LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA
ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Deimantės Urbonaitės
ANTIFOSFOLIPIDINIO SINDROMO LABORATORINIŲ KRAUJO TYRIMŲ
INTERPRETACIJA IR TARPUSAVIO SĄSAJOS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė:
Dr. Viltė Marija Gintauskienė
2
TURINYS
TURINYS ... 2 SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Antifosfolipidinio sindromo epidemiologija ir klasifikacija ... 12
1.2. Antifosfolipidinio sindromo išsivystymo mechanizmai ... 13
1.2.1. Oksidacinio streso įtaka AFS išsivystymui ... 13
1.2.2. Nusilpusi endotelio azoto oksido sintetazės funkcija ... 14
1.2.3. Anti-β2GPI sukelta receptorių aktyvacija ... 14
1.2.4. Padidėjusi audinių faktoriaus ekspresija ir aktyvacija ... 15
1.2.5. Padidėjęs XI faktoriaus laisvojo tiolio kiekis ... 16
1.2.6. Aneksino A5 apsauginio apvalkalo suardymas ir antikūnų sukelta komplemento komponento C5 aktyvacija ... 16
1.3. Klinikiniai AFS požymiai ... 17
1.3.1. Venų trombozė ... 18
1.3.2. Arterijų trombozė ... 18
1.3.3. Centrinės nervų sistemos pažeidimai ... 19
1.3.4. Plaučių pažeidimai ... 19
1.3.5. Odos pažeidimai ... 19
1.3.6. Inkstų pakitimai ... 20
1.3.7. Širdies pažeidimai ... 21
1.3.8. Hematologiniai pakitimai ... 21
1.4. Antifosfolipidinio sindromo laboratorinė diagnostika ... 21
1.4.1. Lupus antikoaguliantas (LA) ... 22
1.4.2. Antikūnai prieš kardiolipiną ... 23
1.4.3. Antikūnai prieš β2-GPI ... 23
1.4.4. Antikūnai prieš protrombiną ir protrombino/fosfatidilserino kompleksus ... 24
1.4.5. Antikūnai prieš aneksiną A5 ir aneksiną A2 ... 24
1.4.6. Vimentinas ... 25
1.5. Seroneigiamas antifosfolipidinis sindromas ... 25
1.6. Vaikų AFS ... 26
1.6.1. Naujagimių AFS ... 27
1.6.2. Vyresnių vaikų AFS ... 27
1.6.3. AFS sergančių vaikų nervų sistemos ir hematologinai pažeidimai ... 27
1.7. AFS poveikis moterų vaisingumui ... 28
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 29
2.1. Tiriamasis kontingentas ... 29
2.2. Ėminių ir mėginių paruošimas ... 30
2.3. Antikūnų prieš β2-glikoproteiną I imunofermentinis tyrimas ... 30
2.4. Antikūnų prieš kardiolipiną imunofermentinis tyrimas ... 31
2.5. Aktyvinto dalinio tromboplastino laiko nustatymas ... 31
2.6. Lupus antikoagulianto kokybinis tyrimas ... 32
2.7. Statistiniai duomenų analizės metodai ... 32
3
3.1. Pacientų laboratorinių kraujo tyrimų rezultatai ... 33
3.1.1. Vyresnių pacientų laboratorinių kraujo tyrimų rezultatų analizė ... 35
3.1.2. Laboratorinių kraujo žymenų tarpusavio sąsajos ... 35
3.2. Vaikų laboratorinių kraujo tyrimų rezultatų analizė ... 36
3.3. Vaisingo amžiaus moterų laboratorinių kraujo tyrimų rezultatų analizė ... 36
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 38
5. IŠVADOS ... 41
6. PRANEŠIMAI IR PUBLIKACIJOS MAGISTRO DARBO TEMA ... 41
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
4
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius: Deimantė UrbonaitėMagistro darbo pavadinimas: Antifosfolipidinio sindromo laboratorinių kraujo tyrimų interpretacija ir tarpusavio sąsajos.
Tyrimo tikslas: Įvertinti antifosfolipidinio sindromo laboratorinių kraujo tyrimų rezultatus atsižvelgiant į tiriamųjų amžių ir lytį.
Uždaviniai:
1. Palyginti tiriamųjų, kuriems įtariamas antifosfolipidinis sindromas, laboratorinių kraujo tyrimų rezultatus bei tarpusavio sąsajas priklausomai nuo amžiaus ir lyties.
2. Išanalizuoti vaikų antifosfolipidinio sindromo laboratorinių kraujo tyrimų rezultatus ir tarpusavio ryšius atsižvelgiant į amžių ir lytį.
3. Nustatyti antifosfolipidinio sindromo laboratorinių kraujo tyrimų rezultatų tarpusavio sąsajas vaisingo amžiaus moterims.
Tyrimo objektas: Tiriamąjį kontingentą sudarė pacientai su įtariamu antifosfolipidiniu sindromu, kuriems 2014-ųjų metų liepos mėn. – 2015-ųjų liepos mėn. LSMUL KK Laboratorinės medicinos klinikoje buvo atlikti antikūnų prieš fosfolipidus tyrimai. Analizuoti 256 pacientų (202 moterys ir 54 vyrai), kurių amžiaus vidurkis 32,18±14,64 m. laboratorinių kraujo tyrimų duomenys.
Metodai: Aktyvinto dalinio tromboplastino laiko (ADTL) ir ADTL-LA tyrimai kraujo plazmoje atlikti analizatoriumi STA Compact Max, Diagnostica STAGO, Prancūzija. AKA IgG ir IgM bei anti-β2GPI
IgG ir IgM tyrimai kraujo serume atlikti taikant imunofermentinį (ELISA, angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) metodą (automatinis analizatorius Gemini, STRATEC Biomedical systems, Vokietija).
Tiriant laboratorinių kraujo žymenų koncentracijų vidurkių pasiskirstymą tarp amžiaus grupių ir lyties taikyta dispersinė analizė (ANOVA). Kiekybinių ir kokybinių požymių ryšio stiprumui vertinti naudotas Spearman'o koreliacijos koeficientas (r).
Tyrimo rezultatai: Vaikams iki 18 m. stebėtos statistiškai reikšmingai didesnės ADTL ir ADTL-LA vertės (43,46±8,41s ir 50,78±8,90s, atitinkamai) nei suaugusiems. Berniukams iki 10 m. vidutinio stiprumo ryšys rastas tarp ADTL ir anti-β2GPI IgM (r=0,537; p=0,039), mergaitėms – stiprus ryšys
tarp ADTL ir AKA IgM (r=0,848; p=0,002). Vyresnėms nei 10 m. mergaitėms nustatytas vidutinio stiprumo ryšys tarp AKA IgM ir ADTL-LA (r=0,636; p=0,048).
Vyrų virš 45 m. amžiaus AKA IgG ir anti-β2GPI IgG koncentracijos statistiškai reikšmingai didesnės,
ypač 51–59 m. amžiaus grupėje (61,81±133,15 GPL/ml ir 58,68±87,74 U/ml, atitinkamai) nei moterų (3,70±3,48 GPL/ml ir 7,47±9,05 U/ml, atitinkamai).
5 vidurkiai didesni (17,20±45,59 U/ml ir 2,43±11,50, atitinkamai) nei vyrų (1,77±0,12 U/ml ir 1,15±0,18, atitinkamai), o 31–35 m. amžiaus moterų grupėje labai stiprūs tarpusavio ryšiai stebėti tarp ADTL-LA/ADTL ir AKA IgM (r=0,953, p<0,001).
Išvados:
1. Didžiausios ADTL ir ADTL-LA reikšmės nustatytos vaikams iki 18 m. amžiaus, anti-β2GPI
IgG ir AKA IgG koncentracijos – 51–59 m. amžiaus vyrams, o antifosfolipidinio sindromo kraujo žymenų stipriausios sąsajos – suaugusioms moterims iki 60 m. amžiaus.
2. Berniukams iki 10 m. amžiaus ADTL prailgėjimas susijęs su didesne anti-β2GPI IgM
koncentracija, o mergaitėms – su didesne AKA IgM koncentracija. Vyresnėms mergaitėms didesnė ADTL-LA reikšmė susijusi su didesne AKA IgM koncentracija.
3. Vaisingo amžiaus moterims antifosfolipidinio sindromo diagnostikai reikšmingi kraujo žymenys ADTL-LA/ADTL ir AKA IgM stipriausiai siejasi 31–35 m. moterims.
6
SUMMARY
Author of Master Thesis: Deimantė UrbonaitėFull title of Master Thesis: Analysis and interpretation of changes and correlations of antiphospholipid syndrome blood markers.
Objective: The aim of the present study was to evaluate changes of antiphospholipid syndrome blood markers depending on age and gender.
The goal of Master Thesis:
1. To compare the changes and correlations of blood markers of patients with suspected antiphospholipid syndrome depending on age and gender.
2. To analyse the changes and correlations of blood markers of patients with suspected pediatric antiphospholipid syndrome depending on age and gender.
4. To determinate the interdependence of antiphospholipid syndrome blood markers in fertile age women with suspected antiphospholipid syndrome depending on age group.
The study contingent: Patients with suspected antiphospholipid syndrome were taken to be examined at Hospital of Lithuania University of Health Sciences (LUHS) Kauno klinikos. A study was carried out from July 2014 till July 2015 with the aim to analyse the changes of antiphospholipid antibodies (aPL) and activated partial thromboplastin time (aPTT) in the blood. There where an investigation of 256 patients of the average age of 32.2±14.6: 202 female and 54 male.
Methods: aPTT and aPTT-LA were measured in blood, aPTT-LA/aPTT ratio was counted (automatic analyser STA Compact Max, Diagnostica STAGO, France). ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method (automatic analyser Gemini, STRATEC Biomedical systems, Germany) was used to measure the concentration of aCL IgG/IgM and anti-β2GPI IgG/IgM. To examinate the mean
concentration distribution of laboratory blood markers between age groups and gender was used analysis of variance (ANOVA). The Spearman’s correlation coefficient (r) was used to assess the quantitative and qualitative evidence of the strength of the connection.
Results:
In children at the age under 18 years old the meanings of aPTT and aPTT-LA (43.46±8.41s and 50.78±8.90s, respectively) were found significantly higher than in adults. The investigation showed medium aPTT correlation with anti-β2GPI IgM (r=0.537; p=0.039) in boys at the age under 10 years
old. In girls at the same age, we determinanted the strong aPTT relation with aCL IgM (r=0.848; p=0.002). The medium aCL IgM correlation with aPTT-LA (r=0.636; p=0.048) was found in the group of girls at the age over 10 years old.
For the men at the age over 45 years old were found significantly higher anti-β2GPI IgG and aCL IgG
7 respectively), in comparison with the meanings of the women at the same age (3.70±3.48 GPL/ml and 7.47±9.05 U/ml, respectively).
At the age group of 31–45 years old, for women (17.20±45.59 U/ml and 2.43±11.50, respectively) were found higher levels of anti-β2GPI IgG and increased aPTT-LA/aPTT ratio, compared to men
(1.77±0.12 U/ml and 1.15±0.18, respectively). Very strong correlation between aPTT-LA/aPTT and aCL IgM (r=0.953, p<0.001) was seen in women group at the age of 31–35 years old.
Conclusion:
1. The highest means of aPTT and aPTT-LA were found in children at the age under 18 years old; in male patients at the age of 51–59 years old were determinated the highest anti-β2GPI IgG
and aCL IgG concentrations; the strongest correlations between antiphospholipid syndrome blood markers was found in women at the age under 60 years old.
2. In boys at the age under 10 years old aPTT prolongation is associated with increased anti-β2GPI IgM levels and in girls at the same age aPTT prolongation is associated with increased
aCL IgM concentration. The higher levels of aCL IgM is associated with increased aPTT-LA mean for the girls over 10 years old.
3. The antiphospholipid syndrome blood markers aPTT-LA/aPTT and aCL IgM have the strongest intercorrelation in fertile age women at the 31–35 years old.
8
INTERESŲ KONFLIKTAS
Interesų konflikto nebuvo.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Magistro baigiamajam darbui atlikti 2015 m. lapkričio 26 d. gautas LSMU Bioetikos centro leidimas Nr. BEC-LMB(M)-94 (1 priedas).
9
SANTRUMPOS
ADTL – aktyvintas dalinis tromboplastino laikas
ADTL-LA – lupus antikoaguliantas, naudojant LA jautrų reagentą AF – audinių faktorius
AFA – antikūnai prieš fosfolipidą AFS – antifosfolipidinis sindromas AKA – antikūnai prieš kardiolipiną
anti-β2GPI – antikūnai prieš β2-glikoproteiną I
aPA – audinių plazminogeno aktyvatorius ApoER2 – ApoE receptorius 2
BDI – baltymų disulfido izomerazė
dRVVT – praskiestų Russell‘o angies nuodų krešėjimo laikas GVT – giliųjų venų trombozė
KAFS – katastrofinis antifosfolipidinis sindromas LA – lupus antikoaguliantas
LR – livedo reticularis MI – miokardo infarktas
oMTL – oksiduotas mažo tankio lipoproteinas p – statistinio pasikliovimo lygmuo
PE – plaučių embolija
r – Spearman'o koreliacijos koeficientas ROS – reaktyvios deguonies formos SD – standartinė vidurkio įverčio paklaida
SN-AFS – seroneigiamas antifosfolipidinis sindromas SRV – sisteminė raudonoji vilkligė
TIA – trumpalaikis išeminis insultas TLR – toll-like receptorius
TMB – tetrametilbenzidino substratas IgG/M/A – G/M/A klasės imunoglobulinai VTE – venų tromboembolijos
10
ĮVADAS
Antifosfolipidinio sindromo (AFS) terminas, apibūdinantis autoimuninę ligą, kuri pasireiškia kraujagyslių trombozėmis ir/ar vaisiaus praradimu, susijusiu su nuolat padidėjusiu antikūnų prieš fosfolipidus (AFA) kiekiu, buvo pradėtas vartoti XX a. 8-ojo dešimtmečio pradžioje.
AFA yra heterogeniškų autoantikūnų, kurie atpažįsta fosfolipidų-baltymų kompleksus arba baltymus, kurie savo prigimtimi yra labai giminingi fosfolipidams (β2-glikoproteinas I ir
protrombinas), grupė. Toks heterogeniškumas atspindi antikūno prigimtį sąveikauti su konkrečiu antigenu, tai išreiškiama skirtingais patogenezės mechanizmais. AFS diagnostikoje dažniausiai nustatomi antikūnai prieš fosfolipidus yra lupus antikoaguliantas (LA), antikūnai prieš kardiolipiną (AKA) ir antikūnai prieš β2-glikoproteiną I (anti-β2GPI). Šie autoantikūnai sutrikdo koaguliacijos ir
fibrinolizės mechanizmus, taip išbalansuodami hemostazę ir skatindami intensyvesnę koaguliaciją. Jie taip pat neigiamai veikia įvairių ląstelių (trombocitų, monocitų ir endotelio) fiziologinę funkciją. AFA gali pažeisti bet kurį organą ar organų sistemą (kraujagysles, smegenis, inkstus, plaučius, virškinamąjį traktą, placentą), tačiau dažniausias požymis yra venų/arterijų/smulkiųjų kraujagyslių trombozė.
AFS klinikiniai simptomai yra kraujagyslių trombozių pasėkmė. Kai kuriais atvejais simptomai atsiranda antikūnams tiesiogiai veikiant ląsteles, pvz., neuronus. Dažniausiai pasitaikantis AFS klinikinis simptomas yra giliųjų venų trombozė (GVT), kurią seka trombocitopenija, livedo reticularis, insultas, paviršinis tromboflebitas, plaučių embolija (PE), persileidimai ir trumpalaikis išeminis insultas (TIA).
Lietuvoje kol kas nėra pakankamai mokslinės literatūros, nagrinėjančios AFA koncentracijos kraujyje pokyčius, tarpusavio sąveiką ir poveikį skirtingų amžiaus grupių bei lyties pacientams. Todėl būtina atlikti kuo daugiau klinikinių ir eksperimentinių tyrimų, norint kuo patikimiau diagnozuoti antifosfolipidinį sindromą, taikyti prevencijos priemones, bei gydymą.
11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti antifosfolipidinio sindromo laboratorinių kraujo tyrimų rezultatus atsižvelgiant į tiriamųjų amžių ir lytį.
Darbo uždaviniai:
1. Palyginti tiriamųjų, kuriems įtariamas antifosfolipidinis sindromas, laboratorinių kraujo tyrimų rezultatus bei tarpusavio sąsajas priklausomai nuo amžiaus ir lyties.
2. Išanalizuoti vaikų antifosfolipidinio sindromo laboratorinių kraujo tyrimų rezultatus ir tarpusavio ryšius atsižvelgiant į amžių ir lytį.
3. Nustatyti antifosfolipidinio sindromo laboratorinių kraujo tyrimų rezultatų tarpusavio sąsajas vaisingo amžiaus moterims.
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Antifosfolipidinio sindromo epidemiologija ir klasifikacija
Skaičiavimais nustatyta, kad AFS dažnis – 5 nauji atvejai 100 tūkst. asmenų per metus, o paplitimas – apie 40–50 atvejų 100 tūkst. asmenų. AFA nustatomi maždaug 13 proc. pacientų sergančių insultu, 11 proc. – patyrusių miokardo infarktą, 9,5 proc. – su giliųjų venų trombozėmis ir 6 proc. pacienčių su persileidimu anamnezėje. 1998 m. 8-ajame tarptautiniame AFA kongrese, Japonijoje buvo suformuluoti AFS klasifikacijos bei diagnostiniai kriterijai. Šie kriterijai buvo atnaujinti 2004 metais, 11-ajame AFA kongrese Australijoje. Australijoje vykusio kongreso metu buvo pasiūlyta modifikuoti Japonijoje sudarytus kriterijus ir prie jų papildomai priskirti antikūnų prieš β2GPI
nustatymą. Taip pat prie ankstesniųjų kriterijų pridėta keletas papildomų su AFS siejamų bruožų: širdies vožtuvo sutrikimai, livedo reticularis, trombocitopenija, AFS nefropatija ir su tromboze nesusiję centrinės nervų sistemos sutrikimai (pvz. kognityvinė disfunkcija). Naujausio, 2013-aisiais vykusio AFA kongreso metu esminių modifikacijų AFS diagnostikos kriterijams priimta nebuvo. AFS diagnozei patvirtinti reikalingas bent vienas klinikinis (pvz.: trombozė arba persileidimas) ir vienas laboratorinis (AKA, LA ar anti-β2GPI) kriterijus [1, 2].
AFS gali būti nustatomas pacientams, neturintiems gretutinių ligų, tai – pirminis AFS. Tokiais atvejais, kai sindromas siejamas su gretutinėmis ligomis, dažniausiai su sistemine raudonąja vilklige (SRV), ir kitomis autoimuninėmis ligomis, infekcijomis, vartojamais vaistais ar piktybiniais navikais, AFS laikomas antriniu [2].
AFA gali pasireikšti įvairiai, pavyzdžiui "paslėpta forma", kai AFS yra besimptomis. Galimas ir "klasikinis" AFS variantas: būdingos pasikartojančios veninės/arterinės trombozės. AFS gali sirgti sveikos moterys, kurių anamnezėje pasikartojantys persileidimai; pacientai su teigiamais AFA, tačiau be trombozių (trombocitopenija, hemolizinė anemija, livedo reticularis) [2].
Labai mažai pacientų daliai nustatoma itin sudėtinga AFS forma – katastrofinis (angl. catastrophic) AFS (KAFS). Šiai formai būdingos greitai susidarančios mikrotrombozės dėl kurių įvyksta skaigūs dauginiai organų pažeidimai. KAFS dažnis yra vos 1 proc. visų AFS atvejų, tačiau visais atvejais jo baigtis letali, todėl klinikinė jo reikšmė labai didelė. Preliminari KAFS diagnostikos kriterijų sistema sudaryta 2002 metais, Italijoje, 10-ojo tarptautinio AFA kongreso metu. Šie kriterijai publikuoti 2003-aisiais (1 lentelė) [3].
Grika EP ir kt. atliko 135 AFS pacientų duomenų analizę, 89 iš jų sirgo pirminiu AFS, o 46 – antriniu AFS [4]. Analizuojant duomenis atsižvelgta į sergamumą, mirtingumą ir organų pakenkimą. Duomenys suskirtyti į grupes pagal vyraujantį sutrikimą: arterinė trombozė, giliųjų venų trombozė ar nėštumo patologijos. 1/4 pacientų per vidutiniškai dešimties metų laikotarpį nuo ligos pradžios
13 išsivystė ryškūs organų pažeidimai. Dažniausiai buvo nustatyti neurologiniai pažeidimai, kurie buvo labiausiai būdingi pacientams su arterine tromboze.
1 lentelė. Katastrofinio AFS diagnostikos kriterijai
KAFS diagnostikos kriterijai Įtariamas KAFS Patvirtintas KAFS
1.Trijų ar daugiau organų, sistemų ar/ir audinių pažeidimai*;
2.Labai greitai blogėjanti būklė;
3.Histopatologiškai patvirtinta bent vieno organo ar audinio smulkiųjų kraujagyslių okliuzija;
4.Laboratoriniais tyrimais patvirtintas antifosfolipidinių antikūnų (LA ir/ar antikadiolipininių antikūnų) buvimas.
1.Visi 4 kriterijai**; 2.Visi 4 kriterijai***; 3. 1,2 ir 4;
4. 1,3 ir 4.
Visi 4 kriterijai.
Jeigu pacientui anksčiau nebuvo nustatytas AFS, antifosfolipidinių antikūnų buvimas turi būti patvirtintas du ar daugiau kartų (tyrimas atliktas ne dažniau nei kas 6 sav.).
*paprastai nustatoma kraujagyslių okliuzija, taikant vizualizavimo metodus; taip pat inkstų pakenkimas, kurį parodo 50 proc. padidėjęs serumo kreatinino rodiklis; sunki sisteminė hipertenzija (>180/100 mmHg) ir/ar proteinurija (>500 mg/24h).
**tik dviejų organų, sistemų ir /ar audinių pažeidimai.
***kai nėra patvirtinimo laboratoriniais tyrimais mažiausiai prieš 6 sav. dėl ankstyvos paciento mirties. LA lupus antikoaguliantas.
Tęstinių tyrimų “Euro-Phospholipid Project” laikotarpiu, 5-erius metus, buvo stebima 1000 AFS sergančių pacientų. Studijos metu nustatyta, kad sergant AFS išgyvenamumas siekia 94% [5]. Per šį laikotarpį mirė 53 pacientai (5,3 proc.). Dažniausios mirties priežastys buvo bakterinės infekcijos (21 proc.), MI (19 proc.), insultas (13 proc.), hemoragija (11 proc.), KAFS (9 proc.), plaučių embolija (9 proc.).
1.2. Antifosfolipidinio sindromo išsivystymo mechanizmai
1.2.1. Oksidacinio streso įtaka AFS išsivystymui
Manoma, kad AFS gali lemti padidėjęs oksidacinis stresas. Fermento paraoksonazės aktyvumas, kuris lemia didelio tankio lipoproteinų antioksidacines savybes, AFS atveju yra sumažėjęs. Grynas β2-glikoproteinas I yra sudarytas iš 4 domenų (I–IV), kurie tarpusavyje sudaro du disulfidinius
tiltelius, ir V-ojo domeno, turinčio papildomą disulfidinį tiltelį. Sveikų pacientų plazmoje β2GPI turi
tiolio –SH grupę. Šios formos β2GPI apsaugo endotelį nuo reaktyvių deguonies formų (ROS) [6], o
antifosfolipidiniai antikūnai skatina ROS kauptis ląstelių viduje [7].
β2GPI gali būti ir žiedinės formos, kaip I domenas sąveikauja su V-uoju. Tokiu atveju, kritinis
B limfocitų epitopas yra “paslėptas” nuo imuninės sistemos. β2GPI jungiantis su neigiamą krūvį
turinčiu fosfolipidų paviršiumi, žiedinė jo forma virsta į kablį. Taip I-asis β2GPI domenas tampa
14 1 pav. Schematinis kablio ir žiedinės β2GPI konformacijos vaizdas. Pagal [8].
(A) 5 domenus (DI-DV) turintis β2GPI junginyje su antikūnais prieš β2GPI.
(B) Tikėtinas plazmos β2GPI modelis. Juodi taškai vaizduoja aminorūgštis, nepaveikias tripsinui; juoda rodyklė vaizduoja
antikūnų prieš β2GPI prisijungimo sritį. Žiedinėje konformacijoje, juodas apskritimas žymi sritį su “paslėptomis”
aminorūgštimis, kurios dalyvauja antikūnams prisijungiant prie β2GPI, žiedinę konformaciją užtikrina DV ir DI tarpusavio
sąveika.
Pacientams, sergantiems AFS, būdingas padidėjęs oksiduoto β2GPI kiekis, sumažėjęs
paraoksonazės aktyvumas, padidėjęs lipidų peroksidacijos šalutinių produktų kiekis, APS sergančių pacientų monocituose nustatytas padidėjęs viduląstelinis ROS kiekis [7].
1.2.2. Nusilpusi endotelio azoto oksido sintetazės funkcija
Pacientams, kurie serga AFS, yra sutrikęs kraujagyslių atsipalaidavimas, susijęs su endotelio azoto oksido poveikiu [9]. Nustatyta, kad AFS segančioms moterims didelio tankio lipoproteinų cholesterolis slopina endotelio azoto oksido gamybą. Endotelio ląstelių išskiriamas azoto oksidas yra svarbus normalios endotelio funkcijos rodiklis. Endotelio azoto oksido sintetazė jį gamina iš L-arginino. Dėl autoantikūnų prieš β2GPI poveikio sumžėja azoto oksido kiekis, nes slopinamas azoto
oksido sintetazės aktyvumas, o tai leidžia monocitų adheziją prie endotelio [10]. 1.2.3. Anti-β2GPI sukelta receptorių aktyvacija
Agar C ir kt. [8] parodė žiedinę plazmos β2GPI struktūrą, kurią palaiko V ir I domenų saveika.
Anijoninio paviršiaus ir V β2GPI domeno sąveikos metu dėl anijoninio poveikio struktūra įgauna
kablio (atvirą) formą. Tokia konformacija leidžia antikūnams prieš β2GPI lengviau prisijungti prie
15 AFS atveju nustatomas β2GPI polimorfizmas: leuciną pakeičia valinas. Šis polimorfizmas
susijęs su aktyvesne anti-β2GPI produkcija, ir padidėjusiu β2GPI antigeniškumu. Nustatyta, kad β2GPI
I domenui specifiški anti-β2GPI yra susiję su išaugusia trombozės rizika AFS atveju. Rahgozar ir kt.
nustatė, kad β2GPI jungiasi prie trombino ir ši sąveika skatina hepariną/heparino kofaktorių II
nuslopinti trombino veikimą. Antikūnų prieš β2GPI prisijungimas silpnina β2GPI ir trombino sąveiką ir
trombino aktyvumas didėja [11].
β2GPI jungiasi ir su ApoER2′, ApoE receptoriaus 2 (ApoER2) atmaina, kuri randama
trombocituose, šioje sąveikoje dalyvauja β2GPI V domenas. β2GPI prisijungimas prie ApoER2′ skatina
trombocitų aktyvaciją ir agregaciją. Šis reiškinys buvo pastebėtas tik su anti-β2GPI antikūnais (su
normalios plazmos β2GPI nestebėta), o tai rodo, kad kai kurias anti-β2GPI antikūnų savybes lemia
β2GPI dimerizacija ir dimerizuoto β2GPI sąveika su ląstelių paviršiaus receptoriais. ApoER2
tarpininkavimas nuo AFA priklausančiuose patogenezės veiksmuose in vivo įrodytas eksperimentuojant su pelėmis, kurioms nuslopintas ApoER2′ veikimas [12].
Dauginius baltyminius endotelio ląstelių paviršiuje esančius kompleksus, tokius kaip aneksinas A2 (prisijungęs prie β2GPI), TLR4 (angl. toll-like receptor), kalretikulinas ir nukleolinas, anti-β2GPI
paverčia signalinėmis molekulėmis. Monocitų lipidinėse salelėse β2GPI kolokalizuojasi su aneksinu
A2 ir TLR4, o anti-β2GPI stimuliuoja monocitus, taip padidindami audinių faktoriaus ekspresiją.
Trombotinio AFS atveju monocitai aktyvuojami dėl polikloninių antikūnų veikimo: antikūnai sukelia audinių faktoriaus ekspresiją, o tai skatina gamintis autoantikūnus, kurie sąveikauja su β2GPI [10].
1.2.4. Padidėjusi audinių faktoriaus ekspresija ir aktyvacija
AFS sergantiems pacientams nustatoma padidėjusi audinių faktoriaus ekspresija. Antifosfolipidiniai antikūnai sutrikdo normalią audinių faktoriaus (AF) ekspresiją tiek monocituose, tiek neutrofiluose, tiek ir endotelio ląstelėse (2 pav.). Pažeistuose monocituose sutrinka baltymų ekspresija. Baltymų ekspresijos pokyčiai rodo, kad šių leukocitų aktyvinimas yra susijęs su autoimuniniais procesais, kurie siejami su prokoaguliacine būkle. AKA aktyvina monocitus intensyviau išskirti audinių faktorių [11]. AF yra išorinio kraujo krešėjimo kelio iniciatorius, neaktyvioje formoje esantis ant ląstelių paviršiaus. Įvykus kraujagyslių pažeidimui, išsiskiria fosfatidilserinas ir audinių faktorius aktyvinamas. Prie aktyvaus AF jungiasi VIIa faktorius, o tai lemia IX ir X faktorių aktyvaciją. AF keitimąsi iš neaktyvios būsenos į aktyvią lemia tiolio mainų reakcijos. Šių mainų reakcijų ekstraląstelinis reguliatorius yra baltymų disulfido izomerazė (BDI) (angl. PDI – protein disulfide isomerase). Būtent BDI lemia nuo ląstelių paviršiaus AF priklausančią trombozę in vivo [13].
16 1.2.5. Padidėjęs XI faktoriaus laisvojo tiolio kiekis
Pacientams, sergantiems AFS nustatytas padidėjęs XI faktoriaus laisvojo tiolio formos kiekis. Nustatyta, kad vienas iš AFS lemiančių veiksnių yra sutrikusi XI faktoriaus aktyvacija. XI faktorius yra profermentas, kurį aktyvina XIIa. XIa faktorius yra atsakingas už IX faktoriaus aktyvinimą. FXI yra fermentų oksidoreduktazės tioredoksino1 ir BDI substratas. Dėl BDI ar aktyvaus baltymo tioredoksino poveikio XI faktorius yra greičiau paverčiamas į XIa faktorių. Šios molekulės nukreipia XI faktorių į tarp grandžių esančias disulfidines jungtis tarp cisteino molekulių ir taip susidaro laisvasis tiolis [14].
1.2.6. Aneksino A5 apsauginio apvalkalo suardymas ir antikūnų sukelta komplemento komponento C5 aktyvacija
AFS patogenezėje svarbi β2GPI sąveika su aneksinais, fosfolipidus prisijungiančių baltymų
šeima, ypač aneksinais A2 ir A5. A2 veikia kaip endotelio ląstelių paviršiaus plazminogeno receptorius ir audinių plazminogeno aktyvatorius (aPA). A2 taip pat tarpininkauja β2GPI-anti-β2GPI antikūnų
kompleksams jungiantis prie endotelio ląstelių ir monocitų, o tai lemia ląstelių aktyvaciją ir krešėjimo sutrikimus [11].
Aneksiną A5 išskiria placentos gaurelių sincitiotrofoblastai ir kraujagyslių endotelio ląstelės. Aneksinas A5 prisijungia prie fostatidilserino ir suformuoja apvalkalą, kuris slopina prokoaguliacinių kompleksų formavimąsi. Anti-β2GPI, sąveikaudami su β2GPI suardo apsauginį apvalkalą ir leidžia
patekti fosfatidilserinui, o tai sudaro sąlygas trombozei. Aneksino A5 atsparumas antikoaguliaciniam aktyvumui koreliuoja su klinikiniais AFS atvejais. Antifosfolipidinių antikūnų paveiktose endotelio ląstelėse stebimas sumažėjęs aneksino A5 kiekis [10].
Pacientams su teigiamais antifosfolipidinių antikūnų tyrimų rezultatais, nustatytas labai didelis komplemento komponentų aktyvumas. C5a jungiasi su neutrofilais ir juos aktyvina ir tai sukelia AF reguliacijos sutrikimus [10].
17 2 pav. AFA inicijuotas krešulio susidarymo mechanizmas. Pagal [15].
1. – AFA sąveika su endoteliocitais (prisijungimas ant paviršiaus esančių β2GPI) → prokoaguliantinio ir prouždegiminio
endotelio fenotipo pasireiškimas. 2. AFA sutrikdyta audinių faktoriaus ekspresiją endoteliocituose ir kraujo monocituose → endotelio-leukocitų adhezija ir citokinų sekrecija. 3. AFA atpažįsta fosfolipidus prijungiančius baltymus, ekspresuojamus ant trombocitų → trombocitų agregacijos skatinimas. 4. AFA sąveika su plazmoje esančiais koaguliacijos kaskados komponentais → antikoaguliacinio aktyvumo inhibicija, poveikis fibrinolizei, natūralaus antikoagulianto aneksino A5 prisijungimas pakeičiamas į anijoninių struktūrų prisijungimą. Krešuliui susiformuoti reikia: AFA – pirminio iniciatoriaus ar kitų prokoaguliacinių būklių. Komplemento aktyvacija taip pat reikalinga krešuliui formuotis in vivo.
1.3. Klinikiniai AFS požymiai
AFS klinikiniai simptomai pasireiškia įvairiose organų sistemose: kraujagyslių, centrinėje nervų sistemoje, odoje, inkstuose, virškinamajame trakte, širdyje ir placentoje. Pagrindinis šio sindromo bruožas yra venų ir/ar arterijų trombozė. Dėl AFS gali atsirasti pažeidimai bet kurio organo kraujagyslėse. Tai, kad trombozės gali susidaryti įvairiose kūno srityse, rodo antikūnų svarbą hemostazėje. Trombozės linkusios pasikartoti tose pačiose vietose (t.y. jeigu įvyko arterinė trombozė, tai kitas trombas taip pat susidarys arterijose). Dažniausiai pasitaikantys AFS klinikiniai požymiai yra veninės trombozės. AFS klinikinės išraiškos gali būti įvairios: nuo lengvų (nežymi trombocitopenija, livedo reticularis (LR), opos kojų srityje, migrena) iki sudėtingų (išeminis infarktas, pasikartojantys persileidimai, vožtuvų nepakankamumas) ir negrįžtamų (dauginis organų nepakankamumas, KAFS) [16].
18 Ištyrus 1000 AFS pacientų paaiškėjo, kad 53,1 proc. būdingas pirminis AFS, 36,2 proc. – antrinis AFS (esant SRV). Dažniausiai pasitaikę AFS simptomai: giliųjų venų trombozė (38,9 proc.), trombocitopenija (29,6 proc.), livedo reticularis (24,1 proc.), insultas (19,8 proc.) ir plaučių embolija (14,1 proc.). Rečiau pasitaiko paviršinis tromboflebitas (11,7 proc.), trumpalaikiai išemijos priepoliai (11,1 proc.), hemolizinė anemija (9,7 proc.) ir epilepsija (7 proc.). Savaiminis persileidimas buvo pagrindinis AFS požymis 14 proc. tirtų moterų [5].
1.3.1. Venų trombozė
Kaip jau minėta anksčiau, kliniškai AFS dažniausiai pasireiškia giliųjų venų trombozėmis. Dėl GVT gali įvykti plaučių embolizacija, kuri lemia plaučių hipertenziją. Pažeistos gali būti ir kitos venos: poraktikaulinės, dubens, viršutinės pilvo, vartų, pažasties ir kt. Paprastai AFS pacientams pasireiškia dėl venų trombozės atsiradę sutrikimai: paviršinių venų tromboflebitas, viršutinės tuščiosios venos sindromas, inkstų venų trombozės, antinksčių infarktas, Addison'o sindromas, Budd Chiari sindromas, plautinė hipertenzija dėl pasikartojančios plaučių embolijos ir difuzinė plaučių hemoragija dėl mikrotrombų. Pasikartojančių venų tromboembolijų (VTE) rizika didėja esant antifosfolipidiniams antikūnams [17]. Analizuojant LA ir AKA IgG/IgM ryšį su venų tromboze, nustatyta statistiškai patikima sąveika tarp LA ir venų tromboembolijos, tačiau ryšys tarp AKA ir venų tromboembolijos – nepatvirtintas. Taip pat nustatyta, kad anti-β2GPI buvimas gali 5 kartus padidinti venų trombozės
tikimybę [16].
1.3.2. Arterijų trombozė
Arterijų trombozės taip pat yra vienas pagrindinių AFS bruožų, tačiau stebimos rečiau nei venų. Dažniausiai pažeidžiamos smegenų kraujagyslės, todėl insultas ir trumpalaikiai išemijos priepuoliai yra dažniausiai pasitaikančios arterijų trombozės pasėkmės. Jaunesnių nei 35-erių metų pacientų atveju, kai nėra aterosklerozės rizikos veiksnių, įvykus insultui ar trumpalaikiui išemijos priepuoliui, turėtų būti įvertina AFS ar kitų trombofilijų rizika. Arterijų trombozės gali susidaryti žąsto, poraktikaulinėse, pažasties, aortos, šlaunikaulio, mezenterinėse, tinklainės ir periferinėse arterijose [18].
Nustatyta ir koronarinės, inkstų bei žarnų pasaitų arterijų pažeidimo atvejų. Studija, kurios metu buvo tirta arterijų trombozės rizika pacientėms, vartojančioms geriamuosius kontraceptikus, parodė, jog LA yra didžiausias arterijų trombozės rizikos faktorius moterims iki 50 m. amžiaus, tuo tarpu AKA ir antikūnai prieš protrombiną nedidino išeminio insulto ar miokardo infarkto rizikos [16].
19 1.3.3. Centrinės nervų sistemos pažeidimai
Būtent CNS pažeidimai yra dažniausia mirties priežastis segant AFS Neurologiniai sutrikimai pasireiškia insultais ar trumpalaikiais išeminiais priepuoliais. Labai svarbu atlikti AFA tyrimus jauniems pacientams, kuriuos ištinka insultas, kai nėra akivaizdžių rizikos faktorių. Dažnu atveju pirmiausia įtariama remituojanti–recidyvuojanti išsėtinė sklerozė ir tik vėliau paaiškėja antifosfolipidinis sindromas. Magnetinio rezonanso tomografijos rezultatai, gauti sergant išsėtine skleroze, paprastai nesiskiria nuo tų, kurie gaunami sergant AFS. Šiuos sutrikimus padeda diferencijuoti AFA tyrimai ir atsakas į antikoaguliacinę terapiją [18]. Manoma, kad be trombozės, tiesioginė imuninė sąveika tarp AFA ir neuronų gali sukelti ir traukulius, chorėją bei transversinį mielitą. Sergant AFS paprastai pasitaiko tipiškas monofazinis transversinis mielitas [19]. Taip pat yra aprašyta ir kitų atvejų: idiopatinės intrakranijinės hipertenzijos, staigus neurosensorinis klausos praradimas dėl apytakos sutrikimų vidinėje ausyje, trumpalaikis miglotas regėjimas, laikina amnezija, neuropatija, distonija bei Parkinsono tipo sindromas. AFA buvimas sergant SRV siejamas su dažnesnėmis neurologinėmis komplikacijomis. AKA buvimas SRV segantiems pacientams dažniau susijęs su suvokimo sutrikimais. Daugiau nei 40 proc. AFS pacientų buvo nustatyti nežymūs kognityviniai sutrikimai ir židininiai smegenų baltosios medžiagos pakitimai [18].
1.3.4. Plaučių pažeidimai
Dažniausiai pasitaikantis AFS plaučių sutrikimas yra plaučių tromboembolija (9 proc.), o kaip pasėkmė – plautinė hipertenzija (2,2 proc.). Kiti, kiek rečiau pasitaikantys sutrikimai: in situ plaučių arterijos trombozė, ūminis kvėpavimo nepakankamumas, alveolinė hemoragija, fibrozinis alveolitas. Apie 3 proc. atvejų išsivysto lėtinė plaučių tromboembolija dėl kurios išsivysto lėtinė plautinė širdis. Embolas, susidaręs dėl triburio ar plaučių vožtuvo pažaidų taip pat gali sąlygoti plautinę hipertenziją [20]. KAFS atveju dažnai pasireiškia ūminis kvėpavimo nepakankamumo sindromas. Nepakankamumas išsivysto dėl smulkiųjų kraujagyslių trombozės ir sisteminio uždegiminio atsako. Difuzinė alveolių hemoragija pasireiškia kosuliu, dusuliu ir karščiavimu (su ar be hemoptizės), ir gali progresuoti į ūmų kvėpavimo nepakankamumą. Pacientai patiria hipoksiją, išsivysto anemija, o krūtinės srities rengeno vaizde matomi sparčiai plintantys alveoliniai infiltratai [21].
1.3.5. Odos pažeidimai
Odos pažeidimų atsiranda beveik pusei AFS pacientų, o maždaug trečdaliui dermatologinės pažaidos yra vienas pirmųjų AFS simptomų. Dažniausiai pasitaikantis odos pažeidimas yra livedo reticularis (LR), nustatomas 18–26 proc. segančiųjų [18]. Šis sutrikimas atsiranda dėl kraujo užsistovėjimo išsiplėtusiuose paviršiniuose kapiliaruose. 17–40 proc. pacientų LR nustatomas kaip
20 pirminis AFS požymis. LR apibūdinamas kaip svarbus arterinės trombozės rizikos veiksnys. Nustatytas ryšys tarp LR ir aukštų AKA titrų [22].
Tarptautiniuose kriterijuose skirtuose AFS klasifikacijai, LR apibrėžiama kaip violetinės, raudonos ar mėlynos spalvos, tinkliški ar margi odos plotai liemens, rankų ar kojų srityse, kurių atsiradimas nėra susijęs su žema aplinkos temperatūra. Tokius pakitimus lemia dalinė ar visiška smulkių ar vidutinių kraujagyslių, esančių odos-poodžio sluosnyje, spindžio okliuzija. Tokiu atveju tiesioginės imunofluorescensijos tyrimas yra neigiamas. LR nėra specifiškas AFS klinikinis simptomas, nes gali būti sutinkamas esant vaskulitams, vaistų sukeltai alergijai. LR dažniau nustatomas antrinio AFS, susijusio su SRV, atveju. Yra žinomas teigiamas ryšys tarp AKA IgG ir LR [23]. Dėl LR gali išsivystyti audinių infarktas, vadinamasis livedo vaskulitas, kuris pasireiškia purpurnėmis dėmėmis, mazgeliais odoje ir/ar skausmingais išopėjimais. Pacientams gali padidėti smegenų ir akių išeminių reiškinių rizika, arterinių trombozių, sisteminės hipertenzijos, širdies vožtuvų sutrikimų bei persileidimų.
AFS atveju galimi ir su LR nesusiję odos pažeidimai. Tokie pažeidimai paprastai yra ribotos odos nekrozės ar opos susidariusios dėl paviršinių venų uždegimo – flebito. Nekrozuojančios opos paprastai atsiranda apatinėse galūnėse: kulkšnis, pėdų ir blauzdų sritį apima nekrozuojanti purpura. Šios opos yra skausmingos, o joms sugijus lieka randai. Dėl flebito opos apatinėse galūnėse gali atsiverti net praėjus daugeliui metų po ligos [16].
1.3.6. Inkstų pakitimai
Dažnausiai pasitaikantys inkstų pažeidimai esant AFS yra inkstų arterijos trombozė arba stenozė, inkstų infarktas, inkstų venos trombozė ir inkstų funkcijos nepakankamumas [24]. Kliniškai AFS nefropatija pasireiškia teigiamais AFA tyrimų rezultatais kartu su kraujagyslių nefropatija, kuriai būdinga hipertenzija, nežymia proteinurija ir ūminiu ir/ar lėtiniu inkstų funkcijos nepakankamumu. AFS nefropatiją galima įtarti jauniems pacientams, kuriems nustatyta inkstų arterijos stenozė, aukštas kraujospūdis ir sutrikusi inkstų funkcija dėl nenustatytos priežasties. Pagrindiniai histopatologiniai šio pažeidimo požymiai yra trombozinės mikroangiopatijos (ūmios trombozės išraiška) ir fibrozinė intimos sluoksnio hiperplazija, aterosklerozė bei židininė žievinio sluoksnio atrofija (dėl lėtinių kraujagyslių pakitimų) [24]. Biopsija patvirtintas inkstų funkcijos nepakankamumas turi statistiškai patikimą ryšį su LA, tačiau su AKA ryšio nėra [25]. AFS nefropatija patvirtinta beveik 40 proc. SRV sergančių pacientų, kai yra padidėję AFA titrai ir tik 4,3% SRV pacientų, kai AFA nebuvo nustatyta [16]. AFS nefropatijai būdingas stiprus ryšys su LA ir AKA bei LR.
21 1.3.7. Širdies pažeidimai
Širdies pažeidimus apima besimptomiai vožtuvų pakitimai, aterosklerozė, miokardo infarktas (MI), trombai vidinėje širdies dalyje, pasikartojančius insultus sukeliančios vegetacijos, plaučių hipertenzija, kardiomiopatija ir diastolinė disfunkcija. Nustatyta, kad AFA yra tiesiogiai susiję su intensyvesne aterogeneze. AFS pacientams, patiriantiems intervencijas dėl ūmaus MI būdinga didenė trombozių rizika [26].
Dėl AFS atsiranda vožtuvų pažeidimų: vožtuvų sustorėjimas ir regurgitacijos, vegetacijų ant vožtuvų susidarymas, retai – stenozės. Esant šiems vožtuvų pažeidimams padidėja embolizacijos rizika, o kartais vožtuvą reikia pakeisti. Dažniausiai pažeidžiami mitralinis ir aortos vožtuvai [18]. Studija parodė, kad aukšti AKA titrai yra nepriklausomas ŪMI ar staigios širdies mirties rizikos faktorius [16].
1.3.8. Hematologiniai pakitimai
Sergant AFS galimi hematologiniai sutrikimai: trombocitopenija, autoimuninė hemolizinė anemija, Evan's sindromas, kaulų čiulpų nekrozė bei trombozinė mikroangiopatija. Trombocitopenija (trombocitų skaičius mažesnis nei 100-150x109/l) nustatoma maždaug 20 proc. pacientų, sergančių
pirminiu AFS ir kiek daugiau nei 40 proc. pacientų, segančių antrine AFS forma kartu su SRV [27]. Tokia trombocitopenija nėra sudėtinga, todėl medicininės intervencijos nėra būtinos. Nors trombocitopenijos priežastys segant AFS nėra aiškiai apibrėžtos, manoma, kad AFA sąveika su trombocitais sukelia trombocitų agregaciją ir trombų susidarymą. Autoimuninė hemolizinė anemija nustatoma nuo 6,6 proc. iki 9,7 proc. AFS pacientų [5]. Taip pat žinoma, kad 55–72 proc. autoimunine hemolizine anemija sergančių pacientų nustatomi AFA. Teigiama, kad AKA prisijungia prie AFS ir hemolizine anemija sergančių pacientų eritrocitų paviršiaus, tačiau antigenas, sąveikaujantis su AFA nėra nustatytas [16].
1.4. Antifosfolipidinio sindromo laboratorinė diagnostika
Sergant AFS trombai gali susidaryti tiek venose, tiek arterijose ir kapiliaruose. Dažniausiai trombai susidaro apatinių galūnių venose ir galvos smegenų arterijose, tačiau tai gali įvykti bet kurio audinio ar organo kraujagyslėse. Dažnai moterims AFS susijęs su ginekologine anamneze. AFS apibrėžia klinikiniai ir laboratoriniai kriterijai (2 lentelė) [28].
2 lentelė. AFS diagnostiniai kriterijai
AFS klinikiniai kriterijai AFS laboratoriniai kriterijai
1. Kraujagyslių trombozė: ≥1 klinikinis arterinės, veninės ar smulkiųjų kraujagyslių trombozės atvejis;
1.LA nustatomas paciento plazmoje*;
2.AKA IgG ir/ar IgM izotipų titras serume ar plazmoje yra vidutinis ar aukštas (> 40 GPL ar
22 2. Vaisiaus mirtimi pasibaigęs nėštumas:
a. Nenustatyta morfologiškai išsivysčiusio vaisiaus (≥1) mirtis 10-ąją nėštumo savaitę ar anksčiau;
b. ≥1 morfologiškai išsivysčiusio vaisiaus priešlaikinis gimdymas iki 34 nėštumo savaitės, dėl eklampsijos ar sunkios preeklampsijos arba aiškių placentos pažeidimo požymių;
c. ≥3 iš eilės sekančių savaiminių persileidimų iki 10 nėštumo savaitės, kai motina turi anatominių ar hormonų sutrikimų ir atmetama genetinių sutrikimų tikimybė.
MPL)*;
3. Nustatomas antikūnų prieš β2-glikoproteiną I
IgG ir/ar IgM izotipų titras serume ar plazmoje*.
*≥2 kartus, ne mažiau nei 12 sav. intervalu.
LA lupus antikoaguliantas; AKA antikūnai prieš kardiolipiną. 1.4.1. Lupus antikoaguliantas (LA)
LA yra in vitro reiškinys, kurio metu stebimas nuo fosfolipidų priklausančios koaguliacijos laiko prailgėjimas. Norint nustatyti LA reikia atlikti keletą žingsnių: pirmiausia nustatomas prailgėjęs krešulio susidarymo laikas, tuomet atliekamas maišymo mėginys slopiklio buvimui nustatyti, taip pat reikalingas fosfolipido priklausomybės nuo slopiklio įrodymas.
Norint nustatyti silpną LA, turėtų būti naudojami bent du tyrimo metodai. LA nustatyti atliekamas dRVVT (angl.dilute Russell viper venom test) tyrimas praskiestų Russell‘o angies nuodų krešėjimo laiko metodu, taip pat ADTL (naudojami LA jautrūs reagentai) arba praskiesto protrombino laikas (angl. dilute prothrombin time). Maišymo mėginys atliekamas norint nustatyti slopiklį, o taip pat įrodyti slopiklio priklausomybę nuo fosfolipidų (naudojama didelė fosfolipidų koncentracija, trombocitus neutralizuojantis reagentas ar LA nejautrus reagentas). Maišymo mėginiai yra vienas iš LA kriterijų, kuris patvirtina specifiškumą, tačiau šių tyrimų trūkumas yra tas, kad silpnas LA gali būti nenustatytas [28].
LA yra svarbesnis nėštumo sutrikimų veiksnys nei kiti antifosfolipidiniai antikūnai, o anti-β2GPI poveikis nėštumui nėra nustatytas. Manoma, kad AKA IgM ir IgG izotipai turi įtakos
pasikartojantiems persileidimams, tačiau nebuvo nustatyta izoliuotų AKA IgM reikšmė. Nustatyta, kad LA tyrimas yra specifiškesnis trombozei nei antikardiolipininių antikūnų ar anti-β2GPI [28]. Buvo
nustayta, kad atvejai, kai teigiamas tik LA (AKA ir anti-β2GPI neigiami) nėra susiję su trombozės
rizika [29].
Pacientai, kurių teigiamas LA, o taip pat pailgėjęs dRVVT ir aktyvintas dalinis tromboplastino laikas (ADTL) dažniau serga tromboze nei tie, kuriems nustatytas tik teigiamas LA. IgM ir IgA izotipų antikūnai yra mažai specifiški [30].
23 1.4.2. Antikūnai prieš kardiolipiną
Nustatyta, kad įvykus apoptozei, kardiolipinai ir jų metabolitai iš mitochondrijų patenka į kitas ląstelės organeles ir ląstelės paviršių, kur sąveikauja su autoantikūnais esančiais AFS sergančio paciento serume [31]. Patekę į ląstelės paviršių antikūnai prieš kardiolipiną (ir/ar jų metabolitai) "išvengia" įprasto transformavimo ciklo. Šis veiksnys lemia antikūnų prieš kardiolipinus gamybą. Nors AKA tyrimas yra gana jautrus, tačiau jis gali būti teigiamas įvairių ligų atveju, įskaitant jungiamojo audinio ir infekcines ligas, tokias kaip sifilis, Coxiella burnetii sukelta infekcija ir AIDS. Tokiais atvejais stebimas mažas IgM titras, nebūdingi su AFS susiję klinikiniai simptomai, todėl asociacijos su AFS nėra.
Teigiamas AKA testas (LA ir anti-β2GPI yra neigiami) nėra pakankamas trombozės (išskyrus
arterinę trombozę) rizikos faktorius [29]. AKA ELISA gali padėti nustatyti antikūnus prieš baltymus, kurie sąveikauja su fosfolipidais, o taip pat anti-β2GPI. Pacientams, sergantiems tromboze IgM
nustatymas neturi diagnostinės vertės. Pacientėms su persileidimu ar negyvagimiu anamnezėje IgM reikšmė nėra nustatyta. Vertinant klinikinę reikšmę reikia atsižvelgti į tai, ar pacientas turi LA, AKA/anti-β2GPI ar abu, taip pat įvertinti izotipų titrus. IgA tyrimai nėra rekomenduojami [29].
1.4.3. Antikūnai prieš β2-GPI
Įprastiniai anti-β2GPI. Baltymų kofaktorius, apolipoproteinas β2-GPI priklauso komplemento
komponentų veiklą reguliuojantiems baltymams ir yra natūralus koaguliacijos inhibitorius. Tam, kad AFA prisijungtų prie kardiolipinų, aplinkoje būtinai turi būti β2-GPI.
β2-GPI yra monomeras, kurį sudaro penki homologiški baltymai – domenai. Penktasis domenas
formuoja kilpą fosfolipidų prisijungimui. Dėl šios kilpos prie β2-GPI gali prisijungti neigiamą krūvį
turintys fosfolipidai (fosfatidilserinas ar kardiolipinas). Plazmoje gali cirkuliuoti dvi skirtingos β2-GPI
konformacijos: uždara žiedinė forma ir atvira forma [8]. Žiedinę β2-GPI formą lemia sąveika tarp
pirmojo ir penktojo β2-GPI domenų. Atvirojoje β2-GPI formoje lieka neapsaugotas pirmojo domeno
epitopas, todėl prie jo gali prisijungti antikūnai. Antikūno ir β2-GPI kompleksai gali prisijngti prie
įvairių receptorių (pvz.: TLR2, TLR4, aneksino A2, glikoproteino 1bα ir kt.) ar ląstelių (endotelio, trombocitų, monocitų ir trofoblastų) [32]. Tokia įvairiapusė sąveika gali inicijuoti viduląstelinius signalus ir uždegininį atsaką [33].
β2-GPI sąveikauja su oksiduotais mažo tankio lipoproteinais (oMTL), todėl neutralizuojamas
uždegiminis atsakas. β2-GPI ir oMTL kompleksai yra imunogeniški. Nustatyta, kad tarp antikūnų prieš
šiuos kompeksus ir arterijų trombozių AFS sergančiųjų organizme yra ryšys [34]. Anti-β2GPI yra labai
24 jautrumas yra didesni nei anti-β2GPI IgG [34]. Teigiami anti-β2GPI buvo nustatyti ir esant SRV
(11-39%) bei infekcinėmis ligomis [35].
Antikūnai prieš atskirus β2GPI domenus. Anti-β2GPI apima grupę antikūnų, kurių taikiniai yra
skirtinti baltymo epitopai. Nustatyta, kad antikūnus prieš pirmąjį domeną sieja stiprus ryšys su trombozėmis ir persileidimais. Anti-β2GPI, specifiški pirmajam domenui, buvo aptikti daugeliui AFS
pacientų ir yra siejami su LA buvimu ir veninimis trombozėmis (jautrumas 85 proc., specifiškumas 99,5 proc.) [36].
Anti-β2GPI IgA. Buvo siekiama nustatytinti anti-β2-GPI IgA sąsają su klinikiniais AFS
požymiais. Pastebėta, kad anti-β2GPI ir AKA IgA buvimas yra susijęs su trombozėmis ir
trombocitopenija; moterims, kurios patyrė pasikartojančius spontaninius persileidimus ar turėjo negyvagimius anamnezėje, buvo nustatytas anti-β2GPI IgA, kai LA buvo neigiamas [37]. Tiriant
pacientus, atitinkančius klinikinius AFS kriterijus (nepriklausomai nuo serologinių žymenų) nustatyta, kad 22,4 proc. tiriamųjų buvo teigiami tik anti-β2GPI IgA [37]. Taigi, AFS pacientams turėtų būti
nustatytas ir anti-β2GPI IgA kiekis, ypač tuomet, kai kiti rutininiai tyrimai yra neigiami.
1.4.4. Antikūnai prieš protrombiną ir protrombino/fosfatidilserino kompleksus
Ilgalaikė studija parodė, kad IgG izotipo antikūnai prieš protrombiną yra labiausiai tinkami trombozės rizikai nustatyti SRV atvejais [34]. Vėlesni tyrimai atskleidė, kad antikūnai prieš protrombiną gali prisijungti prie protrombino/fosfatidilserino kompleksų. Bertolaccini ir kt. neseniai parodė, kad antikūnų prieš protrombino/fosfatidilserino kompleksus (IgG ir/ar IgM) buvimas yra susijęs su arterinių ar veninių trombozių susidarymu [37]. Taip pat nustatyta, kad šiuos antikūnus su LA sieja labai stiprus ryšys ir jie yra jautresni bei specifiškesni nei AKA, todėl antikūnų prieš protrombino/fosfatidilserino kompleksus nustatymas gali būti naudojamas trombozės rizikai nustatyti ir patvirtinti. Be to, šis tyrimas naudingas AFS diagnostikai, kai būdingi klinikiniai požymiai, tačiau klasikiniai AFA tyrimai rodo neigiamus rezultatus [38].
1.4.5. Antikūnai prieš aneksiną A5 ir aneksiną A2
Aneksinai sutinkami visame žmogaus organizme. Tai nuo kalcio prikausomi baltymai, kurie sąveikauja su fosfolipidais. Aneksinas A5 (AnA5) yra antikoaguliacinis baltymas, dažniausiai aptinkamas trofoblastuose ir kraujagyslių endotelio ląstelėse. Nuo β2-GPI priklausomi AFA trukdo
AnA5 prisijungti prie endotelio, todėl susidaro trombai. Atlikta tyrimų, kurie parodė, kad didelė dalis AFS pacientų yra atsparūs AnA5 [39].
Aneksinas A2 (AnA2) yra β2GPI prisijungimo sritis endotelio ląstelėse ir monocituose. Dėl
kryžminių AnA2-β2GPI jungčių ląstelės aktyvinamos, o to pasėkmė yra susidariusi prokoaguliacinė
25 nustatyti dažniau nei sveikiems ar sergantiems SRV, tačiau jie taip pat nustatyti ir kitų autoimuninių sutrikimų atveju, o tai sumažina jų specifiškumą [34].
1.4.6. Vimentinas
Vimentinas yra citoskeletą sudarantis baltymas, aptinkamas ląstelių paviršiuje. Jį išskiria apoptoziniai neutrofilai ir T limfocitai, aktyvinti makrofagai, trombocitai, kraujagyslių endotelio ląstelės ir skeleto raumenų ląstelės. Antikūnai prieš vimentiną pirmąkart nustatyti pacientams, sergantiems SRV. Patebėta sąsaja tarp antikūnų prieš vimentiną ir AKA. Antikūnai prieš vimentiną gali aktyvinti trombocitus ir leukocitus, taip sukeldami didesnę P-selektino, fibrinogeno, AF sekreciją bei skatindami trombocitų-liaukocitų konjugatus [40]. Trombocitų vimentinas prisijungia fibronektino-plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorių ir dalyvauja fibrinolizės ir trombo formavimosi procese. Diagnostinė antivimentininių antikūnų reikšmė nėra visiškai aiški [31].
Vimentinas gali prisijungti prie kardiolipininių antikūnų dėl elektrostatinės sąveikos tarp teigiamą krūvį turinčių aminorūgščių ir neigiamą krūvį turinčių kardiolipininių antikūnų aminorūgščių. Sudėtiniai antikūnai prieš antivimentino/kardiolipino kompleksus nustatyti beveik visiems AFS sergantiems pacientams [31].
1.5. Seroneigiamas antifosfolipidinis sindromas
Seroneigiamo (SN-) antifosfolipidinio sindromo sąvoka naudojama nusakant diagnozę pacientams, kuriems būdingi AFS klinikiniai simptomai, tačiau dažniausiai atliekamų tyrimų (AKA, anti-β2GPI ir LA) rezultatai yra neigiami.
Antifosfolipidiniai antikūnai sąveikauja su fosfolipidus prisijungiančiais baltymais (dažniausiai β2-GPI, protrombinu, C baltymu, aneksinu V, aneksinu II, oksiduotais mažo tankio lipoproteinais)
fosfolipidų-baltymų kompleksais ir neigiamą krūvį turinčiais fosfolipidais [31]. AFS biožymuo – lizo(bis)fosfatidinė rūgštis yra analogiško jautrumo ir specifiškumo kaip anti-β2GPI. Manoma, kad šis
žymuo atsiranda dėl teigiamo LA. Daliai pacientų, sergančių SRV ir turinčių trombozės atvejų anamnezėje, kuriems buvo nustatyti neigiami AKA ir LA, aptikta antiprotrombininių antikūnų. Taigi, antikūnų prieš protrombiną tyrimas gali būti naudingas tiriant SN-AFS [41].
ELISA metodu serumo IgG prieš vimentino/kardiolipino kompleksus buvo nustatyti daugiau nei pusei (55 proc.) SN-AFS ir beveik visiems (92 proc.) AFS pacientams. Serumo IgM prieš vimentino/kardiolipino kompleksus tyrimų rezultatai buvo analogiški. Tyrimai, pakartoti po 12 savaičių, patvirtino visus SN-AFS pacientų pirmųjų tyrimų rezultatus [40]. AFS pacientai dažniausiai miršta dėl giliųjų venų trombozės, miokardo infarkto ir insulto, todėl svarbu taikyti tinkamą diagnostiką pacientams, kuriems įtariamas AFS. Tai svarbu ir tuomet, kai rutininiai AFA tyrimai
26 pakartotinai yra neigiami ir kuomet AFS diagnozė yra patvirtinta. Savalaikė diagnostika leidžia taikyti ilgalaikį gydymą antikoaguliaciniais preparatais – tai efektyviausia priemonė šios ligos atveju.
Kai kuriais atvejais, stebint tipiškus AFS klinikinius simptomus, klaidingai nustatomas LA, AKA IgG ir IgM bei anti-β2GPI seroneigiamumas [41]:
a) silpną LA sunku nustatyti, kai trombocitai netinkamai atskiriami nuo plazmos;
b) nedidelė dalis pacientų su neigiamais AKA IgG ir IgM arba anti-β2GPI gali turėti teigiamą
IgA;
c) kai kurie pacientai, kurie yra seroneigiami AFA (AKA ir anti-β2GPI) gali turėti antikūnų
prieš kitus membraninius fosfolipidus (pvz. fosfatidilseriną, fosfatidinę rūgštį ir kt.), kurie nėra nustatomi rutininių kraujo tyrimų metu;
d) teigiama, kad AFA gali atpažinti baltymus (pvz.: β2GPI) be fosfolipidų. AFA taikiniais taip
pat gali būti protrombinas, C baltymas, S baltymas ir placentos antikoaguliacinis baltymas;
e) esant nefroziniam sindromui stebimas AFA sumažėjimas: AFA pasišalina su šlapimu, gali būti sutrikusi AFA sintezė arba suintensyvėjęs AFA katabolizmas.
1.6. Vaikų AFS
Vaikų (pediatrinis) AFS gali prasidėti naujagimystės laikotarpiu, vaikystėje ar paauglystėje dėl de novo AFA gamybos. Dažniausiai skiriamas naujagimių ir vyresnių vaikų AFS. Vaikams gali būti nustatomas ir KAFS, tuomet pasireiškia greitai susidarančios dauginės organų trombozės ir mikrotrombozės.
Sudarytų atskirų kriterijų pediatrinio AFS vertinimui nėra. Gali būti taikomi modifikuoti Sapporo kriterijai, tačiau jie nėra patvirtinti (3 lentelė) [43].
3 lentelė. Modifikuoti Sapporo kriterijai vaikų AFS (moksliniams tyrimams)
Klinikiniai kriterijai Laboratoriniai kriterijai
Kraujagyslių trombozė: patvirtintas ≥1 klinikinis arterinės, veninės ar smulkiųjų kraujagyslių trombozės atvejis bet kuriame audinyje ar organe.
1. LA nustatytas kraujo plazmoje*;
2. Vidutiniai ar aukšti AKA IgG/IgM titrai (>=40 GPL/MPL)*;
3. Vidutiniai ar aukšti anti–β2GPI IgG/IgM titrai
(>=40 GPL/MPL)*.
AFS diagnozė svarstoma esant klinikiniam kriterijui ir bent vienam laboratoriniam kriterijui. Šie kriterijai rekomenduojami vaikų AFS moksliniams tyrimams, o ne diagnostikai.
*nustatyta ≥2 kartus, kai intervalas tarp tyrimų yra bent 12 sav.
AFS – antifosfolipidinis sindromas; AKA– antikardiolipininiai antikūnai; Anti-β2GPI – Antikūnai prieš β2 glikoproteiną I;
LA– lupus antikoaguliantas.
Vaikų AFS registre [42] skelbiama, kad pirminiu AFS dažniau serga jaunesni vaikai ir jiems dažnesnės arterinės trombozės, o antrinis AFS būdingesnis vyresniems vaikams ir pasireikškia
27 veninėmis trombozėmis. Daugumai (83 proc.) antrinio AFS pacientų buvo nustatyta SLE ir vaistų sukeltas „lupus-like“ sindromas.
1.6.1. Naujagimių AFS
AFS sergančių moterų naujagimiai. Naujagimių, kuriuos pagimdo AFS sergančios moterys, trombozės yra retos, nors AFA praeina placentos barjerą. Tai paaiškinama skirtingu IgG poklasių gebėjimu praeiti pro placentą. Efektyviausiai pro placentą praeina IgG1, toliau seka IgG4, IgG3 ir IgG2 [43].
Atlikta 16-kos naujagimių su periferine tromboze, kuriuos pagimdė moterys su nustatytu AFA kiekiu, retrospektyvinė analizė [44]. Dažniausiu atveju (81 proc.), trombozės buvo arterinės, pusė jų – insultai dėl tromboembolijos gimdoje. 75 proc. naujagimių, po gimimo ar naujagimystės laikotarpiu nustatytų AFA, izotipas sutapo su motinų, o tai patvirtina antikūnų praėjimo pro placentą hipotezę.
Naujagimių AFS de novo. Naujagimiams de novo AFA sintezę gali sukelti antriniai iniciatoriai (priešlaikinis gimdymas, stresas gimdymo metu, dehidratacija, sepsis ir įgimta trombofilija) [45].
1.6.2. Vyresnių vaikų AFS
Vaikų AFS nustatomas įvykus trombozei ir nuolat stebint padidėjusį AFA kiekį. Dažniausiai vaikams tromboembolijos susidaro dėl įgimtų širdies ligų, piktybinių navikų ir AFS [46]. Svarbiausias nuo AFA nepriklausantis trombozės rizikos faktorius vaikams yra centrinės venos kateteris [43]. Anot vaikų AFS registro, [42] įgimti trombozės rizikos faktoriai (Leideno faktoriaus mutacija, baltymo P ar S trūkumas, protrombino geno mutacija) yra dažnesni vaikams, segantiems AFS. Svarbu paminėti, jog vaikams trombozės, o ypač susijusio su AFA, yra labai retos.
33 proc. AFS segančių pacientų nustatyti visų tipų AFA, o 67 proc.– tik vienas ar du tipai, todėl labai svarbu rutiniškai tirti visus AFA. Vaikams dažniau būdingos didesnės LA reikšmės nei suaugusiems [42]. Rožiĝ M ir kt. studijoje tiriant 100 vaikų su nustatytais AFA, pastebėta, kad trombozės pasireiškė tik 10 proc. pacientų, kai tuo tarpu nuo AFA priklausantys požymiai be trombozės būdingi net 77 proc. [47].
1.6.3. AFS sergančių vaikų nervų sistemos ir hematologinai pažeidimai
Dažniausias neurologinis sutrikimas AFS sergantiems vaikams yra insultas ar laikini išeminiai priepuoliai dėl trombozės ar smegenų išemijos, taip pat dažnesni migrenos epilepsijos ir chorėjos atvejai.
Avcin T ir kt. 142 vaikams nagrinėjo ryšį tarp epilepsijos ir AFA. 30 proc. pacientų nustatytė bent vieną iš AFA (AKA arba anti-β2GPI) ir kurį patvirtino pakartotiniu tyrimu po ≥ 6 sav. [42]. Kitos
6-28 iems nustatytas LA, o anti-β2GPI nenustatyta nei vienam [48]. Trumpalaikį AFA padidėjimą Avcin T
ir kt. stebėjo 16,3 proc. sergančiųjų migrena ir 16,7 proc. su stipriu galvos skausmu [42].
AFS sergantiems vaikams būdingi tokie hematologiniai pakitimai, kaip trombocitopenija, hemolizinė anemija, leukopenija ir labai retai pasitaikantis LA hipoprotrombinemijos sindromas dėl antikūnų prieš protrombiną giminingumo [49].
1.7. AFS poveikis moterų vaisingumui
Dažniausiai AFS pasireiškia pasikartojančiais persileidimais ir preeklampsija [50]. Daugėja įrodymų, kad dėl AFS išsivysto nevaisingumas. Ši būklė, kuriai būdinga trombofilija siejama su priešlaikiniu gimdymu, kraujagyslių trombozėmis, gimdos augimo sulėtėjimu ir placentos atšoka (abruptio placentae) [51]. Sauer R ir kt. nustatė, kad moterims su idiopatiniu nevaisingumu (8 proc.) būdingos reikšmingai didesnės AFA koncentracijos nei sveikoms vaisingoms moterims (1,5 proc.). Didesnės AFA koncentracijos nustatomos ir moterims, patiriančioms pasikartojančius persileidimus [52].
Esant AFS veikia antikūnai prieš fosfolipidus, fosfolipidų-baltymų kompleksus ir fosfolipidus prisijungiančius baltymus. Manoma, kad šie antikūnai gali turėti įtakos reprodukcinių sutrikimų formavimuisi. Yra žinoma, kad AKA ir LA tyrimai gali būti naudingi nustatant su AFS susijusį nevaisingumą. Eksperimentiniai modeliai parodė, kad antikūnai prieš fosfatidilseriną ir AKA, kuriems dažnai būdingas kryžminis reaktyvumas, ardo trofoblastą, trukdo formuotis sincitiumui bei slopina žmogaus chorioninio gonadotropino gamybą [53].
Apie 60 proc. spontaninių persileidimų priežastys nežinomos. Kurią šių persileidimų dalį lemia AFS nustatyti sudėtinga dėl keletos priežasčių: skirtingos pasikartojančių persileidimų aplinkybės, nepakankamai standartizuotų AFA nustatymo metodų, sudėtinga sudaryti tiriamųjų grupes pagal antikūnų titrą. Pastaruoju metu siūloma AFS sieti ne tik su pasikartojančiais persileidimais bet ir su nevaisngumu [54].
Atliekant studiją, kurioje dalyvavo 268 pacientės su diagnozuotu nevaisingumu, nustatyta, kad AFA labiau paplitę tarp moterų, kenčiančių nuo nevaisingumo nei tarp vaisingų moterų [55].
Dėl mokslinių AFS tyrimų duomenų trūkumo ne tik Lietuvoje, bet ir pasaulyje yra svarbu išanalizuoti kuo daugiau AFA tyrimų rezultatų, ypač atsižvelgiant į atskiras pacientų amžiaus grupes ir jų lytį. Pediatrinio AFS atvejai yra labai reti, todėl trūksta duomenų apie ligos paplitimą, dažnumą, trombozės riziką ir efektyvius gydymo metodus. Moterų nevaisingumo tyrimų modeliai rodo AFS reikšmingumą nevaisingumo etiologijoje, o pirminio AFS diagnostika vyresnio amžiaus žmonėms yra sudėtinga dėl gretutinių ligų. Anot Cervera R ir kt. dažniausiai AFA tiriami vyresniems pacientams su MI ar insultu, o šių antikūnų paplitimas tarp sveikų vyresnių žmonių nėra žinomas [56].
29
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tiriamasis kontingentas
256 pacientų (amžiaus vidurkis 32,18±14,64 m.), gydytų LSMU ligoninėje KK, demografiniai ir klinikiniai (preliminari diagnozė, nėštumų/gimdymų sk. ir kt.) duomenys iš tyrimų užsakymo lapelių rinkti nuo 2014-ųjų metų liepos mėn. iki 2015-ųjų liepos mėn. ir analizuoti atliktų tyrimų rezultatai. Tiriamieji suskirstyti į keturias amžiaus grupes ir detaliau analizuoti vaikų iki 18 m. amžiaus, vyresnių (virš 45 m.) pacientų bei vaisingo amžiaus (19–45 m.) moterų duomenys (3 pav.). Lietuvos Respublikos Sveikatos apsaugos ministerijos Higienos instituto duomenimis, vaisingomis laikomos 15–49 m. amžiaus moterys. Šios analizės metu 15–18 m. amžiaus mergaičių laboratorinių tyrimų duomenys priskirti vaikų amžiaus grupei.
30
2.2. Ėminių ir mėginių paruošimas
Imunologiniams tyrimams pacientų kraujas surenktas į vakuuminę sistemą be priedų ar su krešulio aktyvatoriumi. Mėginiai centrifuguoti 1300-2000 x g 10 min centrifuga HANLAB ABC CB200(R) (Labmaster, Korėja). Imunologinių tyrimų atlikimui naudotas automatinis imunofermentinis analizatorius Gemini (STRATEC Biomedical systems, Vokietija). Nesant galimybės mėginius ištirti per 8 val., jie buvo laikomi 2–8°C temperatūroje ne ilgiau nei 48 val. Ilgesniam laikymui serumo mėginiai užšaldyti -20°C temperatūroje. Tyrimams nenaudoti ryškiai hemolizuoti, lipeminiai, su padidėjusiu bilirubino kiekiu ar mikroorganizmais užteršti mėginiai.
Krešėjimo tyrimams atlikti paciento kraujas paimtas į vakuuminę sistemą su natrio citratu 3,8% (0,129 M). Kraujas centrifuguotas 15 minučių 2500 x g (centrifuga Rotina 35 Hettich, Vokietija). ADTL ir lupus antikoaguliantas paciento kraujo plazmoje kokybiškai nustatytas naudojant automatinį analizatorių STA Compact Max (Diagnostica STAGO, Prancūzija).
2.3. Antikūnų prieš β2-glikoproteiną I imunofermentinis tyrimas
IgG ir IgM klasių imunoglobulinai prieš β2-glikoproteiną I žmogaus serume kiekybiniam
koncentracijos nustatymui taikytas imunofermentinis tyrimas (ELISA).
Naudotas reagentų rinkinys Aeskulisa β2-Glyco-GM (AESKU.DIAGNOSTICS, Vokietija).
Rinkinio analitinis jautrumas yra 1,0 U/ml, diagnostinis specifiškumas siekia 100 proc., o jautrumas – 47 procentų.
Plokštelė su 96 mikrošulinėliais yra padengta β2-GPI antigenu. Pacientų serumo mėginiai bei
medžiagos, skirtos kontrolei ir kalibracijai inkubuojami antigenu padengtos plokštelės mikrošulinėliuose. Antikūnai, esantys paciento serume, jungiasi prie minėtųjų β2-GPI antigenų,
susidaro antigeno-antikūno kompleksai. Nesusijungęs antikūnai ir kiti serumo baltymai yra pašalinami plaunant mikrošulinėlius. Susidarę antigeno-antikūno kompleksai inkubuojami su fermento krienų peroksidazės ir antikūnų prieš žmogaus imunoglobulinus G ar M konjugatu. Nesusijungęs konjugatas pašalinamas plokšteles praplaunant. Tuomet į mikrošulinėlius įpilama specifinio fermento substrato – TMB. Fermentui reaguojant su substratu susidaro spalvotas reakcijos produktas – matoma mėlyna tirpalo spalva. Ši reakcija sustabdoma naudojant hipochloritinės rūgšties tirpalą ir tuomet reakcijos mišinio spalva pakinta į geltoną. Reakcijos tirpalo spalvos pokyčio intensyvumas yra proporcingas antikūnų koncentracijai paciento serume ir yra išmatuojamas spektrofotometru, esant 450 nm ar 450/620 nm ilgio bangai. Tyrimo rezultatas išreiškiamas U/ml matavimo vienetais, norma: <12 U/ml, silpnai teigiama: 12–18 U/ml, teigiama: >18 U/ml.
31
2.4. Antikūnų prieš kardiolipiną imunofermentinis tyrimas
IgG, IgM ir IgA klasių imunoglobulinai prieš kardiolipiną žmogaus serume kiekybiniam koncentracijos nustatymui taikytas imunofermentinis tyrimas (ELISA).
Naudotas reagentų rinkinys Aeskulisa Cardiolipin-GM (AESKU.DIAGNOSTICS, Vokietija). Rinkinio analizinis jautrumas yra 1,0 GPL(MPL)/ml, diagnostinis specifiškumas SRV sergantiems pacientams siekia 70 procentų.
Plokštelė su 96 mikrošulinėliais yra padengta kardiolipino antigenu. Pacientų serumo mėginiai bei medžiagos, skirtos kontrolei ir kalibracijai inkubuojami antigenu padengtos plokštelės mikrošulinėliuose. Antikūnai, esantys paciento serume, jungiasi prie minėtųjų kardiolipino antigenų, susidaro antigeno-antikūno kompleksai. Nesusijungęs antikūnai ir kiti serumo baltymai yra pašalinami plaunant mikrošulinėlius. Susidarę antigeno-antikūno kompleksai inkubuojami su fermento krienų peroksidazės ir antikūnų prieš žmogaus imunoglobulinus G, M ar A konjugatu. Nesusijungęs konjugatas pašalinamas plokšteles praplaunant. Tuomet į mikrošulinėlius įpilama specifinio fermento substrato – TMB. Fermentui reaguojant su substratu susidaro spalvotas reakcijos produktas – matoma mėlyna tirpalo spalva. Ši reakcija sustabdoma naudojant hipochloritinės rūgšties tirpalą ir tuomet reakcijos mišinio spalva pakinta į geltoną. Reakcijos tirpalo spalvos pokyčio intensyvumas yra proporcingas antikūnų koncentracijai paciento serume ir yra išmatuojamas spektrofotometru, esant 450 nm ar 450/620 nm ilgio bangai. Tyrimo rezultatas išreiškiamas GPL(MPL)/ml matavimo vienetais, norma: <12 GPL(MPL)/ml, silpnai teigiama: 12–18 GPL(MPL)/ml, teigiama: >18 GPL(MPL)/ml.
2.5. Aktyvinto dalinio tromboplastino laiko nustatymas
ADTL nustatyti buvo naudojami reagentai:
- STA-PTT Automate 10 rinkinys; - STA-CaCl2 0,025 M tirpalas;
- STA-ScandiNorm: kontrolinė plazma, normalus lygis; - STA-ScandiPath: kontrolinė plazma, patologinis lygis.
Reagentų rinkinys STA-PTT Automate 10 (Diagnostica STAGO, Prancūzija) naudojamas tiriamojoje paciento plazmoje nustatyti ADTL taikant silicio metodą pagal Langell RD, Larrieu MJ, Weiland C ir kt. Rekalcifikuojant tiriamąją plazmą standartizuotu kefalino (trombocitų pakaitalo) kiekiu ir specifinio aktyvatoriaus silicio pagalba, išmatuojamas krešėjimo laikas. Įvertinamas vidinis krešėjimo kelias (I, II, V, VIII, IX, X, XI ir XII faktoriai, išskyrus trombocitus). Rezultatų skaitines reikšmes pateikia analizatorius, ADTL laikas, išreikštas sekundėmis (s), norma: 28–38 s.
