1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS ONKOLOGIJOS INSTITUTAS
CCND1 IR EGFR GENŲ FUNKCINIŲ POLIMORFIZMŲ SĄSAJOS SU
ANKSTYVO KRŪTIES VĖŽIO KLINIKINĖMIS IR MORFOLOGINĖMIS
SAVYBĖMIS BEI PACIENČIŲ IŠGYVENAMUMU
Magistro baigiamasis darbas
Darbą atliko: Marius Tadas Daniulaitis Darbo vadovas: Gyd. Erika Korobeinikova Darbo konsultantas: Doc. Dr. Rasa Ugenskienė
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ...4 2. SUMMARY ...6 3. PADĖKA ...8 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ...85. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ...8
6. SANTRUMPOS ...9
7. SĄVOKOS ...10
8. ĮVADAS ...11
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...12
9.1 Darbo tikslas:...12
9.2 Darbo uždaviniai: ...12
10. LITERATŪROS APŽVALGA ...13
10.1 Ląstelės ciklo reguliacijos reikšmė KV vystymesi ...13
10.1.1 Ląstelės ciklo kontrolė sveikame audinyje ... 13
10.1.2 Ląstelės ciklo pokyčiai vėžio patogenezėje ... 14
10.1.3 Krūties vėžio ląstelėms būdingi ląstelės ciklo pokyčiai ... 15
10.2 CCND1 genas, jo koduojamas baltymas ir VNP, jų funkcija ir reikšmė vėžio patogenezėje ...15
10.2.1 CCND1 geno ir jo koduojamo baltymo funkcijos ... 15
10.2.2 CCND1 geno rs9344 polimorfizmas ... 16
10.3 Augimo faktoriai, jų funkcijos ir reikšmė vėžio patogenezėje ...16
10.4 EGFR genas ir jo koduojamas baltymas, VNP, jų funkcija ir reikšmė vėžio patogenezėje ...17
10.4.1 EGFR geno ir jo koduojamo baltymo funkcijos ... 17
10.4.2 EGFR rs2227983 polimorfizmas ... 18
11. TYRIMO METODIKA...18
3
11.2 Tyrimo objektas ...19
11.3 Tiriamųjų atranka ...19
11.4 DNR išskyrimas iš kraujo ...19
11.5 EGFR geno rs2227983 ir CCND1 geno rs9344 polimorfizmų nustatymas ...20
11.5.1 Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ... 20
11.5.2 PGR-RFIP metodas EGFR geno rs2227983 polimorfizmui nustatyti ... 22
11.5.3 PGR-RFIP metodas CCND1 geno rs9344 polimorfizmui nustatyti ... 22
11.6 DNR elektroforezė ...23
11.7 Klinikiniai ir patomorfologiniai naviko duomenys bei ligos eigos įverčiai ...23
11.8 Duomenų statistinės analizės metodai ...24
12. REZULTATAI ...25
12.1 Klinikinių ir morfologinių krūties naviko savybių bei CCND1 rs9344 ir EGFR rs2227983 alelių ir genotipų pasiskirstymas tiriamųjų grupėje ...25
12.2 EGFR rs2227983 ir CCND1 rs9344 polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis ...26
12.3 CCND1 rs9344 ir EGFR rs2227983 polimorfizmų ryšys su krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eiga ...32
13. REZULTATŲ APTARIMAS ...38
14. IŠVADOS ...40
4
1. SANTRAUKA
Autorius: Marius Tadas Daniulaitis Mokslinis vadovas: gyd. Erika Korobeinikova Darbo pavadinimas: CCND1 ir EGFR genų funkcinių polimorfizmų sąsajos su ankstyvo krūties vėžio klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis bei pacienčių išgyvenamumu.
Tikslas: Nustatyti ląstelės ciklo kontrolėje dalyvaujančių genų polimorfizmų įtaką krūties vėžio klinikinėms ir morfologinėms savybėms bei ankstyvu krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eigai. Uždaviniai: 1) Nustatyti CCND1 ir EGFR genų polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymą tiriamojoje grupėje; 2) Išanalizuoti CCND1 ir EGFR genų polimorfizmų sąsajas su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis; 3) Nustatyti CCND1 ir EGFR genų polimorfizmų ryšį su ankstyvu krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eiga.
Tyrimo dalyviai: Į tyrimą įtraukta 171 ankstyvuoju I-II stadijos krūties vėžiu serganti pacientė. Metodika: CCND1 rs9344 ir EGFR rs2227983 polimorfizmai buvo nustatyti iš genominės DNR polimerazės grandininės reakcijos restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo (PGR-RFIP) metodu. Statistinėje analizėje naudotas alelinis ir genotipinis modeliai. Neparametriniai kintamieji lyginti taikant Pirsono Chi-kvadrato testą. Išgyvenamumo analizei naudotos vienveiksmė ir daugiaveiksmė Kokso proporcingų rizikų regresinė analizė bei Kaplan-Meierio modeliai. Vertintos klinikinės išeitys: laikas iki ligos atkryčio (LLA) ir bendras išgyvenamumas (BI). Gauti rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai p reikšmė neviršijo 0,05.
Tyrimo rezultatai: Nustatytas tirtų polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymas: EGFR rs2227983 GG genotipas 62%, AA – 5 %, GA – 32 %; G alelis 78%, A – 22% tiriamųjų. CCND1 rs9344 GA genotipas 51%, GG – 27%, AA – 22%; G alelis 52%, A – 48% tiriamųjų. EGFR geno rs2227983 polimorfizmo sąsajų su klinikinėmis ir morfologinėmis KV savybėmis nenustatyta. CCND1 rs9344 polimorfizmas buvo statistiškai reikšmingai susijęs su pirminio naviko dydžiu: G alelio neturinčioms pacientėms didesnio (2-5cm lyginant su <2cm) naviko rizika buvo 2,17 karto didesnė (95%PI: 1,04-4,54; p=0,04). Vienmatėje Cox regresinėje analizėje, esant EGFR geno rs2227983 polimorfizmo AA genotipui ligos atkryčio rizika buvo 3,49 karto didesnė (SR=3,49, 95% PI: 1.17-10.46, p=0,03) negu pacientėms turinčioms GA ar GG genotipą. Analizuojant aleliniu modeliu, pacientėms, neturinčioms G alelio, ligos atkryčio rizika buvo 3,48 karto didesnė (SR=3,48, 95% PI: 1,20-10,05, p=0,02), mirties rizika 3,54 karto didesnė (SR=3,54 95% PI: 1,05-11,99, p=0,04)
5 nei jį turėjusioms, tačiau daugiamatėje analizėje statistiškai reikšmingo ryšio negauta. CCND1 rs9344 polimorfizmas išgyvenamumui įtakos neturėjo.
Išvados: EGFR geno rs2227983 polimorfizmo GG genotipas buvo dažniausias, AA rečiausias, G alelis pasireiškė dažniau už A. CCND1 rs9344 GA genotipas nustatytas dažniausiai, AA – rečiausiai, o G alelis pasireiškė dažniau už A. CCND1 rs9344 polimorfizmas buvo statistiškai reikšmingai susijęs su didesniu naviko dydžiu. Vertinant polimorfizmų sąsajas su LLA ir BI, CCND1 rs9344 polimorfizmas išgyvenamumui įtakos neturėjo. EGFR rs2227983 polimorfizmas vienmatėje išgyvenamumo analizėje buvo susijęs su didesne ligos atkryčio ir mirties rizika, tačiau daugiamatėje analizėje šios sąsajos buvo statistiškai nereikšmingos.
6
2. SUMMARY
Author: Marius Tadas Daniulaitis Scientific supervisor: MD Erika Korobeinikova Title: Associations of CCND1 and EGFR gene functional polymorphisms with clinico-morphological characteristics and survival of early-stage breast cancer.
Purpose: To estimate the associations of cell-cycle related gene polymorphisms with clinicomorphologic characteristics and survival of early-stage breast cancer.
Objectives: 1) To evaluate the allele and genotype distribution of CCND1 rs9344 and EGFR rs2227983 polymorphisms among early stage breast bancer patients; 2) To analyse the associations between CCND1 rs9344 and EGFR rs2227983 polymorphisms and clinico-morphological characteristics of breast cancer. 3) To determine the association between CCND1 rs9344 and EGFR rs2227983 polymorphisms and the survival of early-stage breast cancer patients.
Participants: 171 patients with early-stage breast cancer were included in this study.
Methodology: CCND1 rs9344 and EGFR rs2227983 polymorphisms were genotyped from genomic DNA using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis. Statistical analysis was perfomed using allelic and genotype models. The association between non-parametric variables were estimated using Pearson‘s Chi-square test. Univariate and multivariate Cox proportional hazard regression analysis as well as Kaplan-Meier models were used for survival analysis. Estimated survival endpoints were recurrence-free survival and overall survival, p value less than 0,05 was considered statistically significant.
Results: Alleles and genotypes of the studied polymorphisms were distributed as follow: EGFR rs2227983 GG genotype 62%, AA – 5 %, GA – 32%; G allele 78%, A – 22%, CCND1 rs9344 GA genotype 51%, GG – 27%, AA – 22%; G alelle 52%, A – 48% of subjects. There were no significant associations between EGFR rs2227983 polymorphism and clinico-morphological tumour characteristics. A statistically significant association between CCND1 rs9344 polymorphism and primary tumor size was observed: G allele non-carriers had 2,17 higher risk (95% CI: 1,04-4,54; p=0,04) of larger tumour at diagnosis (2-5 cm vs. <2 cm.) than G allele carriers. Univariate Cox proportional hazard regression analysis revealed that EGFR rs2227983 AA genotype is associated with 3,94 times higher risk of the disease reucurence (95% CI: 1,167-10,458; p=0,025) compared with GA and GG genotypes in genotypic model. In allelic model, EGFR rs2227983 G allele
non-7 carriers had 3,48 times higer risk of disease reccurence (95% CI: 1,20-10,05; p=0,02) and 3,54 times higher risk of death (95% CI: 1,05-11,99, p=0,04) compared with G allele carriers. However, after adjusting for known prognosis factors in multivariate analysis, the association was insignificant. CCND1 rs9344 polymorphism was not associated with the risk of disease reccurence or death.
Conclusions: EGFR rs222798 GG genotype was the most common, meanwhile AA was the rarest. G allele occured more frequently than A allele. CCND1 rs9344 GA genotype was the most commonly identified, AA was the least common; G allele was more frequent than A. The CCND1 rs9344 polymorphism was associated with larger tumor size. Significant link of EGFR rs2227983 polymorphism with recurence-free and overall survival in univariate analysis was observed, however the associations did not remain significant after multivariate analysis. CCND1 rs9344 polymorphism had no effect on survival.
8
3. PADĖKA
Dėkoju darbo vadovei gyd. Erikai Korobeinikovai už pagalbą rašant baigiamąjį magistro darbą. Esu dėkingas LSMU MA MF Onkologijos instituto Onkologijos mokslo laboratorijos darbuotojai Rūtai Brazaitytei už pagalbą atliekant genetinius tyrimus.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Rašant šį darbą, autoriui interesų konflikto nebuvo.
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Etikos komiteto pavadinimas: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centras Leidimo nr: BEC-MF-176
9
6. SANTRUMPOS
BI – bendras išgyvenamumas
CCND1 – D1 ciklinas (angl. Cyclin D1) (baltymas) CCND1 – D1 ciklinas (genas)
CDK – nuo ciklinų priklausoma kinazė (angl. Cyclin-dependent kinase). DNR – deoksiribonukleorūgštis
EDTA - etilendiamintetraacetatas.
EGFR - epidermio augimo faktoriaus receptorius (angl. Epidermal growth factor receptor) (baltymas)
EGFR – epidermio augimo faktoriaus receptoriaus genas
ER - estrogenų receptoriai
FGFR2 – fibroblastų augimo faktoriaus receptoriaus 2 (angl. Fibroblast growth factor receptor 2) genas
G – naviko diferenciacijos laipsnis (angl. Grade) G1 fazė – interfazės G1 fazė (angl. Gap1)
G2 fazė – interfazės G2 fazė (angl. Gap2)
HER2 – žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (angl. Human epidermal growth factor receptor 2) genas
KV – krūties vėžys
LLA – laikas iki ligos atkryčio
LSP1 – limfocitams specifinio baltymo 1 (angl. Lymphocyte-specific protein 1) genas
M – mitozė (angl. Mytosis)
NQO1 – NAD(P)H dehidrogenazės (angl. NAD(P)H dehydrogenase (quinone) 1) genas
10 PR - progestinų receptoriai
PTGS2 – prostaglandinų-endoperoksido sintazės 2 (angl. Prostaglandin-endoperoxide synthase 2) genas
Rb – retinoblastomos baltymas RB1 – retinoblastomos baltymas 1
RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas S – interfazės sintezės fazė (angl. Synthesis)
TGF – trasformuojantis augimo faktorius (angl. Transforming Growth Factor)
TNFSF10 – naviko nekrozės faktorių superšeimos 10 faktoriaus (angl. tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10) genas
TNRC9 – Trinukleotidų sekos pasikartojimo (angl. trinucleotide-repeat-containing 9) genas
VNP – vieno nukleotido polimorfizmas
7. SĄVOKOS
Apoptozė – programuota ląstelių mirtis;
Augimo faktoriai – baltymai, stimuliuojantys specifinių audinių augimą ir dalyvaujantys ląstelės diferenciacijos ir dalinimosi procesuose;
Ankstyvasis krūties vėžys – I arba II stadijos krūties vėžys pagal TNM klasifikaciją; Nuo ciklinų priklausanti kinazė – fermentas, aktyvuojamas suformuojant kompleksus su reguliaciniais baltymais, dar vadinamais ciklinais;
Onkogenas – genas, kurio koduojamas baltymas gali transformuoti normalią ląstelę į vėžinę; Trigubai neigiamas krūties vėžys – krūties navikas, neturintis estrogenų, progestinų ir HER2 raiškos;
Vieno nukleotido polimorfizmas – vieno nukleotido pokytis DNR sekoje;
Vėžio supresoriai – genai, koduojantys baltymus, kurie slopina ląstelės augimą ir vėžinių procesų vystymąsi.
11
8. ĮVADAS
Krūties vėžys (KV) yra dažniausia moterims diagnozuojama onkologinė liga. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, kasmet KV suserga apie 2,1 mln. moterų [1]. Stebima sergamumo KV augimo tendencija. Nustatyta, jog 2012-2016 metų periodu, kasmet buvo užfiksuojama 0,3 procento daugiau naujų KV atvejų. Atrankinių mamografinės patikros programų dėka, KV vis dažniau nustatomas ankstyvose stadijose. Tačiau, nepaisant ankstyvos diagnostikos, net geriausios prognozės I stadijos maži (≤2cm) navikai, be išplitimo į sritinius limfmazgius, turintys teigiamus hormonų receptorius, metastazuoja kas penktai pacientei ir maždaug kas septinta pacientė miršta nuo KV 20 metų laikotarpiu. Esant II-ai KV stadijai ir pažeistiems 1-3 sritiniams limfmazgiams, tolimosios metastazės 20 metų laikotarpiu nuo diagnozės išsivysto 31 % pacienčių ir 28 % šių pacienčių miršta nuo KV [2]. Šie skaičiai dar didesni pacientėms, kurioms nustatomas agresyvesnės eigos navikas, neturintis išreikštų hormonų receptorių. 2018m. duomenimis KV sąlygojo 627 tūkstančius mirčių per metus pasaulyje ir tai sudarė 15% visų moterų mirčių nuo vėžinių susirgimų [1].
Šiuo metu gydymas, esant ankstyvai I-II KV stadijai, parenkamas atsižvelgiant į tokius prognozės ir predikcijos faktorius kaip sritinių limfmazgių pažeidimas, naviko dydis, kraujagyslių ir limfagyslių invazija, paciento amžius, histologinis naviko tipas, diferenciacijos laipsnis, Ki67 proliferacijos žymens ekspresija, atsakas į neoadjuvantinį gydymą, estrogenų ir progesterono receptorių būklė, bei žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (HER2) geno amplifikacija ar padidinta ekspresija. Taip pat pasitelkiami ir multigeniniai testai, tokie kaip MammaPrint, Oncotype DX, Endopredict ir kiti [3]. Tačiau, nepaisant visų šių žinomų prognozės ir predikcijos veiksnių pritaikymo klinikinėje praktikoje, atkryčio ir metastazavimo dažniai po radikalaus gydymo išlieka aukšti.
Kadangi vis dar stebima nemažai atvejų, kuomet kliniškai ir patologiškai panašūs navikai elgiasi skirtingai, šiuo metu mokslininkai koncentruojasi į naujų prognozinių ir predikcinių žymenų paiešką, siekdami patobulinti aukštos rizikos pacienčių atranką ir individualizuoti gydymą. Vieni iš potencialių prognozinių biožymenų yra funkciniai vieno nukleotido polimorfizmai (VNP) genuose, kurie turi įtakos vėžio patogenezei. Funkciniai polimorfizmai gali keisti produkuojamo geno koduojamo baltymo kiekį ir struktūrą ir taip modifikuoti biologinius procesus [4]. Jau yra nustatyta, kad VNP tokiuose genuose kaip FGFR2, TNRC9, LSP1, NQO1, TNFSF10, TGF, PTGS2 yra nepriklausomi KV prognozės veiksniai [5,6,7,8]. Šiuo tyrimu mes siekiame prisidėti prie potencialių
12 prognozinių VNP paieškos. Įvertinus didelę ląstelės ciklo reguliacijoje dalyvaujančio D1 ciklino ir jį koduojančio CCND1 geno (angl. Cyclin D1), ir epidermio augimo faktoriaus receptorių koduojančio EGFR (angl. Epidermal growth factor receptor) genų reikšmę KV patogenetiniuose keliuose, pasirinkome analizuoti šių genų VNP kaip potencialius KV biožymenis.
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
9.1 Darbo tikslas:
Nustatyti ląstelės ciklo kontrolėje dalyvaujančių genų polimorfizmų įtaką krūties vėžio klinikinėms ir morfologinėms savybėms bei ankstyvu krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eigai.
9.2 Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti CCND1 ir EGFR genų polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymą tiriamojoje grupėje;
2. Išanalizuoti CCND1 ir EGFR genų polimorfizmų sąsajas su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis;
3. Nustatyti CCND1 ir EGFR genų polimorfizmų ryšį su ankstyvu krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eiga.
13
10. LITERATŪROS APŽVALGA
10.1 Ląstelės ciklo reguliacijos reikšmė KV vystymesi
10.1.1 Ląstelės ciklo kontrolė sveikame audinyje
Ląstelės dalinimasis susideda iš serijos sudėtingų molekulinių ir biocheminių signalinių kelių. Ląstelės dalinimosi procese yra išskiriamos keturios fazės: interfazei priklausančios G1 (angl. Gap 1), S (angl. Synthesis), G2 (angl. Gap 2) ir M (angl. Mytosis) fazės. G1 fazėje ląstelė auga ir ruošiasi DNR sintezei. S, arba sintezės, fazėje, įvykus DNR replikacijai, kiekviena chromosoma sudvigubėja ir tampa sudaryta iš dviejų dukterinių chromatidžių. G2 fazėje ląstelė ruošiasi dalinimuisi, kaupia medžiagas ir baltymus, reikalingus mitozei. Pasibaigus mitozei yra gaunamos dvi genetiškai identiškos ląstelės. Kiekvienas perėjimas tarp ląstelės ciklo fazių yra reguliuojamas, kad būtų užtikrintas genetinės medžiagos perdavimas į dukterines ląsteles ir būtų išvengta mutacijų, kurios galėtų skatinti tumorogenezę [9]. Artėjant ląstelės ciklo G1 fazės pabaigai, prieš pereinant į S fazę, įvyksta ląstelės DNR patikra dėl genetinės medžiagos pažaidos ir, jeigu ląstelės DNR nėra mutavusi, ląstelės ciklas pereina į S fazę. Vis dėlto, jeigu yra aptinkama DNR pažaida, kurios neįmanoma ištaisyti, ląstelė miršta apoptozės (programuotos ląstelės mirties) būdu. Antra DNR patikros vieta yra ląstelės perėjimas iš G2 į M fazę. Šios patikros metu yra naudojami fermentai, vadinami nuo ciklinų priklausančiomis kinazėmis [10]. CDK (angl. Cyclin dependent kinase) yra atskira serino/treonino kinazių fermentų grupė, kuri įjungia arba išjungia įvairius ląstelės ciklo mechanizmus ląstelės dalinimosi procese. CDK yra aktyvuojamos suformuojant kompleksus su reguliaciniais baltymais, dar vadinamais ciklinais. Iki šiol yra nustatyta 11 ciklinų, randamų žmogaus ląstelėse. Pagrindinės nuo ciklinų priklausančios kinazės yra CDK4 ir CDK6, kurios priklauso nuo D tipo ciklinų: D1 (taip pat žinomo kaip CCND1, angl. Cyclin D1), D2 ir D3 [11]. CDK ir ciklinų kompleksai būtent ir veikia minėtuose ląstelės ciklo perėjimuose iš G1 į S, ir iš G2 į M fazę, atlikdami genetinės medžiagos vientisumo patikrą. Jeigu nėra sutrikusi šių abiejų reguliacinių baltymų veikla, jie atlieka vėžio supresorių funkciją, kontroliuodami ląstelių augimą ir inicijuodami programuotą ląstelės mirtį pažeistoms ląstelėms [12]. Apibendrinant, sveikose ląstelėse ląstelės ciklas yra kontroliuojamas per įvairius signalinius kelius, kurių metu ląstelės auga, replikuoja savo DNR ir dalinasi. Šiame procese dalyvauja įvairūs mechanizmai, kurie užtikrina, jog klaidos ląstelės genetinėje medžiagoje būtų ištaisytos, arba, jeigu DNR pažaida per didelė, ląstelė žūtų apoptozės būdu. Visgi, minėti reguliaciniai procesai gali būti pažeidžiami įvairių veiksnių, dėl ko sutrinka
14 ląstelės DNR patikra minėtuose perėjimuose tarp ląstelės ciklo fazių. Tai sukelia nekontroliuojamą ląstelių dalijimąsi ir inicijuoja karcinogenezę [10].
10.1.2 Ląstelės ciklo pokyčiai vėžio patogenezėje
Ląstelės ciklas, procesas, kurio metu ląstelės auga ir dalinasi, yra esminis vėžio patogenezėje. Ląstelės dalinimosi mechanizmai ir pats genomas yra pastoviai veikiami egzogeninių ir endogeninių mutageninių veiksnių. Pavyzdžiui, oksidacinį stresą sukeliančios reaktyvios deguonies formos, susidarančios metabolinių reakcijų metu, uždegimas, jonizuojanti radiacija gali pažeisti ląstelės DNR [13]. Vėžys yra nekontroliuojamo ląstelės dalijimosi, kurį sukelia neveikiantys ląstelės ciklo reguliaciniai mechanizmai, pasekmė [14]. Vėžinio proceso pradžią gali paskatinti DNR sekos pokytis gene, kuris koduoja reguliacinį baltymą. Pakinta šio geno koduojamo baltymo struktūra ir naujai sintezuotas baltymas neatlieka jam numatytos funkcijos. Dėl neveikiančių reguliacinių baltymų, nesant galimybės atlikti DNR patikrą ląstelės ciklo perėjimuose tarp fazių, sutrinka apoptozė ir genetinės medžiagos klaidos yra toliau perduodamos dukterinėms ląstelėms [15]. Šios reguliacinių procesų klaidos yra pagrindinė vėžinių ląstelių atsiradimo ir nekontroliuojamo dalinimosi priežastis. Onkogenai ir vėžio supresoriai atlieka didelį vaidmenį ląstelės ciklo reguliacijoje, siekdami užkirsti kelią vėžinių procesų vystymuisi. Vieni iš šių baltymų yra vėžio supresoriai p53 ir retinoblastomos proteinas (Rb). P53 baltymas reaguoja į DNR pažaidą G1 fazėje ir inicijuoja p21 baltymo transkripciją. Šis baltymas stabdo tolimesnę DNR sintezę, inhibuodamas nuo ciklinų priklausančias kinazes, kurios G1 fazėje fosforilina ir taip inaktyvuoja Rb baltymą [16]. Aktyvuotas retinoblastomos baltymas (Rb) stabdo transkripcijos faktoriaus E2F, kuris atlieka baltymų, kurie yra reikalingi perėjimui iš G1 į S faze, transkripciją, taip skatindamas ląstelės ciklo perėjimą į kitą fazę. CDK4 ir CDK6 kinazės fosforilina retinoblastomos baltymą formuodamos aktyvius kompleksus su baltymų grupe, vadinama D ciklinais [17]. Vienas iš šios grupės baltymų, ciklinas D1, CCND1 geno koduojamas baltymas, yra svarbus dėl jo reikšmės ląstelės ciklo reguliacijai vėžinių susirgimų atvejais. Šio baltymo koncentracija ypač padidėja krūties vėžio atvejais [18]. Jeigu Rb baltymas yra fosforilinamas ir taip inaktyvuojamas nuo ciklinų priklausančių kinazių ir D ciklinų, E2F faktorius lieka neužslopintas ir toliau atlieka baltymų, skatinančių ląstelės dalinimąsi, transkripciją, taip sudarydamas sąlygas nekontroliuojam ląstelės dalinimuisi [16].
15 10.1.3 Krūties vėžio ląstelėms būdingi ląstelės ciklo pokyčiai
Ląstelės ciklo reguliavimo sutrikimas dėl vėžio supresorių inaktyvacijos ir perteklinės ciklinų ir CDK aktyvacijos yra pagrindinės onkogenezės priežastys krūties vėžio atvejais. Estrogenų receptorius turinčiuose liuminaliniuose krūties navikuose piktybinių ląstelių dalinimasis priklauso nuo estrogenų koncentracijos. Estrogeno molekulė jungiasi prie hormono receptoriaus ir tai inicijuoja receptoriaus sukeltą genų, kurie skatina ląstelės dalinimąsi, ekspresiją. CCND1 yra estrogenų receptoriaus genas – taikinys, kuris skatina ląstelės ciklo progresiją per D1 ciklino ir CDK4 bei CDK6 aktyvaciją. Estrogenų receptorius turintiems navikams yra būdinga CCND1 geno ekspresija ir funkcionuojantys p53 ir Rb vėžio supresoriai, tačiau esant trigubai neigiamiems krūties navikams būdingos RB1 geno mutacijos, dėl kurių sutrinka ląstelės ciklo kontrolė [19].
10.2 CCND1 genas, jo koduojamas baltymas ir VNP, jų funkcija ir reikšmė vėžio patogenezėje
10.2.1 CCND1 geno ir jo koduojamo baltymo funkcijos
CCDN1, dar žinomas kaip genas, koduojantis ląstelės ciklo G1 fazę reguliuojantį baltymą D1 cikliną, yra 11 chromosomos ilgajame petyje, 11q13 lokuse. D1 ciklino baltymas funkcionuoja jungdamasis prie nuo ciklinų priklausančių kinazių CDK4 ir CDK6 ląstelės ciklo perėjime iš G1 į S fazę [20]. Šių baltymų kompleksai fosforilina ir inaktyvuoja retinoblastomos proteiną Rb, todėl nėra slopinamas ląstelės proliferaciją skatinantis E2F faktorius ir ląstelė gali pereiti į S fazę. S fazėje D1 ciklinas yra šalinamas iš ląstelės branduolio ir įvyksta jo proteolizė. Mokslinių tyrimų metu padidėjusi D1 ciklino ekspresija buvo rasta daugiau negu 50 % ištirtų krūties navikų [21]. Sutrikusi CCND1 geno ekspresija ir funkcija prisideda prie sutrikusios ląstelės ciklo kontrolės onkogenezės metu. Per didelė CCDN1 geno ekpresija sutrikdo normalų ląstelės ciklą, galimai skatina onkogenezę ir vėžinių procesų progresavimą. CCDN1 geno polimorfizmų įtaką ligos eigai aprašo daugelis studijų, tyrusių šio geno svarbą kiaušidžių, kolorektinio, skrandžio ir krūties vėžio atvejais [20]. Mokslininkai nustatė ir kitas D1 ciklino funkcijas, svarbias navikų išsivystyme, tokias kaip chromosomų stabilumo slopinimą ar ląstelių migravimo skatinimą. Ląstelių migravimas yra svarbus naviko metastazavimą lemiantis faktorius. Ištirta, jog makrofagai, fibroblastai ir epitelinės ląstelės pasižymi lėtesniu migravimu, jeigu yra išnaudotos D1 ciklino atsargos ląstelėje. Manoma, jog ši D1 ciklino funkcija
16 taip pat priklauso nuo CDK fermentų, nes mokslinių tyrimų metu atskleista, jog mutavęs D1 ciklinas, kuris neaktyvuoja kinazių CDK4 ir CDK6 neskatina ląstelių migracijos [22].
10.2.2 CCND1 geno rs9344 polimorfizmas
CCND1 rs9344 G>A (dar vadinamas CCND1 G870A) polimorfizmas randamas CCND1 geno 242 kodone. Dėl šio VNP gali susidaryti mutavęs D1 ciklino baltymas - D1b ciklinas (angl. Cyclin D1b). Šis baltymo variantas skiriasi nuo natyvinės baltymo izoformos, vadinamos D1a ciklinu (angl. Cyclin D1a) 55 aminorūgštimis ir dėl šių struktūros skirtumų sutrinka jo šalinimo procesas iš ląstelės branduolio, todėl D1b ciklino forma negali būti suardoma proteasomose. Tai prailgina baltymo gyvavimo pusperiodį ir ląstelė anksčiau laiko pereina į S fazę, todėl galimai yra nespėjama ištaisyti DNR mutacijos ir šios genetinės klaidos skatina mutavusių ląstelių proliferaciją [23]. Dauguma atliktų CCND1 geno rs9344 polimorfizmo tyrimų ir metaanalizių konstatuoja AA genotipo ryšį su didesne rizika susirgti krūties vėžiu [24, 25, 26]. Kituose tyrimuose teigiama, jog abu genotipai turintys A alelį (GA ir AA) yra rizikos veiksniai susiję su krūties vėžio išsivystymu [27, 28]. Lu atliktoje 5371 atvejų metaanalizėje bei Soleimani ir bendraautorių atliktame tyrime buvo nustatyta, jog A alelis pasižymi didesne rizika susirgti krūties vėžiu baltųjų rasės žmonėms. Akther ir kiti savo tyrime nustatė, jog baltųjų rasės populiacijose krūties vėžio riziką didina tik AA genotipas [29]. Bedewy ir kiti bei Ebeid ir kolegos atliktuose tyrimuose teigė, jog A alelį turintys genotipai (AA ir GA) yra susiję su padidėjusia krūties vėžio rizika, tačiau nenustatė polimorfizmo ryšio su tiriamųjų rase [29,30]. Lu ir kiti savo tyrime nustatė, kad AA genotipas pasižymi didesne krūties vėžio išsivystymo rizika premenopauzinio amžiaus moterims, o laikas iki ligos atkryčio buvo ilgesnis G alelį turinčių genotipų (GG+GA) pacientėms [31]. Liu ir kolegų tyrime GG genotipas buvo susietas su mažesne tikimybe susirgti trigubai neigiamu KV [32].
10.3 Augimo faktoriai, jų funkcijos ir reikšmė vėžio patogenezėje
Kita grupė baltymų, turinčių didelę reikšmę vėžio patogenezėje yra augimo faktoriai. Augimo faktoriai yra grupė baltymų, kurie stimuliuoja specifinių audinių augimą ir dalyvauja ląstelės diferenciacijos ir dalinimosi procesuose [33]. Augimo faktoriai veikia per parakrininius (stimuliuoja gretimų ląstelių augimą) ir autokrininius (stimuliuoja tos pačios ląstelės augimą) signalinius kelius. Vėžinės ląstelės augime labiausiai dalyvauja autokrininis signalinis kelias. Augimo faktoriai
17 pasižymi skirtingais veikimo mechanizmais, bet dažniausiai veikia per tirozino kinazių receptorius [34]. Tirozino kinazių receptoriai yra transmembraniniai ir pasižymi tirozino kinaziniu aktyvumu citoplazminėje dalyje. Prisijungus ligandams (augimo faktoriams), receptoriai aktyvuojami ir pradeda fosforilinti taikinius, įtraukdami juos į signalinius kelius [35].
Vėžinės ląstelės pasižymi nekontroliuojamu augimu ir proliferacija, kurią skatina augimo faktoriai. Tarp onkogenų ir augimo faktorių yra glaudus ryšys, kai kurie onkogenai koduoja augimo faktorių baltymus (pvz. HER2 koduoja EGFR (angl. Epidermal growth factor receptor)). Įrodyta, jog augimo faktoriai gali padidinti tam tikrų proto-onkogenų (fos, myc) transkripciją [36]. Mutavusios vėžinės ląstelės gali sintetinti augimo faktorius pačios arba per signalinius kelius skatinti sveikas ląsteles juos gaminti.
10.4 EGFR genas ir jo koduojamas baltymas, VNP, jų funkcija ir reikšmė vėžio patogenezėje
10.4.1 EGFR geno ir jo koduojamo baltymo funkcijos
Mūsų pasirinktas EGFR genas ir jo koduojamas EGFR baltymas dalyvauja epidermio augimo faktorių (EGF) signaliniame kelyje. EGFR baltymo reguliuojamas signalinis kelias yra vienas iš svarbiausių KV patogenezėje [37]. Viena to priežasčių yra prie EGF receptoriaus besijungiančių įvairių ligandų gausa: epidermio augimo faktorius (EGF), transformuojantis augimo faktorius-α (TGF-α), amfiregulinas, epiregulinas [38]. Šie ligandai gali aktyvuot MAPK, PI3K/Akt/mTOR, JAK/STAT signalinius kelius, kurie yra atsakingi už tokius tumorogenezę skatinančius veiksnius kaip ląstelių proliferacija, apoptozės slopinimas ir vėžinių ląstelių metastazavimas [39]. EGFR yra tirozino kinazių receptoriai ir jie priklauso ErbB receptorių šeimai, kuri susideda iš Erb-1 (EGFR), ErbB-2 (Her2), ErbB-3 ir Erb4 [40]. EGF didina epitelinių ir mezenchiminių ląstelių mitogeninį aktyvumą, skatina sveikų ląstelių neoplaziją dėl padidėjusio angliavandenių ir aminorūgščių metabolizmo. Įvairiais moksliniais tyrimais atskleista, jog KV, prostatos ir šlapimo pūslės navikai sekretuoja EGF arba į juos struktūriškai bei funkciškai panašius polipeptidus [39]. Vėžiniai susirgimai yra gydomi biologinės terapijos medikamentais, kurie veikia į EGFR receptorių šeimą. Pavyzdžiui, cetuksimabas yra monokloninis antikūnas, kuris stabdo ErbB1 signalinį kelią, prisijungdamas prie ligando jungimosi vietos receptoriuje [41].
EGFR geno ekspresijos padidėjimas stebimas įvairių vėžinių susirgimų metu: KV, kolorektinio vėžio, ne smulkių ląstelių plaučių karcinomos. KV atvejais šis genas yra susijęs su
18 didesniu naviko dydžiu, blogesne diferenciacija, dažnesniu naviko metastazavimu ir prastesniu išgyvenamumu [42]. Esant pakitusiai šio geno ekspresijai, moksliniuose tyrimuose stebėtas naviko rezistentiškumas chemoterapijai. EGFR genas, esantis 7 chromosomos trumpajame petyje 7p12.3-p.1 lokuse, mutuoja retai, tačiau jame dažnai yra aptinkami VNP [43].
10.4.2 EGFR rs2227983 polimorfizmas
EGFR 142285G>A (rs2227983) polimorfizmas yra EGFR geno 521 kodone. Esant šiam VNP, A alelis pakeičia G alelį ir dėl to koduojama arginino (Arg) aminorūgštis yra keičiama į liziną. Pastarasis genetinis variantas pasižymi sumažėjusia įtaka ląstelių proliferacijai, tirozino kinazių aktyvacijai ir proto-onkogenų myc, fos ir jun indukcijai [44]. Mokslinių tyrimų metu (I. Kallel ir kiti, M.S.Leite ir kiti) buvo rastas statistiškai reikšmingas ryšys tarp A alelio nešiojimo ir naviko metastazavimo į limfinius mazgus. Buvo pastebėta, jog, pacientėms su homozigotiniu GG genotipu, metastazės limfmazgiuose buvo aptiktos dažniau negu A alelio nešiotojoms. G alelio nešiotojos taip pat pasižymėjo blogesne ligos prognoze ir didesniu atkryčio dažniu [43, 44].
11. TYRIMO METODIKA
11.1 Tyrimo planavimas
Darbo pradžioje buvo ieškota literatūros duomenų bazėse apie CCND1 ir EGFR genus, jų polimorfizmus bei jų įtaką vėžiniams susirgimams, ypač krūties vėžiui. Buvo rasta tik pora tyrimų, atliktų su krūties vėžiu sergančiomis pacientėmis, kurių metu buvo tiriami minėtų genų polimorfizmai, todėl tai įvertinus ir šią problemą aptarus su mokslinio darbo vadove buvo nuspręsta pradėti atlikti tyrimą, kurio metu būtų ieškoma sąsajų tarp tirtų polimorfizmų ir krūties navikų klinikinių ir morfologinių savybių ir pacienčių ligos eigos. Baigiamojo magistro darbo laboratoriniai tyrimai buvo atliekami LSMU MA MF Onkologijos instituto Onkologijos mokslo laboratorijoje.
19 11.2 Tyrimo objektas
Krūties vėžiu sergančios moterys ir iš jų kraujo ištirti CCND1 geno rs9344 G>A ir EGFR geno rs2227983 G>A polimorfizmai.
11.3 Tiriamųjų atranka
Į tyrimą įtrauktos ankstyvu, I-os arba II-os stadijos (T1 N0, T2 N0, T1 N1, T2 N2), krūties vėžiu sergančios pilnametės pacientės, neturinčios kitų onkologinių susirgimų arba sunkių gretutinių ligų, kurios darytų įtaką pacienčių išgyvenamumui tyrimo laikotarpiu, kurių periferinio kraujo mėginiai ir nuasmeninti klinikiniai duomenys buvo saugomi LSMU MA MF Onkologijos instituto Onkologijos mokslo laboratorijoje. Į tyrimą nebuvo įtrauktos pacientės su nepilna dokumentacija ar nesant ilgalaikio sekimo duomenų. Visos pacientės buvo tirtos ir gydytos Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno klinikose. Visos tyrimo dalyvės buvo supažindintos ir pasirašiusios informuoto asmens sutikimo formą, patvirtintą Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto, protokolo Nr. BE-2-10, tyrimui atlikti gautas LSMU Bioetikos centro pritarimas Nr. BEC-MF-176.
11.4 DNR išskyrimas iš kraujo
DNR išskyrimui kraujas buvo paimtas į mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatu). Genominė DNR išskirta iš periferinio kraujo leukocitų, naudojant „GeneJET Genomic DNA Purification Kit“ rinkinį silikagelio kolonėlių metodu:
1. Į centrifuginį mėgintuvėlį pilama 200 μL kraujo, 20 μl proteinazės K ir 400 μL lizės tirpalo ir viskas sumaišoma.
2. Mišinys inkubuojamas 56 °C temperatūroje 10 minučių.
3. Įpilama 200 μl 96–100 % etanolio, tada mišinys vėl purtomas ir maišomas.
4. Po ląstelių lizės mišinys perkeliamas ant GeneJET Genomic DNA Purification Column išvalymo kolonėlės.
20 5. Kolonėlė įstatoma į skysčių surinkimo mėgintuvėlį ir atliekamas centrifugavimas 1 minutę, 6000 xg per minutę greičiu ir po to skysčių surinkimo mėgintuvėlis yra pakeičiamas nauju.
6. Pilama 500 μl DNR plovimo buferio I ant DNR išvalymo kolonėlės ir centrifuguojama minutę laiko 8000 xg per minutę greičiu, skystis išpilamas iš surinkimo mėgintuvėlio ir įstatoma DNR išvalymo kolonėlė.
7. Pilama 500 μl DNR plovimo buferio II ir centifūguojama 3 minutes laiko 12000 xg greičiu. 8. Išpilamas susidaręs skystis iš skysčių surinkimo mėgintuvėlio ir DNR išvalymo kolonėlė perkeliama į sterilų 1,5 ml mikrocentifūginį mėgintuvėlį.
9. Kad įvyktų DNR eliucija yra įpilama 200 μl eliucijos buferio į DNR išvalymo kolonėlės centrą ir inkubuojama 2 minutes kambario temperatūroje, tada centrifuguojama minutę laiko 8000 xg per minutę greičiu.
10. DNR perkeliama į sterilų mėgintuvėlį.
11.5 EGFR geno rs2227983 ir CCND1 geno rs9344 polimorfizmų nustatymas
11.5.1 Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
Tiriant EGFR geno rs2227983 ir CCND1 geno rs9344 polimorfizmą buvo atlikta PGR, siekiant pagausinti turimos DNR kiekį. Reakcijų sudėtis yra pateikta 1 ir 2 lentelėse. Abiejų reakcijų metu į kiekvieną PGR mėgintuvėlį pilta 23 µl PGR mišinio ir 2 µl DNR tirpalo. Šioms reakcijoms buvo naudojamos 3 ir 4 lentelėse nurodytos pradmenų sekos. CCDN1 geno rs9344 polimorfizmo sekos buvo parinktos pagal Liu ir kitų (2014), o EGFR geno rs2227983 polimorfizmo – pagal Kallel ir kitų (2009) atliktus mokslininkų tyrimus. Sąlygos reakcijoms įvykti yra aprašytos 5 ir 6 lentelėse. 1 lentelė. Mišinio sudėtis naudota CCND1 geno rs9344 polimorfizmo PGR metu.
Reagentas (1 mėginiui) Kiekis, µl
H2O 18,05 DMSO 1,25 10x DreamTaq buferis 2,5 dNTP (10 mM) 0,5 Pradmuo F (20 pmol/µl) 0,3 Pradmuo R (20 pmol/µl) 0,3
21 2 lentelė. Mišinio sudėtis naudota EGFR geno rs2227983 polimorfizmo PGR metu.
Reagentas (1 mėginiui) Kiekis, µl
H2O 19,3
10x DreamTaq buferis 2,5
dNTP (10 mM) 0,5
Pradmuo F (20 pmol/µl) 0,3
Pradmuo R (20 pmol/µl) 0,3
DreamTaq polimerazė (5U/µl) 0,1
3 lentelė. Pradmenų sekos CCND1 geno rs9344 polimorfizmo nustatymui
Pradmuo Pradmens seka
Tiesioginis 5′-GTGAAGTTCATTTCCAATCCGC-3′
Atvirkštinis 5′-GGGACATCACCCTCACTTAC-3′
4 lentelė. Pradmenų sekos EGFR geno rs2227983 polimorfizmo nustatymui
Pradmuo Pradmens seka
Tiesioginis 5’-TGCTGTGACCCACTCTGTCT-3
Atvirkštinis 5’-CCAGAAGGTTGCACTTGTCC- 3
5 lentelė. PGR programa CCND1 geno rs9344 polimorfizmo nustatymui Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
94 ºC 5 min - 94 ºC 30 s 40 53 ºC 30 s 72 ºC 30 s 72 ºC 10 min - 4 ºC ∞ -
6 lentelė. PGR programa EGFR geno rs2227983 polimorfizmo nustatymui Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
94 ºC 4 min -
94 ºC 30 s
40
22
72 ºC 30 s
72 ºC 10 min -
4 ºC ∞ -
11.5.2 PGR-RFIP metodas EGFR geno rs2227983 polimorfizmui nustatyti
EGFR geno rs2227983 polimorfizmui nustatyti taikytas restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (RFIP) metodas. Šiam metodui yra naudojama restrikcijos endonukleazė, kuri esant A aleliui gautą PGR produktą, kurio ilgis yra 155 bpm, kerpa į 117 ir 38 bp fragmentus, o esant G aleliui – į 67, 50 ir 38 bp fragmentus. Į kiekvieną mėgintuvėlį buvo įpilta 5 µl RFIP mišinio ir 10 µl PGR produkto. Reakcija vyko 1-16 valandų 37°C temperatūroje. Reakcijos mišinio sudėtis aprašyta 7 lentelėje.
1 pav. EGFR alelių elektroforegrama. 1 takelis – DNR molekulinės masės žymuo GeneRulerTM UltraLow range („Thermo Fisher Scientific“);10, 15, 16– GA genotipas (117, 67, 50 ir 38 bp); 2, 9
takeliai – AA genotipas (117 ir 38 bp); 3 - 8, 11-14 takeliai – GG genotipas (67, 50 ir 38 bp). Kairėje pusėje nurodyti molekulinės masės žymens DNR fragmentų dydžiai.
7 lentelė. RFIP mišinio sudėtis EGFR geno rs2227983 polimorfizmui nustatyti Reagentas (1 mėginiui) Kiekis, µl
H2O 3,5
10x buferis R 1
Restrikcijos endonukleazė
MvaI (10 U/µl) 1
11.5.3 PGR-RFIP metodas CCND1 geno rs9344 polimorfizmui nustatyti
CCND1 geno rs9344 polimorfizmui nustatyti taip pat taikytas RFIP metodas. Restrikcijos endonukleazė esant G aleliui 167 bp PGR produktą karpo į 145 ir 22 bp fragmentus, o
23 esant A aleliui jis lieka nesukarpytas. Į kiekvieną mėgintuvėlį buvo įpilta 5 µl RFLP mišinio ir 10 µl PGR produkto. Reakcija vyko 1-16 valandų 37°C temperatūroje. Reakcijos mišinio sudėtis aprašyta 8 lentelėje.
2 pav. CCND1 alelių elektroforegrama. 1 takelis – DNR molekulinės masės žymuo GeneRulerTM UltraLow range („Thermo Fisher Scientific“); 2, 4, 5, 10, 12, 13 – GA genotipas (167, 145 ir 22
bp); 3, 14 takeliai – AA genotipas (167 bp); 6, 8, 9, 11 takeliai – GG genotipas (145 ir 22 bp. Kairėje pusėje nurodyti molekulinės masės žymens DNR fragmentų dydžiai.
8 lentelė. RFIP mišinio sudėtis CCND1 geno rs9344 polimorfizmui nustatyti Reagentas Kiekis, µl (1 mėginiui) H2O 3,5 10x buferis TANGO 1 Restrikcijos endonukleazė MspI (10 U/µl) 1 11.6 DNR elektroforezė
Produktai, kurie buvo gauti po PGR-RFIP reakcijų buvo frakcionuoti elektroforezės metodu, kurio metu jie buvo atskirti pagal dydį ir krūvį. DNR makromolekulės turi neigiamą krūvį, todėl patekusios į elektrinį lauką juda teigiamo elektrodo link. Elektroforezė buvo vykdoma horizontalioje vonelėje, naudojant 3% agarozės gelį ir esant 130 V įtampai. Elektroforezės trukmė – 30 minučių.
24 Rinkti klinikiniai duomenys: pacienčių amžius diagnozės nustatymo metu, suskirstant į 2 prognozines grupes (≤40 metų ir >40 metų), naviko dydis, suskirstant į grupes pagal TNM klasifikacijos T parametrą (<2cm ir 2-5cm). Jei pacientė gavusi neoadjuvantinę chemoterapiją vertintas radiologiniais tyrimais nustatytas pradinis naviko dydis, jeigu pacientė iš karto operuota, vertintas patologinis naviko dydis. Vertinta limfmazgių būklė, suskirstant į teigiamus (jei bet kuriame radiologiniame ar patologiniame tyrime buvo nustatyti pažeisti sritiniai limfmazgiai) ir neigiamus. Naviko diferenciacijos laipsnis vertintas suskirstant į dvi grupes – geros ir vidutinės diferenciacijos grupę (G1+G2) ir blogos diferenciacijos grupę (G3), o G4 navikų tarp tyrimo dalyvių nebuvo. Estrogeno, progesterono receptorių raiška vertinta skirstant į teigiamus ir neigiamus; HER2 būklė, skirstant į teigiamą (jei teigiamumas nustatytas imunohistocheminiu ar esant IHC tyrime įverčiui 2+, remtasi in situ hibridizacijos metodu) ir neigiamą.
Pacienčių ligos eiga buvo vertinta reguliariai, atskaitos taškas išgyvenamumo analizėje buvo ligą patvirtinančios biopsijos data. Laikas iki ligos atkryčio buvo apibūdinamas kaip laikas nuo atskaitos taško iki pirmo lokalaus ar tolimojo atkryčio nustatymo fakto. Bendras išgyvenamumas vertintas kaip laikas nuo atskaitos taško iki mirties dėl bet kokios priežasties.
11.8 Duomenų statistinės analizės metodai
Duomenų analizei naudota „IBM SPSS STATISTICS 20“ programa. Analizės metu buvo apskaičiuoti polimorfizmų alelių ir genotipų dažniai, naviko klinikinių ir patomorfologinių duomenų dažniai tiriamųjų grupėje (amžius diagnozės metu, naviko dydis, limfmazgių būklė, naviko diferenciacijos laipsnis, estrogenų, progestinų, HER2 receptoriai) ir vertintos jų sąsajos su genų polimorfizmais pagal alelinį ir genotipinį modelius, naudojant Pirsono kvadrato testą. Chi-kvadrato testas taip pat naudotas vertinti genotipų ir alelių pasiskirstymą pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį. Kaplan-Meierio modelis ir Kokso regresijų modeliai buvo naudojami vertinti polimorfizmų alelių ir genotipų įtaką laikui iki ligos atkryčio (LLA) ir bendram išgyvenamumui (BI). Skirtumai tarp išgyvenamumo kreivių vertinti pagal log-rank testą. Gauti rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, jeigu p reikšmė buvo ne didesnė už 0,05.
25
12. REZULTATAI
12.1 Klinikinių ir morfologinių krūties naviko savybių bei CCND1 rs9344 ir EGFR rs2227983 alelių ir genotipų pasiskirstymas tiriamųjų grupėje
Klinikinių ir morfologinių naviko charakteristikų pasiskirstymas tiriamosioms pateiktas 9 lentelėje.
9 lentelė. Klinikinių ir morfologinių krūties vėžio savybių pasiskirstymas. Amžius diagnozės metu
≤ 40 metų 25,1% >40 metų 74,9% Naviko dydis <2 cm 66,7% 2-5 cm 33,3% Limfmazgių pažeidimas Nepažeisti 61,4% Pažeisti 38,6% Diferenciacijos laipsnis G1 ir G2 77,2% G3 22,8%
Estrogenų receptoriai (ER)
ER (+) 67,8% ER (-) 32,2% Progestinų receptoriai (PR) PR (+) 59,1% PR (-) 40,9% HER2 būklė HER2 teigiami 81,3% HER2 neigiami 18,7%
Tirtų CCND1 rs9344 ir EGFR rs2227983 polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymas aprašytas 10 lentelėje. Polimorfizmų dažniai populiacijoje atitiko Hardžio-Veinbergo dėsnį.
10 lentelė. CCND1 rs9344 ir EGFR rs2227983 polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymas tiriamojoje grupėje.
26 EGFR rs2227983 A (0,22) G (0,78) AA (0,05) GA (0,32) GG (0,62) CCND1 rs9344 A (0,48) G (0,52) AA (0,22) GA (0,51) GG (0,27)
12.2 EGFR rs2227983 ir CCND1 rs9344 polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis
Ištyrus EGFR rs2227983 genotipų GG, GA, GG įtaką krūties vėžio morfologinėms ir klinikinėms savybėms nebuvo rasta statistiškai reikšmingo ryšio tarp šių genotipų ir pacienčių amžiaus, naviko dydžio, metastazių limfmazgiuose, naviko diferenciacijos ir receptorių (ER, PR, HER2) ekspresijos. Tiriant aleliniu modeliu, EGFR rs2227983 G ir A alelių ryšio su naviko morfologinėmis ir klinikinėmis savybėms statistiškai reikšmingų sąsajų taip pat nebuvo gauta (11 ir 12 lentelės).
11. lentelė. EGFR geno rs2227983 polimorfizmo ryšio su KV klinikinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas/alelis Reikšmės N (%) ŠS (95% PI) p Amžiaus grupė ≤40 metų / >40 metų ≤40 metų >40 metų Genotipinis AA 3 (33,3) 6 (66,7) 0,48 GA 11 (19,6) 45 (80,4) GG 29 (27,4) 77 (72,6) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 14 (21,5) 51 (78,5) 0,73 (0,35-1,51) 0,39 Neturintys A alelio (GG) 29 (27,4) 77 (72,6) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 40 (24,7) 120 (75,3) 0,66 (0,16-2,74) 0,56 Neturintys G alelio (AA) 3 (33,3) 6 (66,7) 1 Naviko dydis <2 cm/ 2–5 cm 2-5 cm <2 cm. Genotipinis AA 2 (22,2) 7 (77,8) 0,29 GA 15 41
27 (26,8) (73,2) GG 40 (37,7) 66 (62,3) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+AG) 17 (26,2) 48 (73,8) 1 0,12 Neturintys A alelio (GG) 40 (37,7) 66 (62,3) 1,71 (0,87-3,37) G alelio nešiotojai (AG+GG) 55 (34,0) 107 (66,0) 1 0,47 Neturintys G alelio (AA) 2 (22,2) 7 (77,8) 0,56 (0,11-2,77) Limfmazgių būklė Nepažeisti/ pažeisti Nepažeisti Pažeisti Genotipinis AA 6 (77,8) 3 (22,2) 0,52 GA 31 (82,1) 25 (17,9) GG 68 (81,1) 38 (18,9) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+AG) 37 (56,9) 28 (43,1) 0,74 (0,39-1,38) 0,35 Neturintys A alelio (GG) 68 (64,2) 38 (35,8) 1 G alelio nešiotojai (AG+GG) 99 (61,1) 63 (38,9) 0,79 (0,19-3,26) 0,74 Neturintys G alelio (AA) 63 (38,9) 3 (33,3) 1
12 lentelė. EGFR geno rs2227983 polimorfizmo ryšio su KV patomorfologinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas/alelis Reikšmės N (%) ŠS (95% PI) p Naviko diferenciacijos laipsnis G1+G2 / G3 G1 arba G2 G3 Genotipinis AA 9 (100,0) 0 (0,0) 0,24 GA 43 (76,8) 13 (23,2) GG 80 (75,5) 26 (24,5)
28 Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 52 (80,0) 13 (20,0) 1,3 (0,61-2,76) 0,49 Neturintys A alelio (GG) 80 (75,5) 26 (24,5) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 123 (75,9) 39 (24,1) - 0,10 Neturintys G alelio (AA) 9 (100,0) 0 (0,0) - Estrogenų receptoriai Neigiami / teigiami Neigiami Teigiami Genotipinis AA 4 (44,4) 5 (55,6) 0,22 GA 22 (39,3) 34 (60,7) GG 29 (27,4) 77 (72,6) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 26 (40,0) 39 (60,0) 1,77 (0,92-3,41) 0,09 Neturintys A alelio (GG) 29 (27,4) 77 (72,6) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 51 (31,5) 111 (68,5) 0,57 (0,15-2,23) 0,83 Neturintys G alelio (AA) 4 (44,4) 5 (55,6) 1 Progesteronų receptoriai Neigiami / teigiami Neigiami Teigiami Genotipinis AA 4 (44,4) 5 (55,6) 0,94 AG 22 (39,3) 34 (60,7) GG 44 (41,5) 62 (58,5) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 26 (40,0) 39 (60,0) 0,94 (0,50-1,76) 0,85 Neturintys A alelio (GG) 44 (41,5) 62 (58,5) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 66 (40,7) 96 (59,3) 0,86 (0,22-3,32) 0,83 Neturintys G alelio (AA) 4 (44,4) 5 (55,6) 1 HER2 receptoriai Neigiami / teigiami Neigiami Teigiami Genotipinis AA 7 (77,8) 2 (22,2) 0,95 AG 46 (82,1) 10 (17,9)
29
GG 86
(81,1)
20 (18,9) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 53 (81,5) 12 (18,5) 1,027 (0,47-2,27) 0,95 Neturintys A alelio (GG) 86 (81,1) 20 (18,9) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 132 (81,5) 30 (18,5) 1,26 (0,25-6,36) 0,78 Neturintys G alelio (AA) 7 (77,8) 2 (22,2) 1
„-“ – šansų santykio negalima suskaičiuoti.
Tiriant CCND1 rs9344 genotipų GG, GA, GG įtaką krūties vėžio morfologinėms ir klinikinėms savybėms taip pat nebuvo rasta statistiškai reikšmingo ryšio tarp genotipų ir pacienčių amžiaus, naviko dydžio, metastazių limfmazgiuose, naviko diferenciacijos laipsnio ir receptorių (ER, PR, HER2) ekspresijos (13 ir 14 lentelės).
Tiriant CCND1 rs9344 polimorfizmo G ir A alelių ryšį su naviko morfologinėmis ir klinikinėmis savybėmis, nustatytas statistiškai reikšmingas G alelio ryšys su naviko dydžiu (13 lentelė). 70,7% pacienčių, turinčių G alelį (GG+GA genotipų nešiotojos), naviko dydis buvo mažesnis negu 2 cm., o 29,3% pacienčių naviko dydis buvo tarp 2 ir 5 cm. 52,6 % pacienčių, kurios genotipe neturėjo G alelio (AA genotipas), naviko dydis buvo mažesnis negu 2 cm, o 2-5 cm. dydžio navikai diagnozuoti 47,4% pacienčių be G alelio. G alelio neturinčioms pacientėms didesnio naviko rizika buvo 2,17 karto aukštesnė (ŠS=2,17, 95% PI 1,04-4,54, p=0,04) negu G alelio nešiotojoms. Tarp kitų naviko morfologinių ir klinikinių savybių ir šio polimorfizmo alelių reikšmingo ryšio nenustatyta (13 ir 14 lentelės)
13 lentelė. CCND1 rs 9344polimorfizmo ryšio su KV klinikinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas/alelis
Reikšmės N (%) ŠS (95% PI) p Amžiaus grupė ≤40 metų/ >40 metų ≤40 metų >40 metų Genotipinis AA 9 (23,7) 29 (76,3) 0,85 GA 21 (24,1) 66 (75,9) GG 13 33
30 (28,3) (71,7)
Alelinis A alelio nešiotojai (AA+GA) 30 (24,0) 95 (76,0) 0,80 (0,37-1,71) 0,57 Neturintys A alelio (GG) 13 (28,3) 33 (71,7) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 34 (25,6) 99 (74,4) 1,10 (0,48-2,57) 0,81 Neturintys G alelio (AA) 9 (23,7) 29 (76,3) 1 Naviko dydis <2 cm./ 2–5 cm 2-5 cm <2 cm Genotipinis AA 18 (47,4) 20 (52,6) 0,10 GA 24 (27,6) 63 (72,4) GG 15 (32,6) 31 (67,4) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+AG) 42 (33,6) 83 (66,4) 1 0,90 Neturintys A alelio (GG) 15 (32,6) 31 (67,4) 0,96 (0,47-1,96) G alelio nešiotojai (AG+GG) 39 (29,3) 94 (70,7) 1 0,04 Neturintys G alelio (AA) 18 (47,4) 20 (52,6) 2,17 (1,04-4,54) Limfmazgių būklė Nepažeisti / pažeisti Nepažeisti Pažeisti Genotipinis AA 23 (60,5) 15 (39,5) 0,67 GA 56 (64,4) 31 (35,6) GG 26 (56,5) 20 (43,5) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+AG) 79 (63,2) 46 (36,8) 1,32 (0,67-2,62) 0,43 Neturintys A alelio (GG) 26 (56,5) 20 (43,5) 1 G alelio nešiotojai (AG+GG) 82 (61,7) 51 (38,3) 1,05 (0,50-2,2) 0,90 Neturintys G alelio (AA) 23 (60,5) 15 (39,5) 1
31 14 lentelė. CCND1 rs 9344 polimorfizmo ryšio su KV patomorfologinėmis savybėmis statistinė analizė.
Parametras Modelis Genotipas
Reikšmės N (%) ŠS (95% PI) p Naviko diferenciacij os laipsnis G1+G2 / G3 G1 arba G2 G3 Genotipinis AA 28 (73,7) 10 (26,3) 0,58 GA 70 (80,5) 17 (19,5) GG 34 (73,9) 12 (26,1) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 98 (78,4) 27 (21,6) 1,28 (0,59-2,81) 0,54 Neturintys A alelio (GG) 34 (73,9) 12 (26,1) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 104 (78,2) 29 (21,8) 1,28 (0,56-2,94) 0,56 Neturintys G alelio (AA) 28 (73,7) 10 (26,3) 1 Estrogenų receptoriai Neigiami / teigiami Neigiami Teigiami Genotipinis AA 14 (36,8) 24 (63,2) 0,61 GA 25 (28,7) 62 (71,3) GG 16 (34,8) 30 (65,2) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 39 (31,2) 86 (68,8) 0,85 (0,42-1,74) 0,66 Neturintys A alelio (GG) 16 (34,8) 30 (65,2) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 41 (30,8) 92 (69,2) 0,76 (0,36-1,63) 0,49 Neturintys G alelio (AA) 14 (36,8) 24 (63,2) 1 Progesteron ų receptoriai Neigiami / teigiami Neigiami Teigiami Genotipinis AA 13 (34,2) 25 (65,8) 0,57 AG 36 (41,4) 51 (58,6)
32
GG 21
(45,7)
25 (54,3) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 49 (39,2) 76 (60,8) 0,77 (0,39-1,52) 0,45 Neturintys A alelio (GG) 21 (45,7) 25 (54,3) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 57 (42,9) 76 (57,1) 1,44 (0,68-3,06) 0,34 Neturintys G alelio (AA) 13 (34,2) 25 (65,8) 1 HER2 receptoriai Neigiami / teigiami Neigiami Teigiami Genotipinis AA 32 (84,2) 6 (15,8) 0,78 AG 71 (81,6) 16 (18,4) GG 36 (78,3) 10 (21,7) Alelinis A alelio nešiotojai
(AA+GA) 103 (82,4) 22 (17,6) 1,30 (0,56-3,01) 0,54 Neturintys A alelio (GG) 36 (78,3) 10 (21,7) 1 G alelio nešiotojai (GA+GG) 107 (80,5) 26 (19,5) 0,77 (0,29-2,04) 0,60 Neturintys G alelio (AA) 32 (84,2) 6 (15,8) 1
12.3 CCND1 rs9344 ir EGFR rs2227983 polimorfizmų ryšys su krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eiga
Pacienčių sekimo vidurkis buvo 79,53 mėn. (nuo 22 iki 202 mėn.). Per sekimo laikotarpį 18,7% pacienčių liga recidyvavo, 15,8% pacienčių stebėtos tolimosios metastazės, 12,9 % pacienčių mirė. Visos mirtys buvo sąlygotos krūties vėžio progresavimo.
Atlikus Kaplan-Meierio analizę rasta statistiškai reikšminga sąsaja tarp EGFR polimorfizmo ir laiko iki ligos atkryčio bei bendro išgyvenamumo. Nustatyta, jog AA genotipas, palyginus su GA ir GG genotipais, pasižymi trumpesniu laiku iki ligos atkryčio (3 paveikslėlis). AA genotipo pacienčių laiko iki ligos atkryčio vidurkis buvo 69,4 mėn. (95% PI: 38,81-100,02, p=0,049), GG – 152,2 mėn. (95% PI: 138,20-166,35, p=0,049), o GA 158,36 mėn. (95% PI 134,95-181,76, p=0,049).
33 3 pav. EGFR rs2227983 Kaplan-Meierio LLA kreivės pagal genotipinį modelį.
Kitas statistiškai reikšmingas ryšys buvo rastas tarp G alelio nešiojimo ir ilgesnio laiko iki ligos atkryčio (4 paveikslėlis). G alelio neturinčių pacienčių laiko iki ligos atkryčio vidurkis buvo 69,4 mėn. (95% PI: 38,81-100,02, p=0,02), o G alelio nešiotojų (GG ir GA genotipų pacienčių) – 162,01 mėn. (95% PI: 148,51-175,50, p=0,02). G alelio nešiotojos taip pat pasižymėjo geresniu bendru išgyvenamumu (5 paveikslėlis). G alelio neturinčiųjų tiriamųjų laiko iki mirties vidurkis buvo 98,4 mėn. (95% PI: 71,87-124,932, p=0,03), o G alelio nešiotojų – 176,17 mėn. (95% PI: 165,65-186,68, p=0,03).
34 4 pav. EGFR rs2227983 Kaplan-Meierio LLA kreivės pagal alelinį modelį.
35 5 pav. EGFR rs2227983 Kaplan-Meierio BI kreivės pagal alelinį modelį.
Pagal Kokso vienmatę rizikų regresinę analizę, vertinant visus tris genotipus atskirai genotipiniu modeliu, AA genotipas buvo statistiškai reikšmingas blogos prognozės rodiklis. Esant šiam genotipui, ligos atkryčio rizika buvo didesnė 3,49 karto didesnė (SR=3,49, 95% PI: 1.17-10.46, p=0,03) negu pacientėms su GA ir GG genotipais. Rezultatai patvirtinti ir aleliniu modeliu, kuris parodė, jog pacientėms, neturinčioms G alelio, ligos atkryčio rizika buvo 3,48 karto didesnė (SR=3,48, 95% PI: 1,20-10,05, p=0,02) nei jį turinčioms, o mirties rizika 3,54 karto didesnė (SR=3,54 95% PI: 1,05-11,99, p=0,04), (15 lentelė).
36 15 lentelė. EGFR_rs2227983 ir CCND1_rs9344 polimorfizmų Kokso vienmatės regresinės
analizės rezultatų lentelė
Polimorf izmas
Analizės modelis n (%) LLA BI
SR (95% PI) p SR (95% PI) p EGFR_r s222798 3 Ge noti pini s modelis GG 106 (0,62) 1 1 GA 56 (0,33) 1.02 (0.47-2.20) 0.97 0.85 (0.32-2.24) 0.74 AA 9 (0,05) 3.49 (1.17-10.46) 0.03 3.36 (0.96-11.80) 0.06 Ale li nis m ode li s G alelio nešiotojai (GA+GG) 162 (0,95) 1 0.02 1 0.04 Neturintys G alelio (AA) 9 (0,05) 3,48 (1,20-10,05) 3,54 (1,05-11,99) A alelio nešiotojai (AA+GA) 65 (0,38) 1.27 (0,63-2,56) 0.50 1.13 (0.48-2.65) 0.77 Neturintys A alelio (GG) 106 (0,62) 1 1 CCND1_ rs9344 Ge noti pini s modelis GG 46 (0,27) 1 0.83 1 GA 87 (0,51) 1.10 (0.47-2.57) 0.88 (0.31-2.47) 0.81 AA 38 (0,22) 1.35 (0.51-3.61) 0.55 1.66 (0.56-4.94) 0.36 Ale li nis m ode li s G alelio nešiotojai (GA+GG) 133 (0,78) 0.79 (0,35-1,76) 0.56 0.56 (0.23-1.37) 0.20 Neturintys G alelio (AA) 38 (0,22) 1 1 A alelio nešiotojai (AA+GA) 125 (0,73) 1.17 (0.53-2.61) 0.70 1.11 (0.43-2.83) 0.83 Neturintys A alelio (GG) 46 (0,27) 1 1
37 Atlikus daugiamatę Kokso regresinę analizę, į kurią įtraukti svarbiausi klinikiniai ir morfologiniai prognozės veiksniai (16 lentelė), statistiškai reikšmingų skirtumų tarp EGFR rs2227983 polimorfizmo alelių ir pacienčių ligos eigos neišliko.
16 lentelė. EGFR rs2227983 polimorfizmo Kokso daugiamatės regresinės analizės rezultatai
Kintamasis n (%) Įtaka LLA Įtaka BI
SR (95% PI) p SR (95% PI) p Amžius diagnozės metu ≤40 metų 43 (25,1) 1,28 (0,59-2,77) 0,54 0,89 (0,36-2,23) 0,81 > 40 metų 128 (74,9) 1 1 Naviko dydis <2 cm 114 (0,67) 1,06 (0,48-2,32) 0,88 0,79 (0,31-2,02) 0,62 2-5 cm 57 (0,33) 1 1 Limfmazgių pažeidimas Nepažeisti 105 (0,61) 0,45 (0,21-0,97) 0,04 0,52 (0,21-1,34) 0,18 Pažeisti 66 (0,39) 1 1 Diferenciacij os laipsnis G1 ir G2 132 (0,78) 1,13 (0,44-2,95) 0,80 0,91 (0,30-2,74) 0,87 G3 39 (0,22) 1 1 ER ER (+) 116 (0,68) 1 0,49 1 0,50 ER (-) 55 (0,32) 0,72 (0,28-1,82) 0,69 (0,23-2,00) PR PR (+) 101 (0,59) 1 0,31 1 0,17 PR (-) 70 (0,41) 1,64 (0,64-4,20) 2,21 (0,72-6,80) HER2 HER2(teig.) 32 (0,19) 1 0,27 1 0,90 HER2(neig.) 139 (0,81) 1,78 (0,64-4,94) 1,08 (0,36-3,22) EGFR rs2227983 G alelio nešiotojai 162 (0,95) 0,34 (0,10-1,18) 0,09 0,24 (0,06-1,04) 0,06 G alelio neturintys 9 (0,05) 1 1
Reiškmingos sąsajos paryškintos.
Tarp CCND1 rs9344 polimorfizmo ir ligos atkryčio ir bendrojo išgyvenamumo statistiškai reikšmingo ryšio nebuvo gauta nei pagal vieną modelį.
38
13. REZULTATŲ APTARIMAS
Pastaraisiais metais atliekama vis daugiau tyrimų, kurių metu ieškoma naujų predikcinių ir prognostinių žymenų krūties vėžio diagnostikoje ir gydyme. Visgi, funkcinių vieno nukleotido polimorfizmų (VNP) įtaka vėžiniams procesams nėra iki galo ištirta. Nagrinėjant literatūrą, buvo rasta tik keletas studijų, tyrusių EGFR geno rs2227983 polimorfizmo ryšį su krūties vėžio rizika bei klinikinėmis savybėmis.
Kallel ir kiti 2009 metais atliktame tyrime su 148 krūties vėžiu sergančiomis pacientėmis pateikė išvadą, jog homozigotinis GG genotipas susijęs su naviko išplitimu į limfinius mazgus ir blogesnės diferenciacijos navikais (G3 stadijos), tačiau polimorfizmas nėra susijęs su krūties vėžio išsivystymu [44]. Kitame tyrime M. Sobral Leite ir kiti Brazilijoje į tyrimą įtraukė 508 krūties vėžiu sergančias moteris ir nustatė, jog AA genotipas mažiau susijęs su metastazavimu į limfmazgiu, o A alelis neturi įtakos krūties vėžio išsivystymo rizikai [43].
EGFR geno rs2227983 polimorfizmo alelių ir genotipų pasiskirstymo dažniai mūsų tyrime nuo kitų autorių rezultatų ženkliau nesiskyrė. Kallel ir kitų tyrimo KV pacienčių tarpe G alelį turėjo 76.3%, o A alelį – 23.6% tiriamųjų [44]. Mūsų tyrime G ir A alelis pasireiškė atitinkamai 78% ir 22% pacienčių. Sobral Leite tyrime GG genotipas fiksuotas 61%, GA – 34,9%, o AA 4,2% pacienčių, kuomet mūsų tyrimo metu šie genotipai buvo pasiskirstę atitinkamai 62%, 32% ir 5% dažniais [43]. Mūsų atliktame tyrime, skirtingai nuo Kallel ir kt., statistiškai reikšmingo ryšio tarp limfmazgių pažeidimo ar naviko diferenciacijos laipsnio ir EGFR geno rs2227983 polimorfizmo nebuvo rasta [44]. Visos į mūsų tyrimą įtrauktos klinikinės ir morfologinės KV savybės neturėjo sąsajos su tirtu VNP. Visgi, nei Sobral Leite, nei mūsų tyrime nebuvo rasta statistiškai reikšmingų sąsajų tarp EGFR rs2227983 ir amžiaus diagnozės metu, naviko diferenciacijos, ER, PR ir HER2 receptorių ekspresijos [43].
Atlikus Kaplan-Meierio išgyvenamumo analizę ir Kokso vienmatę rizikų regresinę analizę mūsų tyrime nustatyta, jog G alelio nešiotojos pasižymi vėlyvesniu ligos atkryčiu ir geresniu bendru išgyvenamumu, o AA genotipas (G alelio neturėjimas) yra susijęs su greitesniu ligos atkryčiu. Sobral Leite tyrimo metu buvo gauti prieštaringi rezultatai, teigta, jog AA genotipas susijęs mažesne atkryčio rizika palyginus su GG genotipu, o A alelis – su geresnėmis tolimosiomis ligos išeitimis [43]. Visgi, daugiamatėje Kokso regresijų analizėje mūsų tyrime statistiškai reikšmingų EGFR geno rs2227983 polimorfizmo sąsajų su išgyvenamumo rodikliais nestebėta.
39 Skirtingai nuo EGFR geno rs2227983 polimorfizmo, atlikta daugiau tyrimų, vertinusių CCND1 geno rs9344 polimorfizmo ir KV ryšį. A alelis arba AA genotipas daugelyje tyrimų ir metaanalizių buvo įvardyti kaip veiksniai, didinantys riziką susirgti KV [24-28]. Lu ir kolegų metaanalizėje bei Soleimani ir kitų tyrimo duomenimis A alelis pasižymi rizika tik baltųjų rasės žmonėmis [27, 28]. Kiti tyrėjai, Bedewy ir kolegos, nustatė, jog A alelis yra rizikos veiksnys KV išsivystyme nepriklausomai nuo rasės [30]. Vis dėlto, kol kas itin trūksta tyrimų, nagrinėjančių šio polimorfizmo ryšį su naviko klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis. Mūsų atliktame tyrime gauta, jog iki 2 cm. dydžio navikai buvo diagnozuoti 70,7% pacienčių, kurios genotipe turėjo G alelį, kuomet iš visų pacienčių, turėjusių A alelį, toks naviko dydis diagnozuotas 52,6% pacienčių. 2-5 cm navikai tarp G alelio nešiotojų buvo diagnozuoti 29,3%, o tarp AA nešiotojų – 47,4% pacienčių ir G alelio neturinčioms pacientėms didesnio negu 2 cm naviko dydžio rizika buvo 2,17 karto didesnė (ŠS=2,17, PI 1,04-4,54) negu G alelio nešiotojoms. CCND1 rs9344 polimorfizmo A alelis yra atsakingas už mutavusios D1 ciklino baltymo formos (D1b ciklino) susidarymą, dėl kurio sutrinka genetinių klaidų ištaisymas ląstelių ciklo perėjimų metu ir yra skatinama mutavusių ląstelių proliferacija, todėl tikėtina, jog dėl šios priežasties G alelio neturėjimas (AA genotipas) yra susijęs su greitesniu naviko augimu [23]. Nė viename iš atliktų tyrimų dar nebuvo iki šiol rastas statistiškai reikšmingas ryšys tarp CCND1 geno rs9344 polimorfizmo ir naviko dydžio. Ebeid ir kitų tyrime nebuvo rasta sąsajų ne tik tarp VNP ir naviko dydžio, bet ir tarp kitų klinikinių bei morfologinių charakteristikų (naviko diferenciacijos, naviko išplitimo į limfmazgius, ER, PR ir HER2 ekspresijos), kurios buvo vertintos ir mūsų tyrime [23].
CCND1 rs9344 polimorfizmo genotipų ir alelių pasiskirstymas nežymiai skyrėsi nuo kitų autorių tyrimų. Liu ir kolegų atliktame tyrime su 1232 KV sergančiomis pacientėmis 26,2% turėjo su padidėjusią KV rizika siejamą AA genotipą, o mūsų tyrime AA genotipą turėjo 22% tiriamųjų. GG genotipas buvo labiausiai paplitęs ir Liu ir kitų (59,7%), ir mūsų tyrime (51%) [32].
CCND1 geno rs9344 polimorfizmo įtaka išgyvenamumui ir ligos eigai kol kas irgi nėra iki galo ištirta. Yu ir kolegų atliktame tyrime nustatytas laikas iki ligos atkryčio buvo ilgesnis G alelį turinčių genotipų (GG+GA) pacientėms palyginus su AA genotipu [32]. Mūsų atliktame tyrime nebuvo rasta reikšmingų sąsajų tarp išgyvenamumo rodiklių ir šio polimorfizmo alelių ar genotipų.
Nors ir mūsų tyrimui atrinktos pacientės buvo tos pačios rasės, visos sirgo ankstyvosios stadijos KV ir buvo gautos VNP sąsajos su klinikinėmis naviko savybėmis ir pacienčių ligos eiga, tyrimas turėjo keletą trūkumų. Rezultatams galėjo daryti įtaką tai, jog imtis nebuvo pakankamai didelė, nebuvo atlikti genotipų tyrimai iš navikinio audinio, netirtos CCND1 ir EGFR baltymų
40 koncentracijos. Potenciali geno-geno, geno-aplinkos įtaka bei nerandomizuota pacientų atranka yra kiti veiksniai, kurie galėjo būti įvertinti, siekiant tikslesnių rezultatų.
Buvo gauta, jog CCND1 rs9344 polimorfizmas yra susijęs su naviko dydžiu, EGFR rs2227983 polimorfizmo AA genotipas ir G alelio neturėjimas susijęs ankstyvesniu ligos atkryčiu ir blogesniu bendru išgyvenamumu, tačiau daugiamatėje analizėje ryšys neišliko. Tai galėjo sąlygoti maža imtis ir rezultatas galėjo būti neteisingai neigiamas, todėl reikalingi išsamesni tyrimai su didesne pacienčių imtimi ir su skirtingų rasių populiacijomis.
14. IŠVADOS
1. Ištyrus EGFR geno rs2227983 polimorfizmą tarp ankstyvuoju KV sergančių pacienčių, genotipai pasiskirstė taip: GG genotipas buvo nustatytas 62% tiriamųjų, AA – 5%, o GA genotipą turėjo 32% pacienčių. G alelis pasireiškė dažniau negu A alelis (78% ir 22% atitinkamai). Tiriant CCND1 rs9344 polimorfizmą dažniausiai pasireiškė GA genotipas 51%, GG nustatytas 27%, o AA – 22% tiriamųjų. G alelis buvo nežymiai dažnesnis negu A (52% ir 48%).
2. EGFR geno rs2227983 polimorfizmo sąsajų su klinikinėmis ir morfologinėmis KV savybėmis nenustatyta. Nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys tarp CCND1 rs9344 polimorfizmo ir naviko dydžio. G alelio neturinčioms pacientėms didesnio negu 2 cm naviko dydžio rizika buvo 2,17 karto didesnė negu G alelio nešiotojoms. Kitų sąsajų tarp CCND1 rs9344 polimorfizmo ir klinikinių bei morfologinių naviko savybių nenustatyta.
3. EGFR geno rs2227983 polimorfizmas vienveiksmėje analizėje turėjo įtakos laikui iki ligos atkryčio ir bendram išgyvenamumui, tačiau daugiaveiksmėje analizėje šios sąsajos neišliko statistiškai reikšmingos. CCND1 rs9344 polimorfizmas išgyvenamumui įtakos neturėjo.
41
15. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bray F et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians 68 6 (2018): 394-424. 2. Pan H et al. 20-Year Risks of Breast-Cancer Recurrence after Stopping Endocrine Therapy at 5 Years. N Engl J Med. 2017 Nov 9;377(19):1836-1846.
3. Nicolini A et al. Prognostic and predictive biomarkers in breast cancer: Past, present and future, Seminars in Cancer Biology, Volume 52, Part 1, 2018.
4. Fu F et al. Subtype-specific associations between breast cancer risk polymorphisms and the survival of early-stage breast cancer. J Transl Med. 2018
5. Hein A et al. (2017). Genetic Breast Cancer Susceptibility Variants and Prognosis in the Prospectively Randomized SUCCESS A Study. Geburtshilfe und Frauenheilkunde. 77. 651-659. 6. He Y, Liu H, Chen Q, Shao Y, Luo S. Relationships between SNPs and prognosis of breast cancer and pathogenic mechanism. Mol Genet Genomic Med. 2019 Sep;7(9):e871.
7. Pirie A, Guo Q, Kraft P, Canisius et al. Common germline polymorphisms associated with breast cancer-specific survival. Breast Cancer Res. 2015 Apr 22;17(1):58.
8. Jung J.H., Chae, Y.S., Moon J.H. et al. TNF superfamily gene polymorphism as prognostic factor in early breast cancer. J Cancer Res Clin Oncol 136, 685–694 (2010).
9. Barnum KJ, O'Connell MJ. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods Mol Biol. 2014;1170:29-40.
10. Hunt T, Nasmyth K, Novák B. The cell cycle. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2011 Dec 27;366(1584):3494-7.
11. Niu Y, Xu J, Sun T. Cyclin-Dependent Kinases 4/6 Inhibitors in Breast Cancer: Current Status, Resistance, and Combination Strategies. J Cancer. 2019 Aug 29;10(22):5504-5517.
12. Bai J, Li Y, Zhang G. Cell cycle regulation and anticancer drug discovery. Cancer Biol Med. 2017 Nov;14(4):348-362.
13. Visconti R, Della Monica R, Grieco D. Cell cycle checkpoint in cancer: a therapeutically targetable double-edged sword. J Exp Clin Cancer Res. 2016 Sep 27;35(1):153.
