1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA
Vaida Punytė
IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genų polimorfizmų sąsajos su regos nervo neurito pasireiškimu
Baigiamasis magistrinis darbas Medicina
Mokslinis vadovas: Dr. R. Liutkevičienė
Kaunas, 2020
2
TURINYS
1. SANTRAUKA... 4 2. SUMMARY... 6 3. PADĖKA ... 8 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 85. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8
6. SANTRUMPOS ... 9
7. ĮVADAS ... 10
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
9. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
9.1 Epidemiologija ... 12
9.2 Etiologija ... 12
9.3 Patogenezė ... 13
9.4 IL-6 sąsajos su regos nervo neuritu ... 13
9.5 VEGFA sąsajos su regos nervo neuritu ... 14
9.6 TIMP – 3 sąsajos su regos nervo neuritu... 15
9.7 Klinika ... 16
9.8 Diagnostika... 17
9.9 Gydymas... 19
9.10 Regos nervo neurito ir išsėtinės sklerozės sąsajos ... 20
9.11 Tirtų genų sąsajos su RNN ... 20
10. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 22
10.1 Tyrimo organizavimas... 22
10.2 Tyrimo objektas... 22
10.3 Tiriamųjų atranka ... 22
10.4 Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas……….22
10.5 DNR išskyrimas naudojant silikagelio kolonėles………22
10.6 DNR išskyrimo etapai……….………...……….………23
10.7 DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru………..…………...……24 10.8 Nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos
3 metodu ………24 10.9 PGR etapai……….………..24 10.10 PGR principas……….………...25 10.11 Statistinė analizė ... 27 11. REZULTATAI ... 30
11.1 VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795 genotipų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje ... 30
11.2 IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį bei amžių 33 11.3 IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu bei regos nervo neuritu ir išsėtine skleroze drauge ... 43
12. REZULTATŲ APTARIMAS... 47
13. IŠVADOS ... 49
4
1. SANTRAUKA
Baigiamojo magistro darbo autorė: Vaida Punytė
Baigiamojo magistro darbo pavadinimas: IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genų
polimorfizmų sąsajos su regos nervo neurito pasireiškimu
Regos nervo neuritas (RNN) – tai regos nervo uždegimas. Didelis dėmesys yra skiriamas uždegiminiams ir imuniniams procesams, kurie tikėtina prisideda prie demielinizacijos, bei gali būti siejami su išsėtine skleroze (IS). Manoma, kad IL-6, VEGFA ir TIMP-3 dalyvauja centrinės nervų sistemos (CNS) uždegiminiame procese ir demielinizacijos pasireiškime. Iki šiol nėra atlikta tyrimų, kurie tirtų šių genų polimorfizmų poveikį RNN bei RNN su IS vystymuisi.
Darbo tikslas: Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genų polimorfizmų
sąsajas su RNN bei RNN ir IS pasireiškimu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų dažnį pacientų, sergančių RNN grupėje bei sveikų žmonių imtyje.
2. Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų sąsajas pacientams, sergantiems RNN priklausomai nuo lyties bei amžiaus.
3. Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų sąsajas pacientams, sergantiems RNN bei RNN ir IS kartu.
Tyrimo metodai ir dalyviai: Ištirti 78 pacientai, sergantys RNN, bei 181 sveikų asmenų. Tolimesnei
analizei pacientai, sergantys RNN, buvo suskirstyti į 2 grupes: sergantys IS (n=28) ir be IS (47). 3 tiriamieji iš 78 asmenų, sergančių RNN, neturėjo patvirtintų IS duomenų. Iš tiriamųjų veninio kraujo leukocitų išskirta DNR. Genotipavimas atliktas naudojant realaus laiko polimerazės grandinės reakcijos metodą. Rezultatai vertinti naudojant “ IBM SPSS Statistics 24.0” programą.
Tyrimo rezultatai: Nustatėme, kad VEGFA rs1413711 T/C ir C/C genotipai galimybę susirgti RNN didina
2,8 karto dominantiniame (p=0,003), T/C genotipas – 2,7 karto, o C/C genotipas – 3 kartais kodominantiniame (p=0,005, 0,007) modeliuose. Kiekvienas VEGFA rs1413711 C alelis susijęs su 1,7 karto didesne RNN išsivystymo galimybe (p=0,006). IL-6 rs1800795 C/C genotipas galimybę susirgti RNN didina 2,1 karto kodominantiniame (p=0,04) ir 3,2 karto recesyviniame (p<0,001) modeliuose. Kiekvienas IL-6 rs1800795 C alelis susijęs su 1,6 karto didesne RNN išsivystymo galimybe (p=0,015). IL-6 rs1800795 C/C genotipas susijęs su 2,5 karto didesne RNN su IS išsivystymo galimybe recesyviniame (p=0,03) modelyje.
5
Išvados: VEGFA rs1413711 ir IL-6 rs1800795 genų polimorfizmai yra susiję su RNN be IS, o IL-6
6
2. SUMMARY
Author: Vaida Punytė
Title of research: IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 and TIMP-3 rs9621532 gene polymorphisms
association with optic neuritis
Optic neuritis (ON) – is an inflammation of the optic nerve. A lot of attention is given to inflammatory and immune processes which are considered to contribute to demyelination of axons and may be associated with multiple sclerosis (MS). IL-6, VEGFA and TIMP-3 genes are thought to be involved in the inflammatory process of the central nervous system (CNS) and the manifestation of demyelination.
Aim: To evaluate the association between IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 and TIMP-3 rs9621532 gene
polymorphisms and the manifestation of ON with or without MS. The impact of polymorphisms of these genes on ON and ON with MS development has not been investigated before.
Objectives:
1. To evaluate the frequency of IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 and TIMP-3 rs9621532 in patients with ON and healthy subjects.
2. To evaluate the relationship between IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 and TIMP-3 rs9621532 in patients with ON and healthy subjects, based on their gender and age.
3. To evaluate the relationship between IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 and TIMP-3 rs9621532 in patients with ON with or without MS.
Methods: Investigated 78 patients with ON and 181 healthy controls. For further analysis we devided the
ON group into two subgroups: patients with MS (n=28) and without MS (n=47). 3 patients did not have any data concerning MS therefore were excluded from further analysis. DNA of participant was collected from venous blood leukocytes. Genotyping was performed according to the real-time polymerase chain reaction method. The data was analyzed using the “IBM SPSS Statistics 24.0” program.
Results: Our study determined that T/C and C/C genotypes of VEGFA rs1413711 were associated with
2,8-fold increased odds of ON development under the dominant (p=0,003), T/C genotype with 2,7-fold and C/C genotype with 3-fold under the codominant (p=0,005, 0,007) models. Each allele C at VEGFA rs1413711 was associated with 1.7-fold increased odds of ON development (p=0,006). IL-6 rs1800795 C/C genotype was associated with 2,1-fold increased odds of ON development under the codominant (p=0,04) and 3,2-fold under the recessive (p<0,001) genetic models. Each allele C at IL-6 rs1800795 was associated with 1.6-fold-increased odds of ON development, as well (p=0,015). C/C genotype of IL-6 rs1800795 was associated with 2,5-fold increased odds of ON with MS development under the recessive (p=0,03) model.
7
Conclusions: VEGFA rs1413711 and IL-6 rs1800795 are associated with the development of ON without
8
3. PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju savo darbo vadovei dr. Rasai Liutkevičienei už visą pagalbą bei vertingus patarimus atliekant šį darbą. Alvitai Vilkevičiūtei bei Gretai Gedvilaitei už pagalbą bei pastabas laboratorijoje atliekant tyrimą.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autorei interesų konflikto nebuvo.
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
9
6. SANTRUMPOS
RNN – regos nervo neuritas IS – išsėtinė sklerozė
CNS – centrinė nervų sistema IL-6- interleukinas – 6
VEGFA – kraujagyslių endotelio augimo faktorius A (angl. Vascular endothelial growth factor A) TIMP-3 – audinių metaloproteinazių inhibitorius – 3 (angl. Tissue inhibitor of metalloproteinase -3) NMO – optinis neuromielitas
DNR – deoksiribonukleorūgštis KSB – kraujo – smegenų barjeras
MMP – endogeninė matrikso metaloproteinazė
TNF – naviko nekrozės faktorius (angl. Tumor necrosis factor)
ICAM-1 – interląstelinė adhezijos molekulė -1 (angl. Intercellular adhesion molecule-1)
VCAM-1 – kraujagyslinių ląstelių adhezijos molekulė – 1 (angl. Vascular cell adhesion molecule-1) LPS – lipopolisacharidai
DATL – didelio tankio lipoproteinai MRT – magnetinis rezonanso tyrimas PGR – polimerazės grandininės reakcija SN – standartinis nuokrypis
GS – galimybių santykis
AIC – Akaike informacinis kriterijus (angl. AIC)
10
7. ĮVADAS
Regos nervo neuritas (RNN) gali būti apibrėžiamas kaip ūmi, demielinizuojanti arba idiopatinė regos nervo neuropatija. RNN gali pasireikšti kaip atskira liga arba kaip kitų ligų išraiška (išsėtinės sklerozės (IS) arba optinio neuromielito (NMO)) [1]. RNN dažniausiai serga jaunesnio amžiaus suaugusieji (18-45 m.) [2], rečiau jaunesni nei 18 metų ar vyresni nei 50 metų [3].
RNN yra skirstomas į tipinę ir atipinę formas. Tipinis RNN yra susijęs su demielinizacijos procesais galvos smegenyse. Nors demielinizacija yra pagrindinis patologinis RNN požymis, kuris pasireiškia tiek IS, tiek NMO atvejais, tai nėra vienintelis RNN patologinis mechanizmas. Tyrimais įrodyta, kad taip pat pasireiškia aksonų praradimas ir astrocitų pažeidimas [1,4]. Atipinį RNN gali sukelti bakterinės, virusinės ir grybelinės infekcijos, autoimuninės ligos ar kitos uždegiminės ligos [5]. Taigi diferencinė diagnostika yra svarbi, o prognozė ir gydymas priklauso nuo priežasties [1].
Yra nustatyta, kad 20% pacientų sergančių IS, ji pirmiausia pasireiškia, kaip RNN ir 50% pacientų sergančių IS gyvenimo eigoje pasireiškia RNN. Pacientams, kuriems RNN pasireiškia kaip pirmoji IS išraiška, tolesnė ligos eiga yra geresnės prognozės [6]. Taigi suradus biožymenis, kurie galėtų prognozuoti vėliau atsirandančią IS po RNN epizodo, būtų galima palengvinti IS eigą pradedant ankstyvą gydymą. Atlikti moksliniai tyrimai rodo, kad interleukinas - 6 (IL-6) [7], kraujagyslinis endotelio augimo faktorius A (angl. Vascular endothelial growth factor A, VEGFA) [8] ir audinių metaloproteinazių inhibitorius – 3 (angl. Tissue inhibitor of metalloproteinase - 3, TIMP-3) [9] dalyvauja centrinės nervų sistemos (CNS) uždegiminiame procese bei demielinizacijos pasireiškime. Mūsų žiniomis iki šiol nėra atlikta tyrimų, kurie tirtų šių genų polimorfizmų poveikį RNN bei RNN su IS vystymuisi. Tikimės, jog mūsų pasirinktų genų polimorfizmų sąsajos tyrimas suteiks naujos informacijos apie RNN patogenezę.
11
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genų polimorfizmų
sąsajas su regos nervo neurito bei regos nervo neurito ir išsėtinės sklerozės pasireiškimu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų dažnį pacientų, sergančių regos nervo neuritu grupėje bei sveikų žmonių populiacijos imtyje.
2. Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų sąsajas pacientams, sergantiems regos nervo neuritu priklausomai nuo lyties bei amžiaus.
3. Nustatyti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų sąsajas pacientams, sergantiems regos nervo neuritu bei regos nervo neuritu ir išsėtine skleroze kartu.
12
9. LITERATŪROS APŽVALGA
Regos nervo neuritas (RNN) – tai yra regos nervo uždegimas. Jis yra paplitęs visame pasaulyje, turi daug priežasčių ir dažnai siejamas su išsėtine skleroze (IS) [5].
9.1 Epidemiologija
Vienpusio RNN paplitimas pasaulyje yra nuo 0,94 iki 2,18 atvejų 100 000 gyventojų per metus. Paplitimas Japonijoje (1,6 atvejo 100 000 gyventojų) yra panašus į Švedijos (1,46 atvejo 100 000 gyventojų) ir Jungtinės Karalystės (1 atvejis 100 000 gyventojų). Paplitimas vidurio Europoje yra didesnis – 5 atvejai 100 000 gyventojų [3]. Atlikti tyrimai rodo, kad moterų sergamumas yra didesnis nei vyrų, pvz.: Japonijoje – 1,22:1, o šiaurinėje Europoje santykis yra 3:1. Taip pat sergamumas didesnis yra pavasarį [5].
9.2 Etiologija
RNN yra skirstomas į tipinę ir atipinę formas. Tipinis RNN dažnai yra susijęs su IS dėl vykstančių demielinizacijos procesų galvos smegenyse, kurie sukelia aksonų netekimą [5]. Atipinį RNN gali sukelti infekcijos (pvz., Laimo liga, sifilis, tuberkuliozė, toksoplazmozė), autoimuninės ligos (pvz., sarkoidozė, sisteminė raudonoji vilkligė, Sjogreno sindromas, Behcet‘o liga), kitos uždegiminės ligos (pvz., neuroretinitas, Tolosa-Hunt sindromas), regos nervo kompresija (pvz., Greivso oftalmopatija, metastazės, arterijų aneurizmos, pirminiai augliai (hipofizės adenomos, gliomos, meningiomos)), paveldėtos optinės neuropatijos (pvz., Lėberio sindromas) toksinės bei maistinės neuropatijos (pvz., vitamino B12 trūkumas, apsinuodijimas metanoliu, ar vaistų sukeltos optinės neuropatijos (Etambutolio, Linezolido ar Amiodarono vartojimas anamnezėje) [10].
13
9.3 Patogenezė
Regos nervo pažeidimai yra labai panašūs į IS sukeltus smegenų pažeidimus. Ūmioje fazėje pasireiškia uždegiminiai demielinizuojantys procesai, kurių rezultatas yra įvairaus lygio nervo laidumo sutrikimas ir regėjimo praradimas. Pirminis T- ląstelių aktyvavimas sukelia uždegiminių citokinų išsiskyrimą, nors gali dalyvauti ir B- ląstelės bei aktyvinta mikroglija. Uždegimo išnykimas ir regos atsistatymas vyksta kelias savaites. Prasideda remielinizacija, tačiau nepilna. Natrio kanalai pasiskirsto ant likusių demielinizuotų nervo segmentų. Šis natrio kanalų persiskirstymas padidina nervo laidumą, bet likę aksonai tampa labiau pažeidžiami. Regėjimo atsistatymas gali būti nepilnas dėl nuolatinės demielinizacijos ir aksonų praradimo [5].
9.4 IL-6 sąsajos su regos nervo neuritu
Interleukinas – 6 (6) – yra uždegiminis citokinų šeimos baltymas, kurį koduoja 6 genas. IL-6 yra multifunkcinis citokinas, kuris yra svarbus uždegiminiuose ir imuniniuose procesuose. Dėl jo svarbaus vaidmens uždegimo pradžioje ir pabaigoje, sutrikus jo reguliacijai pasireiškia įvairios lėtinės uždegiminės bei autoimuninės ligos. Taigi, geresnis IL-6 vaidmens supratimas įvairiose patologinėse būklėse leistų išvystyti naujas šių patologijų gydymo strategijas [11].
IL-6 genas yra lokalizuotas 7 žmogaus chromosomoje trumpajame petyje (7p15.3) (1pav.) ir susideda iš 5 egzonų ir 4 intronų. IL-6 genas koduoja IL-6 pirmtaką, kuris yra aktyvuojamas proteolizės būdu. IL-6 yra gaminamas T ir B limfocitų, fibroblastų, monocitų, keratinocitų ir endotelio ląstelių, o sintezę gali išprovokuoti antriniai signalo tarpininkai, bakterijų lipopolisacharidai, virusai, citokinai, tokie kaip IL-1, TNF-alfa ir epidermio augimo faktorius, trombocitų augimo faktorius. IL-6 geno polimorfizmai promotoriaus srityje gali sukelti transkripcijos pokyčius ir šio citokino išskyrimą. Atlikti tyrimai rodo, kad vieno nukleotido G/C polimorfizmas IL-6 geno 174 promotoriaus vietoje kontroliuoja šio geno transkripcijos greitį. Yra identifikuoti du šio polimorfizmo fenotipai: 174 G/G ir 174 G/C genotipai, susiję su greita IL-6 produkcija ir 174 C/C genotipas, susijęs lėta IL-6 produkcija. 174 G/C fenotipas yra susijęs su uždegiminėmis ligomis, tokiomis kaip Alzheimerio liga, 2 tipo cukrinis diabetas, aterosklerozė, osteoporozė ar įvairūs navikai [11].
14 IL-6 yra laikomas pagrindiniu mediatoriumi daugelio imuninių ir lėtinių uždegiminių ligų metu, pvz.: reumatoidinis artritas, išsėtinė sklerozė ar Krono liga. IL-6 yra pagrindinis ūmioje uždegimo fazėje sintezuojamų baltymų stimuliatorius, kurių kiekis būna padidėjęs ūminių ir lėtinių uždegiminių ligų atveju. IL-6 sukelia ūmios fazės reakciją ir B ląstelių diferenciaciją į antikūnius gaminančias ląsteles, to pasekoje yra stimuliuojama imunoglobulinų sekrecija ir skatinama autoantikūnų gamyba. Be to, IL-6 kontroliuoja T ląstelių proliferaciją, diferenciaciją ir taip padeda sukurti uždegiminę aplinką. IL-6 taip pat prisideda prie ūmaus uždegimo pritraukiant neutrofilus į uždegimo vietą. Neutrofilai toliau aktyvuoja IL-6 receptorius aplinkinėse ląstelėse ir taip skatina viduląstelinį IL-6 perdavimo kelią. Dėl to uždegimo vietoje neutrofilus pakeis monocitai, nes yra skatinama monocitus pritraukiančių molekulių sintezė. Monocitų kaupimasis uždegimo srityje yra pagrindinis požymis, kad ūmus uždegimas pereina į lėtinį. IL-6 viduląstelinis perdavimo kelias taip pat kontroliuoja leukocitų infiltraciją sustiprindamas adhezijos molekulių išskyrimą, tokių kaip interląstelinė adhezijos molekulė-1 (angl. Intercellular adhesion molecule - 1, ICAM-1) ir kraujagyslinių ląstelių adhezijos molekulė-1 (angl. Vascular cell adhesion molecule – 1, VCAM-1) endotelio ląstelėse bei L-selektinas limfocituose. Be to, IL-6 skatina makrofagų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus gamybą, dėlto monocitai diferencijuojasi į makrofagus. IL-6 sukelta neutrofilų apoptozės indukcija prisideda šalinant ūmią neutrofilų infiltraciją. Taip pat IL-6 kontroliuoja tarpinius veiksnius, kurie slopina uždegimą. Šių veiksnių sutrikimas, pavyzdžiui, IL-6 hipersekrecija, gali tapti lėtinio uždegimo pradžia. Skatindamas vienbranduolinių ląstelių kaupimąsi, naujų kraujagyslių formavimąsi ir antiapoptotines T ląstelių funkcijas, IL-6 prisideda prie lėtinio uždegimo formavimosi [11].
1 pav. IL-6 geno lokalizacija
(https://ghr.nlm.nih.gov/gene/IL6#location)
9.5 VEGFA sąsajos su regos nervo neuritu
Kraujagyslinis endotelio augimo faktorius A (angl. Vascular endothelial growth factor A, VEGFA) yra nuo seno žinomas kaip veiksnys, būtinas normaliam kraujagyslių augimui, tačiau pastaruoju metu yra
15 atrasta nemažai įrodymų, kad ši molekulė taip pat dalyvauja nervinio audinio funkcionavime. Tyrimais įrodyta, kad VEGFA dalyvauja tokiuose procesuose kaip neurogenezė, neuronų migracija bei aksonų kryptingas augimas.
VEGFA yra dimerinis glikoproteinas, priklausantis „cisteino mazgo“ augimo faktorių šeimai [12]. VEGFA genas yra sudarytas iš 8 egzonų, atskirtas 7 intronų ir lokalizuojasi 6 žmogaus chromosomoje trumpajame petyje (6p21.1) (2pav.)[13]. VEGFA yra vienas pagrindinių kraujagyslių formavimąsi skatinančių veiksnių besivystančiame organizme, tačiau jis svarbus ir suaugusiam organizmui – ypač vykstant organų remodeliacijai bei tam tikrų, su kraujagyslėmis susijusių patologijų atveju. Įrodyta, kad VEGFA dalyvauja vykstant žaizdų gijimui, auglių angiogenezėje, diabetinės retinopatijos bei amžinės geltonosios dėmės degeneracijos vystymesi [14]. Būklėms, susijusioms su demielinizacija (pvz, IS, RNN) yra būdingas VEGFA signalinis kelias. IS atveju, VEGFA išskiria aktyvuoti astrocitai – manoma, kad tokiomis sąlygomis VEGFA veikia endotelio ląsteles, kurios sudaro kraujo – smegenų barjerą (KSB). Dėl tokio VEGFA poveikio suyra glaudžiosios jungtys tarp endotelio ląstelių ir yra pažeidžiamas KSB, todėl į CNS patenka periferinės imuninės ląstelės ir sukelia stiprų uždegimą [13].
VEGFA geno polimorfizmai reguliuoja VEGF išskyrimą ir jo angiogenezės ypatumus [15].
2 pav. VEGFA geno lokalizacija
(https://ghr.nlm.nih.gov/gene/VEGFA#location)
9.6 TIMP – 3 sąsajos su regos nervo neuritu
Audinių metaloproteinazių inhibitorius-3 (angl. Tissue inhibitor of metalloproteinase – 3, TIMP-3) priklauso audinių metaloproteinazių inhibitorių (TIMP) šeimai [16]. TIMP-3 lokalizuotas 22q12.3 chromosomoje (3pav.) ir yra endogeninis matrikso metaloproteinazės (MMP) inhibitorius [17].
Uždegimo metu yra svarbi pusiausvyra tarp MMP ir TIMP. Atlikti tyrimai rodo, kad kai kurios MMP užima svarbią vietą uždegiminių citokinų atpalaidavime. Specifinė MMP ADAM-17 (angl. A
16 disintegrin and proteinase) yra atsakinga už naviko nekrozės faktoriaus (TNF) šeimos citokinų atpalaidavimą iš transmembraninių pirmtakų [18]. TNF šeimos citokinams būdingos uždegimą bei apoptozę skatinančios savybės, o ADAM-17 padidina jų sisteminį bioprieinamumą. TIMP-3 inhibuoja ADAM-17 ir slopina uždegiminį atsaką sumažindamas TNF kiekį organizme. Įrodyta, kad ADAM-17 geno delecija apsaugo peles nuo lipopolisacharidų (LPS) sukelto sepsio, o TIMP-3 geno delecija veikia priešingai – didina pelių jautrumą LPS sukeltam sisteminiam uždegimui [19]. Kitos MMP dalyvauja besivystant būtent neurouždegiminėms ligoms, tokioms kaip RNN [20]. Įrodyta, kad MMP-9 ekspresija padidėja uždegimo metu, o kartu su MMP-2 šios proteazės prisideda prie KSB laidumo atsiradimo [21]. Lietuvoje atlikti tyrimai rodo, kad MMP-2 geno polimorfizmai yra susiję su RNN pasireiškimu pacientams [22]. Kadangi MMP ir ADAM yra svarbūs uždegimo reguliavime, o TIMP-3 yra vienas pagrindinių metaloproteinazių reguliatorių, galima daryti prielaidą, kad TIMP-3 yra susijęs su RNN patofiziologija, o šio geno polimorfizmai gali turėti įtakos RNN pasireiškimui.
3 pav. TIMP-3 geno lokalizacija
(https://ghr.nlm.nih.gov/gene/TIMP3#location)
9.7 Klinika
Tipinis RNN pasireiškia poūmiu vienpusiu regos praradimu ir skausmu, kuris sustiprėja judinant akį. Skausmas paprastai yra silpnas, tačiau pasireiškia daugumai pacientų ir praeina per kelias dienas. Skausmas gali pasireikšti prieš arba kartu su regos netekimu. Regos praradimas dažniausiai išsivysto per kelias valandas ar dienas. Dauguma pacientų skundžiasi neryškiu matymu ar matymu lyg pro rūką. Sunkiausia būklė išsivysto antrąją savaitę. Spalvų juslė sutrinka anksti, yra nepastovi ir linkusi kisti. Ūmioje fazėje sutrinka mėlynos ir geltonos spalvų juslė, o poūmėje – raudonos ir žalios spalvų juslė. Taip pat gali pasireikšti fotopsijos, kurių metu pacientai gali skųstis trumpalaikiais šviesos blyksniais, atsirandančiais judinant akį. Kartais regos atsistatymo metu gali būti trumpalaikis regos pablogėjimas, kuris atsiranda
17 pakilus kūno temperatūrai, pavyzdžiui, esant karštoms oro sąlygoms, po mankštos ar karšto dušo – tai yra Uhthoffo fenomenas. Kitas būdingas fenomenas yra Pulfricho, kuris pasireiškia atstumų vertinimo sutrikimu judantiems objektams [5]. Ūmioje fazėje būdingi akipločio defektai. Centriniai akipločio pakitimai yra nustatomi dažniau nei periferiniai. Beveik visiems pacientams su abipusiu RNN nustatomas aferentinis vyzdžio defektas [2]. Regos nervo diskas dažniausiai yra normalus, tačiau trečdaliui pacientų jis gali būti paburkęs. Kraujosruvos ir eksudatai tipinio RNN atveju pasireiškia retai. 79% pacientų su tipiniu RNN būklė gerėti pradeda per 3 savaites, o 93% - per 5 savaites [23].
Daugelis atipinio RNN pradinių simptomų yra tokie pat, kaip ir tipinio RNN atveju, tik pradžia gali būti neskausminga arba skausmas būna labai stiprus. Regos nervo diskas yra stipriai paburkęs, būdingos kraujosruvos ir eksudatai. Regėjimo aštrumo mažėjimas progresuoja 3 savaites [2].
9.8 Diagnostika
RNN diagnozė gali būti nustatyta remiantis klinikiniais požymiais ir instrumentiniais tyrimais. Paciento ligos istorija ir neurooftalmologinis ištyrimas gali būti panaudoti siekiant išsiaiškinti kitas vienpusio regos praradimo priežastis. Kada diagnozuojamas RNN, turi būti nustatyta ar tai yra tipinė, ar atipinė forma [5].
Tipinis RNN gali būti diagnozuojamas remiantis klinikiniais požymiais, o diagnostiniai tyrimai dažniausiai nėra reikalingi (1 lentelė) [24].
1 lentelė. Tipinio ir atipinio RNN klinikiniai simptomai
Simptomas Tipinis RNN Atipinis RNN
Amžius Jaunas pacientas <50 m. Pacientui >50 ar <12 m. Regėjimo netekimo
laikas
Ūmus ar poūmis regėjimo netekimas
Staigus regėjimo netekimas
Regėjimo netekimo progresavimas
Regėjimo netekimas progresavo kelias dienas ar savaites
Regėjimo netekimas progresavo >2 savaites
Pažeidimas Dažniausiai vienpusis Vienpusis/abipusis
Matymas Sutrinka 90 % atvejų
18 Spalvų juslė Ūmiame periode sutrinka mėlynos ir geltonos spalvų juslė, poūmiame –
raudonos ir žalios Vizualinės stimuliacijos išprovokuoti veikimo potencialai Sumažėjęs latentiškumas Optinė koherentinė tomografija
Regos nervo disko edema (dažniau viršutiniame ir nazaliniame kvadrantuose) nustatoma 20 % pacientų
Skausmas Ūmus skausmingas regos
praradimas. Skausmas sustiprėja judinant akį
Skausmo nebuvimas arba nepakeliamas skausmas
Regos nervo diskas Dažniausiai nepakitęs Eksudatai ir/ar kraujosruvos
Stiklakūnis Nepakitęs Vitriitas
Akiduobė Nepakitusi Akiduobės uždegimas/infiltraciniai
pokyčiai Anamnezė Anamnezėje anksčiau buvęs RNN
ar IS
Anamnezėje anksčiau buvusi neoplazija
Neurologiniai simptomai
Simptomai, leidžiantys įtarti IS Simptomai, leidžiantys įtarti kitas ligas nei IS (NMO, jungiamojo audinio ligos, sarkoidozė, vaskulitai)
Gydymo poveikis gliukokortikoidais
Sutrumpina ligos trukmę Nėra įtakos
Pagerėjimas Spontaniškas pagerėjimas po 2-3 savaičių
Praėjus daugiau nei 3 savaitėms, pagerėjimo nėra
Prognozė Dažniausiai gera Kintama
Atsinaujinimas (per 5-10 metų)
28 % 38 %
Siūloma atlikti galvos smegenų magnetinio rezonanso tyrimą (MRT) tam, kad numatytume IS išsivystymo riziką ateityje [2]. Neurologinė IS diagnozė yra nustatoma pagal McDonaldo kriterijus (2 lentelė) [22].
19 2 lentelė. MRT McDonaldo išplitimo erdvėje kriterijai IS diagnostikoje:
≥1 židinys T2 režimu, randami ≥2 iš 4 CNS sričių:
Periventrikuliariai Jukstakortikaliai Infratentorialiai Nugaros smegenyse
Regos nervo MRT su kontrastu, nors ir nėra būtinas diagnozei patvirtinti, 95% pacientų rodo būdingus pakitimus.
Atipinio RNN atveju patariama atlikti akiduobių ar regos nervo MRT su kontrastu ir juosmeninę punkciją. Likvoro skysčio tyrimas yra atliekamas siekiant aptikti ląsteles, padidėjusį baltymų kiekį ir oligokloninius antikūnus. Kraujo ir kiti tyrimai rekomenduojami atlikti, jeigu įtariamas infekcinės ar uždegiminės kilmės atipinis RNN [5].
9.9 Gydymas
Tipinio RNN atveju tikimasi greito, reikšmingo regėjimo aštrumo atsistatymo per kelias savaites ar mėnesius nuo pradinių simptomų atsiradimo. Atipinio RNN atveju regėjimo aštrumo atsistatymo prognozė yra nepalanki [25].
Pacientams su tipiniu RNN dažnai jokio gydymo nereikia. Galimas gydymas yra gliukokortikoidais. Dažniausiai yra skiriamas intraveninis metilprednizolonas pulsterapija (1g į/v 3-5 dienas), vėliau gydymą pratęsiant geriamuoju prednizolonu 1 mg/kg/d 11 dienų, dozę palaipsniui mažinant per 4 dienas (20 mg vieną dieną, 10 mg antrą, trečią ir ketvirtą dieną). Pasirinkus gydymą geriamuoju metilprednizolonu, yra skiriama 500 mg per/os 5 dienas. Tyrimai rodo, kad gydymas intraveniniu metilprednizolonu lėmė greitesnį regos atsistatymą, bet galutinis regėjimo aštrumas nebuvo geresnis nei skiriant geriamąjį metilprednizoloną [26].
Atipinio RNN atveju reikia paskirti tikslingą gydymą, siekiant išvengti regėjimo praradimo. Jei tai yra uždegiminis atipinis RNN, skiriamas 1 g metilprednizolono į/v. Infekcinio atipinio RNN atveju skiriamas antibakterinis gydymas [2]. Jei nėra atsako į gydymą gliukokortikoidais, galima taikyti
20 plazmaferezę arba intraveninę imunoglobulinų terapiją. RNN susijęs su sisteminėmis ligomis, tokiomis kaip IS, gali būti gydomas ligą modifikuojančiais vaistais [27].
9.10 Regos nervo neurito ir išsėtinės sklerozės sąsajos
Išsėtinė sklerozė – tai lėtinė uždegiminė CNS liga, kuriai yra būdingos daugiažidininės demielinizuotos baltosios medžiagos sritys bei aksonų netekimas. IS priežastis nėra žinoma. Manoma, kad ją gali sukelti virusinės infekcijos arba autoimuniniai procesai. Nėra specifinių ligos žymenų, o diagnostika yra paremta klinikiniais ir instrumentiniais tyrimais [28].
Ūmus izoliuotas neurologinis sindromas kelia didelę diagnostikos problemą, kadangi jis pasireiškia ne tik IS atveju, bet gali būti ir kitų ligų pirminė išraiška arba vienintelis požymis (pvz.: sisteminės raudonosios vilkligės, Sjogreno sindromo, antifosfolipidinio sindromo ar Adamantiades – Behcet ligos). Šias ligas diferencijuoti tarpusavyje yra sudėtinga, nes klinikinės išraiškos ir pažeidimai, matomi MRT, yra panašūs [28].
Taip pat RNN gali būti kaip dalis IS klinikinių išraiškų [28]. Yra nustatyta, kad 20% pacientų sergančių IS, ji pirmiausia pasireiškia, kaip RNN ir 50% pacientų sergančių IS gyvenimo eigoje pasireiškia RNN [4]. Pacientai sergantys ūmiu RNN, kuriems atliktame galvos smegenų MRT nerandama jokių IS pažeidimo požymių, IS išsivystymo rizika per 5 metus yra maža (16%), bet didėja per 15 metų (25%). Tačiau, jeigu atliktame galvos smegenų MRT randami IS būdingi požymiai, jos išsivystymo rizika per 5 metus išauga iki 42%, o per 15 metų iki 72% [23]. Pacientams sergantiems RNN išsivystymo IS rizika yra dar didesnė, jeigu RNN remisijos metu regėjimo aštrumas neatsistato daugiau nei 0,5 arba likvoro skystyje yra randami oligokloniniai antikūnai [3].
9.11 Tirtų genų sąsajos su RNN
3 lentelė. Tirtų genų sąsajos su RNN Imunogenetiniai
veiksniai
Poveikis Patogenezinis mechanizmas Literatūros šaltinis
21
IL-13 Perteklius Sukelia lėtinį uždegimą,
autoimunines ligas skatindami B limfocitų proliferaciją bei antikūnų gamybą.
29
IL-23 Perteklius
AQP-4 Perteklius
TGF-β Trūkumas
MMP-2 (-1306C/T) Trūkumas Reguliuoja T limfocitų ir uždegiminių mediatorių patekimą į CNS, o KSB sutrikimas prisideda prie demielinizacijos, autoimuninių bei uždegiminių ligų.
30
CETP Mutacija Reguliuoja didelio tankio
lipoproteinų (DATL) perversmą į mažo tankio lipoproteinus. DATL plokštelių atsidėjimas centrinėje tinklainės arterijoje ir venoje skatina RNN išsivystymą. Geno mutacija skatina šio geno veiklą ir daromą poveikį.
31
STAT 4 Mutacija Siejamas su padidėjusia
autoimuninių ligų rizika, kadangi skatina T ląstelių proliferaciją.
32
IL-17A Perteklius Dalyvauja imuninių ir
uždegiminių ligų patogenezėje, skatina su uždegimu susijusių genų išskyrimą.
22
10.
TYRIMO METODIKA IR METODAI
10.1 Tyrimo organizavimas
Tyrimas atiktas LSMU Neuromokslų Instituto Oftalmologijos laboratorijoje. Pradžioje duomenų bazėse ieškota informacijos apie regos nervo neuritą, jo epidemiologiją, etiologiją, patogenezę, imunogenetinių veiksnių įtaką šios ligos pasireiškime. Apžvelgta informacija apie IL-6, VEGFA ir TIMP-3, analizuoti atlikti tyrimai, kuriuose buvo nagrinėjama šių genų įtaka uždegiminiams bei demielinizuojantiems procesams. Vėliau įvertintos laboratorijos techninės galimybės ir užsakyti reikiami reagentai.
10.2 Tyrimo objektas
Tyrimo metu ištirti VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795 genų polimorfizmai, sergantiems regos nervo neuritu su ir be išsėtinės sklerozės bei kontrolinei grupėms.
10.3 Tiriamųjų atranka
Buvo gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas (Nr. BE-2-102). Visi tyrime dalyvavę pacientai pasirašė informuoto asmens sutikimo formą. Tyrimo metu buvo suformuotos 2 tiriamųjų grupės: pacientai, sergantys RNN (n=78), ir sveiki asmenys, priskirti kontrolinei grupei (n=181). Tolimesnei analizei pacientai, sergantys RNN, buvo suskirstyti į 2 grupes: pacientai, sergantys IS (n=28) ir be IS (n=47). 3 tiriamieji iš 78 asmenų, sergančių RNN, neturėjo patvirtintų IS duomenų. Į šį tyrimą buvo įtraukti visi pacientai, sergantys RNN, kurie lankėsi LSMUL KK Oftalmologijos klinikoje 2012.01- 2019.08.01.
23 Pacientai, sergantys RNN, į tyrimą buvo įtraukti, jeigu atitiko šiuos kriterijus: ūmus RNN epizodas (su ar be IS), atliktas išsamus oftalmologinis, neurologinis ištyrimas ir MRT. Tiriamųjų, sergančių RNN, oftalmologinis ištyrimas aprašytas literatūros apžvalgos diagnostikos skirsnyje 1 lentelėje. Išsėtinės sklerozės diagnozė patvirtinta neurologo konsultacija, remiantis McDonald kriterijais (literatūros apžvalgos diagnostikos skirsnio 2 lentelė) bei MRT atlikimu.
Į tyrimą pacientai įtraukti nebuvo, jeigu turėjo kitų regos nervo, sisteminių ligų (cukrinis diabetas, onkologinės ligos, lėtinės infekcinės ligos, būklės po organų ar audinių persodinimo) ar nebuvo atliktas MRT.
Kontrolinė grupė buvo surinkta iš sveikų asmenų, kurie atvyko į LSMUL KK Akių ligų kliniką, profilaktiniam oftalmologiniam ištyrimui, atsižvelgiant į sergančiųjų RNN grupės amžių ir lytį. Į tyrimą asmenys buvo įtraukti, jeigu atitiko šiuos kriterijus: nesirgo jokiomis oftalmologinėmis, sisteminėmis infekcinėmis ar neinfekcinėmis lėtinėmis ligomis.
10.4 Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas
Deoksiribonukleininė rūgštis (DNR) buvo išskirta iš veninio kraujo, kuris buvo surinktas į vakuuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatu), kad nesusidarytų mikrokrešuliai ir DNR būtų apsaugota nuo degradacijos. Genominė DNR išskirta iš leukocitų, naudojant dviejų tipų rinkinius: „Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit“ ir „Thermo Scientific MagJET Genomic DNA Kit“.
10.5 DNR išskyrimas naudojant silikagelio kolonėles
Panaudojant rinkinį „Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit“ DNR išskirta silikagelio kolonėlių metodu. Šiuo rinkiniu išskiriama aukštos kokybės DNR, kuri naudojama tolimesniems tikro laiko – polimerazės grandininės reakcijos (PGR) tyrimams. Rinkinio sudėtis:
24 1. Silikagelio kolonėlės
2. Skaidymo tirpalas (Digestion solution) 3. Proteinazės K tirpalas
4. Lizavimo tirpalas (Lysis solution) 5. RNazės A tirpalas
6. Eliucijos buferis (Elution buffer) 7. Plovimo buferis I (Wash buffer I) 8. Plovimo buferis II (Wash buffer II)
10.6 DNR išskyrimo etapai
DNR išskyrimo etapai yra:
1. Leukocitai buvo lizuojami steriliuose 2ml tūrio mėgintuvėliuose. Į 200 µl veninio kraujo įpilama 400 µl lizavimo tirpalo ir 20 µl proteinazės K tirpalo. Mišinys išmaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56℃ temperatūroje, sumaišant kas 2 min.
2. Į mišinį įpilama 200 µl 96 % etanolio tirpalo. Visas mėgintuvėlio turinys perkeliamas į silikagelio kolonėlę, sujungtą su tuščiu (surinkimo) mėgintuvėliu.
3. Silikagelio kolonėlė centrifuguojama 1 min. 6000 x g greičiu. Po centrifugavimo surinkimo mėgintuvėlyje surinktas skystis yra išpilamas, o prie kolonėlės pritvirtinamas naujas surinkimo mėgintuvėlis.
4. Pirmąjam DNR plovimui į kolonėlę buvo įpilama 500 µl plovimo buferio I. Kolonėlė centrifuguojama 1 min 8000 x g greičiu. Nucentrifuguotas skystis iš surinkimo mėgintuvėlio buvo išpilamas ir kolonėlė patalpinama atgal į tą patį surinkimo mėgintuvėlį.
5. Antrasis DNR plovimas vykdomas įpilant 500 µl plovimo buferio II. Kolonėlė centrifuguojama 3 min. 12000 x g greičiu. Nucentrifuguotas skystis išpilamas iš surinkimo mėgintuvėlio ir kolonėlė patalpinama į sterilų 1,5 ml talpos mėgintuvėlį.
6. DNR iš kolonėlės surenkama įpylus 200 µl eliucijos buferio. Mišinys inkubuojamas 2 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojamas 1 min. 8000 x g greičiu.
25 7. Surinkta išgryninta DNR laikoma -20℃ temperatūroje iki tyrimo.
10.7 DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru
Panaudojant spektrofotometrą „Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis” išmatuota išskirtos DNR koncentracija prieš atliekant tikro laiko - PGR. DNR, RNR, mononukleotidų ir oligonukleotidų kiekis nustatomas naudojant vandeninius tirpalus, kada yra matuojama tirpalo adsorbcija (optinis tankis) ultravioletinių bangų ilgyje. Naudojant 260 nm UV šviesos bangos ilgio spindulius yra nustatomos nukleorūgštys. Baltyminės tirpalo priemaišos nustatomos, išmatavus optinių tankių santykį, kada šviesos bangos ilgiai yra 260 ir 280 nm UV. Grynos DNR santykis turi būti apie 1,8.
10.8 Nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu
Genų polimorfizmų tyrimai atlikti tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu.
10.9 PGR etapai
Pirmo etapo metu vyksta iniciacija – Taq polimerazės aktyvacija. Reakcija vyksta 95 ℃ temperatūroje 10 min. Vėliau vykstantys cikliškai pasikartojantys etapai:
1. DNR denatūracija vyksta 92 ℃ temperatūroje 15 s. Denatūracijos metu yra suardomi vandeniliniai ryšiai tarp dviejų DNR grandinių azotinių bazių, todėl grandys atsiskiria viena nuo kitos.
26 2. Pradmenų hibridizacija ir elongacija vyksta 60 ℃ temperatūroje 1 min. Šio etapo metu pradmenys prisijungia prie dauginamų DNR sričių komplementarumo principu. Fermentas Taq polimerazė toliau katalizuoja DNR sintezę. Naujai sintezuota DNR yra komplementari matricinei grandinei. DNR kiekis didėja eksponentiškai, kai yra kartojama denatūracija, hibridizacija ir elongacija.
10.10 PGR principas
Genotipavimas atliktas tikro laiko PGR gausintuvu „Rotor – Gene O“. Naudoti pradmenys ir molekuliniai žibukai, kurie sukurti kompanijos „Applied Biosystems“. Kiekvienai reakcijai naudoti 1 µl genominės DNR ir 9 µl PGR reakcijos mišinio (4 lentelė). PGR vykdyta pagal 5 lentelėje nurodytas sąlygas.
4 lentelė. Realaus laiko PGR mišinio paruošimas
Reagentai 1 pvz., µl 96 pvz., µl
TaqMan Universal Master Mix II (“Applied Biosystems”, Lietuva)
5 µl 480 µl
Sterilus ddH₂O (“Thermo Fisher Scientific”, Lietuva)
3,5 µl 336 µl “Applied Biosystems” genotipavimo rinkinys (VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795) 0,5 µl 48 µl Viso (PGR mišinio) 9 µl 864 µl DNR 1 µl Viso 10 µl
5 lentelė. Optimalios genotipavimo reakcijos sąlygos nustatant VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795 genotipus tikro laiko PGR gausintuvu „Rotor – Gene Q“
27 Genotipavimo
rinkinys
PGR sąlygų protokolai Produkto dydis
VEGFA rs1413711 „Applied Biosystem“ patentas 95 ℃ 10 min 45 ciklų: 92 ℃ 15 s 60 ℃ 90 s Nenurodyta TIMP-3 rs9621532 „Applied Biosystem“ patentas 95 ℃ 10 min 45 ciklų: 92 ℃ 15 s 60 ℃ 90 s Nenurodyta IL-6 rs1800795 „Applied Biosystem“ patentas 95 ℃ 10 min 45 ciklų: 92 ℃ 15 s 60 ℃ 90 s Nenurodyta Atlikimo metodas:
1. 96 mėginiams paruošiamas PGR mišinys.
2. Mišinys išpilstomas po 9 µl į 0,1 ml tūrio mėgintuvėlius.
3. Į 95 mėgintuvėlius įpilama po 1 µl DNR, o į paskutinį šulinėlį įpilamas sterilus vanduo, kaip neigiama kontrolė.
4. 96 mėgintuvėliai sudedami į specialų diską, ant kurio uždedamas apsauginis žiedas. 5. Genotipavimui pasirenkama “Alelių nustatymo” programa.
6. Po 2,5 val. programa baigia darbą. Pagal skirtingų detektorių fluorescencijos intensyvumo santykį, programa nustato tyrimo dalyvių genotipus. Gauti rezultatai yra naudojami statistiniams
skaičiavimams.
10.11 Statistinė analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterinę programą “IBM SPSS Statistics 24.0”. Duomenys pateikti kaip realieji skaičiai (procentai), vidutiniai dydžiai ir standartiniai nuokrypiai (SN). Polimorfizmų genotipų pasiskirstymai įvertinti remiantis Hardžio - Veinbergo dėsniu. Tarpusavio priklausomybės tarp kategorinių kintamųjų įvertinimui taikytas Chi kvadrato ir Fischer vienpusio ir
28 dvipusio kriterijų skaičiavimas. Atlikus dvinarę logistinę regresinę analizę, įvertintas galimybių santykis (GS) regos nervo neuritui pasireikšti, nurodant GS su 95 proc. patikimumo intervalu (PI). Taip pat įvertintas Akaike informacinis kriterijus (angl. AIC), kurio mažiausia vertė nurodo tinkamiausią modelį. Skirtumai vertinti kaip statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
10.12 Baltymų – baltymų sąveika
Siekiant įvertinti baltymų – baltymų sąveiką (angl. protein – protein interaction, PPI) tarp trijų pasirinktų genų naudojome STRING 11.0 programą.
Baltymų sąveikos yra suskirstytos į 3 pagrindines grupes:
1. Žinomos sąveikos (eksperimentiniai duomenys (violetinė spalva), pagal duomenų bazes (mėlyna spalva).
2. Numatomos sąveikos (esančios greta (žalia spalva), genų susiliejimų (raudona spalva), pasireiškiančios kartu (tamsiai mėlyna spalva).
3. Kitos sąveikos (tarpusavio sintezės (juoda spalva), tyrinėjamos (gelsvai žalsva spalva), homologinės (žydra spalva).
Baltymų sąveikos yra nustatytos ir patvirtintos genomo kontekste, didelio mąsto tyrimuose, tarpusavio baltymų sintezėje bei straipsniuose Pubmed duomenų bazėje. IL-6, VEGFA ir TIMP-3 baltymų PPI sąveika pateikta 4 paveikslėlyje. Esant bendram balui ≥0,4 PPI sąveika yra reikšminga.
29 Tik tyrinėjami baltymai buvo įtraukti į šią schemą. Sąveikų grupės sudarytos iš tarpusavio baltymų sintezės (juoda spalva) ir tyrinėjamų sąveikų (gelsvai žalsva spalva). PPI sąveikos gauta p reikšmė yra 0,0472.
30
11.
REZULTATAI
259 tiriamieji buvo suskirstyti į 2 grupes. Pirmą grupę sudarė 78 RNN sergantys asmenys: iš jų 52 moterys (66,7 proc.) ir 26 vyrai (33,3 proc.), tiriamųjų amžiaus vidurkis – 34,13 metai. Kontrolinę grupę sudarė 181 asmuo, iš kurių 118 moterų (65,2 proc.) ir 63 vyrai (34,8 proc.), amžiaus vidurkis siekė 34,49 metus. Grupės pagal lytį bei amžių statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Tiriamųjų charakteristika pateikta 6 lentelėje.
6 lentelė. Tiriamųjų charakteristika
Charakteristika Tiriamieji, sergantys RNN n=78 Kontrolinė grupė, n=181 P reikšmė Vyrai, n (proc.) 26 (33,3) 63 (34,8) 0,819 Moterys, n (proc.) 52 (66,7) 118 (65,2) Amžius (vidurkis ± SN) 34,13±9,86 34,49±10,49 0,793
RNN – regos nervo neuritas; p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05).
11.1 VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795 genotipų dažnis pacientų, sergančių
regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje
Buvo įvertinti VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795 genotipų dažniai pacientų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje (7 lentelė). Genotipų pasiskirstymas kontrolinėje grupėje atitiko Hardžio-Veinbergo dėsnį (p>0,001).
VEGFA rs1413711 genotipų (T/T, T/C, C/C) pasiskirstymai lyginant sergančiuosius RNN su kontroline grupe skyrėsi statistiškai reikšmingai: 16,7%. 55,1%, 28,2%, vs. 35,9%, 43,6%, 20,4%, atitinkamai p=0,008. Taip pat, nustatėme, kad kiekvienas C alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančių RNN nei kontrolinėje grupėje (55,8 % vs. 42,3 %, atitinkamai p=0,005).
IL-6 rs1800795 genotipų (G/G, C/G, C/C) pasiskirstymai lyginant sergančiuosius RNN su kontroline grupe taip pat skyrėsi statistiškai reikšmingai: 23,1%, 32,1%, 44,9% VS. 22,1%, 57,5%, 20,4%,
31 atitinkamai p<0,001. C alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančiųjų RNN grupėje nei kontrolinėje (60,9 % vs. 49,2 %, atitinkamai p=0,014).
7 lentelė. VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje
Genas Genotipas/ Alelis Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė N (proc.) n=181 P reikšmė pagal HW pusiausvyrą RNN grupė N (proc.) n=78 P reikšmė VEGFA rs1413711 Genotipas T/T T/C C/C Iš viso Alelis T C 65 (35,9) 79 (43,6) 37 (20,4) 181 (100) 209 (57,7) 153 (42,3) 0,155 13 (16,7) 43 (55,1) 22 (28,2) 78 (100) 69 (44,2) 87 (55,8) 0,008 0,005 TIMP-3 rs9621532 Genotipas A/A A/C C/C Iš viso Alelis A C 153 (84,5) 27 (14,9) 1 (0,6) 181 (100) 333 (92,0) 29 (8,0) 0,871 64 (82,0) 12 (15,4) 2 (2,6) 78 (100) 140 (89,7) 16 (10,3) 0,377 0,405 IL-6 rs1800795 Genotipas G/G C/G C/C Iš viso Alelis G 40 (22,1) 104 (57,5) 37 (20,4) 181 (100) 184 (50,8) 0,044 18 (23,1) 25 (32,1) 35 (44,9) 78 (100) 61 (39,1) <0,001
32
RNN- regos nervo neuritas; p vertė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05); p reikšmė
pagal HW pusiausvyrą – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,001).
Atlikome dvinarę logistinę regresinę analizę, tiriamųjų sergančių RNN ir kontrolinėje grupėse. Rezultatai pateikti 8 lentelėje.
Analizė parodė, kad VEGFA rs1413711 T/C ir C/C genotipai, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 2,8 karto (GS=2,8; 95 proc. PI: 1,44-5,47, p=0,003). T/C genotipas, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 2,7 karto (GS=2,72; 95 proc. PI:1,35-5,49, p=0,005), C/C genotipas, lyginant su T/T genotipu – 3 kartais (GS=2,97; 95 proc. PI: 1,34-6,59, p=0,007). Taip pat, kiekvienas C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=1,69; 95 proc. PI:1,16-2,46, p=0,006).
IL-6 rs1800795 C/C genotipas, lyginant su G/G ir C/G genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 3,2 karto (GS=3,17; 95 proc. PI:1,78-5,63, p<0,001). C/C genotipas, lyginant su G/G genotipu, galimybę susirgti RNN didina 2,1 karto (GS=2,1; 95 proc. PI:1,02-4,33, p=0,04). Taip pat, kiekvienas C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=1,62; 95 proc. PI: 1,1-2,39, p=0,015).
8 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 polimorfizmų dvinarės logistinės regresijos analizė
Genas Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) P reikšmė AIC
VEGFA rs1413711 Kodominantinis T/T T/C C/C 1 2,72 (1,35-5,49) 2,97 (1,34-6,59) 0,005 0,007 310,6 Dominantinis T/C+C/C vs. T/T 2,8 (1,44-5,47) 0,003 308,6 Recesyvinis C/C vs. T/T+T/C 1,53 (0,83-2,82) 0,17 317,1 Overdominantinis T/C vs. T/T+C/C 1,59 (0,93-2,71) 0,09 316,1 Adityvinis C 1,69 (1,16-2,46) 0,006 311,3 Kodominantinis A/A A/C 1 1,06 (0,51-2,23) 0,87 319,2 C 178 (49,2) 95 (60,9) 0,014
33 TIMP-3 rs9621532 C/C 4,78 (0,43-53,67) 0,21 Dominantinis A/C+C/C vs. A/A 1,19 (0,59-2,42) 0,62 318,7 Recesyvinis C/C vs. A/A+A/C 4,74 (0,42-53,02) 0,21 317,2 Overdominantinis A/C vs. A/A+C/C 1,04 (0,49-2,17) 0,92 318,9 Adityvinis C 1,29 (0,69-2,42) 0,42 318,3 IL-6 rs1800795 Kodominantinis G/G C/G C/C 1 0,53 (0,26-1,08) 2,1 (1,02-4,33) 0,08 0,04 302,5 Dominantinis C/G+C/C vs. G/G 0,95 (0,5-1,78) 0,86 318,9 Recesyvinis C/C vs. G/G+C/G 3,17 (1,78-5,63) <0,001 303,4 Overdominantinis C/G vs. G/G+C/C 0,51 (0,19-1,32) 0,17 304,6 Adityvinis C 1,62 (1,1-2,39) 0,015 312,8
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05); GS – galimybių santykis; AIC – Akaike
11. 2 IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį bei amžių
Antrasis tyrimo uždavinys buvo įvertinti IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų sąsajas pacientams, sergantiems regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį bei amžių.
Palyginę genotipų pasiskirstymus vyrų grupėje nustatėme, jog IL-6 rs1800795 genotipų (G/G, C/G, C/C) pasiskirstymai tiriamųjų, sergančių RNN, ir kontrolinėje grupėje, statistiškai reikšmingai skyrėsi: 15,4 %, 34,6 %, 50,0 % vs. 27,0 %, 50,8 %, 22,2 %, atitinkamai (p=0,034). C alelis buvo statistiškai
34 reikšmingai dažnesnis sergančių RNN nei kontrolinėje grupėje (67,3 % vs. 47,6 %, atitinkamai p=0,017) (9 lentelė).
VEGFA rs1413711 genotipų (T/T, T/C, C/C) pasiskirstymai lyginant moteris, sergančias RNN ir sveikas moteris, statistiškai reikšmingai skyrėsi: 15,45%, 53,8%, 30,8% vs. 33,9%, 46,6%, 19,5%, atitinkamai p=0,034. Taip pat, C alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis RNN sergančioms moterims nei sveikoms: 57,7 % vs. 42,8 %, atitinkamai (p=0,011). IL-6 rs1800795 genotipų (G/G, C/G, C/C) pasiskirstymai lyginant sergančiąsias RNN su kontroline grupe, taip pat statistiškai reikšmingai skyrėsi: 26,9 %, 30,8 %, 42,3 % vs. 19,5 %, 61,0 %, 19,5 %, atitinkamai (p=0,001) (9 lentelė).
9 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų dažnis pacientams, sergantiems regos nervo neuritu ir kontrolinės grupės, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
VEGFA rs1413711 Genotipas Vyrai P reikšmė Moterys P reikšmė RNN grupė n (proc.) (n=26) Kontrolinė grupė n (proc.) n=63 RNN grupė n (proc.) (n=52) Kontrolinė grupė n (proc.) n=118 T/T 5 (19,2) 25 (39,7) 0,142 8 (15,4) 40 (33,9) 0,034 T/C 15 (57,7) 24 (38,1) 28 (53,8) 55 (46,6) C/C 6 (23,1) 14 (22,2) 16 (30,8) 23 (19,5) Alelis T C 25 (48,1) 27 (51,9) 74 (58,7) 52 (41,3) 0,193 44 (42,3) 60 (57,7) 135 (57,2) 101 (42,8) 0,011 TIMP-3 rs9621532 A/A 24 (92,4) 52 (82,5) 0,249 40 (76,9) 101 (85,6) 0,166 A/C 1 (3,8) 10 (15,9) 11 (21,2) 17 (14,4) C/C 1 (3,8) 1 (1,6) 1 (1,9) 0 (0) Alelis
35 A C 49 (94,2) 3 (5,8) 114 (90,5) 12 (9,5) 0,412 91 (87,5) 13 (12,5) 219 (92,8) 17 (7,2) 0,113 IL-6 rs1800795 G/G 4 (15,4) 17 (27,0) 0,034 14 (26,9) 23 (19,5) 0,001 C/G 9 (34,6) 32 (50,8) 16 (30,8) 72 (61,0) C/C 13 (50,0) 14 (22,2) 22 (42,3) 23 (19,5) Alelis G C 17 (32,7) 35 (67,3) 66 (52,4) 60 (47,6) 0,017 44 (42,3) 60 (57,7) 118 (50,0) 118 (50,0) 0,191
RNN- regos nervo neuritas; p vertė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05).
Atlikta dvinarė logistinė regresinė analizė moterų, sergančių RNN ir kontrolinėje grupėse. Rezultatai pateikti 10 lentelėje.
Analizė parodė, kad VEGFA rs1413711 T/C genotipas, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 2,6 karto (GS=2,55; 95 proc. PI:1,05-6,17, p=0,04), o C/C genotipas – 3,5 karto (GS=3,48; 95 proc. PI: 1,29-9,38, p=0,01). T/C ir C/C genotipai, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 2,8 karto (GS=2,82; 95 proc. PI:1,21-6,56, p=0,02). Taip pat, kiekvienas C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=1,82; 95 proc. PI:1,13-2,93, p=0,01).
IL-6 rs1800794 C/G genotipas, lyginant su G/G genotipu, yra susijęs su mažesne RNN išsivystymo galimybe (GS=0,37; 95 proc. PI: 0,16-0,86, p=0,02). C/C genotipas, lyginant su G/G ir C/G genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 3 kartais (GS=3,03; 95 proc. PI: 1,48-6,19, p=0,002). Taip pat, C/G genotipas, lyginant su G/G ir C/C genotipais kartu, galimybę susirgti RNN mažina 3,6 karto (GS=0,28; 95 proc. PI: 0,14-0,57, p<0,001).
10 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų dažnis moterų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje
36
Genas Modelis Genotipas GS (95 proc.
PI) P reikšmė AIC VEGFA rs1413711 Kodominantinis T/T T/C C/C 1 2,55 (1,05-6,17) 3,48 (1,29-9,38) 0,04 0,01 206,2 Dominantinis T/C+C/C vs. T/T 2,82 (1,21-6,56) 0,02 204,8 Recesyvinis C/C vs. T/T+T/C 1,84 (0,87-3,87) 0,11 208,9 Overdominantini s T/C vs. T/T+C/C 1,34 (0,69-2,57) 0,39 210,6 Adityvinis C 1,82 (1,13-2,93) 0,01 205 TIMP-3 rs9621532 Kodominantinis A/A A/C C/C 1 1,63 (0,7-3,79) 0 0,25 1 209,7 Dominantinis A/C+C/C vs. A/A 1,78 (0,78-4,07) 0,17 209,5 Recesyvinis C/C vs. A/A+A/C 0 1 208,9 Overdominantini s A/C vs. A/A+C/C 1,59 (0,69-3,69) 0,28 210,2 Adityvinis C 1,88 (0,86-4,1) 0,11 208,9 IL-6 rs1800795 Kodominantinis G/G C/G C/C 1 0,37 (0,16-0,86) 1,57 (0,65-3,81) 0,02 0,32 198,9 Dominantinis C/G+C/C vs. G/G 0,66 (0,31-1,41) 0,28 210,2 Recesyvinis C/C vs. G/G+C/G 3,03 (1,48-6,19) 0,002 202,1 Overdominantini s C/G vs. G/G+C/C 0,28 (0,14-0,57) <0,001 197,2 Adityvinis C 1,38 (0,86-2,23) 0,18 209,6
37
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05); GS – galimybių santykis; AIC – Akaike
Atlikta dvinarė logistinė regresinė analizė vyrų, sergančių RNN ir kontrolinėje grupėse. Rezultatai pateikti 11 lentelėje.
Analizė parodė, kad IL-6 rs1800795 C/C genotipas, lyginant su G/G genotipu, galimybę susirgti RNN didina 4 kartais (GS=3,95; 95 proc. PI: 1,05-14,85, p=0,04). C/C genotipas, lyginant su G/G ir C/G genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 3,5 karto (GS=3,5; 95 proc. PI: 1,33-9,25, p=0,01). Taip pat kiekvienas C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=2,19; 95 proc. PI: 1,11-4,33, p=0,02).
11 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų dažnis vyrų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje
Genas Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) P reikšmė AIC
VEGFA rs1413711 Kodominantinis T/T T/C C/C 1 3,13 (0,98-9,94) 2,14 (0,55-8,31) 0,054 0,27 107,4 Dominantinis T/C+C/C vs. T/T 2,8 (0,92-8,29) 0,07 105,9 Recesyvinis C/C vs. T/T+T/C 1,05 (0,35-3,12) 0,93 109,5 Overdominantinis T/C vs. T/T+C/C 2,22 (0,88-5,61) 0,09 106,7 Adityvinis C 1,48 (0,79-2,75) 0,22 108 TIMP-3 rs9621532 Kodominantinis A/A A/C C/C 1 0,22 (0,03-1,79) 2,17 (0,13-36,12) 0,16 0,59 108,3 Dominantinis A/C+C/C vs. A/A 0,39 (0,08-1,92) 0,25 107,9 Recesyvinis C/C vs. A/A+A/C 2,48 (0,15-41,2) 0,53 109,1 Overdominantinis A/C vs. A/A+C/C 0,21 (0,03-1,75) 0,15 106,6
38 Adityvinis C 0,63 (0,19-2,14) 0,46 108,9 IL-6 rs1800795 Kodominantinis G/G C/G C/C 1 1,19 (0,32-4,46) 3,95 (1,05-14,85) 0,79 0,04 104,9 Dominantinis C/G+C/C vs. G/G 2 (0,61-6,76) 0,25 108,1 Recesyvinis C/C vs. G/G+C/G 3,5 (1,33-9,25) 0,01 103,1 Overdominantinis C/G vs. G/G+C/C 0,51 (0,19-1,32) 0,17 107,6 Adityvinis C 2,19 (1,11-4,33) 0,02 104
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05); GS – galimybių santykis; AIC – Akaike
Palyginome polimorfizmų genotipų ir alelių dažnius tiriamosiose grupėse, atsižvelgiant į amžių (12 lentelė). Tiriamieji, remiantis mediana buvo suskirstyti į dvi amžiaus grupes: nuo 18 iki 34 m. bei nuo 35 iki 57 m.
Amžiaus grupėje nuo 18 iki 34 m. IL-6 rs1800795 genotipų (G/G, C/G, C/C) pasiskirstymai lyginant sergančiuosius RNN su kontroline grupe skyrėsi statistiškai reikšmingai: 33,3 %, 31,0 %, 35,7 % vs. 21,6 %, 59,8 %, 18,6 %, atitinkamai (p=0,007).
Amžiaus grupėje nuo 35 iki 57 m. IL-6 rs1800795 genotipų (G/G, C/G, C/C) pasiskirstymai lyginant sergančiuosius RNN su kontroline grupe taip pat statistiškai reikšmingai skyrėsi: 11,1 %, 33,3 %, 55,6 % vs. 22,6 %, 54,8 %, 22,6 %, atitinkamai p=0,002. C alelis statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančiųjų RNN grupėje nei kontrolinėje: 72,2 % vs. 50,0 %, atitinkamai (p=0,001).
12 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių
VEGFA rs1413711 Genotipas 18-34 m. P reikšmė 35-57 m. P reikšmė RNN grupė n (proc.) (n=42) Kontrolinė grupė n (proc.) n=97 RNN grupė n (proc.) (n=36) Kontrolinė grupė n (proc.) n=84 T/T 8 (19,0) 37 (38,1) 5 (13,9) 28 (33,3)
39 T/C 23 (54,8) 44 (45,4) 0,07 20 (55,5) 35 (41,7) 0,09 C/C 11 (26,2) 16 (16,5) 11 (30,6) 21 (25,0) Alelis T C 39 (46,4) 45 (53,6) 118 (60,8) 76 (39,2) 0,26 30 (48,4) 32 (51,6) 91 (54,2) 77 (45,8) 0,44 TIMP-3 rs9621532 A/A 35 (83,3) 79 (81,4) 0,75 29 (80,6) 74 (88,1) 0,23 A/C 6 (14,3) 17 (17,6) 6 (16,7) 10 (11,9) C/C 1 (2,4) 1 (1,0) 1 (2,7) 0 (0) Alelis A C 76 (90,5) 8 (9,5) 175 (90,2) 19 (9,8) 0,94 64 (88,9) 8 (11,1) 158 (94,0) 10 (6,0) 0,16 IL-6 rs1800795 G/G 14 (33,3) 21 (21,6) 0,007 4 (11,1) 19 (22,6) 0,002 C/G 13 (31,0) 58 (59,8) 12 (33,3) 46 (54,8) C/C 15 (35,7) 18 (18,6) 20 (55,6) 19 (22,6) Alelis G C 41 (48,8) 43 (51,2) 100 (51,5) 94 (48,5) 0,675 20 (27,8) 52 (72,2) 84 (50,0) 84 (50,0) 0,001
RNN- regos nervo neuritas; p vertė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05).
Atlikome dvinarę logistinę regresinę analizę pagal amžiaus grupes.
18-34 m. amžiaus grupėje VEGFA rs 1413711 C/C genotipas, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 3,2 karto (GS=3,18; 95 proc. PI: 1,08-9,39, p= 0,04). T/C ir C/C genotipai kartu,
40 lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 2,6 karto (GS=2,62; 95 proc. PI: 1,09-6,27, p=0,03). Taip pat kiekvienas C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=1,79; 95 proc. PI: 1,06-3,03, p=0,03). Rezultatai pateikti 13 lentelėje.
IL-6 rs1800795 C/G genotipas, lyginant su G/G genotipu, yra susijęs su mažesne RNN išsivystymo galimybe (GS=0,34; 95 proc. PI: 0,14-0,83, p=0,02). C/C genotipas, lyginant su G/G ir C/G genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 2,4 karto (GS=2,44; 95 proc. PI: 1,08-5,49, p=0,03). C/G genotipas, lyginant su G/G ir C/C genotipais kartu, galimybę susirgti RNN mažina 3,3 karto (GS=0,3; 95 proc. PI: 0,14-0,65, p=0,002). Rezultatai pateikti 13 lentelėje.
13 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų 18 – 34 m. amžiaus grupės dvinarės logistinės regresijos analizė
Genas Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) P reikšmė AIC
VEGFA rs1413711 Kodominantinis T/T T/C C/C 1 2,42 (0,97-6,04) 3,18 (1,08-9,39) 0,06 0,04 168,8 Dominantinis T/C+C/C vs. T/T 2,62 (1,09-6,27) 0,03 167,1 Recesyvinis C/C vs. T/T+T/C 1,79 (0,75-4,29) 0,19 170,6 Overdominantinis T/C vs. T/T+C/C 1,46 (0,71-3,02) 0,31 171,3 Adityvinis C 1,79 (1,06-3,03) 0,03 167,5 TIMP-3 rs9621532 Kodominantinis A/A A/C C/C 1 0,79 (0,29-2,19) 2,26 (0,14-37,13) 0,66 0,57 173,8 Dominantinis A/C+C/C vs. A/A 0,88 (0,34-2,29) 0,79 172,3 Recesyvinis C/C vs. A/A+A/C 2,34 (0,14-38,34) 0,55 171,9 Overdominantinis A/C vs. A/A+C/C 0,78 (0,29-2,15) 0,64 172,1 Adityvinis C 0,97 (0,42-2,26) 0,95 172,3
41 IL-6 rs1800795 Kodominantinis G/G C/G C/C 1 0,34 (0,14-0,83) 1,25 (0,48-3,27) 0,02 0,65 164,2 Dominantinis C/G+C/C vs. G/G 0,56 (0,25-1,23) 0,15 170,3 Recesyvinis C/C vs. G/G+C/G 2,44 (1,08-5,49) 0,03 167,8 Overdominantinis C/G vs. G/G+C/C 0,3 (0,14-0,65) 0,002 162,4 Adityvinis C 1,12 (0,67-1,88) 0,67 172,1
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05); GS – galimybių santykis; AIC – Akaike
35-57 m. amžiaus grupėje VEGFA rs1413711 T/C ir C/C genotipai kartu, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 3,1 karto (GS=3,1; 95 proc. PI: 1,09-8,84, p=0,03). T/C genotipas, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 3,2 karto (GS=3,2; 95 proc. PI: 1,07-9,6, p=0,04). Rezultatai pateikti 14 lentelėje.
IL-6 rs1800795 C/C genotipas, lyginant su G/G genotipu, galimybę susirgti RNN didina 5 kartais (GS=5; 95 proc. PI: 1,44-17,4, p=0,01). C/C genotipas, lyginant su G/G ir C/G genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 4,3 karto (GS=4,28; 95 proc. PI: 1,86-9,83, p=0,001). C/G genotipas, lyginant su G/G ir C/C genotipais kartu, galimybę susirgti RNN mažina 2,4 karto (GS=0,41; 95 proc. PI: 0,18-0,93, p=0,03). Taip pat, C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=2,67; 95 proc. PI: 1,42-5,02, p=0,002). Rezultatai pateikti 14 lentelėje.
14 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų 35-57 m. amžiaus grupės dvinarės logistinės regresijos analizė
Genas Modelis Genotipas GS (95 proc.
PI) P reikšmė AIC VEGFA rs1413711 Kodominantinis T/T T/C C/C 1 3,2 (1,07-9,6) 2,93 (0,88-9,73) 0,04 0,08 145,4 Dominantinis T/C+C/C vs. T/T 3,1 (1,09-8,84) 0,03 143,4
42 Recesyvinis C/C vs. T/T+T/C 1,32 (0,56-3,13) 0,53 148,2 Overdominantinis T/C vs. T/T+C/C 1,75 (0,79-3,85) 0,16 146,7 Adityvinis C 1,6 (0,93-2,76) 0,09 145,7 TIMP-3 rs9621532 Kodominantinis A/A A/C C/C 1 1,53 (0,51-4,59) 0 0,45 1,0 147,6 Dominantinis A/C+C/C vs. A/A 1,79 (0,62-5,14) 0,28 147,5 Recesyvinis C/C vs. A/A+A/C 0 1,0 146,2 Overdominantinis A/C vs. A/A+C/C 1,48 (0,49-4,44) 0,48 148,1 Adityvinis C 1,93 (0,74-5,09) 0,18 146,9 IL-6 rs1800795 Kodominantinis G/G C/G C/C 1 1,24 (0,35-4,33) 5 (1,44-17,4) 0,74 0,01 138,4 Dominantinis C/G+C/C vs. G/G 2,34 (0,73-7,45) 0,15 146,3 Recesyvinis C/C vs. G/G+C/G 4,28 (1,86-9,83) 0,001 136,6 Overdominantinis C/G vs. G/G+C/C 0,41 (0,18-0,93) 0,03 143,9 Adityvinis C 2,67 (1,42-5,02) 0,002 138,1
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05); GS – galimybių santykis; AIC – Akaike
43
11.3 IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu bei regos nervo neuritu ir išsėtine skleroze drauge
Sergančiuosius RNN suskirstėme į 2 grupes: sergančius išsėtine skleroze (IS) ir pacientus, kuriems nebuvo nustatyta IS.
VEGFA rs1413711 genotipų (T/T, T/C, C/C) pasiskirstymai lyginant sergančiuosius RNN, kuriems IS nenustatyta, su kontroline grupe skyrėsi statistiškai reikšmingai: 12,8%, 63,8%, 23,4% vs. 35,9%, 43,6%, 20,4%, atitinkamai (p=0,008). C alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančių RNN be IS nei kontrolinėje grupėje: 55,3 % vs. 42,3 %, atitinkamai (p=0,023) (15 lentelė).
IL-6 rs1800795 genotipų (G/G, C/G, C/C) pasiskirstymai lyginant sergančiuosius RNN be IS su kontroline grupe skyrėsi statistiškai reikšmingai: 23,4 %, 27,7 %, 48,9 % vs. 22,1 %, 57,5 %, 20,4 %, atitinkamai (p<0,001). C alelis buvo statistiškai reikšmingai dažnesnis sergančių RNN be IS nei kontrolinėje grupėje: 62,8 % vs. 49,2 %, atitinkamai (p=0,019) (15 lentelė).
15 lentelė. VEGFA rs1413711, TIMP-3 rs9621532 ir IL-6 rs1800795 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių regos nervo neuritu be išsėtinės sklerozės ir sergančių regos nervo neuritu ir išsėtine
skleroze
Genas Genotipas/Alelis Kontrolinė grupė n (proc.), n=181 RNN be IS n (proc.), n=47 P reikšmė RNN su IS n (proc.), n=28 P reikšmė VEGFA rs1413711 Genotipas T/T T/C C/C Iš viso Alelis T C 65 (35,9) 79 (43,6) 37 (20,4) 181 (100) 209 (57,7) 153 (42,3) 6 (12,8) 30 (63,8) 11 (23,4) 47 (100) 42 (44,7) 52 (55,3) 0,008 0,023 6 (21,4) 13 (46,5) 9 (32,1) 28 (100) 25 (44,6) 31 (55,4) 0,218 0,066 Genotipas A/A A/C 153 (84,5) 27 (14,9) 38 (80,9) 8 (17,0) 0,542 24 (85,7) 4 (14,3) 0,921
44 TIMP-3 rs9621532 C/C Iš viso Alelis A C 1 (0,6) 181 (100) 333 (92,0) 29 (8,0) 1 (2,1) 47 (100) 84 (89,4) 10 (10,6) 0,417 0 (0) 28 (100) 52 (92,9) 4 (7,1) 0,823 IL-6 rs1800795 Genotipas G/G C/G C/C Iš viso Alelis G C 40 (22,1 104 (57,5) 37 (20,4) 181 (100) 184 (50,8) 178 (49,2) 11 (23,4) 13 (27,7) 23 (48,9) 47 (100) 35 (37,2) 59 (62,8) <0,001 0,019 7 (25,0) 10 (35,7) 11 (39,3) 28 (100) 24 (42,9) 32 (57,1) 0,051 0,267
RNN- regos nervo neuritas; IS – išsėtinė sklerozė; p vertė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05).
Atlikta dvinarė logistinė regresinė analizė tiriamųjų, sergančių RNN be IS ir kontrolinėje grupėse. Analizė parodė, kad VEGFA rs 1413711 T/C genotipas, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 4,1 karto (GS=4,11; 95 proc. PI: 1,61-10,49, p=0,003), o C/C genotipas – 3,2 karto (GS=3,22; 95 proc. PI: 1,1-9,42, p=0,03). T/C ir C/C genotipai kartu, lyginant su T/T genotipu, galimybę susirgti RNN didina 3,8 karto (GS=3,83; 95 proc. PI: 1,54-9,5, p=0,004). T/C genotipas, lyginant su T/T ir C/C genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 2,3 karto (GS=2,28; 95 proc. PI: 1,17-4,42, p=0,02). Taip pat, kiekvienas C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=1,67; 95 proc. PI: 1,06-2,64, p=0,03). Rezultatai pateikti 16 lentelėje.
IL-6 rs1800795 C/C genotipas, lyginant su G/G ir C/G genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 3,7 karto (GS=3,73; 95 proc. PI: 1,89-7,34, p<0,001). C/G genotipas, lyginant su G/G ir C/C genotipais kartu, galimybę susirgti RNN mažina 3,6 karto (GS=0,28; 95 proc. PI: 0,14-0,57, p<0,001). Taip pat kiekvienas C alelis yra susijęs su didesne RNN išsivystymo galimybe (GS=1,78; 95 proc. PI: 1,1-2,89, p=0,02). Rezultatai pateikti 16 lentelėje.
16 lentelė. IL-6 rs1800795, VEGFA rs1413711 ir TIMP-3 rs9621532 genotipų tiriamųjų, sergančių regos nervo neuritu be išsėtinės sklerozės, dvinarės logistinės regresijos analizė
45
Genas Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) P
reikšmė AIC VEGFA rs1413711 Kodominantinis T/T T/C C/C 1 4,11 (1,61-10,49) 3,22 (1,1-9,42) 0,003 0,03 225,1 Dominantinis T/C+C/C vs. T/T 3,83 (1,54-9,5) 0,004 223,4 Recesyvinis C/C vs. T/T+T/C 1,19 (0,55-2,56) 0,66 233,8 Overdominantinis T/C vs. T/T+C/C 2,28 (1,17-4,42) 0,02 227,9 Adityvinis C 1,67 (1,06-2,64) 0,03 229 TIMP-3 rs9621532 Kodominantinis A/A A/C C/C 1 1,19 (0,5-2,83) 4,03 (0,25-65,85) 0,69 0,33 234,9
Dominantinis A/C+C/C vs. A/A 1,29 (0,56-2,97) 0,54 233,7 Recesyvinis C/C vs. A/A+A/C 3,91 (0,24-63,75) 0,34 233,2 Overdominantinis A/C vs. A/A+C/C 1,17 (0,49-2,78) 0,72 233,9
Adityvinis C 1,36 (0,64-2,88) 0,42 233,4 IL-6 rs1800795 Kodominantinis G/G C/G C/C 1 0,46 (0,19-1,09) 2,26 (0,97-5,27) 0,08 0,06 218,7 Dominantinis C/G+C/C vs. G/G 0,93 (0,43-1,99) 0,85 233,9 Recesyvinis C/C vs. G/G+C/G 3,73 (1,89-7,34) <0,001 219,7 Overdominantinis C/G vs. G/G+C/C 0,28 (0,14-0,57) <0,001 220,4 Adityvinis C 1,78 (1,1-2,89) 0,02 228,2
p reikšmė – reikšmingumo lygmuo (skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05); GS – galimybių santykis; AIC – Akaike.
Taip pat, atlikta dvinarė logistinė regresinė analizė tiriamųjų, sergančių RNN ir IS kartu.
Analizė parodė, kad IL-6 rs1800795 C/C genotipas, lyginant su G/G ir C/G genotipais kartu, galimybę susirgti RNN didina 2,5 karto (GS=2,52; 95 proc. PI: 1,09-5,83, p=0,03). C/G genotipas, lyginant su G/G ir C/C genotipais kartu, galimybę susirgti RNN mažina 2,4 karto (GS=0,41; 95 proc. PI: 0,18-0,94, p=0,04). Rezultatai pateikti 17 lentelėje.
