Ciani F∗∗∗∗, Cocchia N, El Rass R∗∗∗∗, Avallone L∗∗∗∗, Sica A, Rosapane I, Tortora G, Lorizio R.
∗Dipartimento di Strutture, Funzioni e Tecnologie Biologiche
Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie, Università degli Studi di Napoli Federico II
SUMMARY – Almost all of the felidae species are considered endangered, critically
endangered or vulnerable. Appreciable progress has been made in the development of assisted reproductive technology (ART) for creating in vitro embryos in cats. The aim of this study was to assess the efficiency of immature domestic cat oocytes vitrification in Open Pulled Straw (OPS) using an association of EG (Ethylen Glycol) and DMSO (Dimethyl sulfoxide), and to evaluate the embryonic development after parthenogenetic activation. Anova Test was used to compare the obtained results in control and vitrified oocytes; developmental ability and significance was assessed for P < 0,05. The percentage of degenerated oocytes was higher in vitrified oocytes than control (P < 0.01), while cleavage rate and morulae blastocysts rate significantly lower (P < 0.01) in vitrified oocytes than control. The results demonstrated the possible development to blastocyst of vitrified oocytes. In conclusion cat oocytes can be vitrified in OPS with a fairly good survival rate, cleavage rate and embryo development.
INTRODUZIONE - Le ART (Assisted Reproduction Tecniques) sono state recentemente
accettate ed inserite nei programmi per la salvaguardia dall’estinzione delle specie a rischio (Swanson et al., 2000). La crioconservazione dei gameti rappresenta una procedura fondamentale per lo sviluppo dei programmi di ART essendo in grado di annullare le distanze geografiche, di ridurre le problematiche relative alla difficoltà di sincronizzare la raccolta dei gameti maschili e femminili e soprattutto garantisce lo stoccaggio di materiale genetico tanto prezioso quale quello delle specie a rischio di estinzione. Della famiglia Felidae, tutte le 37
specie sono state dichiarate rare, vulnerabili o a rischio d’estinzione (Swanson et al., 2000) ad eccezione del gatto domestico che rappresenta, dunque, l’unico modello animale utile per lo sviluppo delle metodiche di riproduzione assistita in tale specie. Inoltre, il gatto domestico può essere un possibile ricevente degli embrioni di felini selvatici prodotti in vitro come già dimostrato dalla nascita di piccoli vivi e vitali di Indian desert cat (Pope et al., 1994). Gli
ovociti di gatto domestico hanno alcune peculiarità che limitano lo sviluppo di metodi di crioconservazione efficienti: ooplasma contenente un altissimo numero di goccioline lipidiche (Guraya, 1965) e minore permeabilità ai crioprotettori rispetto agli ovociti di altre specie (Luvoni, 2006). La vitrificazione è una tecnica alternativa di crioconservazione che prevede una esasperazione della velocità di discesa termica al momento del congelamento (Gasparrini et al., 2007). Differenti metodi sono stati sperimentati a tale scopo e tra questi le Open Pulled Straws (OPS) sono state già impiegate con successo in differenti specie (Vajta et al., 1998). Scopo del presente studio è di valutare l’efficienza di sviluppo in vitro dopo attivazione partenogenetica di ovociti di gatto domestico vitrificati allo stadio di Vescicola Germinale (GV).
MATERIALI E METODI - Le ovaie, raccolte da 20 gatte domestiche di differente razza, di
età compresa tra 1 e 5 anni, sottoposte ad ovariectomia presso l’ospedale veterinario dell’ASL Na1, sono state immerse in DPBS con penicillina (63 mg/ml) e streptomycina sulphate (70 mg/ml) a temperatura ambiente e trasportate in laboratorio per la raccolta dei cumulus-oocyte complexes (COCs) entro 3h dall’espianto. I COCs sono stati raccolti mediante mincing delle
ovaie in piastra petri da 35 mm - 0.7 mm contenenti 2 ml Hepes Synthetic Oviductal Fluid (HSOF). Gli ovociti di Grado I e II (Luvoni e Pellizzari, 2000) sono stati lavati 3 volte in HSOF e suddivisi in 2 gruppi: gruppo 1 (gruppo controllo) sottoposto ad In Vitro Maturation
(IVM) e gruppo 2 (gruppo vitrificazione) sottoposto. I COCs di I e II grado raccolti e/o vitrificati-riscaldati sono stati maturati in HSOF con aminoacidi e 5 mg/ml BSA (SOFaaBSA) addizionato con FSH (0,1UI/ml), LH (0,1UI/ml), ITS (Insulin–Transferrin–Sodium selenite) (25µl/ml) ed EGF (25ng/ml), in piastre multipozzetto (50 COCs/ml) in incubatore con il 5% CO2 a 38.5°C per 24 h (Merlo et al., 2008) Gli ovociti maturati sono stati sottoposti ad
attivazione partenogenetica. La vitrificazione è stata effettuata in OPS (Vajta et al., 1998) previa equilibrazione dei medium in terreni di vitrificazione secondo il seguente protocollo: 5% EG e 5% DMSO in HSOF 1 min, 10% EG e 10% DMSO in HSOF 1 min, e 20% EG e 20% DMSO, 10 mg/ml Ficoll 70 e 0.3 M trehalose in HSOF 20 s. Gli ovociti così preparati sono stati caricati in OPS ed immediatamente immersi in azoto liquido e stoccati per 4 settimane. Il riscaldamento è stato effettuato attraverso una graduale esposizione ad HSOF senza trehalose: 1 M trehalose 2’, 0,5 M trehalose 5’, 0 trehalose. Dopo il riscaldamento i COCs immaturi vitrificati sono stati sottoposti ad IVM, attivazione partenogenetica e In Vitro Coltura (IVC). Ad ogni ripetizione dell’esperimento i COCs dei 2 gruppi dopo IVM sono
stati sospesi in HSOF e sottoposti ad attivazione partenogenetica: esposizione dei COCs a HSOFaaBSA (6 mg/ml) con il 7% di etanolo per 10’. Dopo l’attivazione i COCs sono stati coltivati in SOFaaBSA (16 mg/ml) con 2 mM di 6-DMAP per 4h a 38,5°C in 5% CO2, 5% O2
e 90% N2. I COCs attivati sono stati poi sottoposti a coltura in vitro (IVC). Gli embrioni
sviluppati sono stati coltivati per 10gg in SOFaaBSA (16 mg/ml) addizionato con il 10% di FBS (20–30/500 microlitri) a 38.5°C in 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Il medium è stato
sostituito ogni 4 giorni. (Pope, 2004).
RISULTATI - I Risultati ottenuti, esposti in tabella 1. Sono stati sottoposti a one-way
analysis of variance (ANOVA) con il sistema d’analisi statistica informatizzato Graphpad in Stat Version for Windows XP. La significatvità è stata stabilita per P < 0.05. Sono stati valutati l’efficienza di maturazione in vitro, il cleavage e l’efficienza di sviluppo a blastocisti. Per ognuno dei parametri considerati esiste differenza significativa tra i 2 gruppi. Il gruppo vitrificazione mostra, però, una buona percentuale di cleavage e di divisione embrionale (Tabella 1).
Tabella 1 – Sviluppo embrionale di oociti di gatto domestico vetrificati allo stadio GV usando un’associazione di EG e DMSO.
COCs (n°) Cleavage n° (%) Morule n° (%) Blastocisti n° (%)
Gruppo Controllo (354) 176 (49,71) 142 (40,11) 68 (19,20) Gruppo Vitrificati (268) 58 (21,64) 33 (12,31) 12 (4,47)
DISCUSSIONE - La metodica di vitrificazione da noi sperimentata ha consentito di ottenere
COCs di gatto competenti in grado di sviluppare fino allo stadio di blastocisti. I risultati da noi ottenuti dimostrano livelli di efficienza inferiori se confrontati con i risultati precedentemente ottenuti da Merlo et al. (2008) e prima ancora da Murakami et al. (2004) ma
questo è il primo studio in cui si ottengono blastocisti post attivazione ed IVC di ovociti di gatto domestico vitrificati allo stadio di GV. Molti studi hanno dimostrato come la limitata efficienza di sviluppo in vitro di ovociti crioconservati vada ascritta ai danni (cryoinjuries)
ultrastrutturali apportati, in particolare, al fuso meiotico (Martino et al., 1996). Rivolgeremo, dunque, i nostri futuri studi alla valutazione immunocitochimica delle modificazioni ultrastrutturali rilevabili in ovociti di gatta post-vitrificazione.
BIBLIOGRAFIA – 1) Swanson WF, McRae MA, Bond JB, Melniczek JR, Haskens ME.
(2000) Biol Reprod 62 (Suppl. 1), 319-325. 2) Pope CE, McRae MA, Plair BL, Keller GL, Dresser BL. (1994) Theriogenology 42, 513–25. 3) Guraya SS. (1965) J Exp Zool 160, 123– 36. 4) Luvoni GC. (2006) Theriogenology 66, 101–11. 5) Gasparrini B, Attanasio L, De Rosa A, Monaco E, Di Palo R, Campanile G. (2007) Anim Reprod Sci 98, 335–42. 6) Vajta G, Holm P, Kuwayama M, Booth PJ, Jacobsen H, Greve T, Callesen H. (1998) Mol Reprod Dev. 51, 53-8. 7) Luvoni GC, Pellizzari P. (2000) Theriogenology 53. 1529–40. 8) Merlo B., Iacono E., Regazzini M., Zambelli D. (2008) Theriogenology 70, 126–130. 9) Pope CE (2004) Methods Mol Biol. 254. 227-44. 10) Murakami OM, Karja NWK, Wongsrikeao P, Agung B, Suzuki T. (2004) Cryobiology 48 341–8. 11) Martino A, Pollard JW, Leibo SP. (1996) Mol Reprod Dev 54. 1059–69.
RISPOSTA ALLO STRESS NEI PRIMI STADI DI SVILUPPO DELLA SPIGOLA