LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Anželika Korostij
Šunų norovirusų molekulinė diagnostika ir paplitimas Lietuvoje
Canine norovirus molecular diagnostics and prevalence in Lithuania
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof., dr. Algirdas Šalomskas
2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šunų norovirusų molekulinė diagnostika ir paplitimas Lietuvoje“.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas,
pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPOS ...5 ĮVADAS ...6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ...8 1.1. Gastroenteritų etiologija ... 8 1.2. Norovirusas ... 8 1.2.1. Sukėlėjas ... 8 1.2.2. Klinikiniai požymiai ... 9 1.2.3. Plitimas ir patogenezė ... 9 1.2.4. Sukėlėjo atsparumas ... 9 1.2.5. Tyrimo metodai ... 9 1.2.6. Zoonotinis potencialas ... 9 1.3.Šunų parvovirusas ... 10 1.3.1. Sukėlėjas ... 10 1.3.2. Klinikiniai požymiai ... 10 1.3.3. Plitimas ir patogenezė ... 111.3.4. Patologiniai anatominiai pokyčiai ... 12
1.3.5. Sukėlėjo atsparumas ... 12
1.4.Virusinių gastroenteritų gydymas ... 12
1.5. Prevencijos metodai ir galimybės. ... 13
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ...14
2.1. Atvirkštinės transkriptazės PGR ... 14
2.2. Statistinis duomenų įvertinimas ... 15
3. TYRIMO REZULTATAI ...16
4. REZULTATŲ APTARIMAS ...28
5. IŠVADOS ...31
PADĖKA ...32
4 SANTRAUKA
Šunų norovirusų molekulinė diagnostika ir paplitimas Lietuvoje Anželika Korostij
Magistro baigiamasis darbas
Šunų norovirusas (CNV) yra naujai atrastas gastroenteritą sukeliantis patogenas, kuris paskutiniu metu nustatomas įvairiose šalyse. Lietuvoje tyrimų apie norovirusų paplitimą šunų populiacijoje atlikta nebuvo. Šunų parvovirusas (CPV) yra dažniausias šunų gastroenteritą sukeliantis virusas, Lietuvoje yra atlikta daug tyrimų, tačiau nėra tirta ar vienu metu gyvūnas gali sirgti parvovirusiniu ir norovirusiniu enteritu. Darbo tikslas buvo ištirti šunų norovirusų paplitimą sveikų ir sergančių šunų grupėse naudojant atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininę reakciją.
Buvo surinkti 122 klinikinius gastroenterito požymius turinčių ir kliniškai sveikų šunų išmatų mėginiai ir ištirti PGR metodu. CNV buvo teigiami 8,2 proc. visoje ištirtoje šunų populiacijoje, kai tuo tarpu CNV buvo nustatyti1,9proc. kliniškai sveikų šunų ir 13,2 proc. šunų su klinikiniais gastroenterito požymiais. CNV buvo rastas kartu su CPV net 11,8 proc. gastroenterito atvejų ir 1,5 proc. atvejų buvo rastas tik vienas CNV.
Raktažodžiai: norovirusas, parvovirusas, šunys, gastroenteritas, PGR. SUMMARY
Canine norovirus molecular diagnostics and prevalence in Lithuania Anželika Korostij
Master‘s Thesis
Canine norovirus (CNV) is a new gastroenteritis causing pathogen that has been recently reported in various countries.However, there are no studies of CNV in dog‘s population in Lithuania. Canine parvovirus (CPV) is the most common canine gastroenteritis causing virus. There were a lot of researches carried out in Lithuania, but there were no studies about the prevalence of simultaneous parvovirus and norovirus infection. The objective of this study was to determine the prevalence of CNV in a healthy and clinically affected dog population using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR).
Fecal samples from 122 clinically affected and healthy dogs have been collected and examined using RT-PCR. CNV was detected in 8,2% of the samples, while 1,9% of healthy and 13,2% of clinically affected dogs were CNV positive. CNV was detected simultaneously with CPV in 11,8% of the gastroenteritis cases whereas alone in 1,5%.
5
SANTRUMPOS
CNV – šunų norovirusas; CPV – šunų parvovirusas; DNR – deoksiribonukleorūgštis; FPV - kačių panleukopenijos virusas; MEV - audinių enterito virusas; RPV – meškėnų parvovirusas; MVC – šunų minutės virusas;
6
ĮVADAS
XIX-to amžiaus pabaigoje buvo atrasti nauji patogenai - virusai, kurie šiais laikas yra sunkiai kontroliuojama visuomenės sveikatos problema. Virusai sparčiai plinta ir sukelia įvairių organizmo sistemų ligas, tarp jų ir virškinimo sistemos veiklos sutrikimus.
Norovirusai yra plačiai pasaulyje paplitę gyvūnų ir žmonių gastroenteritą sukeliantys patogenai, o šunų norovirusai jau yra randami Italijoje (1), Japonijoje (2), Graikijoje (3) ir Portugalijoje (4).
Norovirusinė infekcija sukeliama Caliciviridae šeimos atstovo noroviruso yra viena iš labiausiai paplitusių žmonių viduriavimą sukeliančių priežasčių visame pasaulyje, visose amžiaus grupėse. Viruso transmisija vyksta fekaliniu-oraliniu keliu arba per užterštą maistą, vandenį ar paviršių. Tipiniai norovirusinės infekcijos požymiai yra pykinimas, vėmimas, viduriavimas, kurie atsiranda po 12 valandų nuo užsikrėtimo ir tęsiasi 1-3 dienas. Sunkesniais atvejais liga gali tęstis daugiau dienų (5).
Pagal Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro duomenis virusinės žarnyno infekcijos 2015 metais sudarė net 52,7 proc. visų žarnyno infekcijų žmonių tarpe, o virusinių žarnyno infekcijų lyginamoji dalis nuo 29,5 proc. 2007 metais padidėjo iki 52,7 proc. 2015 metais rotavirusų ir norovirusų sukeltos infekcijos buvo dažniausios žmonių virusinės žarnyno infekcijos Lietuvoje. Šios infekcijos yra rimta visuomenės sveikatos problema, kadangi sezoninio virusų plitimo metu virusų sukelti protrūkiai kyla ne tik įvairiose vaikų ugdymo įstaigose, bet protrūkių padažnėja ir šeimose. Žmonės yra labai imlūs virusinėms žarnyno infekcijoms, kadangi jų užkrečiamoji dozė yra nedidelė, vaikų grupėse ar šeimose virusai išplinta greitai (6).
Klinikinis virusinio gastroenterito spektras gali svyruoti nuo asimptominės iki sunkią dehidrataciją sukeliančios arba net mirtinos infekcijos.
Pagal Italijoje naujojo šunų noroviruso tyrimus daryta prielaida, kad dėl plačios socialinės sąveikos tarp žmogaus ir naminių gyvūnų būtų vertinga ištirti gyvūninių norovirusų zoonotinį potencialą žmonių populiacijoje (1).
2012 metais, Suomijoje, Helsinkio universiteto Veterinarinės medicinos fakulteto mokslininkų tyrimo rezultatai parodė, kad žmonių norovirusai gali persistuoti šunų virškinamajame trakte. Pagal jų rezultatus klausimas, ar norovirusai gali daugintis šunų virškinamajame trakte, liko neišspręstas, tačiau faktas, kad šunys gali užkrėsti žmones šiuo virusu tapo akivaizdus. Pagal jų rezultatus 4,3 proc. ištirtų šunų fekalijų mėginiai buvo teigiami GII tipo žmonių norovirusui (7).
7 imunodeficitą turintiems ir senyvo amžiaus žmonėms. Vaikai ir kūdikiai yra ypač pažeidžiami žarnyno infekcinių ligų dėl greito elektrolitų ir skysčių balanso sutrikimo, todėl laiku neatstačius šio balanso liga gali būti mirtina.
Pagal portugalų Porto universiteto mokslininkų atlikto tyrimo rezultatus 23 proc. tirtų šunų fekalijų mėginiai buvo teigiami šunų norovirusams (8). Pagal kitus tyrimus, Portugalijoje net 40 proc. viduriuojančių šunų ir 9 proc. šunų, kuriems viduriavimas nebuvo pasireiškęs, buvo teigiami šunų norovirusams (4).
Norovirusams, kaip ir daugeliui kitų kvėpavimo takų ir virškinimo trakto virusų, yra būdingas vidutinio klimato žiemos sezoniškumas (9). Tai vyksta dėl meteorologinių sąlygų pokyčių, tokių kaip drėgmė ir žema temperatūra (10). Norovirusinė infekcija yra labai užkrečiama liga, nes infekcinė dozė yra 18 virusų dalelės (11).
Šunų virusinis enteritas gali būti įtariamas pasireiškus ūmiam vėmimui arba viduriavimui, ypač mažu šuniukų tarpe vienu metu keliems šuniukams. Galutinė diagnozė reikalauja laboratorinio patvirtinimo, tam naudojami tiriamieji metodai, kurie leidžia tiksliai nustatyti koks sukėlėjas yra ligos priežastis.
Šiuo metu imunizacija yra pagrindinis virusinių enteritų prevencijos ir kontrolės būdas, tačiau išaiškinus virusinių ligų epidemiologinę situaciją, galima atrasti naujų efektyvesnių, greitesnių diagnostikos, profilaktikos ir sukėlėjo likvidavimo priemonių, taip sumažinant virusų plitimo grėsmę.
Baigiamasis darbas buvo atliktas 2014-2016 metais LSMU VA Veterinarinės patobiologijos katedroje ir LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Buvo surinkti 122 sergančių ir kliniškai sveikų šunų fekalijų mėginiai ir ištirti PGR metodu dėl norovirusų ir šunų parvovirusų.
Darbo tikslas: Ištirti šunų norovirusų paplitimą sveikų ir sergančių šunų grupėse. Darbo uždaviniai:
1. Pritaikyti RT PGR metodą norovirusų nustatymui šunų klinikiniuose mėginiuose 2. PGR metodu nustatyti šunų norovirusų paplitimą sveikų ir sergančių šunų grupėse. 3. Palyginti šunų mišrių infekcijų (norovirusinės ir parvovirusinės) paplitimą sveikų ir
sergančių šunų grupėse.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Gastroenteritų etiologija
Gastroenteritai būna infekcinės bei neinfekcinės kilmės. Infekciniai šunų gastroenteritai gali būti sukelti didelės įvairovės mikroorganizmų, tokių patogenų kaip virusai, bakterijos, grybai bei pirmuonys. Diagnozavus gastroenteritą į diferencinės diagnostikos sąrašą vertėtų įtraukti ir kitus parazitus, tokius kaip nematodai (12).
Virusiniai patogenai, kurie buvo susieti su enteritu pas šunis, yra šunų parvovirusai, šunų maro virusas, šunų koronavirusai, rotavirusai, astrovirusai, adenovirusai, calicivirusai, enterovirusai, reovirusai, hepatito virusai ir naujai atrasti - norovirusai, kobuvirusai, sapovirusai ir cirkovirusai (13,14).
Mano magistriniame darbe dėmesys bus kreipiamas į naujai šunų populiacijoje atrastą ir mažai ištirtą patogeną - šunų norovirusą bei į labiausiai paplitusį šunų virusinio gastroenterito sukėlėją – šunų parvovirusą.
1.2. Norovirusas
1.2.1. SukėlėjasKiekvienais metais norovirusai sukelia apie vieną milijoną epideminių ir sporadinių stipraus gastroenterito atvejų su hospitalizacija visame pasaulyje, tarp kurių apie 200 tūkstančių mirčių jaunesnių nei 5 metų vaikų ir kūdikių tarpe (15,16). Norovirusinės infekcijos protrūkiai yra būdingi didesnėse žmonių susiburimo vietose, tokiose kaip mokyklos, kruiziniai laivai, restoranai ir kiti kaip kariuomenės bazės.
Norovirusas yra Caliciviridae šeimos atstovas. Viruso nomenklatūra ir genetinė klasifikacija yra komplikuota dėl didelės genetinės įvairovės. Norovirusai yra skirstomi į genogrupes, genotipus ir padermes, remiantis pilna VP1aminorūgščių seka (17). Pirmą kartą šunų norovirusas (CNV) buvo nustatytas ir tuo pačiu charakterizuotas 2007 metais Italijoje (1). Yra 6 norovirusų genogrupės, nuo GI iki GVI, šunų norovirusai yra priskiriami GIV ir GVI genogrupėms (18). Tų pačių virusų genotipai turi apie 85 proc. vienodos informacijos, tuo metu vienos genogrupės virusai turi apie 55 – 85 proc. tos pačios informacijos (19). Padaryta prielaida, kad genetinė įvairovė gali būti iš dalies nulemta polinkiu klaidoms RNR replikacijos metu, dėl taškinių mutacijų (20).
9 1.2.2. Klinikiniai požymiai
Inkubacijos periodas yra 1-3 dienos, klinikiniai požymiai yra žemo laipsnio karščiavimas, vėmimas bei diarėja. (11). Jaunų šuniukų fekalijose dažnai norovirusai randami kartu su antrojo tipo parvovirusais (CPV-2a). Yra nustatyta, kad norovirusas greičiausiai apsunkina parvovirusų infekcijos eigą, o būtent CPV-2 yra dažniausiai pasitaikantis šunų gastroenterito patogenas (1).
1.2.3. Plitimas ir patogenezė
Italijoje buvo atlikti tyrimai 11 mėnesių šuniukui, kuriam pasireiškė gastroenterito požymiai. Šuniukas buvo hospitalizuotas ir gydytas 4 dienas nuo sunkios dehidratacijos iki visiško pasveikimo. Šuniuko išmatos buvo ištirtos virusų atžvilgių, rezultatai parodė teigiamą CPV-2a, taip pat panaudojus atitinkamus p289–p290 pradmenis tyrimo rezultatas buvo teigiamas ir kalicivirusui. Po kaliciviruso aptikimo gyvūnas buvo stebimas dar 30 dienų po pasveikimo. Buvo imami ir tiriami mėginiai kiekvieną dieną. Kalicivirusas buvo nustatomas iki 22 dienos po pasveikimo, kas reiškia aktyvią viruso replikaciją. Tuo metu CPV-2a buvo randami tik iki 10 dienos nuo pasveikimo (1).
1.2.4. Sukėlėjo atsparumas
Norovirusai yra sunkiai išnaikinami. Specifinių kontrolės ir prevencijos būdų nuo norovirusinės infekcijos nėra, todėl reikėtų dažnai valyti ir dezinfekuoti aplinką. Eksperimentinių tyrimų rezultatai rodo, kad antimikrobiniai paviršiai iš vario lydinių yra veiksmingi norint sustabdyti norovirusų plitimą užterštoje aplinkoje (21). Su pelėmis atlikti tyrimai parodė, kad žmonių norovirusų plitimas yra mažinamas naudojant dezinfekcines priemones, kurios savo sudėtyje turi alkoholio (22).
1.2.5. Tyrimo metodai
Atvirkštinės transkriptazės PGR metodas yra šiuo metu jautriausias diagnostinis metodas norovirusų tyrimams išmatose ir aplinkos mėginiuose (23). Imunochromatografiniai greitieji testai yra sukurti tik žmonių norovirusų nustatymui. Žmonių populiacijoje dažniausiai pasitaiko GII.4 norovirusų genotipas. Žmonių norovirusų nustatymo greitasis testas yra labai jautrus, specifiškumas siekia 100 proc. (24). Šunų norovirusų nustatymui greitųjų imunochomatografinių testų nėra sukurta, tačiau jie labai praverstų veterinarinėje praktikoje.
1.2.6. Zoonotinis potencialas
10 kitų žmonių kraujo serume buvo rasti antikūniai. Tačiau reikalingi tolimesni tyrimai, kurie patvirtintų, kad šunų norovirusai gali sukelti žmonių infekciją (18).
1.3. Šunų parvovirusas
1.3.1. SukėlėjasŠunų parvovirusas (CPV) pirmą kartą nustatytas 1978 metais Jungtinėse Amerikos Valstijose pasireiškus protrūkiams šunų veislynuose ir prieglaudose (25).
Šunų parvovirusas (CPV) yra Parvoviridae šeimos, Parvovirinae pošeimio, Parvovirus genties atstovas, kuriai taip pat priklauso Kačių panleukopenijos virusas (FPV), audinių enterito virusas (MEV) ir meškėnų parvovirusas (RPV) (26).
Parvovirusai yra maži, apie 25 nm dydžio, turi viengubą DNR grandinę, infekuoja stuburinius gyvūnus ir vabzdžius. CPV replikacija vyksta tik tam tikrose jaunų ir suaugusių gyvūnų greitai besidalijančių ląstelių branduoliuose, pavyzdžiui gyvūnų žarnyno arba hematopoetiniuose audiniuose (27).
Parvovirusai yra labai stabilūs aplinkoje, kadangi jie yra atsparūs pH, temperatūros pokyčiams, džiovinimui, gydymui lipidų tirpikliais, tripsinu, o taip pat daugumai dezinfekcinių priemonių (27).
1.3.2. Klinikiniai požymiai
Klinikiniai parvovirusinio enterito požymiai dažniausiai atsiranda po 3-7 dienų nuo gyvūno užsikrėtimo (27). Parvovirozė turi dvi ligos formas: enteritas ir miokarditas. Miokardito forma pasitaiko retai ir vystosi šuniukams, kurie buvo užsikrėtė motinos gimdoje (28). Pasireiškia anoreksija, depresija, vėmimas, gleivinga arba hemoraginė diarėja, taip pat dehidratacija, karščiavimas, leukopenija (29).
Mirtingumas šuniukų tarpe gali siekti 70 proc., tuo tarpu suaugusių šunų šis rodiklis siekia vos 1 proc. (27). Ligos pasireiškimo sunkumas priklauso nuo įvairių veiksnių, tokių kaip virusinių dalelių skaičius, virulentiškumas, gyvūno amžius, veislė, stresas, imuninės sistemos būklė, aplinka, kitų patogenų – bakterijų, parazitų, virusų. Organizmas tampa mažiau atsparus antrinei bakterinei infekcijai dėl kaulų čiulpų pažeidimų (28, 30).
11 nustatomas šunų antro tipo parvovirusas. Tai įrodo, kad parvovirusas yra susijęs ir su kitais viduriavimą sukeliančiais patogenais. Šunų išmatų mėginiuose buvo randami taip pat Clostridium
perfringens bakterijų -toksinas, tokie parazitai kaip kriptosporidijos, giardijos. Vienu metu esantys
keli gastroenterito sukėlėjai apsunkina ligos eigą, pailgina gydymo trukmę ir organizmo atsistatymą, gali sukelti komplikacijas (31).
1.3.3. Plitimas ir patogenezė
Šunų parvovirusai sukelia sisteminę ligą, virusą galimą rasti įvairiuose vidaus organuose – limfiniuose mazguose, liežuvyje, stemplėje, kepenyse, blužnyje, inkstuose, plaučiuose ir širdyje (32). Limfiniame audinyje ir žarnyno ląstelėse pokyčiai yra sukeliami dėl šio viruso replikacijos ypatybių. Įtakos ligos eigai turi įvairūs veiksniai, tokie kaip stresas, aplinkos pasikeitimas, gyvūno transportavimas arba parazitinės ligos, kadangi gyvūno organizmas pasidaro jautresnis (33).
Parvovirozė plinta fekaliniu – oraliniu būdu, tai gali vykti dviem būdais. Tiesioginiu būdu, kurio metu viruso virionai į šuns organizmą patenka per burną, ir netiesioginiu, kai patekimas vyksta per nosį, uostant užterštas išmatas (32).
CPV taikinys yra žarnyno kriptos ir limfiniai organai, tačiau virusas gali plisti į visus audinius, taip pat ir į smegenis (29).
Parvovirusas patekęs per burną gali prisijungti prie liežuvio, stemplės gleivinės bei ryklės limfinių mazgų audinio. Toliau viruso replikacija vyksta mezenterinių limfinių mazgų audinyje, kaulų čiulpuose. Iš žarnų pasaito limfinių mazgų virionai patenka į embrioninį žarnyno kriptų epitelį, tai sukelia gaurelių atrofiją bei nuolatinį kraujavimą. Dėl ląstelių pažeidimų infekuotam gyvūnui pasireiškia diarėja. Vystantis infekcijai pasikeičia gyvūno kraujo ląstelių morfologija, atsiranda ūmi leukopenija, kraujo ląstelėse vyksta virusų dauginimasis – viremija (32).
Infekcijos vystymosi eigą įtakoja ir gyvūnų atjunkymas, kai vyksta intensyvi žarnyno ląstelių mitozė, pakinta mityba ir žarnyno mikroflora, virusai patenka į embrioninį žarnyno gaurelių epitelį, prasideda gaurelių atrofija (34).
12 1.3.4. Patologiniai anatominiai pokyčiai
Išskrodus gyvūną, nugaišusį dėl parvovirozės gali būti randama kepenų hiperplazija, ascitas, virškinamojo trakto gleivinių pažeidimai – skrandžio, žarnų. Žarnyno sienelės būna išblyškusios spalvos, plonos. Žarnyne būna vandeningo, kraujingo turinio taip pat gali būti ir gleivingas, gelsvas skystis (36).
Didžiausi pažeidimai nustatomi plonajame žarnyne, tuo tarpu storajame žarnyne pakitimų randama retai. Ūmiais parvovirusinio enterito atvejais randama žarnų kriptų nekrozė. Miokardito atveju yra širdies išsiplitimas, kartais pasireiškia miokardo nekrozė, plaučių edema, hidrotoraksas (35,37).
1.3.5. Sukėlėjo atsparumas
Parvovirusai yra labai atsparūs aplinkos veiksnių poveikiui – kambario temperatūroje išmatose jie išlieka aktyvūs ir virulentiški iki 12 mėnesių, o esant 70°C temperatūrai jo patogeninės savybės nesumažėja dvi valandas. Parvovirusas išlieka aktyvus, esant pH 3,0-9,0, tačiau užtenka 2 arba 10 pH poveikio ir virusas inaktyvuojamas per 30 minučių. Yra pastebėta, kad parvovirusai atsparūs dezinfekcinėms medžiagoms. Virusą gerai neutralizuoja natrio hipochloritas. Yra labai svarbu tinkamai prižiūrėti patalpas, naudoti specialius, veiksmingus dezinfektantus. Šiam tikslui tiktų „Vet and kennel disinfectant“ arba dezinfektantai savo sudėtyje turintys natrio hipochlorito (38).
1.4.
Virusinių gastroenteritų gydymas
Gydant enteritus yra labai svarbu atstatyti elektrolitų ir skysčių balansą, todėl skiriama skysčių terapija. Nuo antrinės bakterinės infekcijos dėl pažeistos žarnų gleivinės yra skiriamos plataus veikimo spektro antimikrobinės medžiagos, vaistai nuo spazmų ir nuo uždegimo. Tai yra simptominis gydymas, nespecifinis parvovirusiniam enteritui, tačiau atliekant viską taisyklingai galima išgelbėti naminio gyvūno gyvybę. Dėl diarėjos gali pasireikšti metabolinė acidozė, tokiu atveju yra naudojami kalio preparatai kalio chlorido pavidalu. Jeigu gyvūnui pasireiškia vėmimas reikėtų skirti antiemetinių vaistų, taip pat vaistus galima derinti su bado dieta (39).
13
1.5 Prevencijos metodai ir galimybės.
Greita infekcinių virusinių susirgimų, o ypač enteritų nustatymas yra ypatingai svarbus šunų veislynuose ir prieglaudose, kad kuo greičiau izoliuoti infekuotus šunis atliekant prevenciją, apsaugant kitus, kontaktą su sergančiais gyvūnais turinčius šunis (27).
Labai svarbus infekcinių ligų prevencijos būdas yra vakcinacija. Parvovirusinio enterito veiksminga profilaktikos priemonė yra vakcinacija. Inaktyvuotoms vakcinoms yra būdingas trumpalaikio imuniteto sukėlimas, yra platus panaudojimas gyvųjų modifikuotų vakcinų. Jos gaminamos naudojant originalią CPV-2 padermę arba CPV-2c. Yra įrodyta, kad imunizuojami šiomis vakcinomis gyvūnai yra apsaugoti nuo užsikrėtimo šunų parvovirusais ir yra saugios naudoti. Laiku ir tinkamai vakcinuoti naminiai gyvūnai turi mažesnę tikimybę susirgti infekcine liga arba gyvūnas perserga lengvesne ligos forma, taip skatinamas ir populiacijos imunitetas, o naudojant polivalentines vakcinas sumažinama pavojingų zoonozinių ligų perdavimo rizika (40).
Šeimininkai turėtų rūpintis savo gyvūno sveikata, taip yra prisidedama atliekant susirgimų prevenciją. Gerai organizmo veiklai yra svarbi gera mityba, todėl reikėtų šuniukus šerti kokybišku pašaru, taip pat reguliariai atlikti dehelmentizaciją, ją yra rekomenduojama atlikti prieš vakcinaciją. Gimę šuniukai turi pasyvų imunitetą gautą kalės krekenose esančių imunoglobulinų pagalba ir yra efektyviai apsaugomi iki 6 savaičių amžiaus, todėl jaunesnių nei 6-8 savaičių amžiaus šuniukų vakcinacija nėra rekomenduotina (41). Po 3 – 4 savaičių nuo pirmos vakcinacijos privaloma atlikti pakartotiną vakcinaciją kartu imunizuojant ir nuo pasiutligės. Po antros vakcinacijos yra vakcinuojama po metų arba jeigu šuniui sukako vieneri metai. Kai kuriuose literatūros šaltiniuose šunis rekomenduojama pradėti vakcinuoti nuo 6 savaičių, o revakcinuoti kas 3 – 4 savaites iki šuniukas sukaks 18 savaičių amžiaus (42).
14
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Prisilaikant gyvūnų globos, laikymo, naudojimo bei veterinarinių reikalavimų, darbo metu buvo surinkti 122 šunų fekalijų mėginiai iš kelių Vilniuje ir Kaune esančių privačių veterinarijos klinikų. Buvo atrinkti 54 įvairaus amžiaus, veislės, lyties, sveiki, be virškinamojo trakto sutrikimų, šunys. Tuo tarpu kitiems 68 šunims buvo pasireiškę tokie virškinamojo trakto sutrikimai, kaip viduriavimas ir vėmimas.
Visi 122 mėginiai buvo ištirti atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininės reakcijos metodu dėl norovirusų ir parvovirusų. 10 kontrolinių virusiniu gastroenteritu sergančių žmonių išmatų mėginių buvo gauti iš LSMU Infekcinių ligų klinikos ir ištirti dėl norovirusų.
Laboratoriniai tyrimai buvo atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute ir gauti rezultatai išanalizuoti šunų norovirusų ir šunų parvovirusų atžvilgiu.
Mėginiai buvo imami į tuščius mėgintuvėlius iš tiesiosios žarnos naudojant medvilninį tamponėlį. Mėgintuvėliai buvo sandariai uždaromi, laikomi -20 C temperatūroje iki pristatymo į laboratoriją. Transportuojant buvo naudojami šaltkrepšiai ir šaldymo elementai. Pristačius į laboratoriją mėginiai buvo užšaldomi -70C temperatūroje iki tolimesnių tyrimų.
2.1. Atvirkštinės transkriptazės PGR
Pirmiausia buvo atlikamas šunų norovirusų RNR išskyrimas. Homogenizacija atlikta paėmus 1 ml TRIzolio tirpalo ir 100 mg mėginio. TRIzol – tai naudojimui paruoštas tirpalas, skirtas bendrosios RNR išskyrimui iš audinių ir ląstelių. Šis reagentas yra monofazinis fenolio ir guanidino izotiocionato tirpalas. Tyrimai atlikti pagal “Invitrogen” gamintojo instrukciją.
Mėginiai buvo tirti paprastu atvirkštinės transkriptazės PGR metodu. Tyrime buvo panaudoti 2 metodai. Pirmojo metodo metu atlikta atvirkštinės transkriptazės PGR su bendraisiais norovirusų pradmenimis JV13y ir JV13i, o bendras produkto sekos dydis 327 bp.
Antrojo metodo metu buvo naudoti šunų norovirusų ORF2 kodo - VP1 kapsidžių proteinų sekų oligonukleidų pradmenysJV102 TGG GAT TCA ACA CAG CAG AG-3′) ir JV103 (5′-TGC GCA ATA GAG TTG ACC TG-3′) su GLPSG amino rūgštimi, kuris yra specifinis „Viseu“ šunų noroviruso padermei (53). Produkto sekos dydis buvo 209 bp. Reakcijos 50 μl mišinį sudarė:
1. Vanduo be nukleazių.31,5 μl 2. PGR buferinis tirpalas 5 μl 3. MgCl2 (25mM) 5 μl
15 5. JV102 pradmuo (20 pmol) 1 μl
6. JV103 pradmuo (20 pmol) 1 μl 7. cDNR 2 μl
8. Taq rekombinantinė DNR polimerazė (2,5U) 0,5 μl
Tyrimas buvo atliktas panaudojus termociklerį Eppendorf Mastercycler Personal. Detali reakcijos eiga pateikta 1 lentelėje. Atlikus AT-PGR buvo atliekama reakcijos produktų elektroforezė agarozės gelyje.
Taip pat išskyrus DNR ir panaudojus atitinkamus pCPV-2ab pradmenis, atvirkštinės transkriptazės PGR metodu ištirti visi mėginiai parvovirusų atžvilgiu pagal Zienius et al. aprašytą metodiką (44).
1 lentelė. PGR etapai.
Etapas Temperatūra, ºC Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 95 5 min 1
Denatūracija 94 1 min
30
Hibridizacija 37 1 min
Ekstensija 72 1 min
Galutinė ekstensija 72 10 min 1
Atvėsinimas 20 - 1
2.2. Statistinis duomenų įvertinimas
16
3.
TYRIMO REZULTATAI
Mėginių tyrimai buvo atlikti 2015-2016 metais. Pirmojo tyrimo metu buvo ištirti 122 šunų ir 10 žmonių fekalijų mėginiai. Tiriant mėginius bendraisiais, žmonių genotipams būdingais norovirusų pradmenimis, visi 122 šunų mėginiai buvo neigiami, tai reiškia, kad mūsų tirti šunys nebuvo žmonių norovirusų nešiotojai, tuo tarpu ištyrus kontrolinius žmonių fekalijų mėginius 7 atvejais rezultatas buvo teigiamas, kas įrodo tyrimo specifiškumą.
1 pav. Šunų norovirusų paplitimas tirtų šunų populiacijoje, PGR tyrimų rezultatai, proc.
Tiriant šunų mėginius antruoju PGR būdu, t.y. naudojant šunų norovirusams būdingus pradmenis, tyrimų rezultatai parodė, kad norovirusų atžvilgiu teigiamų atvejų buvo nustatyta tiek sveikų, tiek sergančių šunų grupėse. 8,2 proc. nuo visų tirtų gyvūnų buvo teigiami norovirusams. Tuo tarpu 0,8 proc. gyvūnų ligos požymiai pasireiškę nebuvo, bet norovirusas buvo nustatytas. Likę 91,8 proc. tirtų gyvūnų buvo neigiami norovirusų atžvilgiu. Rezultatai parodė, kad daugiau šunų buvo teigiami norovirusams sergančių šunų grupėje (95% PI 2,75-12,05) ir rezultatas yra statistiškai reikšmingas (p<0,01) su z-įverčiu lygiu 2,6.
0,8 7,4
91.8
Teigiami atvejai sveikų šunų tarpe
Teigiami atvejai sergančių šunų tarpe
17
2 pav. Kliniškai sveikų šunų PGR tyrimų rezultatai norovirusų atžvilgiu, proc.
Iš 2 paveiksle pateiktos diagramos matome, kad sveikų šunų grupėje, kuriems nebuvo pasireiškę gastroenterito požymiai, norovirusai buvo nustatyti tik 1,9 proc. atvejų (95% PI 1,74-5,54). Rezultatas laikomas statistiškai reikšmingu (p<0,05) su z-įverčiu lygiu 10.
3 pav. Sergančių gastroenteritu šunų PGR tyrimų rezultatai šunų norovirusų atžvilgiu, proc.
18
4 pav. Šunų gastroenteritų etiologija, proc.
19
5 pav. Šunų parvovirusų paplitimas tirtų šunų populiacijoje, PGR tyrimų rezultatai, proc.
Iš aukščiau pateiktos diagramos (5 pav.) matome, kad visoje tirtoje šunų populiacijoje parvovirusas nustatytas 36,1 proc. šunų, įdomus faktas, kad nei vieno sveiko gyvūno išmatų mėginyje parvovirusas rastas nebuvo. Kaip matome iš 2 lentelės, didžiausią teigiamų mėginių dalį sudarė iki 6 mėnesių amžiaus šuniukų grupės – 71,9 proc. (95% PI 60,23 – 83,57). Tuo tarpu vyresnių nei 6 mėnesiai šunų grupėje parvovirusinio enterito paplitimas siekė 4,6 proc. (95% PI 4,9 -9,69) ir rezultatas laikomas statistiškai reikšmingu (p<0,0001), su z-įverčiu lygiu 7,7.
2 lentelė. Šunų užsikrėtimas parvovirusais pagal amžių.
20
3 lentelė. Šunų užsikrėtimas norovirusais pagal amžių.
Šunų amžiaus
grupė
Tirtų mėginių
Teigiami norovirusui, tarp sergančių šunų
Teigiami norovirusui, tarp sveikų šunų
mėnesiais skaičius skaičius proc. skaičius proc.
Iki 3 mėn. 32 8/31 25,8 0/31 0,0
3-6 mėn. 25 1/23 4,4 0/2 0,0
Vyresni
negu 6 mėn. 65 0/14 0,0 1/51 2,0
Iš viso: 122 9/122 7,4 1/122 0,8
21
6 pav. Norovirusais ir parvovirusais užsikrėtusių šunų skaičiaus kitimo dinamika priklausomai nuo amžiaus, proc..
Iš aukščiau pateikto grafiko matome, kad šunų užsikrėtimas tirtais gastroenteritą sukeliančiais virusais mažėja didėjant gyvūno amžiui. Iki 3 mėnesių šuniukai serga dažniausiai. Parvovirusinė infekcija tirtų šunų populiacijoje pasireiškė dažniau, tačiau abejų infekcijų kitimas priklausomai nuo amžiaus buvo tolygus, kas parodo, kad šioms virusinėms infekcijoms amžius turi įtakos ir gyvūnams augant, susirgimo tikimybė mažėja.
11.8 1.5 0 38.2 22.1 4.4 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Iki 3 mėn. 3-6 mėn. Vyresni negu 6 mėn.
22
7 pav. Šunų norovirusų paplitimas priklausomai nuo amžiaus ir lyties, proc..
Iš pateiktos diagramos (7 pav.) matome, kad daugiausia užsikrėtusių norovirusais buvo jauni, iki 3 mėnesių amžiaus patinai, ir sudarė 50 proc. norovirusinės infekcijos atvejų. Iš viso buvo užsikrėtę 60 proc. patinų ir 40 proc. patelių, iš jų 30 proc. patelių buvo iki 3 mėnesių, o 10 proc. vyresnės negu 6 mėnesiai. Užsikrėtę patinai nebuvo vyresni negu 6 mėnesių amžiaus, tačiau rezultatai nėra statistiškai reikšmingi (p>0,05).
50 10 0 60 30 0 10 40 0 10 20 30 40 50 60 70
Iki 3 mėn. 3-6 mėn. Vyresni negu 6
mėn. Iš viso
23
4 lentelė. Užsikrėtusiųjų parvovirusais šunų pasiskirstymas pagal lytį ir amžių tirtų šunų populiacijoje. Šunų amžiaus grupė Tirtų mėginių skaičius Teigiamos parvovirusams patelės Teigiami parvovirusams patinai
skaičius proc. skaičius proc.
Iki 6 mėn. 32 8 25,0 18 56,3
3-6 mėn. 25 5 20,0 10 40,0
Vyresni negu 6
mėn. 65 1 1,5 2 3,1
Iš viso 122 14 11,5 30 24,6
Iš pateiktos 4 lentelės matome, kad daugiausia parvovirusais buvo užsikrėtę patinai iki 3 mėnesių amžiaus ir sudarė 56,3 proc. tirtos šio amžiaus grupės (95% PI 39,11 - 73,49) ir laikoma statistiškai reikšmingu rezultatu (p<0,05) su z-įverčiu 2,5. Taip pat didelę dalį užsikrėtusių patinų buvo 3-6 mėnesių amžiaus grupėje, kas sudarė 40 proc. nuo visų tirtų šio amžiaus gyvūnų, tačiau nėra statistiškai reikšminga galimai dėl mažos imties (p>0,05).
24
8 pav. Gastroenterito pasireiškimas pagal šunų veislę, proc.
66 proc. tiriamų šunų, kuriems pasireiškė gastroenterito požymiai, sudarė grynaveisliai šunys ir 34 proc. mišrūnai. Paveikslėlyje pastebima, kad gastroenteritas dažniausiai buvo nustatomas vokiečių aviganio veislės šunims (16 proc.), iš kurių 45,45 proc. buvo teigiamas parvoviruso rezultatas.
9 pav. Teigiamų norovirusams šunų pasiskirstymas pagal veislę, proc.
34% 6% 9% 16% 4% 4% 6% 6% 15% Mišrūnas Pekinas Jorkšyro terjeras Vokiečių aviganis Labradoro retriveris Špicas
Vakarų Škotijos terjeras Biglis Kitos veislės 20% 30% 20% 10% 10% 10% Mišrūnas Pekinas
25 Iš pateikto paveikslėlio (10 pav.) matyti, kad didžiausią teigiamų rezultatų dalį sudarė pekino veislės šunys, kas sudarė 30 proc. visų norovirusams teigiamų šunų grupę, rezultatas yra statistiškai reikšmingas (p<0,0001). Yra žinoma, kad tai buvo viena pekino veislės šuniukų vada. Antroje pagal dažnumą vietoje infekcija nustatyta vakarų Škotijos terjerams, kurie sudarė 20 proc. teigiamų atvejų, šuniukai buvo iš vienos vados.
10 pav. Teigiamų parvovirusams šunų pasiskirstymas pagal veislę, proc.
Kaip matome iš pateikto paveikslėlio (10 pav.) parvovirusams teigiamų šunų labiausiai buvo paplitę mišrūnai, jie sudarė net 30 proc. tirtų šunų. Iš veislinių šunų vyraujanti veislė buvo Jorkšyro terjeras, ir jų skaičius sudarė 12 proc. nuo visų tirtų šunų. Antroje vietoje buvo vokiečių aviganio veislės šunys, jie sudarė 11 proc. visų tirtų šunų.
30% 9% 12% 11% 5% 5% 9% 9% 2% 2%2%2% 2% Mišrūnas Pekinas Jorkšyro terjeras Vokiečių aviganis Labradoro retriveris Špicas
26
11 pav. PGR tyrimų rezultatai šunų norovirusų ir parvovirusų atžvilgiu pagal vakcinacijos duomenis, proc.
Iš aukščiau pateikto paveikslėlio (11 pav.) matome, kad tinkamai atlikta vakcinacija padėjo sumažinti teigiamų rezultatų skaičių. Net 95 proc. vakcinuotų šunų nebuvo aptikta nei šunų parvoviruso, nei šunų noroviruso, tuo tarpu net 63 proc. nevakcinuotų šunų ir 80 proc. dalinai vakcinuotų šunų buvo rasta CPV ir/arba CNV. Nevakcinuotų šunų grupę sudarė 49, dalinai vakcinuotų 15, o tinkamai vakcinuotų 58 šunys.
Parvovirusų pasireiškimas nevakcinuotų šunų grupėje buvo žymiai didesnis ir sudarė 61 proc. (95% PI 47,34-74,66), o vakcinuotų šunų tarpe vos 3 proc. (95% PI 0,0-7,39), skirtumas grupėse laikomas statistiškai reikšmingu (p<0,0001) su z-įverčiu lygiu 6,6. Taip pat dalinai vakcinuotų šunų grupėje PCV buvo pasireiškęs 80 proc.(95% PI 59,76-100) atvejų, palyginus su vakcinuotų šunų grupe rezultatas yra statistiškai reikšmingas (p<0,0001) su z-įverčiu lygiu 6,8. Toks rezultatas įrodo tai, kad tinkamai atlikta vakcinacija yra veiksminga kovoje prieš užsikrėtimą parvovirusais.
Šunų norovirusų tyrimo rezultatai buvo teigiami 2 proc. vakcinuotų (95% PI 0,0-5,6), 13 proc. dalinai vakcinuotų ir 14 proc. nevakcinuotų (95% PI 4,28-23,72) šunų tarpe. Vakcinacijos palyginimas vakcinuotų ir nevakcinuotų šunų grupėse laikomas statistiškai reikšmingu (p<0,05) su z-įverčiu lygiu 2,3. 37 20 95 61 80 3 14 13 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Nevakcinuoti Dalinai vakcinuoti Vakcinuoti
Neigiami
27
12 pav. Gastroenteritu sergančių šunų ligos baigtis.
28
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Naujai atrasti šunų norovirusai yra plačiai pasaulyje paplitę virškinamojo trakto ligas sukeliantys patogenai. Pavyzdžiui, Portugalijoje atlikti tyrimai rodo, kad 40 proc. viduriuojančių ir 9 proc. sveikų šunų buvo teigiami šunų norovirusų atžvilgiu (4).
Šis tyrimas taip pat parodė, kad 55 proc. buvo teigiami šunų parvovirusui, iš kurių tuo pačiu metu 31,03 proc. buvo teigiami šunų norovirusams. Mano tyrimo atveju buvo nustatyta mažiau parvovirusų atžvilgiu teigiamų mėginių. Iš to galima daryti prielaidą, gal Lietuvoje parvovirusinio enterito paplitimas yra mažesnis, kas gali byloti apie geresnę ligos prevenciją ir kontrolę. Tuo tarpu norovirusai tarp parvovirusiniu enteritu sergančių šunų yra paplitęs beveik vienodai, skiriasi vos 3 proc. nuo Portugalijoje gauto rezultato (4).
Pagal kitus Portugalijoje atliktus tyrimus, kurių metu buvo ištirti 4 metus rinkti mėginiai iš įvairių šalies rajonų, 23 proc. ištirtų šunų buvo teigiami šunų norovirusui. Padaryta išvada, kad šunų norovirusinė infekcija Portugalijoje yra endeminė (8).
Jungtinėje Karalystėje 2012-2013 metais buvo rinkti šunų išmatų mėginiai ir tuo pat metu kraujo serumas. Ištyrus išmatas PGR metodu šunų norovirusų nustatyta nebuvo, tačiau kraujo serumo tyrimo rezultatai imunofermentinės analizės metodu prieš norovirusų antikūnius buvo teigiami 60,1 proc. atvejų. Tyrimas buvo atliktas ir ištyrus 1999-2001 metais rinktus kraujo serumus, rezultatas buvo teigiamas 38,1 proc. atvejų. Šio tyrimo rezultatai parodo, kad per 13 metų šunų norovirusai Jungtinėje Karalystėje paplito plačiau ir tai laikoma statistiškai patikima (p<0,001). Taip pat tyrimas parodė, kad serologinis paplitimas žymiai padidėja vyresnių šunų grupėje, o taip pat, kad paplitusios kelios šunų norovirusų padermės (45). Kadangi mūsų tyrimo metu šunų norovirusai buvo nustatomi tik išmatų mėginiuose, būtų naudinga atlikti kraujo serumo tyrimus ir sužinoti kokios šių virusų padermės ir kaip plačiai yra paplitusios Lietuvoje.
Mūsų tyrimo rezultatai parodė, kad norovirusai šunų populiacijoje dažnai aptinkami ir Lietuvoje. Iki šiol tokių tyrimų nebuvo atlikta ir ši infekcija veterinarijos gydytojų nepakankamai rimtai vertinama. Nors norovirusų paplitimas, lyginant su parvovirusų infekcija, nėra didelis, tačiau akivaizdu, kad 13,2 proc. atvejų šie virusai gali sukelti gastroenteritą arba komplikuoti jau esančią parvovirusų infekciją. Įdomu tai, kad norovirusai buvo rasti ir sveikų suaugusių šunų fekalijose. Taigi, yra pavojus, kad tokie šunys gali būti infekcijos šaltinis ir kelti pavojų jauniems infekcijai jautriems šuniukams (4).
29 žarnyno infekcinėms ligoms dėl jų imuniteto stiprumo. Tai, kad vakcinuoti nuo parvovirusų šunys nesirgo norovirusiniu enteritu, taip pat galima būtų paaiškinti ir vadinamuoju heterologiniu vakcinų poveikio mechanizmu. Šis fenomenas iki šiol nebuvo pastebėtas ir tirtas veterinarinėje praktikoje, tačiau yra analizuotas žmonių medicinoje (46). Heterologinis vakcinų poveikio efektas pasireiškia tada, kai prieš kitus patogenus panaudota vakcina sukelia imuninį atsaką prieš vakcinoje nesančius sukėlėjus (47). Taip pat atliktų tyrimų metu buvo gautas rezultatas, kad moteriškos lyties atstovių grupėse heterologinis efektas yra stipresnis (48). Šis vakcinų poveikis dar yra žinomas kaip vakcinų nespecifinis efektas, kuris galėjo suveikti ir mūsų tirtų šunų atveju.
Mūsų tyrimų metu pastebėjome, kad gastroenteritu sergančių gyvūnų gaištamumas išlieka pakankamai aukštas ir siekė 20 proc., o ypatingai pavojingas viduriavimas yra mažiems, laiku nevakcinuotiems, šuniukams. Dažniausiai pasitaikanti gastroenterito priežastis yra užkrečiamos infekcinės ligos, dėl kurių suserga ne pavieniai šuniukai, o visa šuniukų vada, o tai didina ekonominius nuostolius. Nors ligų prevencijai plačiai taikomos vakcinacijos priemonės, parvovirusas vis dar buvo labai paplitęs ištirtoje šunų populiacijoje.
Pagal gautus rezultatus matome, kad patinų gaišimas buvo 4 kartus dažnesnis, negu patelių. Taip pat iki 6 mėn. amžiaus grupėse norovirusais buvo dažniau užsikrėtę patinai, tačiau vyresnių šunų grupėje skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05). Vyresni šunys gali būti atsparesni šiai infekcijai dėl stipresnio, jau susiformavusio organizmo rezistentiškumo.
Mūsų tyrimo dėl galimos norovirusinės infekcijos transmisijos nuo šunų žmogui metu, ištyrus bendraisiais norovirusų pradmenimis šunų išmatų mėginius, nebuvo gauta nei vieno teigiamo mėginio. Tuo tarpu Suomijoje atlikti tyrimai, kurių tikslas buvo nustatyti, ar šunys gali būti žmonių norovirusų nešiotojai, parodė, kad 4,3 proc. tirtų šunų buvo teigiami žmonių norovirusų genotipams. Tai reiškia, kad šunys yra nešiotojai ir gali platinti norovirusus ne tik tiesioginiu būdu, bet ir užteršdami aplinką, maistą ar vandenį (7).
Išsamių tyrimų metu, kai 510 šunų kraujo serumo mėginių buvo surinkti 14 Europos šalių ir ištirti dėl IgG antikūnių prieš VI genogrupės norovirusus,buvo nustatyta, kad 36 proc. mėginių buvo seroteigiami. Tačiau mėginiai,surinkti Vengrijoje ir Airijoje, buvo neigiami. Taigi, šis tyrimas parodė, kad VI genogrupės norovirusų paplitimas daugelyje Europos šalių yra pakankamai didelis (49).
30 šunų populiacijose. Ypač didelis pavojus kyla didesnės koncentracijos šunų laikymo vietose, tokiose kaip veislynai, prieglaudos ir šunų parodos. O tai gali sukelti daug ekonominių nuostolių bei šunų gaišimų, ypač jaunų šuniukų populiacijoje.
Nors yra keli straipsniai apie norovirusinės infekcijos protrūkius šunų populiacijose (3,50), tačiau įrodymų nepakanka, kad galima būtų teigti, jog šunų norovirusai yra labai virulentiški, sukeliantys sunkius gastroenteritus. Todėl reikėtų atlikti daugiau tyrimų, kurie galėtų tksliau nustatyti įvairių norovirusų padermių virulentiškumo ir patogenines savybes šunų populiacijose, o taip pat įvertinti šių virusų zoonotinį potencialą.
Mano nuomone šunų norovirusai ateityje gali tapti labai pavojingais, sukelti sunkiai pagydomas ligas. Tai gali įvykti dėl norovirusams būdingų genetinių pokyčių, galinčių atsirasti vykstant taškinėms mutacijoms. Todėl labai svarbu kaip galima greičiau atkreipti veterinarijos gydytojų ir mokslininkų dėmesį į šiuos virusus, ištirti kaip galima daugiau šių virusų savybių bei sukurti tinkamas prevencines priemones. Dar nėra atlikta pakankamai tyrimų įrodančių faktą, kad šunys gali užkrėsti ir sukelti norovirusinę žmonių infekciją, tačiau agal Portugalijoje atliktus tyrimus 22,3 proc. veterinarijos gydytojų yra serologiškai teigiami šunų GVI tipo norovirusų atžvilgiu. Jeigu bus įrodytas šunų zoonotinis potencialas, veterinarijos gydytojai bus įtraukti į padidintos rizikos grupę, todėl vertėtų atlikti kuo daugiau tyrimų šia tema (18).
Pasiūlymai ir rekomendacijos:
1. Esant neaiškiems arba sunkiems šunų enteritų atvejams šunis ištirti papildomai dėl norovirusų. 2. Šunims sergant arba persirgus enteritu atlikti kruopščią patalpų dezinfekciją tinkamomis
dezinfekcinėmis priemonėmis.
3. Laikytis tinkamos vakcinacijos schemų, kadangi taisyklingai atlikta vakcinacija apsaugo ne tik nuo parvovirusinės, bet ir nuo norovirusinės infekcijos, o galimai ir kitų enterito sukėlėjų. 4. Veterinarijos gydyklose infekcinėmis ligomis sergančius gyvūnus gydyti atskiroje patalpoje nuo
31
5. IŠVADOS
1. Pritaikius RT PGR metodą, pirmą kartą Lietuvoje 8,2 proc. šunų klinikiniuose mėginiuose buvo nustatyti šunų norovirusai.
2. PGR metodu nustatyta, kad šunų norovirusų paplitimas sveikų šunų grupėje buvo 1,9 proc., o sergančių šunų grupėje 13,2 proc.
3. Mišri infekcija (norovirusinė ir parvovirusinė) sveikų gyvūnų grupėje pasireiškusi nebuvo, tačiau sergančių gyvūnų grupėje sudarė 11,8 proc. nuo visų gastroenteritų atvejų.
32
PADĖKA
Norėčiau nuoširdžiai padėkoti:
LSMU VA VF Veterinarinės Patobiologijos dėstytojui, baigiamojo darbo vadovui, Profesoriui Algirdui Šalomskui už suteiktą pagalbą, pastabas, įžvalgas ir patarimus rengiant magistro baigiamąjį darbą.
LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto, virusologinių tyrimų laboratorijos vyresniajam mokslo darbuotojui Raimundui Lelešiui už rūpestį, paramą ir suteiktą pagalbą įsisavinant tyrimo metodus.
33
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Martella V, Lorusso E, Decaro N, Elia G, Radogna A, D’Abramo M, Desario C, Cavalli A, Corrente M, Camero M, Germinario CA, Banyai K, Di Martino B, Marsilio F, Carmichael LE, Buonavoglia C: Detection and molecular characterization of a canine norovirus. Emerg Infect Dis 2008, 14:1306–1308.
2. Tse H, Lau SK, Chan WM, Choi GK, Woo PC, Yuen KY: Complete genome sequences of novel canine noroviruses in Hong Kong. J Virol 2012, 86:9531–9532.
3. Ntafis V, Xylouri E, Radogna A, Buonavoglia C, Martella V: Outbreak of canine norovirus infection in young dogs. J ClinMicrobiol 2010, 48:2605–2608.
4. Mesquita JR, Barclay L, Nascimento MS, Vinje J: Novel norovirus in dogs with diarrhea. Emerg Infect Dis 2010, 16:980–982.
5. Harris J, Edmunds W, Pebody R, Brown D, Lopman B. Deaths from Norovirus among the Elderly, England and Wales. Emerg Infect Dis 2008, 14:1546–52.
6. 2015 metų ULAC sergamumo ataskaita [žiūrėta 2016 m. lapkričio 7 d.] Prieiga per internetą http://www.ulac.lt/uploads/downloads/SergamumasUL2015.pdf
7. Summa M, von Bonsdorff CH, Maunula L: Pet dogs–a transmission route for human noroviruses? J Clin Virol 2012, 53:244–247.
8. Mesquita JR, Nascimento MS: Molecular epidemiology of canine norovirus in dogs from Portugal, 2007–2011. BMC Vet Res 2012, 8:107.
9. Mounts AW, Ando T, Koopmans M, Bresee JS, Noel J, et al. Cold weather seasonality of gastroenteritis associated with Norwalk-like viruses. J Infect Dis 2000, 181: Suppl 2S284–S287. 10. Chew FT, Doraisingham S, Ling AE, Kumarasinghe G, Lee BW: Seasonal trends of viral
respiratory tract infections in the tropics. Epidemiol Infect 1998, 121:121–128.
11. Teunis PF, Moe CL, Liu P, et al. Norwalk virus: how infectious is it? J Med Virol 2008, 80:1468– 76.
12. Sykes. E.J. Canine and Feline Infectious Diseases, Saunders, 2014.
13. Li L, Pesavento P, Shan T,Leutenegger C M, Wang C, Delwart E, Viruses in diarrhoeic dogs include novel kobuviruses and sapoviruses. J of General Virology 2011, 92, 2534–2541.
14. Cattoli, G. Genetic characterization of a new astrovirus detectedin dogs suffering from diarrhoea. Vet. Microbiol. 2009, 139, 147–152.
15. Glass RI, Parashar UD, Estes MK: Norovirus gastroenteritis. N Engl J Med 2009, 361:1176–1185. 16. Mesquita JR, Delgado I, Costantini V, et al. Seroprevalence of Canine Norovirus in 14 European
34 17. Jang HK, Tohya Y, Han KY, Kim TJ, Son CS, Mochizuki M. Seroprevalence of canine calicivirus
and canine minute virus in the Republic of Korea. Vet Rec. 2003, 153:150–2.
18. Mesquita et al.: Presence of Antibodies against Genogroup VI Norovirus in Humans. Virology Journal 2013, 10:176.
19. Zheng, D. P., T. Ando, R. L. Fankhauser, R. S. Beard, R. I. Glass, and S. S. Monroe. Norovirus classification and proposed strain nomenclature. J Virology 2006, 346:312-323.
20. Lopman B, Gastanaduy P, Park GW, Hall AJ, Parashar UD, Vinje J: Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr Opin Virol 2012, 2:96–102.
21. Keevil and Warnes: P025: Norovirus inactivation on antimicrobial touch surfaces. Antimicrobial Resistance and Infection Control 2013, 2(Suppl 1):P25
22. Belliot G, Lavaux A, Souihel D, Agnello D, Pothier P: Use of murine norovirus as a surrogate to evaluate resistance of human norovirus to disinfectants. Appl Environ Microbiol 2008, 74:3315-8. 23. La Rosa G, Fontana S, Di Grazia A, Iaconelli M, Pourshaban M, Muscillo M. Molecular
identification and genetic analysis of Norovirus genogroups I and II in water environments: comparative analysis of different reverse transcription-PCR assays. Appl Environ Microbiol. 2007, 73(13):4152–4161.
24. Ambert-Balay K, Pothier P. Evaluation of 4 immunochromatographic tests for rapid detection of norovirus in faecal samples. J Clin Virol. 2013, 56(3):194-8.
25. Truyen U. Evolution of canine parvovirus--a need for new vaccines? Vet Microbiol. 2006, 5;117(1):9-13.
26. Muzyczka, N, Berns, K.I: Parvoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Fields Vorology. 4th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadephia, PA, 2001, pp.2327–2359.
27. Decaro N, Buonavoglia C: Canine parvovirus — A review of epidemiological and diagnostic aspects,with emphasis on type 2c. Vet Microbiol. 2012, 24;155(1):1-12.
28. Nelson RW, Couto CG. Canine parvoviral enteritis. In: Small animal internal medicine. 5th ed. St. Louis, MO : Elsevier/Mosby, 2014, psl. 457-459.
29. Decaro, N., Campolo, M., Desario, C., Elia, G., Martella, V., Lorusso, E.,Buonavoglia, C., Maternally-derived antibodies in pups and protection from canine parvovirus infection. Biologicals 2005, 33,259–265.
35 31. Gizzi AB, Oliveira ST, Leutenegger CM, Estrada M, Kozemjakin DA, Stedile R, Marcondes M, Biondo AW. Presence of infectious agents and co-infections in diarrheic dogs determined with a real-time polymerase chain reaction-based panel. BMC Vet Res. 2014. 16;10:23.
32. Hoskins JD. Update on canine parvoviral enteritis. Vet Med 1997, 92(8):694–709.
33. Tennant B: The alimentary tract. In Manual of Canine and Feline Infectious Diseases. Edited by: Ramsey I, Tennant B. Gloucester: British Small Animal Veterinary Association; 2001, 129-150. 34. Brown AJ, Otto CM. Fluid therapy in vomiting and diarrhea. Vet Clin North Am Small Anim Pract
2008, 38(3):653–675.
35. Tilley LP, Smith FrWK, Blackwell's Five-Minute Veterinary Consult: Canine and Feline, 5th Edition, 2011.
36. Lamm CG, Rezabek GB. Parvovirus infection in domestic companion animals. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2008, 38(4):837–850.
37. Atwell RB, Kelly WR: Canine parvovirus: a cause of chronic myocardial fibrosis and adolescent congestive heart failure. J Small Anim Pract. 2008, 21, 609–620.
38. Siegl G. et al. Characteristics and taxonomy of Parvoviridae.Intervirology 1985. N. 26. P. 61 – 73. 39. Nandi S, Kumar M. Canine parvovirus: current perspective. Indian J Virol. 2010, 21(1):31-44. 40. De Cramer KG, Stylianides E, van Vuuren M. Efficacy of vaccination at 4 and 6 weeks in the
control of canine parvovirus. Vet Microbiol. 2011, 21;149(1-2):126-32.
41. Decaro N, Desario C, Elia G, Martella V, Mari V, Lavazza A, Nardi M, Buonavoglia C. Evidence for immunisation failure in vaccinated adult dogs infected with canine parvovirus type 2c. New Microbiol. 2008, 31(1):125-30.
42. Sykes J. Vaccination regimes for dogs and cats. Veterinary focus. 2012, Vol. 22. P.29-35.
43. Schulz BS, Strauch C, Mueller RS, Eichhorn W, Hartmann K. Comparison of the prevalence of enteric viruses in healthy dogs and those with acute haemorrhagic diarrhoea by electron microscopy. J Small Anim Pract. 2008, 49(2):84-8.
44. Zienius D, Lelešius R, Kavaliauskis H, Stankevičius A, Šalomskas A: Phylogenetic characterization of Canine Parvovirus VP2 partial sequences from symptomatic dogs samples. Polish Journal of Veterinary Sciences. 2016, 187–196.
45. Caddy S, Emmott E, El-Attar L, Mitchell J, de Rougemont A, Brownlie J, Goodfellow I..Serological evidence for multiple strains of canine norovirus in the UK dog population. PLoS One. 2013, 8:e81596.
36 47. Goodridge HS, Ahmed SS, Curtis N, Kollmann TR, Levy O, Netea MG, Pollard AJ, van Crevel R, Wilson CB8: Harnessing the beneficial heterologous effects of vaccination. Nat Rev Immunol. 2016, 16(6):392-400.
48. Flanagan KL, van Crevel R, Curtis N, Shann F, Levy O: Heterologous ("nonspecific") and sex-differential effects of vaccines: epidemiology, clinical trials, and emerging immunologic mechanisms. Clin Infect Dis. 2013, 57(2):283-9.
49. Mesquita JR, Delgado I, Costantini V, et al. Seroprevalence of Canine Norovirus in 14 European Countries. Waters WR, ed. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 2014, 21(6):898-900.
