LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Virginija Ţilionytė
Unikalių KRKSV padermių molekulinė diagnostika
šernų ir kiaulių patologiniuose mėginiuose
Molecular diagnostic of unique PRRSV strains in wild
boars and pigs pathological samples
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Doc. dr. Arūnas Stankevičius
2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ,,Unikalių KRKSV padermių molekulinė diagnostika šernų ir kiaulių patologiniuose mėginiuose“.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3 TURINYS SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA ... 8 SUMMARY ... 9 ĮVADAS ... 10 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 13 1.1. KRKSV genotipai ... 13 1.2. Viruso struktūra ... 13 1.3. Imuninis atsakas ... 14 1.4. Epidemiologija ... 16
1.5. KRKS patogenezė, klinikiniai poţymiai ir patologiniai pokyčiai ... 17
1.5.1. Patogenezė ir klinikiniai poţymiai ... 17
1.5.2. Patologiniai pokyčiai ... 18
1.6. Viruso diagnostika ... 19
1.7. Molekuliniai viruso tyrimo metodai ... 20
2. TYRIMŲ MEDŢIAGOS IR METODAI ... 25
2.1. Tyrimų vieta ir objektai ... 25
2.2. RNR išskyrimas ... 27
2.3. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija ... 27
2.4. Lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija... 29
2.5. Elektroforezė ir lizdinės AT-PGR vizualizacija ... 30
2.6. Komplimentarios DNR gavimas ... 30
2.7. Realaus laiko TaqMan atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija ... 31
2.8. Statistinis duomenų analizė ... 32
3.TYRIMŲ REZULTATAI ... 33
4 3.1.2. KRKSV diagnostikoje naudojamų realaus laiko TaqMan AT-PGR oligonukleotidinių
pradmenų tinkamumas ir specifiškumas ... 34
3.1.3. Neigiamos kontrolės tyrimas ... 39
3.2. KRKSV nustatymo patologiniuose mėginių lizdine AT-PGR rezultatai ... 39
3.3.KRKSV nustatymo patologiniuose mėginiuose realaus laiko TaqMan AT-PGR rezultatai ... 42
3.4. KRKSV paplitimas tarp Lietuvos šernų ir kiaulių ... 47
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 50
IŠVADOS ... 53
REKOMENDACIJOS ... 54
PADĖKA ... 55
5 SANTRUMPOS
A – adeninas
AT – atvirkštinė transkripcija
AT-PGR – atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija bp – bazių poros
C – citozinas
C (°C) – Celsijaus laipnis CPE – citopatinis efektas
Ct – (ang. cycle time) – ciklo laikas, PGR produkto susidarymo ciklas CTL – citotoksiniai T-limfocitai
DNR – deoksiribonukleorūgštis
DP-KRKSV – didelio patogeniškumo kiaulių reprodukcinio ir kvėpavimo sindromo virusas DTT – ditiotreitolas
E – apvalkalėtasis proteinas
EAV – (ang. Equine Arterivirus) – arklių Arterivirus virusas
ELISA – (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) – imunofermentinė analizė EU – Europa/os, europietiškas/a
G – guaninas GP – glikoproteinas
GP5-M – glikoproteino ir membranos kompleksas
I – degeneruoto pradmens nukleobazės (adeninas, guaninas, timinas) Y – degeneruoto pradmens nukleobazės (citozinas, timinas)
IFA – imunofermentinė reakcija IL – interleukinas
INF – interferonas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos kb – kilobazė
KCV2 – kiaulių cirko virusas 2 tipas kDa – kilodaltonai
kDNR – komplimentari deoksiribonukleorūgštis KKM – Klasikinis kiaulių maras
6 KRKSV – kiaulių reprodukcinio ir kvėpavimo sindromo virusas
KRKSV-1 – kiaulių reprodukcinio ir kvėpavimo sindromo viruso 1 genotipas KRKSV-2 – kiaulių reprodukcinio ir kvėpavimo sindromo viruso 2 genotipas LDV – laktatdehidrogenazės virusas
LV – Lelystad virusas
MARC-145 – (ang. monkey kidney cells) – Afrikos ţaliosios beţdţionės inkstų ląstelės mg – miligramai
min – minutė, minutės ml – mililitras
mRNR – matricinė ribonukleininė rūgštis N – nukleokapsidės proteinas
NK – (ang. natural killers) – natūraliai ţudanti ląstelė nsp – nestruktūriniai proteinai
ORF – (ang. open reading frame) – atviras nuskaitymo rėmelis nukleotidų grandinėje p – patikimumas
PAM – (ang. porcine alveolar macrophages) – kiaulių alveoliniai makrofagai
PEE – (ang. porcine endometrial endothelial) – kiaulių endometriumo/embriono placentos endotelio ląstelės
pg - pikogramai
PGR – polimerazės grandininė reakcija PI – pasikliautinasis intervalas
pi – po inokuliavimo/infekavimo pmol – pikomoliai
PRRS – (ang. porcine reproductive and respiratory syndrome) – kiaulių reprodukcinis ir kvėpavimo sindromas
PRRSV – (ang. porcine reproductive and respiratory syndrome virus) - kiaulių reprodukcinio ir kvėpavimo sindromo virusas
R – degeneruoto pradmens nukleobazės (adeninas, guaninas) R-nazė – ribonukleazė
RNR – ribonukleininė rūgštis RP-S20 – ribosomų proteinas S20 s – sekundė, sekundės
7 T – timinas
TaqMan – kiekybinė polimerazės grandininė reakcija
TBE – Tris – boro – EDTA buferis
TCID – (ang. tissue culture infectious dose) – audinių kultūros infekcinė dozė TE – Tris – EDTA buferis
TLR – tarpinis signalo perdavimo kelias
TNF – (ang. tumor necrosis factor) – navikų nekrozės faktorius tūks. aps. – tūkstantis apsisukimų
U – uracilas
US – Amerika/os, amerikietiškas/a UV – utravioletiniai spinduliai V – voltas
8 SANTRAUKA
Darbo tikslas: įvertinti molekulinių metodų tinkamumą Lietuvoje atrastų unikalių ir labai skirtingų KRKSV padermių diagnostikai.
Siekiant įvertinti molekulinių metodų tinkamumą KRKSV padermių diagnostikai, lizdine ir realaus laiko TaqMan AT-PGR buvo ištirtos referentinės KRKSV padermės (Lelystad, Hesse) ir 285 šernų (n=238) ir kiaulių (n=47) patologinės medţiagos mėginiai, surinkti iš įvairių Lietuvos rajonių, KRKSV atţvilgiu su devyniais skirtingais oligonukleotidiniais pradmenimis ir zondais.
Atlikus tyrimą nustatyta, kad daugiausiai lizdine AT-PGR KRKSV teigiamų mėginių buvo nustatyta su ORF 1-3/ORF 1-4 oligonukleotidiniais pradmenimis – 96 (80 šernų, 16 kiaulių) patologinės medţiagos mėginiai arba 33,68 % (95 % PI 28,19 – 39,17).
Realaus laiko TaqMan AT-PGR daugiausiai europietiško genotipo KRKSV atţvilgiu teigiamų patologinės medţiagos mėginių nustatyta su EU6 – 343F/EU – 462R oligonukleotidiniais pradmenimis ir EU6 – MGB zondu – 130 (106 šernų, 24 kiaulių) mėginių arba 45,61 % (95 % PI 39,83 – 51,39).
Kiaulių KRKSV diagnostikai skirtus lizdinės AT-PGR ORF1 srities oligonukleotidinius pradmenis galima panaudoti 3-ojo ir 4-ojo subtipo KRKSV padermėms, paplitusioms Lietuvos šernų populiacijoje, diagnozuoti, nes jų pagalba pavyko identifikuoti 22,46 % daugiau KRKSV atţvilgiu teigiamų šernų mėginių nei kiaulių (p<0,001).
Geriausi rezultatai TaqMan AT-PGR buvo gauti, naudojant ORF6 srities EU6 – 343F/EU6 – 462R oligonukleotidinius pradmenis ir EU6-MGB zondą, kurie leido nustatyti 28,77 % daugiau KRKSV atţvilgiu teigiamų šernų nei kiaulių mėginių, lyginant su kitoms sritims komplementariais oligonukleotidiniais pradmenimis ir zondais (p<0,001).
Ištyrus patologinius mėginius su devyniais skirtingais oligonukleotidiniais pradmenimis ir zondais lizdine AT-PGR ir TaqMan AT-PGR didţiausias KRKSV infekcijos paplitimas Lietuvos šernų populiacijose nustatytas – Kėdainių (7,72 %), Alytaus (4,56 %), Kaišiadorių (2,81 %) ir Vilkaviškio (2,11 %) rajonuose, o daugiausiai KRKSV atţvilgiu teigiamų kiaulių identifikuota Švenčionių (2,85 %), Birţų (1,75 %), Raseinių (1,75 %) ir Šilutės (1,40 %) rajonuose.
9 SUMMARY
The main aim of the Master„s thesis: to assess the appropriateness of the methods of molecular for in Lithuania discovered unique and very different PRRSV strains diagnostics.
In order to assess the appropriateness of the methods of molecular for strains of PRRSV diagnostic, the reference strains of PRRSV (Lelystad, Hesse) and 285 wild boars (n=238) and pigs (n=47) pathological material samples, which have been collected from different Lithuanian districts, were investigated nested and real time TaqMan RT-PCR in respect of PRRSV with nine different oligonucleotide primers and probes.
The investigation showed that after nested RT-PCR the largest number in respect of PRRSV positive samples were determinated with ORF 1-3/ORF 1-4 oligonucleotide primers – 96 (80 wild boars, 16 pigs) pathological material samples or 33,68 % (95 % CI 28,19 to 39,17).
Real time TaqMan RT-PCR the largest number in respect of an European PRRSV genotype positive pathological material samples were determinated with EU6 – 343F/EU – 462R oligonucleotide primers and EU6 – MGB probe – 130 (106 wild boars, 24 pigs) samples or 45,61 % (95 % CI 39,83 to 51,39).
The ORF1 field oligonucleotide primers, which have been used in nested RT-PCR for the diagnostic of PRRSV in pigs samples, can be used in the 3rd and 4th subtype diagnosis of PRRSV strains, which have been identificated in Lithuanian wild boars populations, as they have led to identificate 22,46% more wild boars than pigs in respect of PRRSV positive samples (p <0.001 ).
The best results of the TaqMan RT-PCR have been got by using ORF6 field EU6 - 343F / EU6 - 462R oligonucleotide primers and EU6-MGB probes, which helped to determine the 28,77% more wild boar than pigs in respect of PRRSV positive samples, compared with other areas of complementation of oligonucleotide primers and probes (p <0.001).
The examination of pathological samples with 9 different oligonucleotide primers and probes nested RT-PCR and TaqMan RT-PCR showed that the largest prevalence of PRRSV in wild boars population was in Kėdainiai (7,72 %), Alytus (4,56 %), Kaišiadoriai (2,81 %) and Vilkaviškis (2,11 %) districts, meanwhile, the largest percentage of PRRSV positive pigs were identificated in Švenčionys (2,85 %), Birţai (1,75 %), Raseiniai (1,75 %) and Šilutė (1,40 %) districts.
10 ĮVADAS
Kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromas (KRKS) yra sukeltas Arterivirus, KRKS viruso (KRKSV) (King et al., 2012), priklausančio Arteriviridae šeimai, turinčio viengubą, teigiamą, superkapsidės apsuptą, 15 – 15,5 kilobazių RNR genomą, kurį sudaro maţiausiai 10 atvirų nuskaitymo rėmelių (Van Hemert et al., 2008). KRKS, kuris charakterizuojamas reprodukcijos sutrikimais, intersticine pneumonija ir silpnais paršeliais, yra vienas iš svarbiausių susirgimų, nešantis didelius ekonominius nuostolius ir paveikiantis kiaulių veisimo pramonę labiausiai kiaulininkyste uţsiimančiose šalyse. Dėl padidėjusio gaištamumo, gydymo išlaidų, sumaţėjusio kiaulių priesvorio ir vaisingumo (Neumann et al., 2005), KRKSV patiriamos išlaidos kiaulių pramonėje siekia 641 milijonus Jungtinių Amerikos Valstijų dolerių per metus JAV (Velasova et al., 2012). Neumann et al. (2005) apskaičiavo, kad iš KRKS išlaidų, patiriamų JAV kiaulių augintojams, sudaro: 250 milijonų JAV dolerių (45 %) sumaţėjęs vidutinis dienos priesvoris ir pašarų sąnaudos auginamoms kiaulėms, 243 milijonus JAV dolerių (43 %) lėmė auginamų kiaulių gaištamumas, 63 milijonus JAV dolerių (12 %) reprodukcijos sutrikimai. Ekonominis poveikis ūmaus KRKSV protrūkio veislinėse bandose buvo apskaičiuotas 255 JAV doleriais uţ paršavedę ir nuo 6,25 iki 15,25 JAV dolerių uţ augantį paršelį (Holck, Polson, 2003). Patiriami padariniai leidţia manyti, kad KRKSV kelia rimtą grėsmę kiaulių pramonei visame pasaulyje (Neumann et al., 2005).
Tiek naminės kiaulės (Sus scrofa domesticus), tiek ir šernai (Sus scrofa), yra vienintelės ţinomos gyvūnų rūšys, kurios yra natūraliai jautrios KRKSV (prieiga per internetą < http://www.animalhealthaustralia.com.au/wpcontent/uploads/2011/04/prrs3final.pdf> [ţiūrėta 2014.10.10]). Šernai yra rezervuaras daugelio virusų (hepatito E, Auješkio ligos, kiaulių cirko 2 tipo, Japoniškojo encefalito, klasikinio kiaulių maro, Afrikinio kiaulių maro, kiaulių parvoviruso, kiaulių reprodukcinio ir kvėpavimo sindromo, kiaulių gripo), bakterijų (Mycobacterium bovis,
Brucella spp., Coxiela burnetii, Yersinia pestis, Leptospira interrogans) ir parazitų (Trichinella
spp., Toxoplasma gondii), kurie sukelia svarbias ligas naminiams gyvūnams ir ţmonėms (Ruiz-Fons et al., 2008; Meng et al., 2009), tačiau duomenų apie KRKSV paplitimą šernų populiacijose mokslinėse publikacijose yra paskelbta maţai. Šernų populiacija ir migracija labai varijuoja priklausomai nuo lokalizacijos (Sarasa, Sarasa, 2013), prieglobsčio paieškos, maisto buvimo ir socialinio elgesio, o šernų skaičius sąlygoja jų vaidmenį ligų epidemiologijoje (Vicente et al., 2005).
11 ir Šiaurės Amerikoje (Drigo et al., 2014), dabar abu genotipai, su skirtingu paplitimu, yra pasiskirstę visame pasaulyje (Shi et al., 2010). Vykstant viruso replikacijai yra didelė tikimybė įvykti mutacijoms ir rekombinacijoms (Gorbalenya et al., 2006). Didelė viruso įvairovė nustatyta JAV (Fang et al., 2007), Kinijoje (Li et al., 2009), Ispanijoje (Prieto et al., 2009) ir rytų Europoje (Stadejek et al., 2008). Viruso įvairovė iššaukia tikslios diagnostikos ir sėkmingos imunizacijos problemas (Labarque et al., 2004). Sukėlėjo identifikavimas yra svarbiausias dalykas, siekiant kontroliuoti virusinę ligą (Murtaugh et al., 2011). Daţniausiai KRKSV laboratorinė diagnostika paremta antikūnių prieš KRKSV nustatymu. Tačiau serologiniai metodai turi maţą specifiškumą ir/ar jautrumą, atsiţvelgiant į tai, šie metodai negali charakterizuoti dviejų genotipų KRKSV padermių (Yang et al., 2013). Norint diagnozuoti ir diferencijuoti amerikietišką ir europietišką KRKSV genotipą naudojama polimerazės grandininė reakcija.
Mokslinėse publikacijose pateikiami įvairūs KRKSV padermių molekuliniam charakterizavimui, filogenetiniai analizei PGR metodai, kurių pagrindas yra AT-PGR, kuria galima diagnozuoti ir diferencijuoti KRKSV-1 bei KRKSV-2 genotipus. Tačiau dėl didelio KRKSV genetinio kintamumo AT-PGR publikacijose aprašyti metodai, sąlygos ir oligonukleotidiniai pradmenys įvairiose šalyse skiriasi. O dauguma tyrimuose naudojamų oligonukleotidinių pradmenų buvo išbandyti su eksperimentiškai infekuotų kiaulių mėginiais ar ląstelių kultūromis, todėl nėra pakankamai informacijos apie šių pradmenų tinkamumą KRKSV identifikavimui šernų populiacijoje. Ypač sudėtinga ir maţai tyrinėta sritis yra labai skirtingos ir unikalios KRKSV padermės, paplitusios Rytų Europoje. Lietuvoje atrastų KRKSV padermių diagnostika nėra analizuota ir įvertinta molekuliniais tyrimais, nėra aiškūs optimaliausi oligonukleotidiniai pradmenys. Atsiţvelgiant į tai, siekiant atrinkti Lietuvoje paplitusių KRKSV padermių diagnostikai tinkamiausius ir jautriausius molekulinius metodus, buvo atlikti šie tyrimai, kurie papildė ţinias apie šią infekciją.
Darbo tikslas – įvertinti molekulinių metodų tinkamumą Lietuvoje atrastų unikalių ir labai skirtingų KRKSV padermių diagnostikai.
Darbo uţdaviniai:
12 2. Lizdine AT-PGR įvertinti komplementarių ORF1, ORF5, ORF7 sričiai oligonukleotidinių pradmenų tinkamumą, diagnozuojant genetiškai labai skirtingas KRKSV padermes patologiniuose šernų ir kiaulių mėginiuose.
3. Įvertinti realaus laiko TaqMan AT-PGR oligonukleotinių pradmenų ir zondų tinkamumą KRKSV diagnostikai šernų ir kiaulių plaučių bei kraujo serumo mėginiuose.
4. Palyginti skirtingų lizdinės AT-PGR ir realaus laiko TaqMan AT-PGR oligonukleotidinių pradmenų ir zondų jautrumą, nustatant KRKSV unikalias padermes šernų ir kiaulių plaučių ir kraujo serumo mėginiuose.
5. Nustatyti KRKSV paplitimą Lietuvos šernų ir kiaulių populiacijose lizdine AT-PGR ir
13 1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. KRKSV genotipai
Identifikuoti du KRKSV genotipai: Europos arba 1 tipo genotipas, kurio prototipas yra
Lelystad virusas ir Šiaurės Amerikos arba 2 tipo genotipas, kurio prototipas yra referentinė padermė
VR-2332 (Gómez-Laguna et al., 2013). Abu viruso genotipai sukelia panašius klinikinius poţymius – reprodukcinius sutrikimus paršavedėms, kvėpavimo sistemos paţeidimus ir imunosupresiją paršeliams, bei padidina naujagimių, atjunkomų ir penimų paršelių gaištamumą (Zimmerman et al., 2012), tačiau abu genotipai apytiksliai tik 60% yra homologiški, tai yra, identifikuota 50 – 70 % bendrų nukleotidų ir 50 – 80 % bendrų amino rūgščių (Shi et al., 2010). Buvo nustatytas didelis ir progresuojančiai didėjantis genetinis kintamumas – nukleotidų įvairumas Europos (15 %) ir Amerikos (12,5 %) genotipuose (Cho, Dee, 2006; Shi et al., 2010; Shi et al., 2010a).
Iš pradţių buvo manoma, kad KRKSV-1 genetiškai homogeniškas, bet studijos, atliktos Lietuvoje, Baltarusijoje, Rusijos Federacijoje ir Italijoje, parodė KRKSV-1 įvairovę (Pesente et al., 2006; Stadejek et al., 2002, 2006, 2008; Stankevičius et al., 2008, 2009). Baltarusijoje, Lietuvoje ir Rusijoje viruso įvairovė gali siekti 18,2 % ir 12,0 %, atitinkamai, ORF5 ir ORF7 regionuose (Stadejek et al., 2006). Lietuvos, Baltarusijos ir Rusijos šalyse tirtų mėginių sekoskaitos analizės
metu buvo nustatyti keturi skirtingi subtipai, priklausantys Europos genotipui (Stadejek et al., 2002). Remiantis ORF5 ir ORF7 sekomis, 1 subtipas, kurio prototipas Lelystad virusas, vyraujantis vakarų ir rytų Europoje, bei Rusijoje, 2 subtipas – Rusijoje, Lietuvoje ir Baltarusijoje, 3 subtipas – Baltarusijoje (Stadejek et al., 2008). Šeši Lietuvos šernai, atlikus ORF5 sekoskaitą buvo priskirti 3 subtipui, kartu su padermėmis iš Baltarusijos naminių kiaulių (Stankevicius et al., 2012). Šie atradimai cirkuliuojančio laukinio tipo KRKSV padermių šernuose skiriasi nuo tų, kurie cirkuliuoja intensyvios kiaulininkystės fermose (Rodriguez-Prieto et al., 2013). KRKSV-1 tipo įvairovei turi būti naudojama klasifikavimo sistema skirtingiems virusams su skirtingomis genetinėmis ir antigeninėmis savybėmis, kurios gali būti naudingos ir panaudojamos ligos kontrolei ir diagnostikos praktikai (Stadejek et al., 2008).
Literatūros analizė parodė, kad didelis genetinis KRKSV kintamumas apsunkina molekulinę šio viruso diagnostiką.
1.2. Viruso struktūra
14
kurie yra kiti Arterivirus EAV šeimininkai (Murtaugh et al., 2010). KRKSV yra apvalkalėtasis, teigiamo jautrumo, viengubas RNR Arterivirus virusas, kurio 15,4 kb genomas koduoja maţiausiai 10 atvirų nuskaitymo rėmelių (ORF) (Dokland, 2010), ir kuris priklauso Arteriviridae šeimai,
Nidovirales būriui (Zimmerman et al., 2012). KRKSV susideda iš trijų didelių proteinų:
glikoproteino 5, matricos proteino ir nukleokapsidės proteino, bei trijų maţų proteinų: glikoproteino 2a, 4, E (Wu et al., 2001). N proteinas yra polimeras, supantis viruso genomą. N yra imunogeniškiausias viruso proteinas, bet antikūniai prieš N nėra neultralizuojantys ir neapsauginiai (Murtaugh et al., 2002). N proteinas, sudarytas iš 123–128 amino rūgščių, sąveikauja su viruso RNR ir suformuoja viruso nukleokapsidę. N yra ORF7 produktas, kuris išskirtas iš maţiausios subgenominio mRNR (mRNR7), ir yra daţniausiai išskiriamas virusinis proteinas iš infekuotų ląstelių (Dea et al., 2000). Anksčiausias ir stipriausias antikūnių atsakas yra prieš N proteiną. Ir priešingai, prieš didţiausią paviršiaus komponentą GP5-M heterodimerą, antikūnių atsakas yra silpnas ir pavėluotas (Chand et al., 2012). Viruso paviršiuje dominuoja GP5 disulfidas, susijungęs su matriksos proteinu. Paviršiuje yra trys glikoproteinai: GP2, GP3, GP4, bei papildomi apvalkalo proteinai E ir ORF5a (Johnson et al., 2011; Firth et al., 2011). Išanalizavus ORF5 (GP5) nukleotidų seką nustatyta, kad 2 tipo virusas gali būti padalintas maţiausiai į devynias skirtingas grupes ar kilmės linijas (Shi et al., 2010). Visa RNR (mRNR1) buvo panaudota transliuoti du atvirus nuskaitymui rėmelius ORF1a ir ORF1b (Dokland, 2010). ORF2-5 koduoja glikozilinti membranos proteinai GP2 – GP5, ORF6 koduoja neglikozilinti membranos proteinai M, ir ORF7 koduoja nukleokapsidės (N) proteinas (Dea et al., 2000; Snijder, Meulenberg, 1998). Didţiausi ir labiausiai konservatyvūs yra ORF1a ir 1b, kurie koduoja viruso RNR polimerazę, ir ORF7, kuris koduoja nukleokapsidės proteiną. ORF5, koduojantis viruso apvalkalo proteiną, parodo antigeninį kintamumą, kurio dėka galima išvengti imuninės sistemos poveikio (Lunney et al. 2010). Įdomu tai, kad stiprus antikūnių atsakas yra prieš nestruktūrinius proteinus (nsp), tokius kaip nsp2. Nsp2 nėra viriono komponentas ir yra randamas tik infekuotose ląstelėse. Silpno atsako prieš GP5 yra susijęs su N-glikozilinimo jungtimis, kurios identifikuojamos kaip peptido seka N (X) S/T (Chand et al., 2012). N2P2 yra didelis, įvairaus dydţio nuo 1168 iki 1196, priklausomai nuo skirtingų KRKSV padermių (Allende et al., 1999; Fang et al., 2004; Nelsen et al., 1999; Ropp et al., 2004). Tai yra labiausiai kintantis nestruktūrinis baltymas, tik 32 % tapatumas būdingas potipiams (Allende et al., 1999).
1.3. Imuninis atsakas
15 INF-β), TNF-α ir interleukinas-1 (Van Reeth et al., 1999; Thanawongnuwech et al., 2001). Kiaulės su aiškia KRKSV infekcija koordinuoja ankstyvą ekspresiją IL-1β, IL-8 ir INF-g (Lunney et al., 2010a). Reikšminga citokinų grupė – interferonai (INF-α, INF-γ) yra nustatyti kaip komponentai imuninio atsako ir yra pirma gynybinė linija prieš viruso infekciją (Sadler et al., 2008). KRKSV infekcija charakterizuojama uţdelstu neultralizuojančių antikūnių pasirodymu ir specifinių interferonų atsaku. Penki iš 13 nsps buvo nustatyti kaip slopintojai INF-β aktyvatoriaus aktyvacijos (Beura et al., 2010). Stipriausias inhibitorius INF-β buvo nsp1β, kuris perkelia branduolį ir slopina TLR-3 tarpinį signalo perdavimo kelią (Beura et al., 2010), bei TNF-α aktyvatoriaus aktyvaciją (Subramaniam et al., 2009). Nsp2 nėra reikalingas KRKSV replikacijai, bet taip pat maţina IL-1β ir TNF-α (Chen et al., 2010). Ankstyvas citokinų produkcijos slopinimas makrofaguose ir dendritinėse ląstelėse sukelia silpną imuninį atsaką, uţdelstus neultralizuojančius antikūnius, lėtą INF-γ atsaką ir sumaţėjusį citotoksinį T ląstelių atsaką (Costers et al., 2009). Po infekcijos, dauguma antikūnių nėra neultralizuojantys ir pagrindiniai jų taikiniai yra N ir nsp2 proteinai. T ląstelių atsakas KRKSV stebimas 2-8 savaitę po infekcijos (Bautista, Molitor, 1997; Xiao et al., 2004) ir yra nustatomi prieš visus struktūrinius proteinus, koduojamus ORF 2-7 (Bautista et al., 1999).
16 Mokslinėse publikacijose teigiama, kad KRKSV yra sudėtingos sandaros, o struktūros komponentai skirtingai ir savitai paveikia imuninį atsaką, todėl KRKSV kontrolė vakcinomis yra problematiška, nes vakcinacija paskatina tik dalinio imuniteto formavimąsi.
1.4. Epidemiologija
Eksperimentiškai nustatyta, jog inkubacinis periodas svyruoja tarp 4 – 8 dienų, bet esant natūraliam protrūkiui gali būti 3 – 37 dienų (prieiga per internetą < http://www.animalhealthaustralia.com.au/wp-content/uploads/2011/04/prrs3final.pdf> [ţiūrėta 2014.10.10]). Kiaulės gali atrodyti atsparios virusinei infekcijai, tačiau iš tikrųjų virusas replikuoja ir vystosi tolerancija virusinei patologijai, kurios padarinys – kiaulės, tapusios virusų šaltiniu, platinančios virusą bandoje. Virusinė tolerancija yra sudėtinga savybė, apimanti daugelį genų, įskaitant ir tuos, kurie apima augimą ir imuninį atsaką (Doeschl – Wilson et al., 2009). KRKSV persistencija vaidina reikšmingą vaidmenį KRKSV perdavime ir platinime kiaulių populiacijoje (Corzo et al., 2010). Amţius, ankstesnės infekcijos, vakcinacijos, šėrimo planai, stresas, reprodukcinė būsena, išorinė aplinka gali keisti sąveiką tarp kiaulių ir KRKSV (Batista et al., 2004). KRKSV perdavimo tikimybė didėja su didelėmis bandomis ir populiacijos tankiu (Mortensen et al., 2002). KRKSV gali būti perduodamas tiesiogiai ir netiesiogiai (Corzo et al., 2010). Uţsikrėtusios kiaulės išskiria virusą su visais sekretais ir ekskretais, ir jie yra didţiausias infekcijos šaltinis (Cho and Dee, 2006). Virusas išskiriamas su seilėmis (6 savaites), šlapimu (2 savaites), sperma (6 savaites) ir pienu laktacijos metu. Perduodamas per kvėpavimo takus, virškinimo traktą, placentą, kopuliacijos metu, dirbtinio sėklinimo metu, kiaulių įkandimų metu (Zimmerman et al. 2006). Netiesioginis perdavimo kelias apima uţkrėstus batus ir darbo drabuţius (Otake et al., 2002a), adatas (Otake et al., 2002b), uodus (Otake et al., 2002c), muses (Otake et al., 2003), transporto priemones (Dee et al., 2004) ir aerozolius (Otake et al., 2002; Pitkin et al., 2009). Dee et al. (2009) ir Otake et al. (2010) pranešė apie KRKSV nustatymą ir izoliavimą aerozoliuose 4,7 ir 9,2 km atstumu, nurodant bioaerozolių svarbą regionų kontrolės programose.
17 Apibendrinus mokslines publikacijas, galima teigti, kad KRKSV gali būti perduodamas įvairiais būdais, o viruso perdavime, platinime svarbų vaidmenį vaidina ne tik kiaulės ar apyvokos daiktai, bet ir šernai, tačiau KRKSV infekcija šernų tarpe Europoje maţai tyrinėta.
1.5. KRKS patogenezė, klinikiniai poţymiai ir patologiniai pokyčiai 1.5.1. Patogenezė ir klinikiniai poţymiai
Uţsikrėtus, KRKSV patenka į plaučių makrofagus, juose dauginasi, o vėliau makrofagus suardo, sunaikina, todėl atveriamas kelias kitiems mikroorganizmams. Per 12 valandų nuo uţsikrėtimo, virusas patenka į limfinius mazgus, kraują (OIE, 2008). Kiaulių sergamumas paprastai yra 50 – 100 %, kai tuo tarpu ţindukliams paršeliams gaištamumas yra 100 %, nujunkytiems paršeliams – 70 %, suaugusioms kiaulėms – 20 %. Daugiau kaip 40 % paršingų kiaulių, uţsikrėtusių KRKSV, įvyksta abortai, o gaištamumas tokių kiaulių yra 10 % (Zhou et al., 2010).
18 visiems uţkrėstiems KRKSV paršeliams klinikiniai poţymiai pasireiškė 1 – 3 dieną po uţkrėtimo, įskaitant sumaţėjusį apetitą, apatiškumą ir karščiavimą. Viremija pasireiškė visiems paršeliams 3 dieną pi ir maksimumą pasiekė 10 dieną pi. Antikūnių titro padidėjimas buvo stebimas 14 dieną pi visiems paršeliams, o maksimumą pasiekė 17 dieną pi. Reikšmingas poţymis buvo kūno temperatūros pakilimas (41 – 42 °C) visiems paršeliams jau nuo 1 iki 15 dienos pi, o didţiausia temperatūra buvo stebima 1 – 3 ir 7 – 9 dienomis pi. Tyrimo metu apetito sumaţėjimas ir/ar diarėja pasireiškė sporadiškai 7 – 18 dieną pi. Nebuvo pastebėtas reikšmingas svorio priaugimo skirtumas tarp kontrolinės ir tiriamosios grupės. Uţkrėstiems KRKSV paršeliams kosulys pasireiškė 1 – 21 dieną pi, bet labiausiai 13 – 15 dieną, o dusulys pasireiškė 10 – 21 dieną pi, o intensyviausias buvo 16 – 18 dienomis pi. Taip pat paršeliams pasireiškė padidėjęs kvėpavimo daţnis. Trus et al. (2014) tyrimo metu visiems uţkrėstiems paršeliams (keturių savaičių amţiaus) pakilusi kūno temperatūra (41 – 42 °C) buvo stebima nuo 1 iki 14 dienos po uţkrėtimo, o maksimumą pasiekė 5 dieną po uţkrėtimo. Viremija pasireiškė trečią dieną po uţkrėtimo, o antikūnių titras didţiausias buvo 14 dieną po uţkrėtimo. Jiang et al. (2013) nustatė, kad be šių klinikinių poţymių uţkrėstiems paršeliams yra ir kiti simptomai: čiaudėjimas, konjuktyvitas, ištakos iš akių, vidurių uţkietėjimas, drebulys, traukuliai, cianozė (mėlynos ausys), svorio netekimas, odos eritema, hemoragijos.
1.5.2. Patologiniai pokyčiai
Wagner et al. (2011), atlikę infekuotų paršelių lavonų skrodimą nustatė intersticinę pneumoniją ir limfinių mazgų hiperplazija. Plaučių paţeidimai buvo daţnesni ir ryškesni priekinėse plaučių skiltyse. Zhou et al. (2010), su kitais virusiniais patogenais ar kartu su antrine bakterine infekcija buvo nustatytos ţidininės hemoraginės dėmės, abscesai, hemoraginė pneumonija, perikarditas, fibrininė pleuropneumonija, peritonitas.
Paršeliams, kurie buvo uţkrėsti DP – KRKSV arba kontaktavę su DP – KRKSV uţsikrėtusiomis kiaulėmis, atliekant skrodimą buvo nustatyta: intersticinė pneumonija, plaučių edema, plaučių hemoragijos, pleuritas, hidrotoraksas, ascitas, hidroperikardiumas, miokardo nekrozė, miokarditas, hemoragijos širdyje, limfodenopatija, uţkrūčio liaukos atrofija, petechijos inkstuose, fibrininis peritonitas, o paršeliams, kurie buvo uţkrėsti amerikietišku viruso genotipu VR-2332 buvo nustatyta tik intersticinė pneumonija ir limfodenopatija (Guo et al., 2013).
Histologiškai tiriant plaučių paţeidimus, stebima intersticinė pneumonija su dideliu kiekiu makrofagų alveolių pertvarose, kuri pasireiškė II tipo pneumocitų hiperplazija ir hipertrofija. Taip pat buvo nustatyta teigiama imunohistochemija (Guo et al., 2013).
19 ir patologiniai pokyčiai nėra būdingi ir aiškūs, kad remiantis jais būtų galima diagnozuoti ir diferencijuoti KRKS nuo kitų ligų, todėl, norint tiksliai diagnozuoti KRKS būtina atlikti laboratorinius tyrimus.
1.6. Viruso diagnostika
Greitas uţsikrėtusio gyvūno identifikavimas gali sumaţinti potencialų viruso perdavimą neuţsikrėtusioms bandoms, išvengiant ligų plitimo (Liu et al., 2013). KRKSV kontrolė ir likvidavimas paremti visos bandos populiacijos tikrinimu keliais nustatymo metodais, tokiais kaip, visų gyvūnų serologiniais tyrimais, viruso izoliacija, atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (Lurchachaiwong et al., 2008). KRKSV antikūniai gali būti nustatomi serologiniais metodais: imunoperoksidazės, netiesioginės imunofluorescencijos, imunofermentinės analizės metodu arba viruso neultralizacijos reakcija (Guo et al., 2013), tačiau nerimą kelia jų jautrumas (Martinez et al., 2008). Serologija reprezentuoja paplitimą populiacijoje, tačiau šis metodas turi keletą trūkumų, pavyzdţiui antikūnių titro sumaţėjimas po infekcijos (Lager et al. 1997). ORF7 baltymas yra svarbus diagnostinis antigenas, naudojamas ELISA testuose nustatyti KRKSV ir apibrėţti KRKS statusą bandoje. Visi komerciniai ELISA rinkiniai yra paremti ORF7 srities antigenu, priklausančiu KRKSV-1 subtipui 1 arba KRKSV-2, arba abiem (Stadejek et al., 2013).
20 atsaką (Labarque et al., 2003). Citopatinis efektas (CPE) ir didelis jautrumas KRKSV taip pat stebimas monocituose – makrofaguose kiaulių endometriumo/embriono placentos endotelio ląstelių linijose (PEE), PEE gauti iš vieno mėnesio amţiaus kiaulaičių. Suradimas PEE jautrumo KRKSV gali padėti paaiškinti, KRKSV sukeltus reprodukcinius sutrikimus (Feng et al., 2013).
Paskutiniais metais PGR tyrimas tapo labiau jautresniu, specifiškesniu ir greitesniu būdu nustatyti kiaulių virusus (Jiang et al., 2010) ir dabar yra plačiai naudojamas veterinarinėje diagnostikoje (Wu et al., 2014). Molekulinė diagnostika paremta atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos metodu, yra vienas iš labiausiai taikomų metodų KRKSV nustatymui infekuotuose audiniuose, serume ir spermoje. Pats imunogeniškiausias baltymas virione yra 15 kDa N baltymas, kuris yra svarbiausias taikinys, nustatant virusą AT-PGR bei serologiškai, naudojant ELISA (Toplak et al., 2012). Tradicinė AT-PGR atliekama greičiau, tačiau gali įvykti kontaminacija, o tai padidina klaidingai teigiamų mėginių skaičių. Tradicinė lizdinė AT-PGR yra daug darbo reikalaujanti lyginant su realaus laiko AT-PGR, kuri yra automatizuota greita, patogi ir kokybiška analizė (Lurchachaiwong et al., 2008). Realaus laiko AT-PGR metodas, panaudojant pradmenis ir TaqMan zondus, buvo sėkmingai pritaikytas, nustatant genotipą ir KRKSV RNR kiekį (Egli et al., 2001; Chung et al., 2005). Yra gerai ţinoma, kad KRKSV-1 subtipų ORF7 srities mutacijos paveikia AT-PGR pradmenų sujungimo ryšius ir tai maţina diagnostinių PGR patikimumą (Stadejek et al., 2008). Atlikus AT-PGR, skirtingos KRKSV-1 padermės iš Rytų Europos, kurios buvo tirtos, daţnai pateikia klaidingai neigiamus rezultatus dėl mutacijų ir pradmenų sujungimo ryšių (Stadejek et al., 2013). Genetinis skirtumas tarp genotipų labiausiai siejamas su mutacijų greičiu ir viruso populiacijos dydţiu (Murtaugh et al., 2010). PGR – greitas ir didelio našumo tyrimo metodas, kurio dėka vienu metu galima aptikti visus šešis patogenus, tuo itin pagerindamas epidemiologinę prieţiūrą ir ligos valdymą (Wu et al., 2014). Testai visiems šešiems virusams, tokie kaip ELISA, imunoperoksidazės vienasluoksnis tyrimas ir imunofluorescensijos tyrimas tinkami ir naudojami tyrimams, tačiau reikalauja didelio laboratorinio darbo, daug laiko ir yra maţiau jautrūs (Xu et al., 2012; Liu et al., 2011). Šie kiaulių virusai daţnai sukelia labai panašius klinikinius poţymius, patogenų diferenciacija reikalauja tikslios diagnozės. O monospecifinė PGR analizė reikalauja paruošti kiekvieną taikinį amplifikavimui ir todėl yra brangi (Wu et al., 2014).
1.7. Molekuliniai viruso tyrimo metodai
21 TAGGTGA-3‟), kurių produkto dydis – 650 bp. Bei realaus laiko AT-PGR ir panaudojo 125 bp produkto dydţio pradmenis PRRSVf2 GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3‟), PRRSVr2 (5‟-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3‟), amerikietiško genotipo US (5‟-FAM-CTGGGYARGA TYATCGCCCAGCA-BHQ1-3‟) ir europietiško genotipo EU (5‟HEX-TTRGCCTGTCCTCCCCT RGGTTG-BHQ1-3‟) zondus, palygindamas SYBR Green I ir TaqMan reakcijos mišinius. Iš 112 kiaulių, kurioms buvo pasireiškę klinikiniai poţymiai, mėginių tradicine AT-PGR buvo identifikuota 18 KRKSV atţvilgiu teigiamų mėginių bei 16 realaus laiko AT-PGR su SYBR Green I ir 20 – su TaqMan reakcijos mišiniu. Panaudojus TaqMan realaus laiko AT-PGR reakcijos mišinį buvo nustatytas didesnis jautrumas, nei su SYBR Green I (Lurchachaiwong et al. 2008).
Reiner et al. (2009) atliko lizdinę AT-PGR, nustatyti KRKSV šernų plaučių ir tonzilių mėginiuose, panaudojant ,,Multiplex PCR Mastermix„„ (Qiagen, Vokietija) bei įvairius pradmenis: Gilbert et al. (1997) su nedidelėmis modifikacijomis: PRRSV1 (5‟-CAACCTCCTGTATGAACTT GC-3‟), PRRSV2 (5‟-AGGTCCTCGAACTTGAGCTG-3‟) (bendri pradmenys abiems genotipams), produkto dydis – 258 bp, europiniam genotipui: PRRSV3 (5‟-CTGTATGAACTTGCAGGATG-3‟), PRRSV4 (5‟-CGACAATACCATGTGCTG-3‟), kurio produkto dydis – 186 bp, Šiaurės Amerikos genotipui: PRRSV_NA1 (5‟-GGCGCAGTGACTAAGAGA-3‟), PRRSV_NA2 (5‟-GTAACTGAA CACCATATGCTG-3‟), kurio produkto dydis – 108 bp; Pesch (2003) pradmenis, amplifikuojančius ORF7 sritį, kurie yra bendri abiems genotipams, PLR TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3„), PLS (5„-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3„), produkto dydis – 432 bp, Šiaurės Amerikos genotipui: US-7-s (5‟-AGTCCAGAGGCAAGGGACCG-3‟), US-7-as (5‟-TCAATCAGTGCCATT CACCAC-3‟), produkto dydis – 336 bp, europiniam genotipui: EU-7-s (5‟-ATGATAAAGTCCCA GCGCCAG-3‟), EU-7-as (5‟-CTGTATGAGCAACCGGCAGCAT-GCGCCAG-3‟), produkto dydis – 219 bp. Mėginių kDNR amplifikuotos, atitinkamai, europietiškam (amerikietiškam) genotipui: pradinė denatūracija (95°C, 15 min), 35 (30) ciklai, denatūracija (94°C, 30 s), hibridinimas (55°C (58°C), 90 s) ir išplėtimas (72°C, 1 min), galutinis išplėtimas (72°C, 10 min). Iš 531 Vokietijos šernų mėginių 14,2 % buvo teigiami amerikietiško KRKSV genotipo atţvilgiu, 6,2 % – europietiško ir 4,5 % buvo teigiami abiejų KRKSV padermių atţvilgiu, panaudojus PRRSV3, PRRSV4 bei PRRSV_NA1, PRRSV_NA2 pradmenis. Europietiško KRKSV genotipo atţvilgiu teigiamų plaučių mėginių buvo nustatyta 89 %, tonzilių – 11 %, o amerikietiško genotipo atţvilgiu – 97 % (plaučių) ir 3 % (tonzilių) (Reiner et al., 2009)
(5‟-22 GTRGAAAGTGCTGCAGGYCTCCA-3‟), EU6-462r (5‟-CACGAGGCTCCGAAGYCCW-3‟) ir EU6-MGB (Fam-CTGTGAGAAAGCCCGGAC-ZNA-4-BHQ1) zondu. Tačiau ištyrus 203 šernų patologinius mėginius, nei vienas nebuvo teigiamas KRKSV 1 tipo atţvilgiu.
Toplak et al. (2012) panaudojo ORF7 regiono pradmenis: P1 (5‟-CCA GCC AGT CAA TCA RCT GTG-3‟) ir P2 (5‟-GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG-3‟) (Donadeu et al., 1999), kurie naudojami identifikuoti abi 1 tipo ir 2 tipo KRKSV padermes, AT-PGR sąlygomis: 50°C 30 min; 95 °C 15 min; 40 ciklų: 94°C 30s, 60°C 1 min, 72 °C 1 min, ir galutinis išplėtimas 72 °C 10 min, panaudojant ,,One-step RT PCR kit“ rinkinį (Qiagen, Vokietija). Iš 142 kiaulių, kurioms buvo pasireiškę klinikiniai poţymiai, patologinių mėginių, atlikus AT-PGR 65 (45.8%) buvo teigiami. Nustatytas KRKSV buvo 89,1 – 96,1% identiškas su Lelystad padermei ir 62,4 – 65,1 % nukleotidų buvo identiški su VR-2332.
Rodriguez-Prieto et al. (2013) atliko AT-PGR analizes, paremtas ORF1 (Reiner et al., 2009) srities pradmenimis bei ORF7 (Donadeu et al., 1999) abiejų genotipų pradmenimis – ORF7-P1 (5‟-CCAGCCAGTCAATCARCTGTG-3‟), ORF7-P2 (5‟-GCGAATCAGGCGCACWGTATG-3‟), kurių produkto dydis – 291-300 bp, o 27 šernų audinių homogenizatai buvo ištirti AT-PGR, pasirinkus ribosomų proteiną S20 (RP-S20), panaudojant abiejų genotipų pradmenis - RP-S20 FWD (5‟-CGCTCCTGGCTCACCGCTGTT-3‟), RP-S20 RVS (5‟-TGCGGCTGGTGAGGGTGAT CC-3‟), kurių produkto dydis – 148 bp, panaudojant ,,SYBR Green Master Mix“ (Quantitative RT-PCR Brilliant II SYBR Green Master Mix, JAV). Visi 27 šernų audinių homogenizatai buvo teigiami, atlikus RP-S20 amplifikaciją. Tačiau nei vienas šernas ir nei viena Iberijos kiaulė nebuvo teigiama, atlikus AT-PGR analizes su ORF1 ir ORF7 sričių pradmenimis.
Liu et al. (2013) palygino paprastą AT-PGR ir dauginę PGR (buvo tiriami: KRKSV, KCV2, KKM viruso atţvilgiu). Iš 82 paršavedţių ir paršelių, su klinikiniais poţymiais, mėginių, atlikus paprastą AT-PGR buvo nustatyti 43, o dauginę PGR – 42 mėginiai teigiami KRKSV atţvilgiu, panaudojus ORF 5 srities pradmenis ORF5 F (5‟-CATTTCATGACACCTGAGACCAA-3‟) ir ORF5 R (5‟-AGAGCATATATCATCAACTGGCGT-3‟), kurių produkto dydis – 718 bp.Visi trys virusai buvo nustatyti 3 (3.66 %)mėginiuose. KRKS, KVC2 tipo ir KKM virusai yra ekonomiškai svarbūs virusai, kurie sukelia reprodukcijos ir/ar kvėpavimo paţeidimus kiaulėms. Todėl galutinė diagnozė kelių sukėlėjų sukeltos infekcijos daţnai yra sudėtinga, ypač KRKSV, KCV2, KKM viruso, kadangi kiaulėms gali pasireikšti vienodi klinikiniai poţymiai (Liu et al., 2013).
23 Kinija) ir ORF7 pradmenis PRRSV1 (5‟-CCAGTTCCAGCCAGTCAATCA-3‟), PRRSV2 (5‟-GC CCCGATTGAATAGGTGAC-3‟), kurių produkto dydis 433 bp. Iš 103 kiaulių patologinių mėginių, teigiamų mėginių rodiklis mišrios KCV2 tipo ir KRKSV buvo aukštas 52.4 % (54/103). Ir tik 4.8 % (5/103) mėginių buvo nustatyti teigiami Auješkio ligos viruso, KCV2 tipo, KRKSV, KKM, Japoniškuoju encefalito viruso atţvilgiu. Tačiau Zeng et al. (2014) nustatė, kad jautrumas dauginės PGR yra maţesnis nei paprastos AT-PGR. Maţiausias kiekis, reikalingas dauginei PGR buvo 10,5 pg, o parastai AT-PGR - 3,9 pg.
Drigo et al. (2014) atliko realaus laiko AT-PGR ir panaudojo skirtingus reakcijos mišinius (TaqMan ir SYBR Green) bei Lurchachaiwong et al. (2008) naudotus 1 ir 2 genotipui specifinius pradmenis ir zondus, bei vieną papildomą didelio genetinio įvairumo 1 tipo Italijos padermėms zondą EU-2 (5‟-FAM-ATGATGAAATCCCAGCGCCAGCGGT-3‟-IABkFQ) (Forsberg et al., 2002; Pesch et al., 2005). Drigo et al. (2014) taip pat atliko AT-PGR, remiantis Persia et al., 2001). Abiems KRKSV tipams buvo panaudotas vienas bendras pradţios pradmuo US/EU-F (5‟-ATGGCCAGCCAGTCAATC-3‟) ir du specifiniai pabaigos pradmenys: EU-R (5‟-GATTGCAAGCAGAGGGAGCGTTC-3‟), US-R (5‟-GGCGCACAGTATGATGCGTAG-3‟), produkto dydţiai – 1 tipo (181 bp) ir 2 genotipo (282 bp) (Drigo et al., 2014). TaqMan realaus laiko AT-PGR buvo atlikta tokiomis sąlygomis: 50°C 15 min; 95°C 2 min; 40 ciklų 95°C 10 s ir 60°C 30 s, panaudojant ,,SuperScript® III RT/Platinum® Taq Mix“ (Life Technologies, Italija) rinkinį, o SYBR Green - 50°C 15 min, 95°C 5 min, 40 ciklų 95°C 10 s ir 60°C 30 s, panaudojant ,,SuperScript® III Platinum® SYBR® Green one-step qPCR Kit“ (Life Technologies, Italija). Abiem realaus laiko AT-PGR metodais buvo nustatytas virusas, apie 15 KRKSV kopijų/µl uţkrėstose abiejų tipų KRKSV ląstelėse ir 125 KRKSV kopijų/ µl serume. Visos kiaulės, uţkrėstos VR-2332 ir
Lelystad padermių 106.1kopijų/ml infekcine doze, iki 28 dienos po uţkrėtimo buvo teigiamos,
išskyrus vieną kiaulaitę, kuri buvo ištirta kaip neigiama, panaudojant SYBR Green mišinį. 42 dieną po uţkrėtimo 80 % (8 iš 10) kiaulių buvo teigiamos, tiriant AT-PGR, ir tik 40 % (4 iš 10) buvo teigiamos, tiriant realaus laiko AT-PGR metodais. 76 dieną tik 3 kiaulaitės buvo vis dar teigiamos realaus laiko AT-PGR, panaudojant SYBR Green reakcijos mišinį (Drigo et al., 2014).
(5‟-FAM-24 CACCGCGTATAACTGTGACAACAACGC-BHQ1-3‟), kurių produkto dydis – 73 bp. Tiesioginės realaus laiko AT-PGR Ct vidurkis buvo 25,91, o tradicinės realaus AT-PGR – 26,93. Iš 144 mėginių, 94 (65,3 %) buvo teigiami didelio patogeniškumo atţvilgiu, tiek atlikus tradicinę realaus laiko AT-PGR, tiek tiesioginę realaus laiko AT-PGR (Kang et al., 2014).
25 2. TYRIMŲ MEDŢIAGOS IR METODAI
2.1. Tyrimų vieta ir objektai
Tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijos Anatomijos ir fiziologijos katedros Imunologijos laboratorijoje ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Mikrobiologijos ir virusologijos instituto virusologinių tyrimų laboratorijoje 2012 – 2014 metais.
Tyrimų metu buvo ištirti (iš viso n=285) patologinės medţiagos (plaučių ir kraujo serumo) mėginiai: šernų (n=238) ir kiaulių (n=47) mėginiai, kurie buvo surinkti iš skirtingų Lietuvos rajonų 2012 – 2014 metų laikotarpiu. Visi mėginiai iki tyrimų buvo laikomi uţšaldyti – 20 °C temperatūroje.
Rezultatus tinkamai įvertinti, buvo panaudotos teigiamos – KRKSV referentinės padermės ir neigiamos kontrolės. Europiniam KRKSV genotipui buvo panaudota KRKSV referentinė padermė – 5,5 TCID50 Lelystad virusas, o Šiaurės Amerikos genotipui – 6,3 TCID50 Hesse virusas.
Neigiamos kontrolės – vanduo be nukleazių, kiaulių cirkoviruso referentinė padermė 2 (KCV2). Tyrimų metu buvo atliekama:
1. Patologinių šernų ir kiaulių mėginių rinkimas.
2. Lizdinės AT-PGR ir realaus laiko TaqMan AT-PGR oligonukleotidinių pradmenų ir zondų jautrumo ir tinkamumo KRKSV identifikavimui nustatymas, panaudojant teigiamas kontroles – referentines padermes (TCID50 Lelystad, Hesse virusus).
3. Lizdinės AT-PGR ir realaus laiko TaqMan AT-PGR oligonukleotidinių pradmenų ir zondų specifiškumo KRKSV identifikavimui nustatymas, panaudojant neigiamas kontroles (vandenį be nukleazių, KCV2 referentinę padermę).
4. Šernų ir kiaulių patologinių mėginių KRKSV atţvilgiu ištyrimas, atliekant lizdinę AT-PGR ir realaus laiko TaqMan AT-AT-PGR, panaudojant skirtingus oligonukleotidinius pradmenis ir zondus.
26
1 schema. Tyrimų schema
Tiriamųjų šernų ir kiaulių mėginių tyrimas PGR KRKSV atţvilgiu
Šernų ir kiaulių patologinių mėginių ištyrimas KRKSV atţvilgiu, atliekant lizdinę AT-PGR, panaudojant
skirtingus oligonukleotidinius pradmenis.
Šernų ir kiaulių patologinių mėginių ištyrimas KRKSV atţvilgiu, atliekant realaus laiko TaqMan AT-PGR, panaudojant skirtingus oligonukleotidinius pradmenis ir
zondus.
Neigiamų kontrolių (vandens be nukleazių, KCV2 referentinių padermių) tyrimas KRKSV atţvilgiu
Lizdinės AT-PGR atlikimas ir įvertinimas, panaudojant skirtingus oligonukleotidinius pradmenis.
Realaus laiko TaqMan AT-PGR atlikimas ir įvertinimas, panaudojant skirtingus oligonukleotidinius pradmenis ir
zondus.
Teigiamų kontrolių - referentinių padermių (5,5 TCID50Lelystad, 6,3 TCID50 Hesse virusų)
tyrimas KRKSV atţvilgiu
Lizdinės AT-PGR atlikimas ir įvertinimas, panaudojant skirtingus oligonukleotidinius pradmenis.
Realaus laiko TaqMan AT-PGR atlikimas ir įvertinimas, panaudojant skirtingus oligonukleotidinius pradmenis ir
zondus.
Komplimentarios DNR gavimas
Neigiamos kontrolės mėginių kDNR
gavimas. Tiriamųjų mėginių kDNR gavimas.
Teigiamos kontrolės mėginių kDNR gavimas.
RNR išskyrimas
RNR išskyrimas iš neigiamos
kontolės mėginių. RNR išskyrimas iš tiriamųjų patologinių mėginių. RNR išskyrimas iš tiegiamos kontrolės mėginių.
Tiriamųjų šernų (n=238) ir kiaulių (n=47) patologinių mėginių rinkimas
27 2.2. RNR išskyrimas
RNR buvo išskiriama iš 10 – 30 mg plaučių skutenų arba 200 µl kraujo serumo, panaudojant komercinį RNR išskyrimo ,,GeneJETTM
RNA Purification Kit„„ (Thermo Scientific, Lietuva) rinkinį (ISO 9001, ISO 14001). Kiekvienas mėginys, siekiant sukelti ląstelių lizę, veikiamas 300 µl lizavimo buferio ir 6 µl DTT tirpalo mišiniu. Uţpylus mėginiai maišomi ,,Vortex„„ purtykle (IKA, JAV) 10 sekundţių. Tuomet ant kiekvieno mėginio uţpilama po 600 µl tirpalo mišinio, kurį sudaro 590 µl TE buferio ir 10 µl proteinazės K. Uţpylus mėginiai 10 sekundţių maišomi ,,Vortex„„ maišykle bei inkubuojami 10 minučių kambario temperatūroje (15 – 25°C). Po inkubacijos mėginiai centifuguojami 10 minučių 12 tūkst. aps./min greičiu centrifuga (Nippon Genetics Europe, Korėja). Po centrifugavimo paviršinė frakcija, kurioje yra RNR, perkeliama į naujus mėgintuvėlius be R-nazių (Eppendorf, Vokietija). Į kiekvieną mėgintuvėlį pripilama po 450 µl etanolio (96%) ir maišoma pipetuojant. Tuomet kiekvieno mėginio 700 µl lizato perkeliama, atitinkamai, į naujas komercinio rinkinio mėgintuvėlių kolonėles su specialia membrana, kuri imobilizuoja RNR. Perkeltas lizatas yra centrifuguojamas 1 minutę 12 tūkst. aps./min greičiu. Prisitvirtinusios kolonėlės membranoje RNR molekulės plaunamos plovimo buferiais, į kurių sudėtį įeina 96% etanolis. Į kiekvieną mėgintuvėlio kolonėlę įpilama po 700 µl pirmojo plovimo buferio ir centrifuguojama 1 minutę 12 tūkst. aps./min greičiu. Tada į kiekvieno mėgintuvėlio kolonėlę įpilama po 600 µl antrojo plovimo buferio ir vėl centrifuguojama 1 minutę 12 tūkst. aps./min greičiu. Po to plaunama antru plovimo buferiu, į kiekvieną mėgintuvėlio kolonėlę įpilant po 250 µl ir centrifuguojama 2 minutes 12 tūkst. aps./min greičiu. RNR nusausinama papildomai centrifuguojant 1 minutę 12 tūkst. aps./min greičiu. Kolonėlės perkeliamos į naujus sterilius komercinio rinkinio mėgintuvėlius, o ant kiekvienos membranos uţpilama po 100 µl vandens be nukleazių ir centrifuguojama 1 minutę 12 tūkst. aps./min greičiu. Gauta RNR naudojama atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininėje reakcijoje, iki naudojimo laikoma uţšaldyta -20°C temperatūroje.
2.3. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
28 lentelėje), 0,5 µl 10 % tritonu-X (Sigma, JAV), 0,3 µl atvirkštinės transkriptazės ,,Revert AidTM„„
(200u/ µl) (Thermo Scientific, Lietuva), 0,13 µl R-nazių inhibitoriumi ,,RiboLockTM„„ (20u/µl) (Thermo Scientific, Lietuva).
1 lentelė. AT-PGR KRKSV oligonukleotidiniai pradmenys
Eil. Nr.
Oligonukleotidinių pradmenų
pavadinimas
Oligonukleotidinių pradmenų seka 5’→3’ AT-PGR produkto dydis, bp Šaltinis 1. ORF 1-1 CAACCTCCTGTATGAACTTGC 258 Reiner et al. (2009) ORF 1-2 AGGTCCTCGAACTTGAGCTG 2. EU ORF 5B CAATGAGGTGGGCIACAACC 719 Oleksiewicz et al. (1998) EU ORF 5C TATGTIATGCTAAAGGCTAGCAC
3. ORF 7B GCCCCTGCCCAICACG 636 (EU)
659 (ŠA) Oleksiewicz et al. (1998) ORF 7C TCGCCCTAATTGAATAGGTGA 4. US 208F GTACGGCGATAGGGACACC 914 Umthum, Mengeling (1999) US 331R CCAGAATGTACTTGCGGCC 5. PLR TCGCCCTAATTGAATAGGTG 432 Pesch (2003) PLS ATGGCCAGCCAGACAATCA Pastaba: I=A+G+T.
Mėginiai amplifikuoti ,,Mastercycler personal‟‟ (Eppendorf, Vokietija) amplifikatoriuje, amplifikavimo sąlygos pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Atvirkštinės transkripcijos PGR amplifikavimo sąlygos
Etapai Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius
Atvirkštinė transkripcija 42 30 min 1
Pradinė denatūracija 95 5 min 1
Denatūracija 94 1 min
40
Hibridinimas 55 1 min
DNR sintezė 72 1 min 30 s
Galutinis išplėtimas 72 10 min 1
29 2.4. Lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
Lizdinės PGR mišinys buvo paruoštas pagal gamintojo instrukciją, sumaišant 2,5 µl AT-PGR produkto su 12,5 µl ,,DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)” (Thermo Scientific, Lietuva) reakcijos mišinio, 8 µl vandens be nukleazių (Thermo Scientific, Lietuva), po 1 µl vidinių pradţios ir pabaigos 20 pmol/µl darbinės koncentracijos oligonukleotidinių pradmenų (lizdinėje AT-PGR naudoti pradmenys pateikti 3 lentelėje).
3 lentelė. Lizdinės AT-PGR KRKSV oligonukleotidiniai pradmenys
Eil. Nr. Oligonukleotidinių pradmenų pavadinimas Oligonukleotidinių pradmenų seka 5’→3’ Lizdinės AT-PGR produkto dydis, bp Šaltinis 1. ORF 1-3 CTGTATGAACTTGCAGCAGGA TG 186 Reiner et al. (2009) ORF 1-4 CGACAATACCATGTGCTG 2. EU ORF 5F ATGAGATGTTCTCACAAATTG GGGCG 606 Suarez et al. (1996) EU ORF 5R CTAGGCCTCCCATTGCTCAGC CGAAGT 3. ORF F1343 CGAGCTGTTAAACGAGGATGT 418 Drew et al. (1997) ORF R133 TCGCCCTAATTGAATAGGTGA 4. US ORF 5B GCTCCATTTCATGACACCTG 818 Meulenberg et al. (1993) US ORF 5C AAAGGTGCAGAAGCCCTAGC 5. EU-7-s ATGATAAAGTCCCAGCGCCAG 219 Pesch (2003) EU-7-as CTGTATGAGCAACCGGCAGCA
30
4 lentelė. Lizdinės AT-PGR amplifikavimo sąlygos
Etapai Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 95 5 min 1
Denatūracija 94 1 min
40
Hibridinimas 55 1 min
DNR sintezė 72 1 min 30 s
Galutinis išplėtimas 72 10 min 1
2.5. Elektroforezė ir lizdinės AT-PGR vizualizacija
Lizdinės AT-PGR produktai buvo frakcionuojami 1,8 % agarozės gelyje (Thermo Scientific, Lietuva), kuris daţytas 1 µl/ml etidţio bromidu (Life Technologies, JAV). Elektroforezė buvo vykdoma 67 minutes 1xTBE buferyje (Thermo Scientific, Lietuva), leidţiant 120 V įtampos elektros srovę. Elektroforezei atlikti naudojamas elektroforezės aparatas ,,Consort EV243„„ (Sigma Aldrich, JAV).
Lizdinės AT-PGR elektroforezės rezultatai buvo matomi UV lempos ,,UV T-20M„„ (Herolab, Vokietija) spinduliuose ir vertinami pagal susidariusio PGR produkto juostelių fluorescencijos signalą (,,+” – stebima fluorescencija, teigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys, ,,–“ – fluorescencija nenustatyta, neigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys) ties atitinkamo produkto dydţio (bp) molekulinės masės ţymeklio ,,GeneRuler Low Range DNA Ladder“ arba ,,MassRulerTM
Low Range DNA Ladder, ready to use“ (Thermo Scientific, Lietuva) atitinkama pozicija ir pagal produkto fluorescencijos signalo intensyvumą (,,+” – silpnas, ,,++” – vidutiškas, ,,+++” – stiprus, ,,++++” – labai stiprus).
2.6. Komplimentarios DNR gavimas
Mėginių komplimentari DNR mišinys buvo paruoštas pagal gamintojo instrukciją, naudojant komercinį ,,RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit„„ (Thermo Scientific, Lietuva) rinkinį (ISO 9001, ISO 14001): sumaišant 5 µl RNR su 6 µl vandens be nukleazių, 1 µl oligonukleotidu ,,Oligo(dT)18 primer„„, 4 µl 5X reakcijos buferiu, 1 µl R-nazių inhibitoriumi
,,RiboLockTM„„ (20u/µl), 2 µl 10 mM dNTP mišiniu, 1 µl atvirkštine transkriptaze ,,Revert AidTM“ (200u/ µl).
31 2.7. Realaus laiko TaqMan atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
Realaus laiko mišinys paruoštas pagal gamintojo instrukciją, sumaišant 5 µl kDNR su 12,5 µl ,,TaqMan Universal Master Mix II No UNG‟‟ (Life Technologies, JAV) mišiniu, 5,8 µl vandens be nukleazių (Thermo Scientific, Lietuva), 0,5 µl zondu ir po 0,6 µl pradţios ir pabaigos oligonukleotidiniais pradmenimis (naudoti pradmenys ir zondai pateikti 5 lentelėje). Mėginiai amplifikuoti ,,Mastercycler Realplex S„„ (Eppendorf, Vokietija) amplifikatoriuje, amplifikacijos sąlygos pateiktos 6 lentelėje.
Realaus laiko TaqMan AT-PGR rezultatai vertinami, analizuojant tiriamųjų mėginių Ct reikšmę – PGR produkto susidarymo ciklas, pasireiškiantis fluorescencijos signalu.
5 lentelė. Realaus laiko TaqMan AT-PGR oligonukleotidiniai pradmenys ir zondai
Eil. Nr. Oligonukleoti-dinių pradmenų pavadinimas Oligonukleo-tidinių pradmenų seka 5’→3’ Zondo pavadinimas Zondo nukleotidų seka 5’→3’ Produk-to dydis, bp Šaltinis 1. EU6 – 343F GTAGAAAG TGCTGCAG GTCTCCA EU6-MGB Fam-CTGTGAG AAAGCCC GGAC- ZNA-4-BHQ1 119 Revilla-Fernandez et al. (2005) EU6 – 462R CACGAGGC TCCGAAGT CCT 2.
Fross For GATGACRT CCGGCAYC Fross Eu Fam- GCAATCG ATCCAGA CGGCTT-Tamra 87 Kleiboeker et al. (2005) Fross Rev CAGTTCCT GCGCCTTG AT 3. PRRSV-EU-2.1F GCACCACC TCACCCRR AC PRRSV-EU-2.1 FAM Fam-CCTCTGY YTGCAAT CGATCCA GAC-BHQ-1 59 Kleiboeker et al. (2005) PRRSV-EU-2.1R CAGTTCCT GCRCCYTG AT 4. US6-289F TCCAGATG CCGTTTGT GC US6-MGB Fam-CCCTGCC CACCA8G T-ZNA3-BHQ1 123 Revilla-Fernandez et al. (2005) US6-412R GACGCCGG ACGACAAA TG
32
6 lentelė. Realaus laiko TaqMan AT-PGR amplifikavimo sąlygos
Eil. Nr.
Oligonukleotidinių pradmenų, zondų pavadinimai
Realaus laiko AT-PGR sąlygos (temperatūra/ laikas) Pradinė
denatūracija
Denatūracija Hibridinimas Išplėtimas
1ciklas 40 ciklų
1. EU6 – 343F/EU6 –
462R, EU6-MGB 95 °C / 10 min 95 °C / 15 s 60 °C / 30 s 72 °C / 30 s 2. Fross For/ Fross Rev,
Fross Eu 95 °C / 10 min 94°C/ 20 s 55 °C/ 45 s 72 °C / 30 s 3. PRRSV-EU-2.1F/ PRRSV-EU-2.1R, PRRSV-EU-2.1 FAM 95 °C / 10 min 95 °C / 15 s 58 °C / 30 s 72 °C / 30 s 4. US6-289F/ US6-412R, US6-MGB 95 °C / 10 min 95 °C / 15 s 60 °C / 30 s 72 °C / 30 s
2.8. Statistinis duomenų analizė
Gautų duomenų statistinė analizė buvo atlikta, panaudojant Microsoft Office Exel (2013) programą. Buvo apskaičiuoti gautų duomenų : procentinis pasiskirstymas (%), didţiausia ir maţiausia reikšmė, pasikliautinasis intervalas (PI), aritmetinis vidurkis (x̅), vidurkio paklaida (mx),
dispersija (2), standartinis nuokrypis (), variacijos koeficientas (Cv, %), koreliacija (r). Įvertinti skirtumams tarp nepriklausomų imčių buvo panaudotas Fišerio testas, t-testas, priklausomų imčių – Stjudento skirsnis, tarp kokybinių analizuojamų veiksnių – Chi kvadrato testas. Oligonukleotidinių pradmenų tarpusavio koreliacijai įvertinti buvo apskaičiuotas koreliacijos koeficientas (r). Duomenys laikyti patikimais, kai p<0,05. Duomenys grafiškai pateikti, panaudojant Microsoft
33 3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1.1. KRKSV diagnostikoje naudojamų lizdinės AT-PGR oligonukleotidinių pradmenų tinkamumas ir specifiškumas
Lizdinės AT-PGR oligonukleotidinių pradmenų tinkamumas ir specifiškumas KRKSV diagnostikai buvo įvertintas, atliktus lizdinę AT-PGR su skirtingais oligonukleotidiniais pradmenimis ir atitinkamomis teigiamomis kontrolėmis – referentinėmis padermėmis, skirtingo laipsnio praskiedimuose (100 – 10-7).
Teigiamos kontrolės – referentinės padermės – 5,5 TCID50 Lelystad viruso lizdinė AT-PGR
buvo atlikta su ORF 1-3/ORF 1-4, EU ORF 5F/EU ORF 5R, ORF F1343/ORF R133, EU-7-s/EU-7-as oligonukleotidiniais pradmenimis, tačiau susidarę specifiniai PGR produktai buvo nustatyti tik su ORF 1-3/ORF 1-4 ir EU ORF 5F/EU ORF 5R oligonukleotidiniais pradmenimis. Intensyviausias fluorescencijos signalas buvo nustatytas 10-2 ir 10-3 laipsnio praskiedimuose ir įvertintas kaip labai stiprus (++++) tiek su ORF 1-3/ORF 1-4, tiek ir su EU ORF 5F/EU ORF 5R oligonukleotidiniais pradmenimis. Nors ir silpnas (+) fluorescencijos signalo intensyvumas buvo nustatytas, atlikus lizdinę AT-PGR su ORF 1-3/ORF 1-4 oligonukleotidiniais pradmenimis 10-6
34
7 lentelė. Lizdinės AT-PGR rezultatai, panaudojus skirtingus oligonukleotidinius
pradmenis ir nutitruotą referentinę 5,5 TCID50 Lelystad KRKSV padermę
Pradmenys
Praskiedimo laipsnis (referentinė Lelystad KRKSV padermė) 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
ORF 1-3/ORF 1-4 ++ ++ ++++ ++++ +++ ++ + –
EU ORF 5F/EU ORF 5R + ++ ++++ ++++ ++ + – –
EU-7-s/EU-7-as – – – – – – – –
ORF F1343/ORF R133 – – – – – – – –
Pastaba: „–” – neigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys, „+” – silpnas fluorescencijos signalo intensyvumas, teigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys, „++” – vidutiškas fluorescencijos signalo intensyvumas, teigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys, „+++” – stiprus fluorescencijos signalo intensyvumas, teigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys, ,,++++” – labai stiprus fluorescencijos signalo intensyvumas, teigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys. Raudonos spalvos linija paţymėtas intensyviausias fluorescencijos signalas.
Atlikus lizdinę AT-PGR, su amerikietiško genotipo referentine paderme –Hesse ir US ORF
5B/US ORF 5C oligonukleotidiniais pradmenimis, specifiniai PGR produktai buvo nustatyti 100, 10-1, 10-2 praskiedimuose. Intensyviausias fluorescencijos signalas buvo nustatytas 10-2 laipsnio praskiedime, tačiau tik vidutinio intensyvumo (++) (8 lentelė). Lizdinės AT-PGR tyrimai buvo atlikti po penkis kartus ir visais atvejais gauti teigiami ir neigiami rezultatai nesiskyrė (p<0,05).
8 lentelė. Lizdinės AT-PGR rezultatai, panaudojus US ORF 5B/US ORF 5C
oligonukleotidinius pradmenis ir nutitruotą referentinę 6,3 TCID50 Hesse KRKSV padermę
Pradmuo Praskiedimo laipsnis (referentinė Hesse KRKSV padermė) 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
US ORF 5B/US ORF 5C + + ++ – – – – –
Pastaba: „–” – neigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys, „+” – silpnas fluorescencijos signalo intensyvumas, teigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys, „++” – vidutiškas fluorescencijos signalo intensyvumas, teigiamas KRKSV atţvilgiu mėginys. Raudonos spalvos linija paţymėtas intensyviausias fluorescencijos signalas.
3.1.2. KRKSV diagnostikoje naudojamų realaus laiko TaqMan AT-PGR oligonukleotidinių pradmenų tinkamumas ir specifiškumas
35 Realaus laiko TaqMan AT-PGR leido gauti specifinius amplifikavimo produktus su visais naudotais oligonukleotidiniais pradmenimis ir zondais. Didėjant praskiedimo laipsniui, Ct reikšmės taip pat didėdavo. Maţiausias europietiško KRKSV genotipo referentinės pademės Ct vidurkis buvo nustatytas su EU6 – 343F/EU6 – 462R oligonukleotidiniais pradmenimis ir EU6-MGB zondu, didţiausias – su Fross For/Fross Rev oligonukleotidiniais pradmenimis ir Fross Eu zondu visuose praskiedimo laipsniuose. 100 laipsnio praskiedime Ct vidurkis svyravo nuo 18,64±0,10 iki 26,56±0,05, 10-1 – nuo 21,63±0,09 iki 28,94±0,07, 10-2 – nuo 27,02±0,23 iki 32,83±0,12, o 10-3– nuo 30,74±0,22 iki 33,45±0,05, 10-4 – nuo 32,96±0,15 iki 34,58±0,05 bei 10-5 laipsnio praskiedime – nuo 37,09±0,16 iki 37,89±0,07 su atitinkamais pradmenimis.
Amerikietiško KRKSV genotipo referentinės padermės su US6-289F/US6-412R oligonukleotidiniais pradmenimis ir US6-MGB zondu Ct vidurkis svyravo nuo 24,14±0,08 (100 laipsnio praskiedime) iki 34,86±0,07 (10-5 laipsnio praskiedime).
36
1 pav. Realaus laiko TaqMan AT-PGR rezultatai su skirtingais oligonukleotidiniais
pradmenimis ir zondais, panaudotais tiriant referentines Lelystad ir Hesse KRKSV padermes.
Pastaba: L – Lelystad, H – Hesse virusas. 0, -1, -2, -3, -4, -5 – praskiedimo laipsniai, atitinkamai: 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 E U6 – 3 4 3 F/EU6 – 4 6 2 R /EU 6 -MG B P RR SV -EU -2 .1 F/P RR SV -EU -2 .1 R/P RR SV -EU -2 .1 FA M Fro ss Fo r/Fro ss R ev /Fro ss E u US6 -2 8 9 F/US 6 -4 1 2 R /US6 -MG B E U6 – 3 4 3 F/EU6 – 4 6 2 R /EU 6 -MG B P RR SV -EU -2 .1 F/P RR SV -EU -2 .1 R/P RR SV -EU -2 .1 FA M Fro ss Fo r/Fro ss R ev /Fro ss E u US6 -2 8 9 F/US 6 -4 1 2 R /US6 -MG B E U6 – 3 4 3 F/EU6 – 4 6 2 R /EU 6 -MG B P RR SV -EU -2 .1 F/P RR SV -EU -2 .1 R/P RR SV -EU -2 .1 FA M Fro ss Fo r/Fro ss R ev /Fro ss E u US6 -2 8 9 F/US 6 -4 1 2 R /US6 -MG B E U6 – 3 4 3 F/EU6 – 4 6 2 R /EU 6 -MG B P RR SV -EU -2 .1 F/P RR SV -EU -2 .1 R/P RR SV -EU -2 .1 FA M Fro ss Fo r/Fro ss R ev /Fro ss E u US6 -2 8 9 F/US 6 -4 1 2 R /US6 -MG B E U6 – 3 4 3 F/EU6 – 4 6 2 R /EU 6 -MG B P RR SV -EU -2 .1 F/P RR SV -EU -2 .1 R/P RR SV -EU -2 .1 FA M Fro ss Fo r/Fro ss R ev /Fro ss E u US 6 -2 8 9 F /US 6 -4 1 2 R /US 6 -MGB E U6 – 3 4 3 F/EU6 – 4 6 2 R /EU 6 -MG B P RR SV -EU -2 .1 F/P RR SV -EU -2 .1 R/P RR SV -EU -2 .1 FA M Fro ss Fo r/Fro ss R ev /Fro ss E u US6 -2 8 9 F/US 6 -4 1 2 R /US6 -MG B L 0 H 0 L -1 H -1 L-2 H -2 L -3 H -3 L -4 H -4 L -5 H -5 Ct re ik šm ė Oligonukleotidiniai pradmenys
37 Anksčiausiai TaqMan AT-PGR referentinės Lelystad padermės produktas buvo nustatytas 16,79 cikle su EU6 – 343F/EU6 – 462R oligonukleotidiniais pradmenimis ir EU6-MGB zondu (100 laipsnio praskiedimas), vėliausiai – 38,99 cikle su tais pačiais oligonukleotidiniais pradmenimis ir zondu (10-5 laipsnio praskiedime).
Realaus laiko TaqMan AT-PGR referentinės Hesse padermės produktas anksčiausiai buvo nustatytas 23,19 cikle (100 laipsnio praskiedimas), o vėliausiai 35,66 cikle su US6-289F/US6-412R oligonukleotidiniais pradmenimis ir US6-MGB zondu (10-5 laipsnio praskiedime).
Atlikus duomenų analizę nustatyta, kad tinkamiausi identifikuoti referentinę Lelystad padermę oligonukleotidiniai pradmenys – EU6 – 343F/EU6 – 462R ir EU6-MGB zondas visuose tirtuose praskiedimo laipsniuose, kadangi nustatyti maţiausi Ct reikšmių nuokrypiai nuo aritmetinių vidurkių ir maţiausios Ct reikšmių sklaidos. Maţiausiai tinkami referentinės Lelystad padermės identifikavimui – Fross For/Fross Rev oligonukleotidiniai pradmenys ir Fross Eu zondas visuose tirtuose praskiedimo laipsniuose (9 lentelė).
38
9 lentelė. Realaus laiko TaqMan AT-PGR rezultatų dispersijos, standartiniai nuokrypiai ir
variacijos koeficientai, gauti ištyrus referentines padermes su skirtingais oligonukleotidiniais pradmenimis ir zondais Referentinė padermė, praskiedimo laipsnis Oligonukleotidiniai pradmenys ir zondai Dispersija Standartinis nuokrypis Variacijos koeficientas, % Lelystad 100
EU6 – 343F/EU6 – 462R/EU6-MGB 0,65 0,81 3,04
PRRSV-EU-2.1F/PRRSV-EU-2.1R/PRRSV-EU-2.1 FAM 1,18 1,08 4,66
Fross For/Fross Rev/Fross Eu 2,77 1,67 8,94
Hesse 100 US6-289F/US6-412R/US6-MGB 1,81 1,34 5,57
Lelystad
10-1
EU6 – 343F/EU6 – 462R/EU6-MGB 0,31 0,56 2,13
PRRSV-EU-2.1F/PRRSV-EU-2.1R/PRRSV-EU-2.1 FAM 1,38 1,17 4,06
Fross For/Fross Rev/Fross Eu 2,21 1,49 6,87
Hesse 10-1 US6-289F/US6-412R/US6-MGB 1,31 1,15 4,27
Lelystad
10-2
EU6 – 343F/EU6 – 462R/EU6-MGB 1,41 2,07 6,33
PRRSV-EU-2.1F/PRRSV-EU-2.1R/PRRSV-EU-2.1 FAM 4,32 2,08 7,13
Fross For/Fross Rev/Fross Eu 14,50 3,81 14,09
Hesse 10-2 US6-289F/US6-412R/US6-MGB 1,77 1,33 4,58
Lelystad 10-3
EU6 – 343F/EU6 – 462R/EU6-MGB 0,60 0,78 2,33
PRRSV-EU-2.1F/PRRSV-EU-2.1R/PRRSV-EU-2.1 FAM 6,65 2,58 7,92
Fross For/Fross Rev/Fross Eu 14,06 3,75 12,20
Hesse 10-3 US6-289F/US6-412R/US6-MGB 1,01 1,00 3,20
Lelystad 10-4
EU6 – 343F/EU6 – 462R/EU6-MGB 0,74 0,86 2,49
PRRSV-EU-2.1F/PRRSV-EU-2.1R/PRRSV-EU-2.1 FAM 5,66 2,38 6,90
Fross For/Fross Rev/Fross Eu 6,05 2,46 7,46
Hesse 10-4 US6-289F/US6-412R/US6-MGB 1,77 1,33 4,15
Lelystad
10-5
EU6 – 343F/EU6 – 462R/EU6-MGB 1,57 1,25 3,30
PRRSV-EU-2.1F/PRRSV-EU-2.1R/PRRSV-EU-2.1 FAM 2,76 1,66 4,40
Fross For/Fross Rev/Fross Eu 7,22 2,69 7,24
Hesse 10-5 US6-289F/US6-412R/US6-MGB 1,28 1,13 3,25
39 3.1.3. Neigiamos kontrolės tyrimas
Neigiamų kontrolių (vanduo be nukleazių, KCV2 padermė) lizdinės ir realaus laiko
TaqMan AT-PGR rezultatai buvo gauti neigiami su visais naudotais oligonukleotidiniais
pradmenimis ir zondais (3 ir 5 lentelės). Tyrimai su visais oligonukleotidiniais pradmenimis buvo atlikti po penkis kartus ir visais atvejais gauti rezultatai nesiskyrė (p<0,05).
3.2. KRKSV nustatymo patologiniuose mėginių lizdine AT-PGR rezultatai
