Micera E1, Moramarco AM1, Zupa R2, Corriero A2, De Metrio G2, Zarrilli A.1
1
Dip. di Produzione Animale, Università di Bari
2
Dip. di Sanià' e Benessere degli Animali, Università di Bari
SUMMARY – During the reproductive season, the Atlantic bluefin tuna show oocytes at
different growing stages, indicating an asynchronous pattern of ovarian development. In maturing female fish, vitellogenin is produced in high amounts and it is the precursor of the egg yolk proteins. Vitellogenin is synthesized in the liver under estrogenic control and released into the blood stream to be incorporated the developing oocytes. Vitellogenin is normally absent in male fish and in juvenile female fish. In the bluefin tuna, sex and gonadal maturity cannot be determined by simple visual inspection due to the lack of external sexual dimorphisms. Vitellogenin can be therefore used as a specific biomarker for gender and reproductive phase determination. The aim of this study was to develop a rapid, qualitative latex test for the detection of vitellogenin in bluefin tuna plasma.
INTRODUZIONE – Il tonno rosso (Thunnus thynnus L.) è un grande pesce pelagico capace
di migrazioni trans-atlantiche con aree di riproduzione circoscritte nel Golfo del Messico e nel Mar Mediterraneo (1). La riproduzione, nel Mediterraneo, avviene da maggio a luglio, con variazioni spazio-temporali legate all'andamento termico (2). Il tonno rosso è soggetto ad una intensa pressione di pesca che si è tradotta in una drastica riduzione della biomassa dei riproduttori nel corso degli ultimi decenni (2; 3). Sforzi notevoli sono in atto per sviluppare l'acquacoltura del tonno rosso (4; 5). Femmine di tonno rosso mostrano variazioni stagionali dell’attività ovarica, permettendo la caratterizzazione di quattro periodi. Esse, nel Mediterraneo centrale e occidentale, sono riproduttivamente inattive da agosto a marzo, quando solo ovociti in stadio peri-nucleare (cellule poliedriche di piccolo diametro e senza tuorlo) sono presenti negli ovari. Nel mese di aprile ovociti allo stadio lipidico appaiono negli ovari (fase pre-vitellogenesi). Nel mese di maggio gli ovari sono caratterizzati dalla presenza di ovociti vitellogenici con tuorlo (fase vitellogenica). Nei mesi di giugno-luglio, pieno periodo riproduttivo, negli ovari sono presenti ovociti idratati e/o follicoli post-ovulatori, segni rispettivamente di una ovulazione imminente e/o recente (fase di tarda vitellogenesi). Nei mesi da fine luglio a settembre gli ovari contengono solo ovociti in stadio perinucleare e senza tuorlo e gli ultimi stadi dei follicoli vitellogenici in atresia (fase post-vitellogenesi). La presenza simultanea di tutti gli stadi di sviluppo degli ovociti in questa specie indicano che il tonno rosso ha uno sviluppo degli ovociti asincrono (6). Durante la maturazione ovarica le femmine producono grandi quantità di vitellogenina (Vtg), una proteina utilizzata quale precursore delle proteine del tuorlo, principali fonti nutrizionali per la crescita degli embrioni. La Vtg è normalmente assente o presente in minime concentrazioni nei maschi e nelle femmine prepuberi (7). Si tratta di un complesso lipoglicofosfoproteico prodotto sotto controllo estrogenico nel fegato di femmine mature. Il controllo estrogenico della Vtg è mediato dal legame del 17β-estradiolo allo specifico recettore epatico. La Vtg è rilasciata nel torrente circolatorio per essere incorporata negli ovociti in accrescimento mediante endocitosi
mediata da recettore (8). La Vtg serve anche come una molecola carrier per lipidi, carboidrati, gruppi fosfati e sali minerali essenziali per il normale sviluppo delle uova (9).
Poichè ci sono molti segmenti di Vtg che appaiono essere altamente conservati tra le specie, è possibile lo sviluppo di anticorpi che cross-reagiscono tra le specie potendo servire a un ruolo più universale (10). La Vtg è stata usata nelle specie di interesse in acquacoltura come un indicatore della maturità sessuale (11) e può essere un utile biomarker per la determinazione di genere, in specie dove non esiste un dimorfismo sessuale esterno. Molti metodi analitici sono stati sviluppati per misurare i livelli circolanti di Vtg nel plasma: ELISA, RIA, elettroforesi e Western Blotting (12; 13). Una tecnica basata su biopsia muscolare per la determinazione del sesso e la maturità sessuale è stata sviluppata per il tonno rosso e il pesce spada (Xiphias gladius L.) con kit ELISA (14). Tutte queste tecniche richiedono complesse procedure di laboratorio e costi notevoli. Scopo di questo lavoro è quello di fornire un test qualitativo rapido per la ricerca della Vtg nel plasma di tonno rosso, utile per l'identificazione di genere in esemplari allevati in acquacoltura.
MATERIALI E METODI - Allestimento del campione: prelievi di sangue sono stati
ottenuti da tonni rossi allevati in due impianti di allevamento sperimentale (Vibo Marina, Calabria, Italia e Cartagena, Murcia, Spagna) e sacrificati durante i mesi di aprile (n = 15), maggio (n = 12) e giugno (n = 9 ) 2008. Campioni di sangue sono stati presi anche da tonni selvatici pescati nel mese di giugno 2008 (N = 11) (Sardegna, Italia). Tutti i pesci utilizzati nel presente studio erano adulti in base alle dimensioni della prima maturità sessuale segnalate da Corriero nel 2003 (6). Il sangue è stato raccolto dalle vene laterali o dal cuore con siringhe eparinizzate e centrifugato a 5000×g per 15'. Il plasma è stato stoccato a -20° C.
Preparazione della sospensione di anticorpi anti-Vtg-latex (abVtg-LS): Anticorpi anti-Vtg di orata purificati da coniglio (Biosense, Bergen, Norvegia) sono stati accoppiati a particelle di latex carbossilate di 0,8 mm di diametro. La sensibilizzazione delle particelle di latex è stata effettuata con lavaggi in tamponi a diverso pH: tampone carbonato (pH 9,6), tampone fosfato (pH 4,7). Alle particelle di latex risospese in fosfato buffer è stato aggiunto il 2% di 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimide-HCl e 5 mM N-hydroxysuccinimide (NHS). La sospensione è stata agitata per 4 ore a temperatura ambiente e poi lavata in tampone borato, pH 8,0. Le diluizioni di anticorpi anti-Vtg utilizzate sono state: 1:100, 1:300, 1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:5000 (15). Il latex coniugato è stato lavato in BSA e risospeso in latex storage buffer (1% di BSA, 5% di glicerolo e 0,1% di NaN3 in PBS).
Test di agglutinazione del latex: la reazione di agglutinazione del latex è stata eseguita su tutti i campioni di plasma raccolti (n=47) miscelando, su un vetrino da microscopio, 50 microlitri di plasma con 20 microlitri di abVtg-LS.
RISULTATI – La reazione di agglutinazione tra abVtg-LS e la Vtg presente nel plasma dei
campioni era visibile tra 60'' e 120". I risultati ottenuti sono mostrati in Tabella 1.
Tabella 1- Reazione di agglutinazione tra abVtg-LS in differenti concentrazioni e il plasma di femmine di tonno rosso nei differenti mesi testati.
Diluizioni anticorpi anti-Vtg 1:100 1:300 1:500 1:1000 1:2000 1:5000 aprile - - - - maggio + + + + - - giugno + + + + + -
Nel periodo non riproduttivo o fase pre-vitellogenica (aprile) nessuna diluizione di abVtg-LS ha mostrato una reazione di agglutinazione nei 15 campioni (6 maschi e 9 femmine). All’inizio del periodo riproduttivo o fase vitellogenica (maggio) le diluizioni comprese tra 1:100 e 1:1000 hanno rivelato la presenza di Vtg nelle 4 femmine dei 12 campioni (8 maschi). In tarda fase di vitellogenesi (giugno) tutte le diluizioni di abVtg-LS, tranne 1:5000, hanno reagito positivamente con 6 femmine dei 9 pesci testati (3 maschi) presenti nell’impianto di allevamento sperimentale e nelle 6 femmine degli 11 pesci selvatici (5 maschi).
DISCUSSIONE - L’agglutinazione con il latex, tra tutti i test di rilevamento di antigene, è il
metodo più rapido e semplice da eseguire. Combinando il latex con anticorpi anti-Vtg di orata purificati dal coniglio abbiamo creato un test qualitativo, basato su una reazione di agglutinazione, in grado di rivelare in pochi secondi la presenza di questa proteina nel plasma. Il nostro test si è rivelato efficace per la determinazione del sesso nel pieno periodo riproduttivo, fase di vitellogenesi iniziale e tarda vitellogenesi.
Viene confermato che nelle femmine adulte in periodo non riproduttivo la Vtg è presente in concentrazioni molto basse (11).
Il test di agglutinazione messo a punto costituirà un importante strumento di gestione dei riproduttori di tonno in acquacoltura e si può ipotizzare un suo utilizzo anche in concomitanza di esperimenti di marcatura con strumenti elettronici, al fine di ottenere informazioni utili per meglio interpretare i dati relativi ai comportamenti migratori dei soggetti marcati.
BIBLIOGRAFIA - 1) Block BA et al (2005) Nature, 434, 1121–1127. 2) Heinisch G et al
(2008) Marine Biology, 154, 623-630. 3) ICCAT (2007) In: Report for biennial period, 2006– 07, Part I: 2006. ICCAT, Madrid, pp 98–114. 4) Corriero A et al (2007) Aquaculture, 272, 675-686. 5) Mylonas CC et al (2007) Reviews in Fisheries Science, 15, 183-210. 6) Corriero A et al (2003) J. Fish Biol, 63, 108-119. 7) Parks LG et al (1999) Comp. Biochem. Physiol. C, 123, 113–125. 8) Berg H et al (2004) Reproductive Biology and Endocrinology, 2, 62. 9) Gillespie DK, de Peyster A (2004) Ecotoxicology and Environmental Safety, 58, 90-95. 10) Denslow ND et al (1997) In D.A. Bengston and D.S. Henschel (eds) Environmental Toxicology and Risk Assessment: Biomarkers and Risk Assessment (5th Vol) ASTM STP 1306, pp 23-36. Philadelphia: American Society for Testing and Materials. 11) Mosconi G et al (1998) General and Comparative Endocrinology, 110, 252-261. 12) Heppell SA, Sullivan CV (2000) Col. Vol. Sci. Pap. ICCAT, 51, 860-864. 13) Kim N et al (2008) Biosensors and Bioelectronics, 24, 391-396. 14) Bridges CR et al (2001) Col. Vol. Sci. Pap. ICCAT, 52, 752- 758. 15) Inzana TJ (1995) Journal of Clinical Microbiology, 33, 2297-2303.
MODIFICAZIONI DELLE IODOTIRONINE TOTALI E LIBERE NEL CAVALLO