Toschi P, Fidanza A, Pasquariello N, Czernik M, Di Egidio F, Maccarrone M, Loi P, Ptak G.
Dipartimento di Scienze Biomediche Comparate, Università degli studi di Teramo
SUMMARY - In vitro culture and manipulation of embryos can lead to aberrant placental
and foetal development in all mammals studies so far. The development of a normal placental angiogenesis is central for further foetal growth. A reduced placental vascular development, associated with embryonic mortality, has been described in ART derived sheep foetuses. Placental development and function is strongly regulated by imprinted genes, therefore, the majority of the studies have focused on their epigenetic deregulation in ART foetuses. However, placental angiogenesis relays mostly on non imprinted genes. In this work we analyzed by Real-Time PCR the expression levels of 22 imprinted and non imprinted genes, including several angiogenetic factors and components of Notch signalling pathway, which are involved in vascular development and differentiation. Extraembryonic tissues were collected at day 20 of gestation from embryos obtained by natural breeding (control), parthenogenesis (PA), in vitro fertilization (IVF) and Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT). Altered levels of mRNA expression were found in the experimental embryo models comparing with the controls. Particularly deregulated were FGF2 and various components of Notch pathway like Notch-1,2,4 receptors and Dll1, a specific ligand. In addition, placenta from ART embryos showed a down regulated expression of imprinted genes, like H19, PHLDA2, IGF2, as well as a reduced expression of DNA methyltransferase-1 (Dnmt1). Our results demonstrated a deregulation of genes regulating placental development and angiogenesis, affecting both imprinted and non imprinted genes, in sheep ART derived foetuses. Remarkably, the imprinted genes whose expression we found altered are totally different from those described in mice, suggesting important differences between species in the epigenetic alteration resulting from extreme ART, such SCNT. To conclude, our work bring a significant contribution toward the molecular characterization of the ART-derived placental phenotypes, and strongly suggest that equal attention should be focused on non imprinted genes.
INTRODUZIONE - Nei mammiferi la maggior parte delle perdite embrionali avviene
durante il primo periodo di gestazione (>30% nelle specie animali, ~50% in quella umana). Le prime fasi della gravidanza hanno infatti un ruolo fondamentale in quanto si instaura in esse una corretta angiogenesi placentare, evento indispensabile per la crescita e lo sviluppo del feto. Si è visto inoltre che l’utilizzo di tecniche di coltura in vitro degli embrioni la loro micromanipolazione può portare ad un aberrante sviluppo placentare e fetale (1). In particolare, feti di topo e di pecora ottenuti con l’utilizzo di tecnologie ART, esibiscono anomalie di sviluppo e vascolarizzazione placentare in molti casi associate a morte precoce dell’embrione (2). Tuttavia, nonostante esista una correlazione fra la gravità delle anomalie osservate e l’invasività della manipolazione, le conoscenze riguardo ai meccanismi che contribuiscono ad un’alterata placentazione negli embrioni ART sono ancora limitate. Lo
sviluppo placentare è largamente dipendente da geni regolati da imprinting genomico”. L’imprinting genomico è un meccanismo di regolazione epigenetico (non basato cioè su modifiche della sequenza del DNA) che conferisce una complementarità funzionale agli alleli paterni e materni unitisi alla fertilizzazione, dove i paterni controllano lo sviluppo dei tessuti extraembrionali e quelli materni invece lo sviluppo del feto proprio. La produzione di embrioni con tecniche di riproduzione assistita (ART) è spesso associata ad una alterata espressione di geni imprintati, soprattutto nella placenta. In questo studio è stata analizzata l’espressione di 22 geni imprintati e non, inclusi vari fattori angiogenetici e componenti della famiglia Notch coinvolti nello sviluppo vascolare e nella differenziazione artero-venosa (3), in tessuti extraembrionali di embrioni ART di pecora. Al fine, tessuti extra-embrionari sono stati prelevati al 20 ° giorno di sviluppo (fase in cui ha inizio la vascolarizzazione placentare) di embrioni di pecora ottenuti in seguito a monta naturale (controllo), o in seguito ad embryo transfer di embrioni ottenuti mediante partenogenesi (PA), fertilizzazione in vitro (IVF) e trasferimento nucleare di cellule somatiche (Somatic Cells Nuclear Trasnfer - SCNT).
MATERIALI E METODI - Le analisi sono state effettuate su tessuti extraembrionali di
pecora raccolti al giorno 20° di gestazione e conservati in azoto liquido. I modelli sperimentali sono stati prodotti nel nostro laboratorio adattando i metodi embrionali precedentemente descritti (2,4). L’RNA totale è stato estratto usando l’RNeasy Mini Kit (Qiagen) in accordo con le procedure descritte nel protocollo. Per il dosaggio dei campioni è stato utilizzato il metodo spettrofotometrico e 1µg di RNA è stato quindi retrotrascritto come da protocollo tramite QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). In seguito sono stati disegnati i primers d’espressione per i seguenti geni: β-ACTINA (housekeeping), VEGF, FGF2, FGF2R2, ANG1, ANG2, Tie-2, CDH5, Efrina B2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH4, JAG1, JAG2, HEY1, HEY2, DLL1 (impinting materno), DLL4, IGF2 e MEST (entrambi con
imprinting materno), H19, PHLDA2 e CDKN1C (imprinting paterno), DNMT1. I livelli di m-
RNA sono stati determinati tramite Real-Time PCR quantitativa (ABI PRISM 7700 Applied Biosystem) utilizzando Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (Invitrogen) secondo le modalità descritte nel protocollo. Il gene housekeeping della β-actina è stato utilizzato per normalizzare i dati ottenuti e la quantizzazione relativa è stata effettuata applicando il metodo comparativo Ct. Per l’analisi statistica i dati sono stati elaborati utilizzando il Mann-Whitney T-test non parametrico (GraphPad 5 Software for Science).
RISULTATI - I nostri risultati hanno dimostrato una alterata espressione di alcuni geni in
tutti i modelli embrionali ART, rispetto ai controlli. In particolare i livelli dell’mRNA dell’FGF 2 mostrano una significativa riduzione in tutti i modelli ART (p<0.05). Al contrario, l’mRNA di ANG2 e del rispettivo recettore Tie2 è maggiormente espresso nei partenogenoti rispetto agli IVF (p<0.01); in questi ultimi infine ANG2 e Tie2 sono down- regolati rispetto ai controlli (p<0.05). Anche i geni imprintati presentano una espressione anomala nei modelli sperimentali studiati. In particolare H19, IGF2 e PHLDA2 risultano significativamente meno espressi nei cloni rispetto ai controlli (p<0.05). Inoltre lo stesso H19 mostra un aumento significativo dei livelli di mRNA negli embrioni monoparentali rispetto agli IVF (p<0.01) e ai cloni (p<0.05). In questi 2 modelli sperimentali l’espressione della DNMT1 risulta ridotta rispetto ai controlli (p<0.05), mentre i partenogenoti mostrano anche in questo caso un significativo (p<0.01) aumento nei livelli di mRNA rispetto agli IVF. Anche i geni del pathway Notch risultano altamente deregolati negli embrioni ART. In particolare, i recettori Notch1 e 4, sono maggiormente espressi nei partenogenoti rispetto agli embrioni IVF (p<0.01). Anche Notch 2 e il ligando DLL1 mostrano lo stesso andamento, anche se con differenze meno significative (p<0.05). Inoltre il gruppo sperimentale dei cloni mostra elevati livelli d’espressione rispetto ai controlli per Notch2, rispetto agli IVF per quanto riguarda i 3
recettori Notch e il ligando Jag1 (p<0.05). Infine Notch4, Dll1 e Jag2 risultano meno espressi negli embrioni ART rispetto ai controlli con diversa significatività (Dll1 e Jag2: p<0.05; Notch4: p<0.01).
DISCUSSIONE - I nostri risultati dimostrano che feti di pecora ottenuti in seguito all’utilizzo
di tecnologie ART presentano una alterata espressione dei geni coinvolti nello sviluppo e nell’angiogenesi placentare. Tali anomalie riguardano sia geni regolati da imprinting, che geni non-imprintati. Un dato importate rilevato è stata la discordanza fra le alterazioni epigenetiche riscontrate nei nostro studio, e quelle precedentemente descritte nel topo (modello di riferimento per la alterazioni epigenetiche indotte dalla procedure ART). Questo dato, unico nel suo genere, suggerisce differenze di specie nei meccanismi epigenetici che regolano lo sviluppo fetale, e nella loro de-regolamentazione indotta dalle tecniche ART più estreme, quali il (SCNT). Inoltre i nostri risultati sottolineano che nello studio delle anomalie placentari, stessa attenzione deve essere rivolta ai geni non-imprintati, come i classici fattori angiogenetici e i componenti della famiglia Notch, i cui livelli di espressione sono risultati significativamente alterati nei modelli sperimentali. I dati ottenuti supportano quindi l’ipotesi iniziale secondo cui le manipolazioni embrionali e la colture in vitro agiscono modificando l’asseto epigenetico placentare nelle prime fasi della gravidanza, come indicato dalla alterata espressione di geni che regolano l’imprinting, come le DNMT1, e dei suoi target, da noi evidenziato. In conclusione, questo lavoro apporta un notevole contributo di conoscenza per la caratterizzazione molecolare dei fenotipi placentari derivanti dall’applicazione di diverse tecnologie ART, e indica chiaramente la inattendibilità del topo come modello universale per lo studio delle alterazioni epigenetiche indotte dalle tecniche ART.
BIBLIOGRAFIA - 1) Feil et al. 1998, Mamm. Genome 9, 831-834; 2) Loi et al 1998, Biol.
Reprod. 58, 1177-1187; 3) Thomas Gridley 2007 Development 134, 2709-2718; 4) Ptak et al. 2002 Biol. Reprod. 67, 1719-25.
NORMALE PROFILO DI METILAZIONE DEL GENE H19 NEL TESSUTO