Studio dell’alterata omeostasi del rame in un modello cellulare di Alzheimer.

Contemporaneamente alle analisi svolte sui fluidi ottenuti dall’Ospedale Fatebenefratelli di Roma, i nostri studi sono stati rivolti anche ad un modello

cellulare utile allo studio di questa patologia, cioè fibroblasti provenienti da espianti cutanei di soggetti affetti da AD.

I fibroblasti presentano le caratteristiche genetiche tipiche dei pazienti AD ma a differenza dei campioni di liquidi corporei (urine, sangue o LCS) hanno il vantaggio di poter esser mantenuti in coltura, eliminando di fatto ogni possibile influenza derivante dall’alimentazione o dall’uso di farmaci. Per questi motivi i fibroblasti rappresentano un ottimo modello sperimentale per investigare i meccanismi alla base dell’eziopatogenesi dell’AD ed in particolare per testare la risposta dei tessuti agli insulti tipici cui il cervello è soggetto nell’AD, o per investigare gli effetti di strategie terapeutiche innovative (Uberti et al.,2002; Huang et al., 2005). I fibroblasti utilizzati nelle nostre ricerche sono stati acquistati dalla Coriell cell repository e provengono da espianti cutanei da soggetti affetti dalla forma sporadica della patologia (sAD) e da soggetti affetti dalla forma familiare della malattia (fAD), caratterizzati da mutazioni nel gene della presenilina 1 (PS-1).

I fibroblasti sono stati seminati alla densità di 4 x 104 cell/cm2 e sono stati utilizzati sempre tra il IV e VII passaggio in coltura al fine di mantenere costanti i livelli di crescita ed evitare il possibile invecchiamento della linea cellulare, cui questa linea è soggetta.

Le analisi effettuate mediante spettroscopia di assorbimento atomico, volte a valutare il contenuto intracellulare del rame in cellule in coltura, evidenziano un incremento dei livelli di rame nei fibroblasti sAD ed ancor più marcato e significativo in quelli di origine fAD (figura 5), dove il contenuto del metallo è praticamente raddoppiato rispetto alle cellule di controllo. Questo risultato evidenzia uno scompenso nell’omeostasi del rame ancor più marcato di quanto non abbiamo dimostrato mediante le analisi sui campioni di fluidi provenienti da pazienti AD, ed inoltre suggerisce che tale fenomeno, è ancor più marcato nei soggetti affetti dalla forma familiare della patologia. L’aumento nei livelli intracellulari di rame può causare gravi danni ossidativi alle macromolecole, quindi al fine di valutare possibili conseguenze di questo scompenso abbiamo effettuato un saggio di perossidazione lipidica. Tale saggio ci consente di stimare i livelli di malondialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale (4-HNE), tipici indicatori di danni ossidativi ai lipidi. La figura 6 evidenzia che sia nei fibroblasti sAD che fAD i marcatori di perossidazione lipidica sono significativamente più elevati rispetto ai controlli. La quantità di MDA e 4-HNE raddoppiano nelle cellule sAD e quasi triplicano in quelle fAD, con un andamento simile a quello riscontrato analizzando il contenuto intracellulare di rame (figura 5). Una volta appurato l’aumento nei livelli di rame intracellulare abbiamo

pensato di testare gli effetti sui fibroblasti in coltura di un polifenolo di origine naturale che stà riscuotendo un notevole interesse nel mondo scientifico, la curcumina. Questo polifenolo viene assunto normalmente con la alimentazione in quanto è uno dei componenti principali del curry, una spezia di origine orientale il cui consumo è ormai notevolmente diffuso in tutto il globo. Ra m e (n g/ m g di pr o te ine ) Ctrl sAD fAD 0 5 10 15 20 25 30 *

Figura 5. I livelli intracellulari di rame valutati nei fibroblasti dei pazienti AD risultano superiori a quelli dei controlli. Il contenuto di rame è stato valutato in fibroblasti

provenienti da soggetti sani (Ctrl), pazienti colpiti dalla forma sporadica della patologia (sAD) e dalla forma familiare (fAD) mediante analisi spettroscopica di assorbimento atomico effettuata a seguito di completa digestione dei campioni con HNO3 a temperatura

ambiente. n = 5, * p<0.001.

È stato dimostrato che la curcumina è in grado di legare il rame formando un complesso con proprietà antiossidanti, assimilabili a quelle della superossido dismutasi a rame e zinco, ed inoltre mostra notevoli proprietà nel contrastare l’angiogenesi, fenomeno in cui il rame gioca un ruolo fondamentale. Recenti studi hanno proposto la curcumina anche per il trattamento dell’AD, infatti, dal momento che è in grado di chelare il rame e formare un complesso antiossidante, potrebbe risultare estremamente utile nella terapia di tale patologia. Per saggiare l’efficacia di questo composto nel trattamento dell’AD, abbiamo testato le sue capacità sui fibroblasti in coltura dopo averli sottoposti ad un insulto ossidativo.

* Pe ro ss id az io ne li pi di ca µm ol ( M D A + 4- H N E ) /m g di p rot ei ne 0 50 100 150 200 Ctrl sAD fAD **

Figura 6. I fibroblasti AD presentano un livello di danni ossidativi ai lipidi cellulari notevolmente maggiore rispetto alle cellule di controllo. Gli indicatori dell’avvenuta

perossidazione lipidica (malondialdeide –MDA- e 4-idrossinonenale -4-HNE) sono stati valutati spettrofotometricamente alla lunghezza d’onda 586 nm. n = 5 *p=0,005

Le cellule sono state incubate per un’ora con perossido di idrogeno (H2O2

alla concentrazione finale100 µM) e, dopo aver rimosso lo stimolo pro- ossidante dal mezzo di coltura, sono state trattate per ulteriori 24 ore con curcumina (1 µM). Al termine del trattamento è stata valutata la vitalità cellulare mediante il saggio dell’MTS. Questo tipo di analisi è in grado di stimare la morte cellulare attraverso la valutazione della funzionalità mitocondriale, e dal momento che i mitocondri sono particolarmente suscettibili ad insulti di tipo ossidativo, questo saggio risulta particolarmente indicato per l’analisi che vogliamo effettuare. Come è possibile osservare in

figura 7 il trattamento con H2O2 produce un’elevata mortalità in tutte e tre le linee di fibroblasti analizzate, tuttavia è evidente che le linee di fibroblasti AD presentano una maggiore suscettibilità allo stress ossidativo rispetto a quelli provenienti da soggetti sani. A questa maggior suscettibilità comunque fa da contraltare una miglior risposta al trattamento con la curcumina; è evidente infatti che l’effetto della curcumina è tanto più elevato quanto più

elevato è il contenuto intracellulare di rame. Tale osservazione quindi sembra confermare ulteriormente la presenza di un’alterata omeostasi del rame nell’AD e la possibile efficacia della curcumina nel trattamento terapeutico di tale patologia.

0 20 40 60 80 100 120

*

*

Figura 7. La curcumina protegge i fibroblasti sAD e fAD dall’azione tossica dell’H2O2. Le cellule sono state trattate con H202 (100 μM) per 1 ora, dopo averla rimossa le cellule

sono state mantenute in coltura per ulteriori 24 ore. La vitalità delle cellule è stata misurata attraverso la loro capacità di trasformare l’MTS in formazano (test dell’MTS). La curcumina (1 μM) è stata aggiunta alle cellule dopo il trattamento col perossido di idrogeno e mantenuta per le 24 ore successive fino all’analisi della vitalità. n = 5 * p< 0,005 vs Ctrl (cellule non trattate), # p< 0,005 vs H2O2.

5.2 LA CARENZA DI RAME COME MODELLO