtraukti į daugiamatę Kokso proporcingų rizikų regresinės analizės modelį kartu su klinikiniais (pacientės amžius, naviko dydis bei diferenciacijos laipsnis, limfmazgių pažeidimas) bei morfologiniais naviko duomenimis (ER, PR, HER2 ekspresija). Tolimųjų išeičių skirtumai tarp grupių buvo pateikti naudojant Kaplan–Meierio kreives. Skirtumai tarp kreivių vertinti pagal Breslow ir log–rank testą. Kadangi daugiau nei 50 % pacienčių sekimo įvykiai nebuvo nustatyti, palyginamajai išeičių analizei buvo naudoti mėnesių vidurkiai. Statistiškai reikšmingais buvo laikomi tie rezultatai, kurių p reikšmė mažesnė nei 0,05. Duomenys buvo analizuojami SPSS (Statistical Package for the Social Sciences; IBM Corp., Armonk, Niujorkas, JAV) 26 vers.
REZULTATAI
1. Tiriamosios imties apibūdinimas bei BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmų pasiskirstymas tiriamųjų grupėje
Tyrime dalyvavo 171 ankstyvu KV sergančios pacientės, kurių dauguma buvo vyresnės nei 40 metų – 128 (66,9 %). Pagal naviko dydį grupę iki 2 cm sudarė 114 pacienčių (66,7 %), o daugiau nei 2 cm – 57 moterų (33,3 %). Pagal limfmazgių būklę grupės pasiskirstė taip: nepažeistus 105 tiriamosios (61,4 %) ir pažeistus 66 pacientės (38,6 %). Pagal naviko diferenciacijos laipsnį: 132 tiriamųjų (77,2 %) navikai buvo gerai arba vidutiniškai diferencijuoti (naviko diferenciacijos laipsnis atitinkamai G1 arba G2) ir 39 (22,8 %) – blogai diferencijuoti (G3). ER ekspresija buvo nustatyta 116 (67,8 %) tirtų navikų, PR – 101 (59,1 %), o HER2 – 32 (18,7 %).
Pacienčių sekimo laikotarpio mediana 38 mėn. (min. 5 mėn. – max. 202 mėn.). Cenzūravimo metu 32 (18,7 %) moterims iki cenzūravimo datos buvo pasireiškęs lokalus ir/ ar tolimasis ligos progresas, 27 (15,8 %) pacientėms buvo nustatytos tolimosios metastazės, 22 (12,9 %) tirtos moterys buvo mirusios dėl bet kurios priežasties (onkologinės ar neonkologinės mirties diagnozės).
Abiejų polimorfizmų genotipų dažnis tirtoje populiacijoje atitiko Hardžio–Veinbergo dėsnį. Tiriamųjų BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmų genotipų ir alelių pasiskirstymas pateiktas 8 ir 9 lentelėse.
8 lentelė. BBC3 geno rs2032809 polimorfizmo alelių ir genotipo pasiskirstymas tiriamojoje grupėje.
9 lentelė. TP53 geno rs1042522 polimorfizmo alelių ir genotipo pasiskirstymas tiriamojoje grupėje.
Alelių ir genotipų pasiskirstymas
A G AA AG GG
N 90 81 49 82 40
Dažnis 0,53 0,47 0,29 0,48 0,23
Alelių ir genotipų pasiskirstymas (N; dažnis)
C G CC CG GG
N 40 131 10 60 101
2. BBC3 rs2032809ir TP53 rs1042522 polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis
Analizuojant BBC3 geno rs2032809 polimorfizmo genotipų įtaką naviko morfologinėms ir klinikinėms savybėms, buvo nustatyta statistiškai reikšminga sąsaja tarp recesyvinio genotipo ir moterų amžiaus. Nustatyta, kad AA genotipas moterų, sergančių KV grupėje, yra rečiau susijęs su jaunesniu amžiumi lyginant su pacientėmis, turėjusiomis AG ir GG genotipus (atitinkamai 14,3 % ir 29,5 %). AA genotipo nešiotojoms KV buvo 0,40 karto (95 % PI 0,16–0,97; p reikšmė 0,042) rečiau nustatomas jaunesniame amžiuje. Nebuvo rasta sąsajų tarp šio polimorfizmo ir krūties naviko dydžio, limfmazgių pažeidimo, diferenciacijos laipsnio, receptorių (ER, PR, HER2) ekspresijos (10 ir 11 lentelės).
10 lentelė. BBC3 rs2032809 polimorfizmo genotipų ryšio su KV klinikinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas Reikšmės
(N, %) ŠS (95% PI) P reikšmė Amžiaus grupė ≤ 40 metų > 40 metų* Genotipinis AA 7 (14,3) 42 (85,7) 0,109 AG 25 (30,5) 57 (69,5) GG 11 (27,5) 29 (72,5) Recesyvinis AG–GG 36 (29,5) 86 (70,5) 1 0,042 AA 7 (14,3) 42 (85,7) 0,40 (0,16–0,97) Dominantinis GG 11 (27,5) 29 (72,5) 1 0,695 AA–AG 32 (24,4) 99 (74,9) 0,85 (0,38–1,90) Overdominantinis AA–GG 18 (20,2) 71 (79,8) 1 0,124 AG 25 (30,5) 57 (69,5) 1,73 (0,86–3,48) Naviko dydis <2 cm. * 2–5 cm Genotipinis AA 36 (73,5) 13 (26,5) 0,413 AG 51 (62,2) 31 (37,8) GG 27 (67,5) 13 (32,5) Recesyvinis AA 36 (73,5) 13 (26,5) 0,64 (0,31–1,33) 0,640
AG–GG 78 (63,9) 44 (36,1) 1 Dominantinis GG 27 (67,5) 13 (32,5) 1 0,898 AA–AG 87 (66,4) 44 (33,6) 1,05 (0,49–2,23) Overdominantinis AA–GG 63 (70,8) 26 (29,2) 1 0,235 AG 51 (62,2) 31 (37,8) 1,47 (0,78–2,79) Limfmazgių būklė Nepažeisti* Pažeisti Genotipinis AA 35 (71,4) 14 (28,6) 0,233 AG 47 (57,3) 35 (42,7) GG 23 (57,5) 17 (42,5) Recesyvinis AA 35 (71,4) 14 (28,6) 0,54 (0,26–1,10) 0,09 AG–GG 70 (71,4) 52 (42,6) 1 Dominantinis GG 23 (57,5) 17 (42,5) 1 0,563 AA–AG 82 (62,6) 49 (37,4) 0,81 (0,39–1,66) Overdominantinis AA–GG 58 (65,2) 31 (34,8) 1 0,293 AG 47 (57,3) 35 (42,7) 1,39 (0,75–2,58) * Lyginta kaip kontrolinė grupė
11 lentelė. BBC3 rs2032809 polimorfizmo genotipų ryšio su KV patomorfologinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas Reikšmės
(N, %) ŠS (95% PI) P reikšmė Naviko diferenciacijos laipsnis G1 arba G2* G3 Genotipinis AA 38 (77,6) 11 (22,4) 0,999 AG 63 (76,8) 19 (23,2) GG 31 (77,5) 9 (22,5) Recesyvinis AA 38 (77,6) 11 (22,4) 1,03 (0,55–1,94) 0,932 AG–GG 94 (77,0) 28 (23,0) 1 Dominantinis GG 31 (77,5) 9 (22,5) 1 0,913 AA–AG 101 (77,1) 30 (22,9) 1,04 (0,53–2,05) Overdominantinis AA–GG 19 (23,2) 20 (22,5) 1 0,988 AG 63 (76,8) 19 (23,2) 1,01 (0,56–1,78)
Estrogenų receptoriai Neigiami* Teigiami Genotipinis AA 15 (30,6) 34 (69,4) 0,783 AG 29 (35,4) 53 (64,6) GG 11 (27,5) 29 (72,5) Recesyvinis AA 15 (30,6) 34 (69,4) 1,11 (0,54–2,26) 0,783 AG–GG 40 (32,8) 82 (67,2) 1 Dominantinis GG 11 (27,5) 29 (72,5) 1 0,471 AA–AG 44 (33,6) 87 (66,4) 0,75 (0,34–1,64) Overdominantinis AA–GG 53 (64,6) 63 (70,8) 1 0,390 AG 29 (35,4) 53 (64,6) 0,75 (0,40–1,44) Progesteronų receptoriai Neigiami* Teigiami Genotipinis AA 18 (36,7) 31 (63,3) 0,381 AG 38 (46,3) 44 (53,7) GG 14 (35,0) 26 (65,0) Recesyvinis AA 18 (36,7) 31 (63,3) 1,28 (0,65–2,53) 0,479 AG–GG 52 (42,6) 70 (57,4) 1 Dominantinis GG 14 (35,0) 26 (65,0) 1 0,384 AA–AG 56 (42,7) 75 (57,3) 0,72 (0,35–1,51) Overdominantinis AA–GG 32 (36,0) 57 (64,0) 1 0,169 AG 38 (46,3) 44 (53,7) 0,65 (0,35–1,20) HER2 Neigiami* Teigiami Genotipinis AA 41 (83,7) 8 (16,3) 0,265 AG 69 (84,1) 13 (15,9) GG 29 (72,5) 11 (27,5) Recesyvinis AA 41 (83,7) 8 (16,3) 0,80 (0,33–1,92) 0,613 AG–GG 98 (80,3) 24 (19,7) 1 Dominantinis GG 29 (72,5) 11 (27,5) 1 0,108 AA–AG 110 (84,0) 21 (16,0) 0,50 (0,22–1,16) Overdominantinis AA–GG 70 (78,7) 19 (21,3) 1 0,359 AG 69 (84,1) 13 (15,9) 0,69 (0,32–1,51) * Lyginta kaip kontrolinė grupė
Tiriant TP53 geno rs1042522 polimorfizmo genotipų įtaką naviko morfologinėms ir klinikinėms savybėms, tyrimo metu buvo nustatyta statistiškai reikšmingų sąsajų tarp overdominantinio genotipo ir moterų amžiaus bei naviko dydžio. Analizė parodė, kad moterų, sergančių KV, overdominantinis CG genotipas yra susijęs su jaunesniu amžiumi lyginant su pacientėmis, turėjusiomis CC ir GG genotipus (atitinkamai 35,0 % ir 19,8 %). CG genotipo nešiotojoms KV buvo 2,18 karto (95 % PI 1,08–4,42; p reikšmė 0,03) dažniau nustatomas jaunesniame amžiuje, be to buvo nustatomas didesnis pirmininis navikas (ŠS 1,97 95 % PI 1,02– 3,81). Nebuvo rasta sąsajų tarp šio polimorfizmo ir limfmazgių pažeidimo bei patomorfologinių savybių (12 ir 13 lentelės).
12 lentelė. TP53 geno rs1042522 polimorfizmo genotipų ryšio su KV klinikinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas Reikšmės
(N, %) ŠS (95% PI) P reikšmė Amžiaus grupė ≤ 40 metų > 40 metų* Genotipinis CC 1 (10,0) 9 (90,0) 0,07 CG 21 (35,0) 39 (65,0) GG 21 (20,8) 80 (79,2) Recesyvinis CC 1 (10,0) 9 (90) 0,32 (0,04–2,56) 0,280 CG–GG 42 (26,1) 119 (73,9) 1 Dominantinis GG 21 (20,8) 80 (79,2) 1 0,117 CC–CG 22 (31,4) 48 (68,6) 1,75 (0,87–3,51) Overdominantinis CC–GG 22 (19,8) 89 (80,2) 1 0,03 CG 21 (35,0) 39 (65,0) 2,18 (1,08–4,42) Naviko dydis <2 cm.* 2–5 cm Genotipinis CC 8 (80,0) 2 (20,0) 0,107 CG 34 (56,7) 26 (43,3) GG 72 (71,3) 29 (28,7) Recesyvinis CC 8 (80,0) 2 (20,0) 0,48 (0,10–2,35) 0,366 CG–GG 106 (65,8) 55 (34,2) 1 Dominantinis GG 72 (71,3) 29 (28,7) 1 0,125 CC–CG 42 28 2,08
(60,0) (40,0) (0,43–10,11) Overdominantinis CC–GG 80 (72,1) 31 (27,9) 1 0,04 CG 34 (56,7) 26 (43,3) 1,97 (1,02–3,81) Limfmazgių būklė Nepažeisti* Pažeisti Genotipinis CC 7 (70,0) 3 (30,0) 0,423 CG 33 (55,0) 27 (45,0) GG 65 (64,4) 36 (35,6) Recesyvinis CC 7 (70,0) 3 (30,0) 0,67 (0,17–2,67) 0,567 CG–GG 98 (60,9) 63 (39,1) 1 Dominantinis GG 65 (64,4) 36 (35,6) 1 0,341 CC–CG 40 (57,1) 30 (42,9) 1,35 (0,73–2,53) Overdominantinis CC–GG 72 (64,9) 39 (35,1) 1 0,207 CG 33 (55,0) 27 (45,0) 1,51 (0,80–2,87)
13 lentelė. TP53 geno rs1042522 polimorfizmo genotipų ryšio su KV patomorfologinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas Reikšmės
(N, %) ŠS (95% PI) P reikšmė Naviko diferenciacijos laipsnis G1 arba G2 G3 Genotipinis CC 9 (90,0) 1 (10,0) 0,751 CG 44 (73,3) 16 (26,7) GG 79 (78,2) 22 (21,8) Recesyvinis CC 9 (90,0) 1 (10,0) 0,53 (0,15–1,87) 0,325 CG–GG 123 (76,4) 38 (23,6) 1 Dominantinis GG 79 (78,2) 22 (21,8) 1 0,563 CC–CG 53 (75,7) 17 (24,3) 1,18 (0,66–2,13) Overdominantinis CC–GG 88 (79,3) 23 (20,7) 1 0,281 CG 44 (73,3) 16 (26,7) 1,39 (0,76–2,55) Estrogenų receptoriai Neigiami Teigiami Genotipinis CC 2 (20,0) 8 (80,0) 0,695 CG 20 (33,3) 40 (66,7) GG 33 (32,7) 68 (67,3) Recesyvinis CC 2 8 1,96 0,404
(20,0) (80,0) (0,40–9,57) CG–GG 53 (32,9) 108 (67,1) 1 Dominantinis GG 33 (32,7) 68 (67,3) 1 0,864 CC–CG 22 (31,4) 48 (68,6) 1,06 (0,55–2,04) Overdominantinis CC–GG 35 (31,5) 76 (68,5) 1 0,810 CG 20 (33,3) 40 (66,7) 0,92 (0,47–1,80) Progesteronų receptoriai Neigiami Teigiami Genotipinis CC 3 (30,0) 7 (70,0) 0,725 CG 26 (43,3) 34 (56,7) GG 41 (40,6) 60 (59,4) Recesyvinis CC 3 (30,0) 7 (70,0) 1,66 (0,42–6,67) 0,473 CG–GG 67 (41,6) 94 (58,4) 1 Dominantinis GG 41 (40,6) 60 (59,4) 1 0,913 CC–CG 29 (41,4) 41 (58,6) 0,97 (0,52–1,80) Overdominantinis CC–GG 44 (39,6) 67 (60,4) 1 0,639 CG 26 (43,3) 34 (56,7) 0,86 (0,45–1,62) HER2 Neigiami Teigiami Genotipinis CC 9 (90,0) 1 (10,0) 0,255 CG 52 (86,7) 8 (13,3) GG 78 (77,2) 23 (22,8) Recesyvinis CC 9 (90,0) 1 (10,0) 0,47 (0,06–3,82) 0,477 CG–GG 130 (80,7) 31 (19,3) 1 Dominantinis GG 78 (77,2) 23 (22,8) 1 0,106 CC–CG 61 (87,1) 9 (12,9) 0,50 (0,22–1,16) Overdominantinis CC–GG 87 (78,4) 24 (21,6) 1 0,189 CG 52 (86,7) 8 (13,3) 0,56 (0,23–1,33)
3. BBC3 rs2032809 ir TP53 rs1042522 polimorfizmų sąsajos su išgyvenamumu
Tyrimo metu buvo nustatyta statistiškai reikšmingų sąsajų tarp BBC3 rs20328 genotipų bei pacienčių išgyvenamumo, ligos progreso ir metastazių išsivystymo dažnio. Pastebėtas statistiškai
