Paoletti E, Baragli P, Pacchini S, Martelli F, Sighieri C.
Dipartimento di Scienze Fisiologiche, Università di Pisa
SUMMARY – Cortisol determination in hair it's a non-invasive method and seems to be
important for studies of chronic stress. February to May, 20 healthy horses of equitation’s school were divided in 2 groups, Green Group (GV: 4 females and 6 geldings; 13±2,9 aged) and Red Group (GR: 5 females and 5 geldings; 13.7±2.7 aged). GG was subjected to environmental enrichment protocol. Hair samples were collected with manually shave, at skin level, from a square zone on ischiatic region at the beginning of the experiment (T0), after 45 days (T1) and at the end of the three months period of the experiment (T2). Cortisol extraction was made with ethyl ether and concentration was analyzed using a salivary ELISA kit. Data were statistically analyzed with Kruskal-Wallis test for variability within groups and with Mann-Whitney test to rank variability. The results showed a variability in both groups between T0 vs T1 (GG, P=0.009; RG, P=0.013) and T0 vs T2 (GG, P=0.004; RG, P=0.004), but not between T1 vs T2. No differences were found between groups (P>0.06). Those results show the possibility of HPA axis monitoring using hair analyses. Anyway there are a lot of question about hair physiology, cortisol cyclical release and cortisol accumulation in hairs that must take in account.
INTRODUZIONE – Il monitoraggio negli animali dello stress da un punto di vista
endocrinologico si è incentrato soprattutto sulla valutazione della concentrazione di cortisolo a livello ematico, salivare e talvolta fecale, riscontrando talvolta problemi di ordine pratico: le metodologie impiegate sono risultate essere spesso invasive, scarsamente significative e piuttosto indaginose. La misurazione della concentrazione di cortisolo nel pelo potrebbe invece fornire un’importante alternativa per lo studio dello stress cronico, rappresentando una metodica semplice, indicativa di un intervallo di tempo adeguatamente lungo e per niente invasiva. Le metodiche di analisi del pelo hanno trovato larga applicazione soprattutto nelle scienze forensi, sia in campo umano (1) che animale (2). Negli ultimi tempi comunque l’analisi del pelo ha attratto l’interesse del mondo scientifico anche per quanto riguarda la valutazione del benessere animale (3-12), ma ancora non vi è stata una sua applicazione al cavallo. Scopo del nostro lavoro è stato quindi quello di verificare il possibile utilizzo di questa metodologia anche negli equini e di comparare i livello di cortisolo nel pelo di due gruppi sottoposti a diversi protocolli di management.
MATERIALI E METODI – Da Febbraio a Maggio del 2007, 20 cavalli di una scuola di
equitazione, clinicamente sani, sono stati sottoposti a un protocollo sperimentale relativamente al benessere dei cavalli in scuderia. Questi sono stati divisi in due gruppi, il Gruppo Verde (GV) e il Gruppo Rosso (GR), costituiti rispettivamente da 4 femmine e 6 castroni (età 13±2,9 anni) e 5 femmine e 5 castroni (età 13.7±2.7 anni). Il GV è stato sottoposto per tre mesi a un protocollo che contemplava per i soggetti la possibilità di maggiori contatti sociali tra i cavalli dello stesso gruppo, un arricchimento ambientale dei box e modifiche nella gestione dell’abbeverata e dell’alimentazione in risposta ai bisogni etologici della specie. Il GR invece è stato mantenuto nelle condizioni standard, senza apportare nessuna modifica. I prelievi di pelo sono stati predisposti all’inizio del periodo sperimentale,
tempo 0 (T0), a metà di questo, dopo 45 giorni (T1) e alla fine, dopo altri 45 giorni (T2). I prelievi sono stati effettuati con rasatura manuale, il più possibile in prossimità della pelle, ponendo attenzione a non causare lesioni, nella regione della tuberosità ischiatica seguendo il protocollo di Accorsi e colleghi (2008). I campioni raccolti sono stati identificati e conservati in fogli di alluminio ben chiusi fino alle analisi. La metodologia di estrazione del cortisolo dal pelo è stata modificata da Martin e Réale (11). Il pelo è stato finemente tagliato in frammenti di 1–3 mm di lunghezza: per l’estrazione sono stati utilizzati 50 mg di peli così preparati a cui sono stati aggiunti 2,5 ml di etere etilico. Le provette sono state quindi agitate su vortex per 30” e poi incubate a temperatura ambiente e agitate delicatamente per 1 h. I campioni sono stati quindi filtrati per separare la fase liquida. L’estrazione è stata ripetuta altre due volte aggiungendo 2 ml di etere etilico alla fase solida. La fase liquida è stata quindi essiccata a 37 °C sotto un flusso di gas di azoto e il residuo secco è stato nuovamente disciolto in 100 µl di PBS a pH 7.0. La concentrazione di cortisolo è stata quindi determinata con un kit commerciale ELISA per il cortisolo salivare (Dia-Metra S.r.l., Italy) (6). Alcuni campioni, scelti casualmente, sono stati anche analizzati con metodologia RIA, per validare la metodologia impiegata (DIMORFIPA, Università di Bologna). I dati sono stati statisticamente analizzati con il test di Mann-Whitney per la comparazione tra le mediane di due campionamenti della stessa popolazione e con il test di Kruskal-Wallis per la comparazione tra i gruppi.
RISULTATI – L’analisi statistica ha evidenziato una differenza tra T0 e T1 nel GV
(P=0,009) e nel GR (P=0,013) e tra T0 e T2 nel GV (P=0,004) e nel GR (P=0,004). Non è stata rilevata nessuna differenza tra T1 e T2 per il GV (P=0,829) e per il GR (P=0,330). Nessuna differenza è stata evidenziata tra i due gruppi con il test di Kruskal-Wallis (P>0.06). I risultati sono illustrati in Figura 1.
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 T0 T1 T2 [c o rt is o lo ] n g /m l GV GR
Figura 1. Andamento delle medie delle concentrazioni di cortisolo nel pelo nel GV e GR.
DISCUSSIONE – Le analisi da noi effettuate sono state in grado di rilevare delle
concentrazioni di cortisolo con un coefficiente di variazione compreso tra 0,34 e 0,79 che, in relazione al numero di campioni da noi analizzato, può essere ritenuto un sufficiente grado di attendibilità. Sembra quindi possibile la valutazione del cortisolo nel pelo anche nel cavallo. Per quanto riguarda la variabilità tra i vari test si è evidenziato un aumento tra T1 e T2, per entrambi i gruppi. E' da ritenersi probabile la presenza di un fattore comune che abbia
determinato un aumentato rilascio di cortisolo, imputabile probabilmente a una variazione stagionale (13). Da T1 a T2 la concentrazione di cortisolo non è cambiata significativamente, anche se nel GV è andata tendenzialmente diminuendo, mentre nel GR è andata tendenzialmente aumentando. Nell'osservare tali risultati dobbiamo considerare che ci sono molte variabili relativamente alle analisi del pelo. I meccanismi coinvolti nell’accumulo di una sostanza nel pelo (14, 15) sembrano infatti coinvolgere diverse vie: endogena, per diffusione passiva dalla fitta rete capillare che circonda il follicolo pilifero; endogena- esogena, attraverso la diffusione dai diversi secreti dell’organismo, quali sebo e sudore; esogena, per un fattore di contaminazione ambientale. La sostanza viene quindi ritenuta nelle fibre cheratinizzate attraverso la sua interazione con i componenti presenti (melanina, proteine, etc.) (16) in dipendenza di diversi fattori (2). Esiste quindi un lasso di tempo intercorrente tra l’incorporazione della sostanza nel pelo e la comparsa di tale sostanza sulla porzione esterna del pelo stesso, non ancora definito (2). La crescita del pelo è inoltre influenzata da molti fattori, quali specie, stagione, fotoperiodo, temperatura e clima, disponibilità di cibo, rilasci ormonali, variabilità individuale, età, genere, regione del corpo (17, 18). La finestra temporale presa in esame con il campionamento effettuato da T0 a T2 potrebbe quindi non essere stata sufficiente a evidenziare l’eventuale rilascio e accumulo di cortisolo relativamente a tale periodo. Altro importante fattore che può influire sui risultati riguardanti il cortisolo è la natura del follicolo pilifero, che, a livello di singole cellule, reagisce in risposta a eventi stressanti con una produzione locale di cortisolo (19, 20). Saranno quindi necessari ulteriori approfondimenti per chiarire come una eventuale produzione locale possa influire sulla concentrazione di cortisolo rilevata nel pelo. In conclusione il nostro studio potrebbe aprire una strada alternativa per il monitoraggio endocrinologico dello stress cronico nel cavallo. Anche se i nostri risultati non hanno evidenziato differenze significative tra i due gruppi, sono da ritenersi necessarie ulteriori indagini relativamente alle variabili sopraccitate, che possano effettivamente validare o meno i risultati ottenuti.
BIBLIOGRAFIA – 1) Pragst F, Balikova MA (2006) Clin Chim Acta, 370, 17-49. 2)
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E191. 10) Accorsi PA et al (2008) Gen Comp Endocrinol, 155, 398–402. 11) Martin JGA e Réale D (2008) Behav Proc, 77, 66-72. 12) Pelagalli A et al (2008) Atti VII Congr Naz
SOFIVet, San Benedetto del Tronto, 91-92. 13) Fazio E et al (2001) Atti del LV Congr Naz SISVet, Rimini, 20-22 settembre, 61-62. 14) Cone EJ, (1996) Therap Drug Monit, 18, 438- 443. 15) Henderson GL (1992) Forensic Sci Int, 63, 19-29. 16) Pötsch L et al (1997) Forensic Sci Int, 84, 25-35. 17) Stenn KS e Paus R (2001) Physiol Rev, 81, 449-494. 18) Dunnett M e Lees P (2003) Research in Veterinary Science, 75, 89-101. 19) Botchkarev VA (2003) Am J Path, 162, 709-712. 20) Slominski A et al (2007) Mol Cell Endocrinol, 265–266, 143-149.
Si ringrazia Horse Country S.r.l. e il Prof. Accorsi con il gruppo di ricerca DIMORFIPA (Università di Bologna). Ricerca eseguita con un contributo Horse Country S.r.l. (http://www.horsecountry.it).