che una ridotta disponibilità di rame provoca una marcata riduzione ne

livelli di proteina immunoreattiva per entrambi gli chaperoni. Per quanto riguarda CTR1 è interessante notare che, nelle nostre condizioni sperimentali, è possibile visualizzare l’omo-trimetro (circa 60 kDa), l’omo- dimero (circa 40 kDa) ed il monomero della proteina (21 kDa) nonostante le condizioni totalmente riducenti cui i campioni sono stati sottoposti prima di caricarli sul gel di poliacrilammide per l’immunoelettroforesi (figura 9A). Si può notare che la diminuzione della proteina immunoreattiva è proporzionale alla deplezione di rame che è stata operata, dopo sei giorni in presenza di Trien infatti la proteina è quasi assente (figura 9A).

L’ATP7A, invece, identificata da una banda a 190 kDa risulta praticamente irrilevabile dopo soli tre giorni di trattamento con il Trien (figura 9B), per tale motivo non sono riportati i risultati analoghi ottenuti dopo una deplezione di rame più prolungata.

Un’altra proteina, in grado di legare il rame e probabilmente implicata nel riciclo di questo metallo a livello delle sinapsi, è la proteina prionica, PrP. Questa proteina, cui vengono attribuite diverse forme di encefalopatie spongiformi, sembra esser in qualche modo regolata dal rame quindi siamo

andati a vedere che tipo di risposta presenta in condizioni di una concentrazione di rame estremamente ridotta.

A

Giorni

Trien 125 µM

0 1 2 3 4 5 6 7 8

I° passaggio 2° passaggio

C 0 2 4 6 8 10 12 Trien 125 µM - Ra m e (n g/ m g p ro te ine ) +

**

_**

Figura 8. Il Trien e l’effetto di un suo prolungato utilizzo sul contenuto intracellulare di rame in cellule SH-SY5Y. A) Formula di struttura del chelante del rame Trien (trietilene

tetrammina tetraidrocloruro). B) Rappresentazione schematica del trattamento di cellule SH-SY5Y con Trien 125 µM per due passaggi in coltura. C) Valutazione del contenuto intracellulare di rame al termine del trattamento, mediante spettroscopia di assorbimento atomico. Il contenuto di rame valutato nelle cellule di controllo è pari a 10.5 ng/mg di proteine. n = 5; ** 0.01<p<0.001 vs controllo.

Per analizzare mediante Western blot PrP abbiamo utilizzato un anticorpo in grado di riconoscere le due isoforme della proteina, a 27 e 30 kDa, più un frammento a 21 kDa risultato della degradazione proteolitica della proteina conseguente alla sua internalizzazione, evento che si riscontra dopo l’avvenuto legame del rame. La figura 10 mostra come una ridotta disponibilità di rame per 3 giorni non altera significativamente il pattern elettroforetico della proteina. Dopo 6 giorni di deplezione, invece, la ridotta disponibilità di rame provoca un arricchimento dell’isoforma di 30 kDa a discapito delle altre due forme riconoscibili (figura 10) confermando il ruolo del rame nella regolazione di tale proteina.

60 kDa 40 kDa 21 kDa - + 3 7 Trien 125 µM giorni CTR1 - + monomero dimero trimero A 190 kDa giorni ATP7A - + 3 Trien 125 µM B

Figura 9. La diminuzione del contenuto di rame nelle cellule SH-SY5Y induce una severa riduzione delle proteine deputate al suo ingresso (CTR1) e alla sua espulsione (ATP7A) dalle cellule. Western blot effettuato con anticorpi specifici anti-CTR1 ed anti-

ATP7A su lisati cellulari totali dopo 3 e 7 giorni di trattamento con Trien 125 µM. Sono stati caricati 50 μg di proteine per ogni corsia. n = 3.

Tuttavia, le due proteine a rame più rappresentative e, forse, fondamentali a livello metabolico, sono la citocromo c ossidasi (complesso IV della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale o cytox) e la superossido dismutasi a rame e zinco (Cu,Zn SOD o SOD1).

È noto in letteratura che la cytox, come pure altri complessi della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale, è un target rilevante in numerosi processi neurodegenerativi, ad esempio nell’AD, nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA) o nei processi neurodegenerativi associati alla carenza sistemica di rame nella malattia di Menkes (Rossi et al., 2004; Martin et al., 2007; Reddy e Beal, 2008). La SOD1 invece, oltre alla sua vitale attività antiossidante, è intimamente connessa alla SLA dal momento che il 20% dei casi di origine familiare sono associate a circa 130 mutazioni note del gene che codifica per questa proteina.

30 kDa 27 kDa 21 kDa - - + + _{Trien 125 µM} giorni 3 7 Frammento proteolizzato (core)

Figura 10. La proteina prionica PrP risente della scarsa disponibilità di rame ottenuta nelle cellule SH-SY5Y mediante prolungato trattamento con Trien. Western blot

effettuato con un anticorpo specifico anti-PrP gentilmente donatoci dal prof. Kascsak, su lisati cellulari totali dopo 3 e 7 giorni di trattamento con Trien 125 µM. Sono stati caricati 50 μg di proteine per ogni corsia. n = 3.

Dal momento che l'induzione della deplezione di rame riduce notevolmente il contenuto intracellulare del metallo già dopo tre soli giorni di trattamento, e non si apprezzano differenze significative prolungando il trattamento con il Trien, abbiamo proseguito le nostre indagini mantenedo il chelante nel mezzo di crescita cellulare per un solo passaggio in coltura. In condizioni di ridotta disponibilità di rame, in seguito al trattamento delle cellule di neuroblastoma con Trien per tre giorni, saggi spettrofotometrici di attività enzimatica mostrano una notevole riduzione nell’attività della cytox pari al 60 % rispetto alle cellule di controllo (figura 11A). Parallelamente, sono state eseguite analisi di Western blot su lisati cellulari totali di SH- SY5Y trattate seguendo lo stesso protocollo sperimentale, al fine di valutare i livelli di proteina immunoreattiva della subunità II dell’enzima; tale subunità è di origine mitocondriale, presenta due siti di legame per il rame, ed è noto che la scarsa disponibilità del metallo ne causa una marcata

riduzione dei livelli proteici. Tale risultato è stato confermato dalle analisi effettuate a seguito del trattamento con il Trien (figura 11B).

Come è possibile osservare dalla figura 12A che mostra un Western blot rappresentativo, anche i livelli di SOD1 immunoreattiva diminuiscono in seguito alla riduzione del contenuto intracellulare di rame. Contemporaneamente a questo fenomeno però, va notato come i livelli dello chaperone del rame specifico per SOD1 (CCS) aumentino invece a seguito del trattamento con Trien (figura 12A). Tale evento trova riscontro in letteratura in altri modelli sperimentali di carenza di rame (Bertinato et al., 2003; Prohaska et al., 2003). La riduzione della SOD1 viene confermata anche da saggi di attività eseguiti su gel di poliacrilammide in seguito a corsa elettroforetica in condizioni non denaturanti (native). Come mostrato in figura il trattamento con il chelante del rame produce una drastica riduzione della banda dell’attività della SOD1 (figura 12B), ancora più marcata di quanto non venga evidenziato dal Western blot. Il pannello B della figura 12 mostra anche un controllo classico per questo tipo di saggio, cioè un gel incubato con una soluzione di cianuro di potassio al fine di inibire in modo specifico l’attività della SOD1 e verificare che la banda di attività visualizzata è effettivamente da attribuire a quest'enzima.

È interessante notare una marcata differenza tra la diminuzione della SOD1 riscontrata tra il saggio di Western blot e quello dell’attività enzimatica, dove è notevolmente più accentuata.

Abbiamo effettuato di conseguenza saggi di ricostituzione enzimatica in

vitro, abbiamo incubato gli estratti cellulari a temperatura ambiente per tre

ore con CuSO4 1 mM e successivamente abbiamo ripetuto il saggio

dell’attività enzimatica sul gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti. In figura 13A è mostrato un gel di attività rappresentativo del risultato ottenuto in seguito a ricostituzione dell'enzima. Gli istogrammi in

figura 13B, rappresentano il risultato delle densitometrie delle bande di

attività ottenuti in seguito a ricostituzione, è possibile vedere un parziale recupero della attività enzimatica, che, in accordo con quanto pubblicato in lavori precedenti, dimostra inequivocabilmente la presenza di proteina non degradata e scarica di rame.

0 25 50 75 100 ** At ti vi tà d el la cy to x (% ) A Trien 125 µM - +

Complex IV (Sub II) 24 kDa 37 kDa GAPDH

B

Trien 125 µM

- +

Figura 11. La diminuzione dei livelli intracellulari di rame nelle SH-SY5Y, ottenuta dopo tre giorni di trattamento con il Trien, causa una drastica riduzione della attività della cytox e della sua subunità II immunoreattiva. A) L’attività enzimatica è

stata valutata con metodo spettrofotometrico. n = 5,** p< 0,001 rispetto al controllo. B) Western-blot con anticorpi specifici anti-subunità II della cytox e GAPDH. 30 μg di proteine sono stati caricati per ogni corsia. La GAPDH è stata analizzata per verificare il corretto caricamento dei campioni proteici. n = 5.

In letteratura è noto che l’assenza di rame nel sito catalitico della SOD1 non consente il corretto folding proteico e sembra faciliti l’associazione della proteina al comparto mitocondriale (Field et al., 2003), dove esso è fisiologicamente presente anche se in quantità molto bassa (1-5% del totale). Abbiamo quindi voluto analizzare l’influenza del trattamento con Trien sulla localizzazione intracellulare dell’enzima.

CCS 35 kDa