ANALISI ELETTROFORETICHE.

4.9.1 Western blot.

Al termine di ogni trattamento, le cellule attaccate sono state staccate e centrifugate per collezionare i pellets. Ognuno di essi è stato successivamente lisato in ghiaccio per 30 min, in un tampone Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, contenente NaCl 150 mM, Triton X-100 (Sigma) 1% ed un cocktail di inibitori delle proteasi (Sigma) 10%. Dopo essere stati centrifugati (23000 x g, per 30 min, a +4°C) i supernatanti venivano aliquotati e conservati a -80°C. I campioni in cui sono state analizzate le NOS, invece, non sono stati centrifugati in seguito alla lisi, al fine di evitare la perdita delle proteine in questione spesso associate alle membrane cellulari. La concentrazione totale di proteine è stata valutata mediante il metodo di Lowry. L’analisi mediante Western blot è stata condotta utilizzando l’elettroforesi su gel di acrilammide generalmente al 12%, per le analisi delle proteine ad alto peso molecolare (nNOS, iNOS, ATP7A e Cp), invece, abbiamo utilizzato gel di acrilammide al 7,5%. In seguito all’elettroforesi in condizioni denaturanti, le proteine sono state trasferite su un filtro di nitrocellulosa Protran (Schleicher and Schuell, Germany), per 1 ora a +4°C.

Per il riconoscimento delle proteine sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: per PrP un anticorpo sviluppato in coniglio, concesso gentilmente dal dottor Kascsak, del New York State Istitute for Basic Research; per la SOD1 abbiamo usato un anticorpo policlonale (AB1237), fornito dalla Chemicon (USA); per CCS, CTR1 e per la gliceraldeide-3- fosfatodeidrogenasi (GAPDH) abbiamo usato anticorpi monoclonali (rispettivamente sc-20141, sc-18473 e sc-32233) forniti dalla Santa Cruz Biotechnology (USA); per Mn-SOD abbiamo usato un anticorpo policlonale (06984) fornito dalla Upstate (USA); per VDAC, per la subunità II della cytox, la subunità da 39 kDa del complesso I, per la subunità α del complesso F0 del complesso V come pure per la subunità α dell’enzima E 1 del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi, abbiamo usato anticorpi monoclonali (A-21317, A-6404 e A-21344, A-21350 e A-21323 rispettivamente) forniti dalla Molecular Probes (USA); per l’ATP7A, l’nNOS e l’iNOS gli anticorpi policlonali utilizzati (611770, 610311 e 610333 rispettivamente) sono stati forniti dalla BD Transduction

Laboratories (USA); per la Cp abbiamo usato un anticorpo policlonale (C0911) fornito dalla Sigma (USA).

Gli anticorpi secondari utilizzati, anti-mouse (A2304), anti-rabbit (A0545) e anti-goat (A5420) sono stati forniti dalla Sigma (USA).

La quantità di proteine totali separata su gel è riportata nelle didascalie delle singole figure. Il riconoscimento delle specifiche proteine da parte degli anticorpi è stato visualizzato mediante chemiluminescenza, utilizzando il Super Signal Chemiluminescent Substrate (Pierce, USA).

4.9.2 Elettroforesi in condizioni non riducenti ed a temperatura controllata (CT-SDS-PAGE).

Questa tecnica è stata applicata per identificare sia la olo- che la apo- proteina Cp attiva ed immunoreattiva nei campioni di siero e LCS a nostra disposizione.

La corsa elettroforetica è stata realizzata su gel di acrilammide al 7,5%, contenente SDS allo 0,1% I campioni non vengono esposti né a calore né ad agenti riducenti, inoltre, l’elettroforesi è stata effettuata a una temperatura costante di +20°C, in modo tale da preservare la struttura nativa e l’attività delle proteine oltre ad impedire la precipitazione dell’SDS. Successivamente alla corsa, il gel può essere trattato per valutare l’attività della Cp (vedi dopo) oppure può essere utilizzato per il trasferimento delle proteine su filtro di nitrocellulosa, analogamente a quanto avviene in un Western blot. Prima di effettuare il traferimento delle proteine, il gel è stato bollito per 10 minuti a +90°C nel tampone utilizzato per la corsa elettroforetica contenente però l’1% di SDS. Questo passaggio è critico perché provoca una destrutturazione della proteina in loco rendendone accessibili gli epitomi soggetti al riconoscimento anticorpale. Parallelamente ai campioni è stato saggiato anche uno standard di Cp umana purificata al fine di poter ottenere una valutazione semi quantitativa. In seguito al trasferimento, il filtro di nitrocellulosa è stato trattato esattamente come in un Western blot ed incubato con un anticorpo primario specifico per la Cp (C0911) fornito dalla Sigma (USA).

4.9.3 Determinazione dell’attività della Cp su gel.

Come detto in precedenza in seguito a CT-SDS-PAGE è possibile evidenziare anche l’attività ossidasica della Cp. A tale scopo il gel è stato equilibrato in tampone acetato 0,1 M pH 5.4 a +37°C per 40 minuti e successivamente incubato in una soluzione di o-dianisidina 0,5 mg/ml in tampone acetato 0,1 M pH 5,4. L’ o-dianisidina è un substrato della Cp ed in presenza dell’enzima attivo genera, in seguito ad ossidazione, un composto colorato ed insolubile che rimane localizzato sulla banda contenente l’enzima. La forma attiva di Cp appare quindi come una banda colorata sul gel facilmente identificabile (Schosinsky et al., 1974; Musci et al., 1993).

4.9.4 Saggio dell’attività superossido dismutasica della SOD1 su gel di acrilammide in condizioni non denaturanti.

L’attività delle SOD1 è stata determinata su gel di poliacrilammide al 10% mediante una colorazione specifica ottenuta a seguito della corsa elettroforetica effettuata in condizioni non-denaturanti. I campioni cellulari sonicati (per 10’’ in PBS), sono stati centrifugati a 23000 x g per 30 min a +4°C. Il supernatante è stato raccolto e separato su gel privo in assenza di SDS, beta-mercaptoetanolo e bollitura, a +4°C. In queste condizioni, le proteine mantengono la loro struttura nativa e gli enzimi mantengono la loro attività. Alla fine della separazione elettroforetica, il gel è stato immerso in successione in due soluzioni: una contenente nitro blu di tetrazolio (NBT), l’altra contenente riboflavina e illuminato (Beauchamp e Fridovich, 1971). Questo dosaggio si basa sulla capacità delle flavine ridotte fotochimicamente

di generare, in seguito a riossidazione, l’anione O2.- il quale a sua volta

riduce l’NBT che si trasforma in un composto colorato che è il blu di formazano. L’attività superossido dismutasica è rivelata tramite la comparsa di bande chiare sul gel, derivanti dalla mancata riduzione dell’NBT dovuta alla dismutazione dell’anione O2.- da parte dell’enzima. Su ogni corsia è stata caricata la medesima quantità di proteine totali (indicata nelle didascalie delle figure), stimata mediante il metodo di Lowry.

4.10 RICOSTITUZIONE DELL’ENZIMA SOD1 DEPRIVATO DI