Albrizio M, Guaricci AC, Dimatteo S, Di Bello A, Siniscalchi M, Quaranta A.
Dipartimento di Produzione Animale, Università degli Studi di Bari
SUMMARY - The aim of this study was to investigate the presence of the mu opioid receptor
in the liver and in the testis of the turtle Caretta caretta. The mu opioid receptor is the target
for exogenous and endogenous opioid peptides that are responsible for several physiological effects acting as autocrine, paracrine and endocrine factors. In mammals the role of this G- coupled receptor has been investigated in relation to its ability in modulating digestion, the liver response to viral agents and the reproductive activity; in reptilian no information are available yet. In this study the presence of the receptor in the two tissues has been investigated by a molecular approach. The results obtained show that in the liver and testis of Caretta caretta the mu opioid receptor is expressed thus suggesting its possible involvement in the
regulation of digestion and reproduction in reptilian.
INTRODUZIONE - I peptidi oppioidi endogeni esplicano numerosi effetti fisiologici sia a
livello centrale che periferico attivando, come fattori autocrini, paracrini ed endocrini, specifici recettori transmembrana accoppiati a proteine G. I recettori oppioidergici vengono distinti in tre classi principali: mu, delta e kappa. La loro distribuzione, tessuto specifica, è stata ampiamente studiata nei mammiferi e correlata alla regolazione di numerose attività funzionali quali l’analgesia, la respirazione, la motilità gastrointestinale (1) e la riproduzione (2-3). Nei rettili, il sistema oppioidergico è stato studiato soprattutto in relazione alla regolazione della funzione respiratoria; il cervello dei rettili, infatti, a differenza di quello dei mammiferi, risulta essere particolarmente resistente all’anossia. La risposta alla privazione di O2 dipende in gran parte dalla regolazione ed espressione di proteine di membrana (4); i
recettori oppioidergici ne risultano coinvolti, essendo stato dimostrato il loro ruolo sia attraverso studi funzionali, impiegando agonisti ed antagonisti, sia attraverso studi di binding (5). Nei mammiferi è stato studiato il coinvolgimento di tali recettori nella regolazione delle funzioni digestive (6), nella risposta epatica ad agenti virali (7) e nella modulazione della funzione riproduttiva (3), nei rettili manca sia una caratterizzazione molecolare dei recettori che una mappa di distribuzione tessutale. Obiettivo di questo studio preliminare è stato pertanto valutare l’espressione, attraverso un approccio molecolare, del recettore mu in
Caretta caretta.
MATERIALI E METODI - Lo studio è stato effettuato su un esemplare di Caretta caretta
spiaggiato sulle coste del basso Adriatico in provincia di Lecce e giunto presso la nostra Facoltà per i rilievi autoptici. Il soggetto di sesso maschile pesava Kg 10,8, presentava un carapace caratterizzato dai seguenti diametri: CLC 47,8 cm; CCW 42,2 cm.
Sono stati prelevati frammenti di tessuto epatico e di parenchima testicolare che sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e polverizzati per poter estrarre le proteine totali secondo la metodica precedentemente riportata (3). In breve 100 mg di materiale polverizzato sono stati solubilizzati in 300 µl di tampone di lisi freddo (PBS/0.1%Triton X) contenente il seguente cocktail di inibitori di proteasi: 1µg/ml Pepstatina A, 1µg/ml Leupeptina, 1µg/ml Aprotinina, 100µg/ml PMSF, 100g/ml Benzamidina, 8µg/ml Calpaina I e II. Ciascun
al vortex ogni 10’; al termine è stato centrifugato a 10000xg a 4°C e si è recuperato il sovranatante. E’ stato effettuato il dosaggio spettrofotometrico del sovranatante per valutarne il contenuto proteico. Quaranta microgrammi di proteine di ciascun campione sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel precostituito di poliacrilammide 4-12% (Bio-Rad, Milano, Italia). Al termine dell’elettroforesi le proteine sono state trasferite su membrana Immobilon- P (Millipore, Milano, Italia) mediante il sistema Trans-Blot semi-dry (Bio-Rad) e ibridate per 18 ore a 4°C con l’anticorpo primario di coniglio contro il terzo loop extracellulare del recettore mu di ratto diluito 1:7500 (Chemicon, Roma, Italia). Dopo opportuni lavaggi la membrana è stata ibridata con l’anticorpo secondario coniugato con perossidasi diluito 1:10000 (Chemicon). L’immunocomplesso è stato successivamente rivelato mediante il sistema ECL plus (Amersham, Milano, Italia). Come controllo positivo di ibridazione, sono state utilizzate le proteine estratte da cervello di ratto. La specificità dell’anticorpo è stata valutata ibridando la membrana contenente le proteine con una miscela equimolare di anticorpo e del suo antigene. A conferma dell’integrità delle proteine utilizzate, la membrana è stata deibridata mediante RestoreTM Western blot Stripping Buffer (Pierce, Milano, Italia) e ibridata nuovamente con anticorpo anti beta-actina diluito 1:10000 (Chemicon).
RISULTATI - L’analisi mediante western blot delle proteine estratte da testicolo e fegato di
Caretta caretta, ha evidenziato la presenza di segnali di ibridazione positivi per il recettore
mu per gli oppioidi. Così come osservato nel cervello di ratto, anche in Caretta caretta il
recettore si presenta caratterizzato da segnali multipli di ibridazione. Sono stati evidenziati, infatti, segnali positivi corrispondenti a proteine di peso compreso fra 70 e 40 kDa circa manifestazione dei rimaneggiamenti post-traduzionali a cui il recettore è sottoposto nei vari tessuti. Nel testicolo l’intensità dei segnali risulta maggiore rispetto a quella del fegato; nel cervello di ratto è presente un’ulteriore banda positiva di ibridazione di circa 65 kDa. In tutti i tessuti analizzati è osservabile un segnale positivo di ibridazione di circa 30 kDa corrispondente alla forma nativa del recettore (8). Nessun segnale di ibridazione è stato invece ottenuto ibridando la membrana contenente le proteine con la miscela equimolare di anticorpo e del suo antigene comprovando, quindi la specificità dell’anticorpo impiegato. L’integrità delle proteine utilizzate è stata valutata sottoponendo la membrana ad ibridazione con l’anticorpo per la proteina costitutiva beta-actina. È stato ottenuto il segnale atteso di circa 40 kDa in tutti i campioni esaminati.
~ 70 kDa ~ 65 kDa ~ 50 kDa ~ 45 kDa ~ 40 kDa ~ 30 kDa ~ 40 kDa Beta-actina MOR T F C T- F- C-
Western blot: nel pannello in alto è mostrata l’ibridazione di proteine estratte da testicolo (T)
e da fegato (F) di Caretta caretta e da cervello di ratto (C) con l’anticorpo anti terzo loop del
recettore mu per gli oppioidi diluito 1:7500. I pesi molecolari dei segnali positivi di ibridazione sono indicati mediante frecce. Nella parte destra del pannello è mostrata l’ibridazione delle stesse proteine (T-, F-, C-) con una miscela equimolare di anticorpo e del suo antigene per comprovare la specificità dell’anticorpo. Nel pannello in basso è mostrata l’ibridazione delle stesse proteine con l’anticorpo per il gene costitutivo beta-actina diluito 1:10000.
DISCUSSIONE - Questo studio preliminare condotto su un esemplare di Caretta caretta, ha
evidenziato l’espressione del recettore mu per gli oppioidi anche nel fegato e nel testicolo dei rettili. È stato effettuato un western blot impiegando, per la prima volta in questa specie, un anticorpo prodotto in coniglio utilizzando una sequenza di ratto corrispondente al terzo loop extracellulare del recettore mu per gli oppioidi. La cross reattività dell’anticorpo di ratto era stata evidenziata in precedenza solo per i pesci (9) e per i mammiferi quali: topo (10), uomo (11), cavallo (3) cane (12). I risultati del nostro studio confermano ulteriormente il ruolo del terzo loop quale regione funzionalmente importante del recettore mu, poiché sito di legame degli agonisti (13), il che lascia supporre che la sequenza amminoacidica si sia mantenuta inalterata fra specie filogeneticamente divergenti. Sarebbe interessante, in uno studio successivo, analizzare tale sequenza sia a livello nucleotidico che amminoacidico per una completa caratterizzazione del recettore in questa specie di rettili di grande interesse faunistico. La presenza di segnali multipli di ibridazione di differente peso molecolare lascia supporre che anche in questa specie come nel ratto e nella specie equina (8) la proteina corrispondente al recettore mu per gli oppioidi subisca modificazioni post-traduzionali di glicosilazione e/o fosforilazione che ne modulano la risposta funzionale nei vari distretti cellulari. La differente intensità dei segnali di ibridazione nel testicolo e nel fegato lascerebbe presupporre l’impiego preferenziale di una delle forme di modificazione post-traduzionale quale risposta funzionale dello specifico tessuto ai differenti stimoli. Questo lavoro, infatti apre nuove interessanti prospettive per la caratterizzazione funzionale del recettore mu nei rettili, poiché traccia la via per intraprendere uno studio dettagliato dei differenti pattern di modificazione della proteina successivi alla sua sintesi osservabili nei diversi distretti cellulari, inoltre l’espressione del recettore in tessuti funzionalmente differenti di Caretta caretta quali il testicolo e il fegato suggerisce l’importanza del sistema oppioidergico nella
modulazione di eventi funzionali chiave nella vita di un individuo quali la digestione e la riproduzione così come dimostrato nei mammiferi.
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CARATTERISTICHE CITOCHIMICHE, MORFOMETRICHE E FUNZIONALI DI