La ceruloplasmina come marcatore dell’Alzheimer.

La prima parte del mio studio sul coinvolgimento dell’alterata omeostasi del rame nell’eziopatogenesi di patologie neurodegenerative ha riguardato prevalentemente la malattia di Alzheimer (AD). L’AD, come precedentemente ricordato, è la principale patologia che colpisce il sistema nervoso centrale (CNS) nell’età adulta; è considerata una patologia multifattoriale ma il possibile coinvolgimento dal rame è ancora estremamente dibattuto.

Il nostro studio, volto a determinare il effettivo coinvolgimento del rame in tale patologia, è stato svolto in parallelo su campioni di siero e liquido cerebrospinale (LCS) prelevati da pazienti AD ottenuti dall’Ospedale Fatebenefratelli dell’isola Tiberina di Roma, con il quale abbiamo collaborato, e contemporaneamente su un modello cellulare dell’AD, ossia fibroblasti cutanei provenienti da pazienti affetti dalla forma sporadica della malattia (sAD) o dalla sua forma familiare (fAD). Dal momento che numerosi lavori suggeriscono un’alterazione dell’omeostasi del rame nell’AD (Pajonk et al., 2005; Squitti et al., 2006), riscontrabile non solo nel CNS ma anche in tessuti periferici, per prima cosa siamo andati ad analizzare nei campioni di fluidi in nostro possesso la proteina a rame ceruloplasmina (Cp). La Cp, che è una proteina prevalentemente sierica, è una ferrossidasi fondamentale per il metabolismo sistemico del ferro (Fe). Necessita di ben sei atomi di rame per risultare attiva e questa sua caratteristica la rende la principale trasportatrice di rame a livello sierico. Infatti lega circa il 95% del rame sierico, inoltre fa sì che venga considerata un ideale indicatore dell’alterazione del metabolismo rame nelle malattie ad esso correlate, come ad esempio nelle malattie di Menkes e di Wilson.

I liquidi analizzati sono stati prelevati da gruppi di dieci individui ciascuno, soggetti sani e pazienti AD, omogenei per età e sesso (Tabella II). I pazienti AD sono stati selezionati in base ai risultati ottenuti nei test di valutazione delle capacità cognitive come l’MMSE (Mini Mental State Examination) il cui risultato, inferiore a 25/30, permette di assegnare il paziente ad una categoria di “probabile” AD (Tabella II).

N. soggetti

Pazienti AD Soggetti sani

10 10 Sesso (maschi/ femmine) Età (anni) MMSE 16.9 ± 5.6 28.4 ± 0.9 3/7 3/7 73.2 ± 8 74.6 ± 7.5

Tabella II Caratteristiche dei gruppi investigati

Questi risultati affiancati dalle analisi di imaging del cervello (MRI) permettono di diagnosticare la patologia con una buona percentuale di successo, pur non potendo averne la certezza.

In prima istanza è stata valutata la concentrazione di rame negli LCS e nei sieri mediante spettroscopia di assorbimento atomico e come è possibile vedere dalla figura 1 non abbiamo riscontrato variazioni significative tra i pazienti AD e i soggetti sani né negli LCS (0.39 ± 0.11 µM nei campioni AD contro 0.52 ± 0.14 µM nei soggetti sani figura 1A) né nei sieri (20.6 ± 3.1 nei campioni AD contro 23.7 ± 1.5 µM nei soggetti sani figura 1B). I livelli di rame da noi ottenuti nel LCS sono assolutamente equiparabili a quelli ottenuti da altri ricercatori e riportati in letteratura (Molina et al., 1998; Melo

et al., 2003; Squitti et al., 2006).

Il passo successivo della nostra ricerca quindi è stato quello di analizzare i livelli di Cp immunoreattiva identificabile nei nostri campioni; come è possibile vedere in figura 2 A le analisi di Western Blot (sono mostrati due campioni rappresentativi per ogni gruppo), effettuate dopo aver sottoposto i campioni ad una completa denaturazione, non evidenziano sostanziali differenze tra i vari campioni. È interessante notare inoltre che, al fine di paragonare l’ammontare totale di Cp oltre che tra AD e controlli, anche tra

LCS e sieri, abbiamo caricato la stessa quantità di proteine per ogni corsia dopo aver però diluito i campioni di siero di un fattore 100.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 5 10 15 20 25 30 LCS Siero AD AD Ctrl Ctrl Ra m e (ng/ mg di pr o te ine ) Ram e (ng/ m g di pr o tei ne ) A B

Figura 1. Non si riscontrano significative differenze nel contenuto di rame A) dei LCS e B) dei sieri tra i due gruppi di soggetti analizzati. La valutazione dei livelli di rame è

stata eseguita mediante spettroscopia di assorbimento atomico in seguito a digestione completa dei campioni con HNO3 per una settimana a temperatura ambiente. Ctrl =

soggetti sani, AD = pazienti AD. n = 10.

La figura 2A evidenzia un pattern elettroforetico assolutamente paragonabile nei due liquidi analizzati mostrando una banda a 132 kDa, corrispondente alla proteina completamente denaturata, inoltre è possibile osservare che, nonostante siano stati caricati in eguale misura, nei campioni di LCS la quantità di Cp immunoreattiva è inferiore rispetto a quanto riscontrato nei sieri.

In seguito alle analisi di Western blot è stato possibile valutare la concentrazione della Cp presente in tutti i campioni analizzati rapportando i dati ottenuti mediante densitometria delle bande a quanto ottenuto dalla Cp umana purificata utilizzata come standard (hCp), tuttavia non sono evidenziabili differenze significative nè tra i campioni di LCS (0.023 ± 0.014 µM negli AD contro 0.026 ± 0.012 µM nei soggetti sani) né tra quelli di siero (3.7 ± 0.5 µM negli AD contro 4.3 ± 0.7 µM).

Sulla base della concentrazione di Cp, ottenuta confrontando le densitometrie, abbiamo voluto verificare la correlazione tra la proteina immunoreattiva e la concentrazione del rame, valutata con l’assorbimento atomico, al fine di evidenziare l’esistenza di Cp con un contenuto sottostechiometrico di rame e quindi inattiva e, allo stesso tempo, la presenza di rame non associato alla Cp. Per ottenere tale correlazione abbiamo stimato il rapporto tra il rame e la Cp sia nei sieri che negli LCS. Dalla figura 2B è possibile osservare che il rapporto ottenuto tra rame e Cp nei campioni di siero è molto vicino a 6 (5.7 ± 0.3 per gli AD e 5.3 ± 0.4 per i soggetti sani), in accordo con quanto noto che ogni molecola di Cp lega sei atomi di rame e ne trasporta circa il 95% nel siero. Tale risultato, tuttavia, non è confermato negli LCS dove il rapporto è di circa 15-20 sia per i pazienti AD che per i soggetti sani (figura 2B) (16.5 ± 5.6 per gli AD contro 20.1 ± 4.8 dei controlli). Questa differenza così netta, che non è stata rilevata mediante SDS-PAGE, suggerisce che negli LCS ci sia un rapporto diverso tra il rame e la Cp e magari una percentuale maggiore di proteina inattiva; d’altra parte con il Western blot non sarebbe stato possibile evidenziare tale fenomeno dal momento che la banda a 132 kDa, visualizzabile dopo completa denaturazione del campione, è la sommatoria sia della forma attiva che di quella inattiva della proteina. Per ovviare a questo inconveniente abbiamo sfruttato il fatto che il legame del rame provoca anche un cambio conformazionale della proteina e quindi la forma contenente rame e correttamente strutturata, o olo-Cp, e quella non legante il metallo, non correttamente strutturata e quindi sicuramente inattiva, o apo-Cp, possono esser separate mediante tecniche elettroforetiche a temperatura controllata (21 °C) ed in condizioni non riducenti (LT-SDS PAGE). Tale tecnica può essere seguita da analisi di immunoriconoscimento o da colorazione per attività. Se sottoposte ad immunoblot, infatti, le due forme della proteina danno origine a due bande ben distinte, in corrispondenza di 132 kDa troveremo l’apo-proteina, mentre a 80 kDa potremo visualizzare la forma olo della proteina (Hellmann et al., 2002).

Se invece il gel, dopo la separazione elettroforetica, viene incubato per saggiare l’attività enzimatica della proteina, sarà evidenziabile solo la banda dell’olo-Cp ad 80 kDa, dal momento che mantiene la sua corretta conformazione e preserva anche la sua attività. In figura 3 sono mostrate immagini rappresentative delle analisi di immunoblot dopo LT-SDS-PAGE. Grazie a questa tecnica si può evidenziare che nei campioni di siero la Cp possiede un pattern elettroforetico assolutamente paragonabile tra i pazienti AD ed i soggetti sani. È ben visibile, infatti, che circa l’80-90% della

proteina immunoreattiva è in forma olo- (figura 3A), in accordo con quanto noto in letteratura (Bielli e Calabrese, 2002; Hellmann e Gitlin, 2002). Tale evidenza trova ulteriore riscontro nel saggio dell’attività

A 132 kDa LCS AD Ctrl Siero AD Ctrl hCP B 0 5 10 15 20 25 30 LCS Siero AD Ctrl R am e /C p im m u n o re at tiv a * *

Figura 2. Il rapporto rame/ceruloplasmina (Cp) è più elevato nei LCS che nei sieri. A)

Western blot rappresentativo dei LCS e dei sieri di due campioni provenienti da soggetti sani (Ctrl) e due pazienti AD. Per ogni corsia del gel sono state caricate 10µg di proteine totali. 45 ng di ceruloplasmina umana (hCp) purificata sono stati utilizzati come standard. B) Rapporto tra il rame contenuto nei fluidi analizzati e la Cp. La concentrazione di rame (µM) è stata valutata mediante spettroscopia di assorbimento atomico dei campioni di LCS e siero. La concentrazione di Cp (µM), invece, è stata ottenuta mediante l’analisi densitometrica delle bande rapportate alla hCp standard. I risultati mostrati rappresentano le medie (±D.S.) delle analisi densitometriche di almeno tre corse elettroforetiche effettuate su 10 campioni di ciascun gruppo di soggetti analizzati. Ctrl = soggetti sani, AD = pazienti AD. * p<0.001.

enzimatica (figura 3C) dove è chiaramente evidenziabile una sola banda ad 80 kDa, di intensità paragonabile a quella ottenuta dall’immunoblot sia nei pazienti AD che nei soggetti di controllo.

A AD Ctrl apo-Cp olo-Cp hCp C hCp AD Ctrl olo-Cp D hCp AD Ctrl olo-Cp hCp AD Ctrl apo-Cp olo-Cp B Siero LCS 132 kDa 80 kDa 132 kDa 80 kDa

Figura 3. I campioni LCS dei pazienti AD mostrano una minor quantità di Ceruloplasmina attiva. I campioni di siero (A e C) e LCS (B e D) sono state effettuate

mediante elettroforesi in condizioni non denaturanti. È mostrata un’analisi rappresentativa di Western blot (A e B) e attività amino-ossidasica della Cp saggiata mediante l’uso di o- dianisidina. Sono stati caricati 10µg di proteine totali per ogni corsia. 45 ng di ceruloplasmina umana (hCp) purificata sononstati utilizzati come standard.

Un tipico immunoblot eseguito dopo LT-SDS-PAGE con campioni di LCS invece (figura 3B), mostra un pattern elettroforetico della Cp paragonabile a quello ottenuto nei sieri solo per i campioni dei soggetti sani, ma è notevolmente differente per quanto riguarda i pazienti AD. È evidente negli LCS AD che esiste un rapporto tra la forma olo- e la forma apo- della proteina assolutamente differente a quello riscontrato nei sieri. Questo dato trova riscontro nel saggio dell’attività enzimatica della Cp, infatti, si può notare in figura 3D che a differenza di quanto riscontrato nei campioni di controllo, nei soggetti AD l’attività enzimatica della Cp dà origine ad una banda visibile solo debolmente. Questo risultato ci suggerisce che c’è una minor quantità di olo-proteina attiva negli LCS degli AD.

Effettivamente, sulla base dell’analisi densitometrica delle bande ottenute mediante l’immunoblot e il saggio dell’attività enzimatica ci è stato possibile

calcolare che la forma olo- della Cp negli LCS AD corrisponde circa al 70% di quella ottenuta nei controlli, mentre la quantità di proteina attiva negli AD è solo il 30% rispetto ai soggetti sani (figura 4). Questo dato interessantissimo mette in risalto che in questo distretto corporeo degli AD non solo c’è meno olo-Cp, ma di questa ne è attiva solo il 50% circa. Ciò evidenzia inoltre che negli LCS AD esiste una percentuale di rame non correlabile alla Cp più elevata che nei soggetti sani, sintomo evidente di uno squilibrio nella corretta distribuzione di questo metallo a livello cerebrale.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Ct rl C P / AD C P Cp immunoreattiva 80 kDa Cp attiva 80 kDa *

Figura 4. Nei LCS dei pazienti AD la quantità di Cp attiva è inferiore alla quantità di olo-proteina immunoreattiva riscontrata. La media ottenuta dall’analisi densitometrica

delle bande riscontrate ad 80 kDa mediante Western blot effettuato in seguito ad elettroforesi in condizioni non denaturanti dei campioni dei soggetti sani (Ctrl) è stata divisa per quella ottenuta dai campioni dei pazienti malati (AD). La stessa metodica di calcolo è stata utilizzata con i dati densitometrici provenienti dai saggi di attività su gel. I risultati mostrati sono la media (± D.S.) delle analisi densitometriche effettuate su almeno tre elettroforesi differenti. Sono stati utilizzati i campioni provenienti da 10 soggetti sani e 10 pazienti AD. * p<0.001.

5.1.2 Studio dell’alterata omeostasi del rame in un modello cellulare