Bertotto D1, Negrato E1, Radaelli G1, Richard J2, Simontacchi C1.
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Dipartimento di Scienze Sperimentali Veterinarie, Università degli Studi di Padova
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Impianto Ittico Sperimentale di Pellestrina, Veneto Agricoltura, Legnaro Padova
SUMMARY - In fish, as in mammals, high levels of cortisol indicate a stress status but the
hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI) axis develops at different times among species. The present study investigates stress in a commercial species, the European sea bass
Dicentrarchus labrax by sampling larvae, post larvae and fry during routine procedure in the
production cycle as tank transfer at 4 and 42 days post hatching (dph) and grading at 77 and 105 dph. Cortisol was measured with a specific microtitre radioimmunoassay (RIA) validated in “in toto” animals. The hormone was not detectable in 4 dph-larvae while at 42 dph,
transferred animals showed levels significantly higher than controls (37±6 and 21±0,7 ng/g respectively). Grading of 77- dph fries caused an important increase in cortisol production with 16±2,5 ng/g in controls and 63±4 ng/g in graded animals. Also the grading of 105-dph fries increased cortisol levels from 10±2 ng/g of controls to 41±4 ng/g of graded animals. The results indicates that the 4 dph is an age with low reactivity to the stress while tank transfers and grading resulted highly stressful in animals older than 42 dph. In conclusion, the analysis of cortisol levels during development in sea bass provide data useful to improve production protocols minimizing the stress conditions.
INTRODUZIONE - Il cortisolo è il principale glucocorticoide prodotto dal tessuto
interrenale dei pesci (Wendelaar Bonga, 1997; Mommsen et al., 1999). Questo ormone, oltre
a svolgere importanti funzioni come regolatore di processi fisiologici quali il metabolismo energetico, l’osmoregolazione, l’immunità e lo sviluppo, è stato ampiamente dimostrato essere implicato nella reazione allo stress. Infatti nei pesci, come in molti mammiferi, elevati livelli di cortisolo sono indicatori di uno stato di stress, ma l’asse ipotalamo-ipofisi- interrenalico (HPI) inizia a funzionare in momenti diversi dello sviluppo a seconda della specie: nella carpa l’asse funziona già prima della schiusa delle uova (Stouthart et al., 1998),
mentre in altre specie esso viene attivato solo dopo la schiusa, come in tilapia (Hwang e Wu, 1992) o in trota fario (Barry et al., 1995) o alla metamorfosi, come in Paralictis olivaceus, un
pesce piatto del Giappone (Seiler et al., 1983). L’analisi dei livelli di questo steroide nei primi
stadi di sviluppo, generalmente critici per la sopravvivenza degli animali, potrebbe fornire indicazioni utili per un eventuale intervento sui protocolli di allevamento al fine di evitare i gravi danni derivanti da elevate produzioni di cortisolo. Il nostro studio è stato eseguito su una specie di grande interesse commerciale, la spigola (Dicentrarchus labrax), per valutare,
attraverso la produzione del cortisolo, l’effetto stressante di alcune pratiche del normale ciclo produttivo d’allevamento, quali trasferimenti e selezioni per taglia.
MATERIALI E METODI - Larve, post larve e avannotti di spigola sono stati prelevati da
lotti di produzione dell’Impianto Ittico Sperimentale di Pellestrina (Veneto Agricoltura, Legnaro) e successivamente analizzati presso i nostri laboratori. La deposizione dei
raccolte e trasferite negli schiuditoi. Una volta schiuse, le larve sono state mantenute al buio e non alimentate fino al 10° giorno dopo la schiusa. I campionamenti sono stati effettuati in vari momenti del ciclo produttivo, in corrispondenza dei primi due trasferimenti di vasca, a 4 e 42 giorni dalla schiusa, e delle prime due selezioni per taglia, a 77 e 105 giorni.
Nel primo trasferimento, a 4 giorni, le larve sono state trasferite dagli schiuditoi a vasche troncoconiche di capienza maggiore mediante un tubo innescato come sifone. A 42 giorni, le larve sono state nuovamente trasferite in vasche più grandi concentrandole in un piccolo volume di acqua e convogliandole, con un tubo avvitato allo scarico, in secchi da 10 lt e da qui in mastelli da 500 lt che sono stati poi riversati nella vasca di destinazione. Il trasferimento è durato complessivamente 2 ore. La selezione delle taglie è una pratica di uso comune nell’allevamento di alcune specie ittiche, in particolare della spigola, che serve a migliorare la gestione del lotto di animali ed evitare il cannibalismo. Nello specifico di questo studio, essa è stata effettuata per mezzo di “selezionatori” ovvero di ceste galleggianti provviste di fessure di dimensioni variabili a seconda della taglia che si vuole selezionare. Gli animali di controllo sono stati prelevati subito prima del trasferimento nei selezionatori mentre gli individui “trattati” sono stati prelevati un’ora circa dopo la selezione. Tutti gli animali sono stati sacrificati con eccesso di anestetico (MS222) e mantenuti a -20°C fino al momento dell’analisi radioimmunologica (RIA) del cortisolo. Le larve di 4 giorni sono state riunite in campioni di numerosità variabile (70-100) mentre le post larve derivate dal secondo trasferimento (42 giorni) sono state processate in gruppi di tre individui ciascuno. Gli avannotti provenienti dalle selezioni (77 e 105 giorni dalla schiusa) sono stati trattati singolarmente. Al momento dell’analisi i campioni sono stati scongelati per il conteggio e la pesatura, quindi ricongelati con azoto liquido, polverizzati, estratti con etere dietilico e aliquote degli estratti utilizzate per il RIA del cortisolo, già validato su larve e avannotti di spigola “in toto” (RIA su micropiastra; optiplate 96 well PACKARD).
Data la distribuzione non normale dei dati ottenuti, per valutare la differenza fra le varie concentrazioni di cortisolo si è utilizzato il test non parametrico U di Mann-Whitney. I valori medi riportati nel testo e nella tabella sono espressi come mediane. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software per Windows STATISTICA 7.1.
RISULTATI - La tabella 1 riporta le concentrazioni di cortisolo negli animali di controllo e
dopo le pratiche di allevamento rappresentate da 2 trasferimenti e 2 selezioni di taglia.
Pratiche di allevamento (età) Controlli (C) Trattati (T) cortisolo (ng/g) mediana ± es n cortisolo (ng/g) minimo cortisolo (ng/g) massimo C nr 4 nr nr 1° trasferimento (4 giorni) T nr 3 nr nr C 20,7± 0,7 44 10,0 28,0 2° trasferimento (42 giorni) T 36,9±6,5 23 14,1 123,0 C 15,6±2,5 27 4,5 57,8 1° selezione (77 giorni) T 63,1±4,4 32 14,3 112,7 C 10,5±2,3 12 5,3 34,9 2° selezione (105 giorni) T 41,0±4,0 10 14,1 48,3
Tab 1. Concentrazione di cortisolo in larve, postlarve e avannotti di spigola (nr = non
I livelli di cortisolo delle larve di 4 giorni si sono dimostrati non rilevabili, cioè inferiori alla sensibilità del metodo di dosaggio (< 3 pg/pozzetto), sia negli individui di controllo che in quelli trasferiti. Invece negli individui di 42 giorni si sono evidenziati valori di cortisolo significativamente più elevati nei trasferiti rispetto ai controlli (p < 0,000; U = 193,0). Nei campionamenti prima e dopo la selezione delle taglie, effettuati a 77 giorni di età, gli individui selezionati hanno presentato concentrazioni di cortisolo maggiori rispetto ai controlli (p < 0,000; U = 52,0). Infine, anche gli avannotti sottoposti alla seconda selezione (105 giorni) hanno mostrato livelli di cortisolo significativamente più alti rispetto ai controlli (p < 0,000; U = 4,0).
DISCUSSIONE E CONCLUSIONE - La mancata rilevabilità della concentrazione di
cortisolo nelle larve di 4 giorni sottoposte al trasferimento consente solo di affermare che le quantità prodotte sono sicuramente basse, ma non è possibile escludere che ci sia comunque una risposta allo stress, seppure minima. Rimane quindi da capire se la bassa produzione di cortisolo sia dovuta ad un basso stress indotto dalla pratica di trasferimento adottata o alla bassa funzionalità dell’asse HPI in quel momento dello sviluppo. Una replica dell’analisi sottoponendo le larve di 4 giorni ad un evento sicuramente stressante potrà chiarire questo aspetto. A 42 giorni di età, il trasferimento di vasca, effettuato con modalità certamente più traumatiche rispetto a quella utilizzata a 4 giorni, ha evidenziato un effettivo funzionamento dell’asse HPI con valori di cortisolo significativamente più elevati negli animali trasferiti rispetto ai controlli. Anche la prima selezione di taglia, effettuata a 77 giorni, si è rivelata un evento particolarmente stressante, con una risposta in termini di produzione di cortisolo più elevata rispetto a quella riscontrata durante il secondo trasferimento. Questo risultato potrebbe essere giustificato dalla maggiore traumaticità dell’evento, oppure da un completamento dello sviluppo della risposta allo stress. In maniera del tutto analoga, gli avannotti di 105 giorni hanno evidenziato un aumento significativo nei livelli di cortisolo, determinato dalla selezione per la taglia. La variabilità individuale nella produzione del cortisolo sia a livello dei controlli che dei trattati sembra essere una caratteristica di questa specie come si evince anche da diversi lavori condotti su animali adulti.
In conclusione, i trasferimenti e le selezioni per la taglia applicate successivamente ai 42 giorni dalla schiusa, con le modalità descritte, risultano altamente stressanti e vanno pertanto limitati allo stretto necessario ed eventualmente perfezionati nel protocollo in modo da minimizzare al massimo lo stress.
BIBLIOGRAFIA - Barry, T.P., Malison, J.A., Held, J.A., Parrish, J.J., 1995. Ontogeny of
the cortisol stress response in larval rainbow trout. Gen Comp Endocrinolol, 97 (1): 57-65. Hwang, P.P., Wu, S.M., Lin, J.H., Wu, L.S., 1992. Cortisol content of eggs and larvae of teleosts. Gen Comp Endocrinol, 86 (2): 189-196.
Mommsen, T.P., Vijayan, M.M., Moon, T.W., 1999. Cortisol in teleosts: dynamics, mechanisms of action, and metabolic regulation. Rev. Fish Biol. Fisher. 9, 211-268.
Seiler K, Seiler R, Claus R, Sterba G., 1983. Spectrophotometric analyses of hydroxysteroid dehydrogenase activity in presumed steroid-producing tissues of the brook lamprey (Lampetra planeri bloch) in different developmental stages. Gen Comp Endocrinol.
51(3):353-63.
Stouthart, A.J., Lucassen, E.C., van Strien, F.J., Balm, P.H., Lock, R.A., Wendelaar Bonga, S.E. 1998. Stress responsiveness of the pituitary-interrenal axis during early life stages of common carp (Cyprinus carpio). J Endocrinol, 157 (1): 127-137.
CARATTERIZZAZIONE DEL GENE DEL RECETTORE MT1 DELLA