Mura MC, Luridiana S, Daga C, Dettori ML, Pazzola M, Vacca GM, Bini PP,
Carcangiu V.
Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Studi di Sassari
SUMMARY - The aim of the present research were to characterize the MT1 melatonin
receptor gene, to evidence possible polymorphisms, in mouflon. Sixty two mouflon were available for this study. DNA was extracted from blood samples collected from each mouflon and subjected to PCR analysis to allow amplification of the main part of exon II of the MT1 gene. Twenty PCR products were sequenced in order to obtain the exact sequence of the aforesaid exon. The uniform 824 bp PCR product was digested with endonucleases MnlI and RsaI and checked for the presence of restriction sites. One polymorphic site for each enzyme was detected (A328G and C322T, respectively) and animals were placed into +/+, +/− or −/− group for MnlI and C/C, C/T or T/T group for RsaI enzyme. Allele − and −/− genotype frequency were predominant compared to allele + and +/+ genotype. Allele C and C/C genotype frequency were predominant compared to T allele and T/T genotype. The results provide the exon II sequence of the mouflon melatonin receptor MT1 gene and show that the reproductive activity of animals with −/− genotype is strongly influenced by photoperiod.
INTRODUZIONE - Gli animali selvatici presentano un periodo ristretto di attività
riproduttiva in modo che il parto avvenga nella stagione in cui le condizioni ambientali sono favorevoli alla crescita dei nuovi nati (Wayne et al., 1989). Il fattore ambientale principale che determina questo comportamento dell’attività riproduttiva è il fotoperiodo. Il segnale luminoso percepito dalla retina viene trasdotto in segnale chimico dall’epifisi che, mediante la secrezione di melatonina, informa l’organismo dell’andamento del fotoperiodo (Karsh et al., 1984). Infatti, questo ormone viene secreto principalmente durante le ore di buio e, attraverso la sua azione nel nucleo ipotalamico premammillare, controlla la stagionalità riproduttiva negli ovini (Malpaux et al., 1998). Le diverse azioni della melatonina, nei mammiferi, vengono svolte attraverso specifici recettori, e tra questi recettore l’MT1 sembra sia il solo coinvolto nella regolazione della stagionalità riproduttiva (Weaver et al., 1996; Dubocovich , 1988). Negli ovini il gene di questo recettore è ubicato nel cromosoma 26 e presenta due siti polimorfici, in posizione 606 e 612 della sequenza depositata (Messer et al., 1997). L’assenza del sito di taglio in posizione 612 (allele -) ha un’incidenza maggiore nella Suffolk, razza ad attività riproduttiva fortemente stagionale (Hernandez et al., 2005). Mentre la presenza del sito di taglio in posizione 612 (allele +) conduce, sia in omozigosi che in eterozigosi, in diverse razze ovine, ad un’attività riproduttiva meno legata al fotoperiodo (Notter and Cockett et al., 2005). La presenza del sito di taglio in posizione 606, rilevabile con l’endonucleasi RsaI, risulta avere una certa influenza con l’attività riproduttiva meno stagionale in diverse razze ovine cinesi (Chu et al., 2006). Considerando che gli studi finora condotti hanno riguardato razze di pecore domestiche, che hanno perciò subito un intervento selettivo da parte dell’uomo volto al miglioramento dell’efficienza riproduttiva stagionale, risulta interessante indagare se, quanto riscontrato nella pecora, possa avere valenza anche in un ovino selvatico, come il muflone. Lo scopo della presente ricerca è quello di caratterizzare il gene del recettore della melatonina, di evidenziare i possibili polimorfismi nel muflone (Ovis Gmelini Musimon).
MATERIALI E METODI - Per la prova sono stati utilizzati 62 mufloni, di cui 50 (35
femmine e 15 maschi) provenienti da differenti aree di ripopolamento di proprietà dell’Ente Foreste della Regione Sardegna. Nelle aree di ripopolamento l’alimentazione al pascolo, nei periodi più rigidi, veniva integrata con fieno di prato polifitico o di erba medica. Di questi animali si conosceva il periodo dei parti del gruppo degli animali ma non la data precisa di ciascuno.Il prelievi di sangue dei mufloni tenuti nelle aree di ripopolamento venivano eseguiti durante le sedute di catture volte al controllo dello stato sanitario e nutrizionale degli animali. Il Dal sangue ottenuto è stato estratto il DNA usando un kit commerciale (Puregene Blood Core Kit B, Qiagen Sciences, Maryland, USA). 100-150 ng di DNA genomico sono
stati per amplificare il II esone del gene del recettore MT1 della melatonina e i prodotti di 20 campioni sottoposti a sequenziamento (Carcangiu et al., 2009). Tutti i campioni amplificati sono stati digeriti con due enzimi MnlI e RsaI per evidenziare i due polimorfismi. Dai dati ottenuti e stata calcolata la frequenza allelica e genotipica mediate (Genepop).
RISULTATI - Il prodotto della PCR dei 62 campioni ha esitato in una singola banda da 824
bp. La digestione degli amplificati con l’enzima MnlI mostra 7 siti di taglio nelle posizioni 221, 254, 324, 560, 582, 610, 693, e solo il sito di taglio in posizione 324, del tratto amplificato, è risultata polimorfico. Questa posizione corrisponde alla posizione 612 della sequenza depositata in GenBank e il polimorfismo è determinato da una sostituzione di un’Adenina (A) con una Guanina (G). La presenza della Guanina determina il taglio evidenziabile all’elettroforesi con una banda da 236 e una da 67 (allele +) mentre la presenza dell’Adenina conduce ad una banda da 303 (allele -) (Fig. 2). La frequenza allelica e genotipica viene mostrata nella tabella 1. È risultata prevalente la frequenza dell’allele – e del genotipo -/- rispetto all’allele + e al genotipo +/+. La digestione del frammento amplificato con RsaI ha evidenziato quattro siti di taglio in posizione 56, 323, 346 e 757 che hanno esitato in 5 bande da 411, 267, 67 e 23 bp. Il polimorfismo è determinato dalla presenza di una citosina (C) o di una timina (T) in posizione 606 della sequenza depositata. La presenza della C (allele C) nella posizione suddetta determina il taglio con l’evidenziazione all’elettroforesi di due bande una da 267 e l’altra 23 bp mentre la presenza della T (allele T) non essendoci il sito di taglio lascia intatto il frammento da 290 bp. La frequenza allelica e genotipica viene mostrata nella tabella 1. È risultato prevalere l’allele C rispetto a quello T e il genotipo C/C rispetto a quello T/T. La popolazione è risultata in equilibrio di Hardy-Weinberg sia per il sito di restrizione MnlI che per quello RsaI. Il sequenziamento del frammento amplificato ha confermato la presenza o l’assenza del polimorfismo in tutti i campioni esaminati. Inoltre il sequenziamento ha consentito di caratterizzare il II esone del gene del recettore della melatonina nel muflone . Tale gene è risultato avere un’omologia del 100% con la pecora di razza Sarda. Dall’allineamento sono risultate cinque mutazioni, comprese quelle che determinano il polimorfismo, di cui quattro silenti, che non conducono a cambi aminoacidici, e una in posizione 706 che implica una sostituzione aminoacidica, (Tabella 3). Gli animali che risiedevano presso i recinti di ripopolamento hanno presentato il parto dal 25 Marzo fino al 20 Aprile.
DISCUSSIONE - I dati della presente ricerca forniscono prima di tutto la sequenza della
maggior parte della regione codificante del gene del recettore della melatonina di un ovino selvatico, come il muflone, e quindi non sottoposto a selezione da parte dell’uomo. Tale frammento, che corrisponde alla maggior parte dell’esone II del gene suddetto non differisce da quanto si riscontra negli ovini domestici (Messer et al. 1997). La sostituzione in posizione 612 della sequenza è quella che principalmente è stata correlata con l’attività riproduttiva negli ovini. Infatti, gli animali del genotipo +/+ mostrano un’attività riproduttiva meno legata
genotipo -/- (Pellettier et al., 2000; Chu et al., 2006). Anche nella pecora di razza Sarda noi abbiamo rilevato che il genotipo +/+ determina un anticipo dell’attività riproduttiva rispetto ai -/- (Carcangiu et a., 2009). Nella presente ricerca i mufloni hanno mostrato il genotipo -/- con alte frequenze e superiori a molte razze di pecore domestiche. Inoltre considerando che questi animali hanno presentato i parti nel mese di Marzo-Aprile confermano che gli ovini portatori di questo genotipo hanno una attività riproduttiva molto legata al fotoperiodo anche se non risiedono ad alte latitudini. La prevalenza di questo genotipo è frutto della selezione naturale in quanto gli animali portatori di questo carattere hanno maggiore successo riproduttivo. Infatti il parto in primavera da una possibilità maggiore di sopravvivere ai nascituri per il fatto che le condizioni ambientali sono ottimali per la crescita e la produzione di latte, da parte della madre, per le buone risorse pascolative ambientali. Invece gli animali che nascono in altri periodi e quindi con riproduzione non propriamente vincolata al fotoperiodo decrescente partoriscono o troppo tardi (fine estate inizio autunno) o troppo in anticipo (inverno) e ciò determina la nascita dei piccoli in periodi non ottimali per il loro sviluppo.
CONCLUSIONI - I risultati del presente studio forniscono la sequenza del II esone del gene
del recettore della melatonina di un ovino selvatico come il muflone. Inoltre, mette in risalto che gli animali portatori del genotipo -/- del gene suddetto hanno una attività riproduttiva molto influenzata dal fotoperiodo. L’alta frequenza di questo genotipo e la bassissima frequenza del genotipo +/+ è pertanto frutto della selezione naturale per consentire la sopravvivenza della specie.
BIBLIOGRAFIA – Carcangiu V., Mura M.C., Vacca G.M., Pazzola M., Dettori M.L., Luridiana S., Bini P.P., 2009. Polymorphism of the melatonin receptor MT1 gene and its relationship with seasonal reproductive activity in the Sarda sheep breed. Anim. Reprod. Sci. in press. Chu M.X., Cheng D.X., Liu W.Z., Fang L., Ye S.C., 2006. Association between melatonin receptor 1A gene and expression of reproductive seasonality in sheep. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 19 1079-1084. Dubocovich M.L., 1988. Pharmacology and function of melatonin receptors. FASEB J. 2 2765-2773. Hernandez X., Bodin L., Chesneau D., Guillaume D., Chemineau P., Malpaux B., Migaud M., 2005. Relationship between MT1 melatonin receptor gene polymorphism and seasonal physiological responses in Île-de-France ewes. Reprod. Nut. Develop. 45 151–162. Karsch F.J., Bittman E.L., Foster D.L., Goodman R.L., Legan S.J., Robinson J.E., 1984. Neuroendocrine basis of seasonal reproduction. Rec. Prog. Horm. Res. 40 185–232. Kennaway D.J. Rowe S.A., 1995. Melatonin binding sites and their role in seasonal reproduction. J. Reprod. Fertil. Suppl. 49 423–435. Lincoln G.A., Lincoln C.E., McNeilly A.S., 1990. Seasonal cycles in the blood plasma concentration of FSH, inhibin and testosterone, and testicular size in rams of wild, feral and domesticated breeds of sheep. J. Reprod. Fertil. 88 623-633. Malpaux B, Daveau A, Maurice-Mandon F, Duarte G & Chemineau P 1998 Evidence that melatonin acts in the premammillary hypothalamic area to control reproduction in the ewe: presence of binding sites and stimulation of luteinizing hormone secretion by in situ microimplant delivery. Endocrinol 139 1508- 1516. Messer L.A., Wang L., Tuggle C.K., Yerle M., Chardon P., Pomp D., Womack J.E., Barendse W., Crawford A.M., Notter D.R., Rothschild M.F., 1997. Mapping of the melatonin receptor 1a (MTNR1A) gene in pigs, sheep and cattle. Mamm. Genome 8 368-370. Notter DR & Cockett NE 2005 Opportunities for detection and use of QTL influencing seasonal reproduction in sheep: a review. Genet. Sel. Evol. 37 S39-S53. Pelletier J., Bodin L., Hanocq E., Malpaux B., Teyssier J., Thimonier J., Chemineau P. 2000. Association between expression of reproductive seasonality and alleles of the gene Mel1a receptor in the ewe. Biol. Reprod. 62 1096-1101. Wayne N.L., Malpaux B., Karsch F.J. 1989. Social cues can play a role in timing onset of the breeding season of the ewe J. Reprod. Fertil. 87 707-713. Weaver DR, Liu C & Reppert SM 1996 Nature’s knock-out: the Mel1b receptor is not necessary for reproductive and circadian responses to melatonin in Siberian hamsters. Mol. Endocrinol. 10 1478-1487.
CRONOLOGIA DEI PICCHI DI LH IN PECORE SARDE SOTTOPOSTE A