La superossido dismutasi a rame e zinco.

La superossido dismutasi a rame e zinco (SOD1) è un enzima omodimerico con massa molecolare di circa 32 KDa con un atomo di rame ed uno di zinco per subunità (Bannister et al., 1987). Ha una struttura a barile beta formata da otto filamenti beta antiparalleli per ciascun monomero. Ognuno di essi possiede due importanti anse funzionali, una elettrostatica per l’interazione con l’ O2.- ed uno zinc loop, che racchiude la regione di legame per i metalli. Gli ioni rame e zinco vengono legati da due siti localizzati in stretta vicinanza e sono coordinati da un comune residuo di istidina, l’His63 nella sequenza della proteina umana. Una fitta rete di legami idrogeno stabilizza il legame tra i metal-binding sites e la restante struttura funzionale della proteina. Nella forma ossidata dell’enzima, in cui il

rame è Cu2+_{, l’anello imidazolico del residuo di His63 costituisce un ponte}

tra il Cu2+ e lo Zn2+. Inoltre, Cu2+, lega le catene laterali di tre residui aggiuntivi di istidina (His46, His48 e His120) ed una molecola d’acqua

(modificata da Valentine et al., 2005)

Figura 19. Struttura tridimensionale del dimero funzionale di SOD1 umana. In blue è

rappresentato il rame, in arancio lo zinco. Le due anse funzionali, quella elettrostatica e quella per il legame dello zinco sono rappresentate in verde ed arancio, rispettivamente. Nel riquadro è possibile osservare in particolare la rete di legami idrogeno che stabilizza il sito catalitico dell’enzima.

Al contrario, quando l’enzima si riduce (Cu1+) durante il meccanismo

catalitico, il rame si distacca dal residuo di His63 e contemporaneamente rilascia la molecola d’acqua passando ad una configurazione in cui è coordinato esclusivamente alle catene laterali delle tre istidine. La SOD1 umana possiede inoltre quattro residui di cisteina che hanno diversa reattività. Mentre la Cys-111 si trova sulla superficie dell’enzima vicino all’interfaccia del dimero, la Cys-6 si trova all’interno della struttura a barile beta. Gli altri due residui invece, la Cys-57 e la Cys-146, sono coinvolti nella formazione del ponte disolfuro intramonomero, fondamentale per la stabilità strutturale della proteina (Valentine et al., 2005). Enzimaticamente parlando la SOD1 è in grado di catalizzare la dismutazione dell’anione superossido

(O2.-) a perossido d’idrogeno (H2O2)e ossigeno molecolare (O2), per cui è la sua funzionalità, mantenendo sotto controllo i livelli del superossido, è propedeutica al mantenimento del corretto equilibrio ossidoriduttivo intracellulare.

La reazione catalizzata dall’enzima è la seguente:

O

+ Cu

O

+ Cu

Cu

+ O

+ 2H

H

O

+ Cu

La SOD1 è responsabile di circa il 90% dell’intera attività superossido dismutasica delle cellule, infatti è presente nelle cellule ad una concentrazione sorprendentemente alta (1 μM). In aggiunta all’alta efficienza catalitica, la

rimozione dell’O2.- avviene sempre prontamente a concentrazioni molto

basse, sotto qualsiasi condizione fisiologica di pH e indipendentemente dalla presenza di eventuali competitori molecolari (Bannister et al., 1987). La SOD1 è distribuita estensivamente in un’ampia varietà di cellule e la misura della sua attività viene generalmente considerata come controllo interno della sua espressione genica. Sebbene l’espressione della SOD1 sia considerata costitutiva, il suo livello di mRNA può essere drammaticamente regolato in risposta ad un’ampia gamma di stimoli fisici, chimici e biologici (shock termico, UV e raggi X, metalli pesanti, perossido di idrogeno, ossido nitrico) (Zelko et al., 2002). La sintesi dell’ mRNA di SOD1 può essere anche stimolata dalla presenza di ioni metallici, considerati fonte potente di ROS, attraverso gli elementi di risposta ai metalli (MRE: metal responsive elements) del gene SOD1 (Yoo et al., 1999). Comunque la regolazione della trascrizione del gene SOD1 in risposta a stimoli diversi può variare a seconda del tipo cellulare. Sebbene sia considerato, come detto, principalmente un enzima citosolico, una frazione dell’enzima SOD1 è stata trovata nei perossisomi, lisosomi e nucleo e nello spazio intermembrana dei mitocondri (IMS). La frazione mitocondriale costituisce il 5% della quantità totale di SOD1 (Sturtz et al., 2001; Okado Matsumoto e Fridovich, 2001).

Il trasferimento del rame alla SOD1 è mediato da uno chaperone specifico, CCS (Copper Chaperone for SOD1), (Huffman. e O’Halloran, 2001). E’ una proteina omodimerica di 249 amminoacidi e di circa 33 KDa di peso molecolare per subunità, a localizzazione principalmente citosolica. Questa proteina presenta tre domini: il dominio I, all’estremità N-terminale,

contenente il motivo MXCXXC, specifico per legare il rame; il dominio II, nella porzione centrale della proteina, con una struttura complessivamente simile al barile-beta della SOD1 ma mancante dei residui necessari per catalizzare la disproporzione dell’anione superossido.

c

Figura 20. Struttura del complesso tra la SOD1 e CCS (Puig e Thiele, 2002).

E’ importante notare come i residui coinvolti nella formazione dell’omodimero nella SOD1 siano conservati in CCS, consentendo la formazione dell’eterodimero SOD1-CCS, evento ritenuto propedeutico affinchè avvenga lo scambio del rame tra CCS e SOD1 (figura 20). Il dominio III, infine, si trova all’estremità C-terminale e contiene un motivo conservato tra i CCS di specie diverse, CXC, che è richiesto per trasferire il rame dal CCS alla SOD1.

CCS, inoltre, appare di importanza fondamentale anche per la localizzazione nello IMS della SOD1. In cellule di lievito mutanti prive di

CCS, infatti, è stata osservata una significativa riduzione dei livelli di SOD1 mitocondriale, mentre la sovraespressione di CCS a livello dell’IMS aumenta i livelli di SOD1 nel mitocondrio. Ciò ha portato ad ipotizzare che la apo-SOD1 (l’enzima privo di rame, e quindi inattivo) possa attraversare la membrana esterna del mitocondrio ma, che soltanto dopo l’interazione ed il trasferimento del rame da parte di CCS, la SOD1 attiva venga stabilizzata nell’IMS (Okado-Matsumoto e Fridovich, 2001). CCS infatti, facilita la conversione nella forma matura della proteina accelerando l’ossidazione dei residui di cisteina e la formazione del ponte disolfuro (Son et al., 2007). Inoltre, sono state descritte nell'IMS, nuove proteine coinvolte nell’importo della SOD1 nel mitocondrio, la cui funzione è quella di mantenere i gruppi tiolici della proteina nello stato ossidato (Mesecke et al., 2005).

Dal momento che la SOD1 non presenta la sequenza segnale tipica delle proteine a localizzazione mitocondriale, il meccanismo che porta alla sua internalizzazione in questi organelli è tuttaltro che chiaro. Una delle ipotesi proposte a riguardo prevede che una frazione dell’mRNA, abbondantemente trascritto nella cellula, venga direttamente tradotto dai ribosomi situati in prossimità della membrana esterna mitocondriale. A questo punto la SOD1 perimitocondriale viene riconosciuta da TOM, un complesso con funzione di trasporto posto sulla membrana esterna mitocondriale, il quale ne consente il passaggio, almeno parziale, nell'IMS quando la proteina non è ancora assemblata e prima che si sia formato il ponte disolfuro (Stan et al., 2003)

(figura 21).

Solo in seguito all’ingresso nel mitocondrio la SOD1 assume la sua struttura caratteristica, viene rifornita del metallo e diventa enzimaticamente attiva. Anche CCS è stato trovato in mitocondri di cellule di lievito (Sturtz et

al., 2001), tuttavia la sua presenza in mitocondri di cellule di mammifero non

è stata ancora dimostrata. In ogni caso, è interessante notare che per quanto il meccanismo di incorporazione del rame da parte della SOD1 mediato da CCS sia così specifico, sembra che che esistano vie alternative affinchè il metallo venga trasferito alla SOD1, anche in assenza di CCS (Carrol et al., 2004). Questo sottolinea il ruolo fondamentale della proteina nella difesa della vitalità e funzionalità cellulare, nonchè la sua importanza anche a livello evoluzionistico.

Hervias et al., 2006

Figura 21. Meccanismi ipotizzati per il trasporto di SOD1 nel mitocondrio. L’enzima

SOD1 viene tradotto dai ribosomi citosolici e risiede nel citosol, dove interagisce con lo chaperone CCS per il trasferimento del rame (1). Una parte di SOD1 viene tradotta da ribosomi localizzati in prossimità del mitocondrio (2) dove può esser riconosciuta dal complesso di trasporto associato alla membrana esterna del mitocondrio TOM (3). Questa viene trasportata nell’IMS prima di essere assemblata (3 o 4). Nell’eventualità in cui SOD1 venga solo parzialmente importata e la porzione C-terminale rimanga sul versante citosolico del sistema di trasporto TOM, la proteina potrebbe essere nuovamente indirizzata verso il citosol o bloccare TOM (5). SOD1 nel mitocondrio diventa enzimaticamente attiva. Il trasferimento del rame alla proteina potrebbe essere mediato da CCS (6). Una frazione di SOD1 potrebbe non assumere la conformazione tridimensionale ed entrare nella matrice attraverso il complesso per il trasporto interno TIM (7 e 8).