Avies aortos inervacijos segmentiniai skirtumai.

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS ANATOMIJOS INSTITUTAS

Adomas Aladaitis

Avies aortos inervacijos segmentiniai skirtumai.

BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS

Darbo vadovė: prof. Neringa Paužienė

2

TURINYS

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5

6. SĄVOKOS ... 6

7. SANRUMPOS ... 7

8. ĮVADAS ... 8

9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

10.1 Aortos sandara. Segmentiniai skirtumai ... 10

10.2 Aortos nervinė reguliacija ... 12

10.3 Pilvinės aortos aneurizma ... 13

11. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 16

11.1 Medžiaga ... 16

11.2 Imunohistocheminis tyrimas... 16

11.3 Mikroskopinis aortos nervinių struktūrų tyrimas ... 17

12. REZULTATAI ... 21

12.1 Krūtininės ir pilvinės aortos inervacijos gylis ... 21

12.2 Krūtininės aortos vidurinio dangalo nervinės skaidulos ... 22

12.3 Krūtininės ir pilvinės aortos bendras nervinių skaidulų (PGP9.5) ir adrenerginių (TH) skaidulų pasiskirstymas ... 23

13. REZULTATŲ APTARIMAS ... 28

14. IŠVADOS ... 30

3

1. SANTRAUKA

Autorius. Adomas Aladaitis. Pavadinimas. Avies aortos inervacijos segmentiniai skirtumai. Tyrimo tikslas. Imunohistochemiškai nustatyti ir palyginti avies aortos inervaciją skirtinguose jos segmentuose.

Uždaviniai. 1. Nustatyti aortos nervinių skaidulų tipą. 2. Nustatyti skaidulų išsidėstymą ir

gausumą aortoje. 3. Palyginti avies krūtininės ir pilvinės aortos segmentų inervacijos ypatybes.

Tyrimo metodika. Ištirtos trys juodgalvių avių aortos. Kiekviena aorta padalinta į tris segmentus: krūtininė aorta, aorta thoracica,pilvinės aortos viršinkstinis segmentas, aorta suprarenalis, pilvinės aortos poinkstinis segmentas, aorta infrarenalis. Imunohistocheminiu metodu buvo išryškinamos skirtingo neurocheminio fenotipo skaidulos ir nervai, naudojant keturis nervinių skaidulų žymenis: tirozino hidroksilazę (TH), su kalcitonino genu susijusį peptidą (CGRP), substanciją P (SP) ir baltymo geno produktą 9.5 (PGP9.5). Panaudojant “ImageJ” programos paketą buvo apdorotos 1008 gautos mikronuotraukos iš kiekvieno aortos segmento ir įvertintas nervinių struktūrų pasiskirstymas jose. Duomenys statistiškai apdoroti naudojant IBM v.20.0 programinę įrangą. Neparametriniai trijų nepriklausomų grupių duomenų vidurkiai ir jų skirtumai buvo statistiškai palyginti naudojant Wilcoxon testą, pasirinkus 95% patikimumo lygmenį (p<0,05).

Tyrimo rezultatai. Nustatyta, kad krūtininėje aortoje PGP9.5 (2,5±2,03 µm2) ir TH (2,15±1,45 µm2) teigiamų nervinių skaidulų yra daugiau negu pilvinėje aortos dalyje, p<0,001. Reikšmingai didesnis PGP9.5 teigiamų nervinių skaidulų tankumas (0,69±0,33 µm2

) buvo viršinkstiniame segmente, lyginant su poinkstinio segmento (0,4±0,34 µm2

) inervacija, p<0,05.

Krūtininėjė aortoje nervinės skaidulos randamos giliau – net iki 63% vidurinio dangalo, tunica media, storio, kai tuo tarpu pilvinės aortos viršinkstiniame ir poinkstiniame segmentuose, jos randamos 26,5% ir 20,4% atitinkamai, p<0.001.

Krūtininėje aortoje tolstant nuo išorinio dangalo, tunica externa, link spindžio statistiškai reikšmingai mažėjo tiek PGP9.5 tiek ir TH teigiamų nervinių skaidulų kiekis, p<0,001.

Išvados. 1. Avies aortoje daugiausiai yra simpatinės nervų sistemos skaidulų. Juntamosios SP ir CGRP teigiamos nervinės skaidulos buvo retos. 2. Avies aortoje inervacijos tankumas mažėja leidžiantis aortai nuo krūtininės link pilvinės dalių. 3. Krūtininėje aortoje nervinės skaidulos prasiskverbia giliau į vidurinį dangalą lyginant su pilvinės aortos segmentais.

4

2. SUMMARY

Author. Adomas Aladaitis. Title. Segmental Differences in the Innervation Meshwork in the Tunica Media of the Sheep Aorta.

Aim of the study. To investigate the differences of innervation in different segments of the sheep aorta with immunohistochemical methods.

Objectives. 1. To investigate the type of nerve fibres in the sheep aorta. 2. To define distribution and density of the nerve fibres in the sheep aorta. 3. To compare innervation peculiarities in different segments of the sheep aorta.

Methods. Three aortas of the blackfaced sheep were examined. Each aorta were divided into three segments: aorta thoracica, aorta suprarenalis, aorta infrarenalis. The fibres of various neurochemical phenotypes were visualized by means of the immunohistochemical method using four markers: protein gene product 9.5 (PGP9.5), tyrosine hydroxilase (TH), substance P (SP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP). All photos of aorta were processed with „ImageJ“ program modules. All data were calculated with IBM SPSS v.20.0 software package. Nonparametric data of three independent group means and their differences were statistically compared using Wilcoxon test, confidence interval 95% (p<0.05).

Results. In our analysis we found that thoracic aorta were more densely innervated than both suprarenal and infrarenal abdominal aorta segments. Thoracic aorta PGP9.5 - 2,5±2,03 µm2 and TH - 2,15±1,45 µm2, suprarenal segment PGP9.5 - 0,69±0,33 µm2, TH - 0.4±0.33 µm2, infrarenal segment PGP9.5 - 0,4±0,34 µm2 and TH - 0.34±0.28 µm2, p<0.001. Statistically significant difference also was found between suprarenal and infrarenal segments PGP9.5, p<0.05.

Nerve fibres network in thoracic aorta were found more deeper in tunica media than in abdominal aorta segments, p<0.001. In thoracic aorta nerve fibres take almost 63% of vessel width, in abdominal aorta suprarenal and infrarenal segments - 26.5% and 20.4%, respectively.

In thoracic aorta receding from adventitia to lumen positive nerve fibres positive for PGP9.5 and TH were significantly diminishing, p<0,001.

Conclusions. 1. Sympathetic nerve fibres are most abundant in all segments of sheep aorta. Sensory fibres, SP and CGRP positive were rare. 2. Innervation density was decreasing from the thoracic to the abdominal segments of the sheep aorta. 3. Nerve fibres penetrating more deeply in tunica media of thoracic aorta than abdominal aorta.

5

3. PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju savo mokslinio darbo vadovei gerb. prof. N. Paužienei už reikalingą pagalbą ir taiklius bei svarbius savalaikius patarimus. Taip pat gerb. dr. K. Rysevaitei-Kyguolienei už patarimus ir didelę pagalbą ruošiant preparatus bei dr. H. Inokaičiui už pagalbą paruošiant iliustracijas.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Leidimą išdavė Valstybinė Maisto ir veterinarijos tarnyba. Leidimo numeris G2-59. Leidimo išdavimo data 2017 02 15.

6

6. SĄVOKOS

Desminas - III tipo tarpinis filamentas, specifiškas raumenų ląstelėms; Disekacija – aortos vidinio dangalo, tunica intima, atsisluoksniavimas; Fentolaminas - neselektyvus alfa-adrenerginių receptorių antagonistas;

Guanetidinas - kraujo spaudimą mažinantis preparatas, mažinantis norepinefrino išsiskyrimą;

6-hidroksidopaminas - neurotoksinis preparatas, naikinantis dopaminerginius ir noradrenerginius neuronus;

Imunohistochemija - histochemijos rūšis, kai žymėtieji antikūnų preparatai naudojami aptikti specifines struktūras audiniuose;

Lamininas - pagrindinis ląstelių pamatinės membranos komponentas; Medija - aortos sienos vidurinis dangalas;

Poinkstinis pilvinės aortos segmentas – pilvinės aortos dalis žemiau inkstinių arterijų atsišakojimo; Tetrodotoksinas - neurotoksinas, natrio kanalų blokatorius;

Tunica externa - kraujagyslių sienos išorinis dangalas; Tunica intima - kraujagyslių sienos vidinis dangalas; Tunica media - kraujagyslių sienos vidurinis dangalas;

Viršinkstinis pilvinės aortos segmentas - pilvinės aortos dalis virš inkstinių arterijų atsišakojimo; Vimentinas - III tipo tarpinis filamentas, esantis mezenchiminėse ląstelėse.

7

7. SANRUMPOS

EDRF – endotelio išskiriamas atpalaiduojantis faktorius; FBT – fosfatinis buferinis tirpalas;

NK1 – neurokininas 1; NO – azoto oksidas;

PAA – pilvinės aortos aneurizma;

PPA – poinkstinis pilvinės aortos segmentas; VPA – viršinkstinis pilvinės aortos segmentas; PGP9.5 – baltymo geno produktas 9.5;

SNS – simpatinė nervų sistema; SP – substancija P;

KA – krūtininės aortos segmentas; TH – tirozino hidroksilazė.

8

8. ĮVADAS

Avių aortos plačiai naudojamos kardiovaskuliniuose tyrimuose, nes žmogaus ir avies širdies ir kraujagyslių sistema turi daug panašumų (avių koaguliacinė sistema tokia pati kaip ir mūsų) [1]. Siekiant suprasti aortos inervacijos ypatumus ir tobulinti ateities tyrimus, susijusius su aortos patologijomis, būtini gyvūnų aortų fiziologiniai, biocheminiai, imunohistocheminiai ir kiti tyrimai. Išsamūs aortos tyrimai atskleistų menkai ištyrinėtą aortos inervaciją ir sudarytų sąlygas suprasti aortos aneurizmų etiologiją.

Daugelyje tyrimų vertintas tik bendras aortos inervacijos tankumas bei lygintas su kito tipo (raumeninio) kraujagyslių inervacija [2,3,4]. Mūsų žiniomis, nėra duomenų apie avių aortos inervacijos segmentinius skirtumus, nors skirtingų aortos dalių jautrumas aneurizmoms yra skirtingas [5]. Aorta, kaip pagrindinė žmogaus arterija yra gyvybiškai svarbi, kiekviena jos patologija gali komplikuotis mirtimi. Inervacija atlieka labai svarbų vaidmenį normalios aortos sienos struktūros palaikyme. Sutrikus nervinei sistemai pradeda kisti aortos sienos sudėtis, ima didėti kolageno skaidulų, o lygiųjų raumenų ir elastino kiekis mažėja, taip aorta tampa standesnė ir mažiau atspari patiriamam stresui, kurį sukelia širdies išstumiamas kraujo tūris [6]. Ankščiau buvo manyta, kad aorta yra tik vamzdis, kuriuo pratekantis kraujas yra išskirstomas į visus kitus organizmo organus ir audinius, tačiau didėja įrodymų, kad aorta geba susitraukinėti panašiu dažniu kaip ir širdis ir taip reguliuoti pratekančio kraujo tūrį ir jo spaudimą [7].

Šiame darbe atliktas imunohistocheminis aortos sienos nervinių skaidulų tyrimas. Skirtingo neurocheminio fenotipo skaidulos aortos medijoje išryškintos imunochistocheminiu metodu ir įvertintas jų tankis, pasiskirstymas bei fenotipiniai skirtumai tarp atskirų avies aortos segmentų. Šis tyrimas tampa itin aktualus siekiant išsiaiškinti aortos inervacijos ypatumus ir galimą reikšmę palaikant optimalią kraujagyslės sienos struktūrą.

9

9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Imunohistochemiškai nustatyti ir palyginti avies aortos inervaciją skirtinguose jos segmentuose.

Uždaviniai:

1) Nustatyti aortos nervinių skaidulų tipą

2) Nustatyti skaidulų išsidėstymą ir gausumą aortoje

10

10. LITERATŪROS APŽVALGA

Anatomiškai aorta yra suskirstyta į tris pagrindines ir labai skirtingo ilgio dalis: kylančioji aorta, aortos lankas ir nusileidžiančioji aorta. Aortos aneurizmos dažniausiai vystosi nusileidžiančiojoje, ilgiausioje aortos dalyje, su didžiausiu dažniu poinkstiniame pilvinės aortos segmente [5]. Klinikinėje praktikoje nusileidžiančioji aorta dažniau skirstoma dar į tris dalis: krūtininė aorta, aorta thoracica, pilvinės aortos viršinkstinis segmentas, aorta suprarenalis, pilvinės aortos poinkstinis segmentas, aorta infrarenalis. Šis suskirstymas tampa labai svarbus priimant sprendimus dėl skirtinguose segmentuose esančių aneurizmų gydymo taktikos [5].

Histologiškai aortos siena sudaryta iš trijų dangalų, kurie vienas nuo kito atskirti išorine ir vidine elastine plokštelėmis. Vidinį dangalą, tunica intima, sudaro kraujagyslės spindį išklojantis endotelis, vidurinį dangalą, tunica media, sudaro elastinas, lamininas ir I, III ir IV tipo kolageno skaidulos bei lygiųjų raumenų ląstelės, o iš išorės aortą dengia puriojo jungiamojo audinio išorinis dangalas, tunica externa [8,9].

Dabar jau puikiai žinoma, kad aorta yra ne tik rezervuaras, iš kurio kraujas paskirstomas po visą organizmą, tačiau taip pat atlieka svarbų vaidmenį moduliuojant kairiojo skilvelio funkciją, aprūpina krauju miokardą bei visą arterinę sistemą [10]. Sistolės metu aorta išsiplečia, o diastolės susitraukia. Sistolės metu aortoje susikaupia didelis kiekis kraujo, kurį išstumia kairysis skilvelis, o diastolėje šis kraujo tūris paskirstomas po visą organizmą. Ši aortos funkcija svarbi palaikant kraujo spaudimą viso širdies ciklo metu. Aortos savybė sutalpinti reikiamą kraujo tūrį yra tiesiogiai susijusi su jos elastinėmis savybėmis. Šios savybės mažėja senstant ar sergant kai kuriomis ligomis [11,12].

Leidžiantis žemyn nuo kylančiosios aortos dalies iki bifurkacijos, kinta tiek struktūrinės, tiek ir mechaninės aortos savybės [13]. Pagrinde šių požymių kaitą lemia elastino ir kolageno santykis skirtinguose aortos segmentuose. Daugiausia elastino skaidulų randama proksimalinėje aortos dalyje, arčiau širdies, o kolageno – distalinėje. Tai nulemia skirtingą aortos sienos atsaką į skirtingo dydžio patiriamą stresą, kurį sukelia sistolės metu iš kairiojo širdies skilvelio išstumiamas kraujo tūris [7]. Sistolės metu išstumto kraujo sukeltam stresui aortos sienoje dalyvauja elastino bei standesnės ir tvirtesnės kolageno skaidulos. Diastolės metu, kuomet patiriamas stresas yra mažas, aortos sienoje pagrinde funkcionuoja tik elastino skaidulos [14-19]. Didesnis kolageno skaidulų kiekis pilvinėje aortoje nulemia tai, kad ši kraujagyslės sritis yra standesnė ir mažiau atspari patiriamam stresui, lyginant su krūtinine aortos dalimi, kurioje yra didesnis elastino skaidulų kiekis [20].

11 Lygiųjų raumenų ląstelių tankis visuose aortos segmentuose yra panašus. Manoma, kad lygieji raumenys sudaro tam tikrą tinklą kartu su kolageno skaidulomis, kuris suteikia papildomo

tvirtumo kraujagyslės sienai [21]. Lygiųjų raumenų ir endotelio ląstelės yra pagrindiniai aktyvūs

stambiųjų kraujagysių komponentai. Lygieji raumenys kraujagyslėse atlieka sintetinę funkciją, jie gamina ekstraląstelinį matriksą (kolageną, elastiną), nors kitose organizmo vietose tai atlieka fibroblastai [6]. Endotelis išskiria biochemiškai aktyvias medžiagas (su endoteliu susijusį augimo faktorių (EDRF), azoto monoksidą (NO), endoteliną (ET)). Pasyvieji komponentai elastinas ir kolagenas dalyvauja atliekant pagrindines aortos funkcijas, tačiau homogeniškas lygiųjų raumenų išsidėstymas visoje aortoje leidžia manyti kad lygieji raumenys ne tik gamina ekstraląstelinį matriksą, suteikia aortos sienai tvirtumo, tačiau tuo pačiu palaiko bendrą kraujagyslės tonusą [22,18]. Ilgai buvo manyta, kad stambiųjų kraujagyslių lygieji raumenys negali pakankamai aktyviai susitraukinėti širdies ciklo metu. Aortai ir kitoms stambioms kraujagyslėms buvo pritaikytas „Windkessel“ efektas, kuris paaiškina elastines aortos savybes širdies ciklo metu, kuomet aorta pasyviai išsiplečia ir susitraukia [23-28]. Tačiau atsirado naujų įrodymų, kad aortos medijoje esantys lygieji raumenys gali ne tik susitraukinėti ir taip palaikyti kraujagyslės tonusą ir reguliuoti kraujospūdį, bet ir pulsuoti tokiu pačiu dažniu kaip ir širdis [7]. Mangel ir kolegos [7] pademonstravo, kad triušio aorta širdies ciklo metu gali ritmiškai aktyviai susitraukinėti, ir šie sinchroniniai susitraukimai yra neurogeninės kilmės. Elektriškai stimuliuojant triušio aortą buvo sukelti susitraukimai, kurie buvo tokio pat dažnio kaip ir širdies ritmas. Šią aortos pulsaciją buvo galima suretinti panaudojant tetrodotoksiną ir fentolaminą [7]. Visa tai įrodo, kad sinchroniniai pulsiniai aortos susitraukimai yra neurogeninės kilmės ir reguliuojami širdies nervinės sistemos. Manoma, kad šie pulsiniai sinchroniniai aortos susitraukimai galimai saugo nuo kraujagyslės sienos pertempimo sistolės metu [23]. Sumažinant aortos sienos išsiplėtimą mažėja tempimo (Laplaso) jėgos veikiančios aortą, taip apsaugodamos nuo aortos vidinio dangalo atsisluoksniavimo ir aneurizmų formavimosi. Tačiau ši idėja dar nėra iki galo patikslinta [7].

Atlikti tyrimai rodo, kad senstant kinta aortos sienos sudėtis. Jauname amžiuje elastino ir kolageno formavimasis vyksta vienodai, tačiau organizmui senstant elastino kiekis pradeda stipriai mažėti, o kolageno didėti [29]. Todėl aortos vidurinis dangalas senstant storėja. Tai yra aiškinama didėjančiu tarpinio filamento vimentino ir mažėjančiu desmino kiekiu lygiosiose raumenų ląstelėse. Nesubrendusiose lygiųjų raumenų ląstelėse pagrinde randamas vimentinas, o subrendusiose desminas. Pastarosios labiau atlieka kontraktilinę funkciją, o nesubrendusios ląstelės – sintetinę, taip gamindamos daugiau ekstraląstelinio matrikso [30,6]. Buvo pastebėta, kad atlikus cheminę aortos simpatektomiją vimentino ekspresija taip pat padidėja [6].

12

10.2 Aortos nervinė reguliacija

Simpatinė nervų sistema (SNS) kraujagyslėse atlieka ne tik trumpalaikę aktyvacijos funkciją sukeliant vazokonstrikciją. Daugėja įrodymų, kad SNS turi trofinį poveikį lygiųjų raumenų ląstelėms. Ji modifikuoja jų metabolizmą bei skatina diferenciaciją ankstyvos angiogenezės, įvairių ligų ir pažaidų metu [31-33]. SNS daro didelį poveikį raumeninio tipo kraujagyslėms, keisdama jų tonusą bei geometriją. Tačiau iki šiol manoma, kad elastinio tipo kraujagyslėse SNS vaidmuo palyginus nėra toks svarbus [34,35]. Aortos biomechaninės funkcijos daugiausiai priklauso nuo ekstraląstelinio matrikso komponentų (elastino ir kolageno) bei kraujo spaudimo [10,35-38]. Taigi arterinę sistemą pagrinde reguliuoja SNS, tačiau jos poveikis aortos biomechaninėms savybėms nėra iki galo aiškus.

Atlikus cheminę simpatektomiją triušiams su 6-hidroksidopaminu, po 8 savaičių buvo tirtos jų aortos. Tyrimas parodė, kad sumažėjus SNS aktyvumui aortos sienoje statistiškai reikšmingai padaugėjo kolageno bei sparčiau pradėjo kauptis lipidai. Šie pokyčiai buvo prilyginti remodeliacijai, vykstančiai organizmui senstant [37]. Kitame tyrime, naudojant žiurkes ir atlikus cheminę simpatektomiją guanetidinu, buvo stebėtas aortos medijos suplonėjimas ir elastino skaidulų tankio sumažėjimas pilvinėje aortoje [39]. Tiriant kiaules po chirurginės simpatektomijos buvo stebėti aortos sienos vidiniai pokyčiai, medijoje padaugėjo elastino ir kolageno skaidulų lygiųjų raumenų ląstelių sąskaita [40].

Adrenerginė inervacija labai svarbi kraujagyslių lygiųjų raumenų diferenciacijai. Sumažėjus jos aktyvumui pradeda kisti ląstelių fenotipas. Lygiųjų raumenų ląstelės tampa daugiau sintezuojančiomis ekstraląstelinį matriksą, o ne atliekančiomis kontraktilinę funkciją [32,41,42].

Nustatyta, kad didžiausias TH pozityvių adrenerginių nervinių skaidulų tankis yra krūtininėje aortos dalyje, o mažiausias - pilvinėje [3]. Nervinės skaidulos teigiamos TH daugiausiai randamos tik gyvūnų aortos išorinio-vidurinio dangalų riboje, tačiau giliau viduriniame dangale jų aptikta nebuvo. Apskaičiuota, kad tik 10-20% aortos sienoje esančių lygiųjų raumenų ląstelių turi glaudų kontaktą su nervų galūnėlėmis. Vis dėlto aortos neurogeninis atsakas į nervinį impulsą yra pakankamas ir greitas [2]. Manoma, kad toks atsakas įmanomas tik greitai pasklidusio neuromediatoriaus dėka bei miogeninio atsako, kurio metu sužadinta raumeninė ląstelė esanti šalia nervinių struktūrų perduoda savo impulsą greta esančiai kitai ląstelei, kuri neturi tiesioginio ryšio su nervinėmis skaidulomis [43,44]. Tačiau - nėra iki galo ištirta kokiu būdu adrenerginė inervacija pasieka gilesnes vidurinio dangalo dalis.

Klasikinis supratimas apie kraujagyslių inervaciją teigia, kad jose randamos tik simpatinės nervų sistemos skaidulos. Tačiau buvo gauti duomenys apie cholinerginę aortos inervaciją. F. Amenta

13

ir kolegos teigia, kad buvo rasta AChE pozityvių nervinių skaidulų žinduolių aortose. Šios skaidulos išsidėsčiusios dviem nerviniais rezginiais: paviršiniu – išoriniame dangale ir giliuoju – išorinio-vidurinio dangalų pereinamojoje zonoje. Tačiau aiški cholinerginės inervacijos funkcija aortoje nebuvo išaiškinta [45].

Kardiovaskulinėje sistemoje plačiai paplitęs su kalcitonino genu susijęs peptidas (CGRP). CGRP pozityvios nervinės skaidulos taip pat randamos aortos sienoje. Dažniausiai CGRP teigiamos nervinės skaidulos pasiekia kraujagysles kartu su substancijai P teigiamomis juntamosiomis nervinėmis skaidulomis [46]. Tyrimai parodė, kad žiurkės aorta yra inervuota CGRP teigiamomis skaidulomis, kurių didžiausias tankis randamas pilvinėje aortoje, o mažiausias krūtininėje aortoje bei aortos lanko dalyje. Šių skaidulų daugiausiai randama aortos išorinio ir vidurinio dangalų riboje [47]. CGRP sukelia lygiųjų raumenų atsipalaidavimą ir kraujagyslių vazodilataciją, o esant šio neuropeptido trūkumui didėja bendras ir vidutinis arterinis spaudimas bei padidėja aortos standumas ir sumažėja elastingumas nekintant elastino/kolageno santykiui [47].

Nervinės skaidulos teigiamos substancijai P yra plačiai paplitusios po visą organizmą. SP neuronai ir/ar nervinės skaidulos randamos įvairiose CNS dalyse [48,49]. Periferijoje pirminės aferentinės SP skaidulos aptinkamos širdyje, šlapimo ir tulžies pūslėse, kasoje, kaulų čiulpuose, užkrūčio liaukoje, blužnyje, limfmazgiuose. Taip pat šių skaidulų daug aplink kraujagysles. Nervinės skaidulos dažniausiai lokalizuojasi aplink kraujagysles, tačiau kai kurios iš jų įsiskverbia ir į gilesnius sluoksnius [50]. Išsiskyrę peptidai iš juntamųjų įcentrinių skaidulų kraujagyslėse per NK1 receptorius veikia dvejopai: netiesiogiai per endotelio išskiriamas vazodilatuojančias medžiagas ir tiesiogiai veikiant lygiuosius raumenis sukeliant vazokonstrikciją [51]. SP sukeliama kraujagyslių vazodilatacija galima tik esant nepažeistam endoteliui. Pagrindinis SP taikinys yra kraujagyslių endotelis, o ne lygiųjų raumenų ląstelės, kaip buvo manoma anksčiau. SP sukelia endogeninių vazodilatuojančių faktorių (prostaciklinų, EDRF ir NO) išsiskyrimą iš endotelio, kurie geba sumažinti kraujagyslių lygiųjų raumenų tonusą [52,53]. Taigi vazodilatacija yra pagrindinis sukeliamas vazomotorinis SP efektas nepažeistose kraujagyslėse, tačiau esant pažeistam endoteliui ar sutrikus NO sintezei, SP sukelia kraujagyslių vazokonstrikciją [51].

10.3 Pilvinės aortos aneurizma

Aneurizma yra negrįžtamas, lokalizuotas visų arterijos sienelės dalių išsiplėtimas. Pilvinės aortos išsiplėtimas >50% arba >3cm yra kliniškai reikšmingas ir laikomas patologija. Dažniausiai aneurizmos formuojasi pilvinėje aortos dalyje žemiau inkstų arterijų [5].

14

Pilvinės aortos aneurizmos plyšimo rizika didėja su jos diametru. Esant aneurizmos diametrui <4cm, 4-4,9cm, 5-5,9cm metinė plyšimo rizika atitinkamai didėja 0,3%, 1.5% ir 6.5%. Aneurizmos diametrui esant 6cm ar daugiau, rizika plyšti didėja dramatiškai ir siekia 32,5% [55].

Aneurizmos plyšimas yra itin rizikinga būklė. Mirštamumas nuo jos yra labai didelis: 25% pacientų net nepasiekia ligoninės, kiti 51% nespėja patekti ant operacinio stalo, ir iš tų kurie buvo operuoti, išgyvena tik 11% pacientų. Pagrindinis tikslas gydant pilvinės aortos aneurizmas – išoperuoti pacientus su didele plyšimo ir maža operacinių komplikacijų rizika (4-6%) [56].

Pilvinės aortos aneurizmų (PAA) dažnis JAV populiacijoje siekia 6% [57]. Jos dažniausiai randamos baltaodžiams vyrams ir mirštamumas pasiekia piką vėlyvame amžiuje ties 65-80m [58]. Trečdalį atvejų sudaro moterys ir pastaraisiais metais pastebėtas nedidelis šių atvejų augimas, kuris aiškinamas didėjančiu rūkančių moterų skaičiumi [59,60]. Kiekvienais metais užfiksuojama 0,4-0,67% gyventojų populiacijai tenkančių naujų pilvinės aneurizmos atvejų vakarų pasaulyje, rytuose šis skaičius yra mažesnis [61,62]. Amerikoje kasmet miršta apie 7 000 (11/100 000) žmonių nuo PAA plyšimo [63]. Europai tenka 10,6/100 000 mirčių per metus [64]. Kasmet matomas naujų PAA atvejų augimas, kuris aiškinamas geresne kardiovaskulinių ligų kontrole ir ilgesniu žmonių išgyvenamumu, leidžiančiu išsivystyti aneurizmoms. Tačiau tikrasis registruojamas mirčių nuo PAA plyšimo skaičius gali būti dar didesnis, nes neretai staigios mirties priežastis būna nepatvirtinama dėl vis mažėjančio atliekamų autopsijų kiekio.

Pilvinės aneurizmos vystymasis yra komplikuotas ir dinaminis procesas. Šiame procese pagrinde dalyvauja trys komponentai: proteolizė, uždegimas ir lygiųjų raumenų ląstelių apoptozė [65]. Tam tikrą predispoziciją vystantis PAA galima įžvelgti jau ankstyvoje embriogenezėje. Elastino sintezė pilvinėje aortoje baigiasi iki gimimo ir bet kokie pokyčiai esant placentos disfunkcijai ar sutrikus audinių mitybai gali lemti ilgalaikius pokyčius aortos sienelėje. Taip pat embriogenezės metu įvairios signalinės molekulės, tokios kaip beta-transformuojantis augimo faktorius, nulemia lygiųjų raumenų ląstelių fenotipą, nuo kurio ateityje priklausys jų atsakas į įvairius faktorius, kurie nulems PAA išsivystymą [66].

Dažniausiai PAA vystymasis buvo aiškinamas kaip lokalus pažeidimas, kurio patogenezėje vyravo aterosklerozė [67]. Tačiau atsiradus daugiau įrodymų, šio patogenetinio mechanizmo, kaip pagrindinės PAA priežasties, buvo atsisakyta, nes buvo įrodyta, kad esant PAA pažeidžiamos dauguma arterijų, ir tai yra daugiau sisteminė negu lokali patologija [68]. Aterosklerozė PAA patogenezėje turėtų būti suprantama kaip sutrikusios kraujotakos kraujagyslės spindyje pasekmė, o ne kaip pagrindinė aneurizmos vystymosi priežastis [69]. Tai lengva paaiškinti, nes arterijos aterosklerozinis sienos pažeidimo sunkumas nekoreliuoja su PAA vystymusi [70].

15

PAA pasižymi visų arterijos sienos dangalų išsiplėtimu dėl sumažėjusio elastino kiekio, lygiųjų raumenų ląstelių apoptozės ir kolageno skaidulų atsidėjimo [71]. Pokyčiai arterijos sienos matrikse buvo pastebėti ne tik arterijos aneurizmos vietoje, bet ir kituose, sveikuose aortos segmentuose bei apatinėje tuščiojoje venoje. Visi šie radiniai nusako, kad PAA yra sisteminė patologija [72,73].

Uždegimas ir arterijos sienelės matrikso pažeidimas yra vienas iš svarbiausių komponentų PAA formavimesi [74]. Reaktyvieji deguonies ir azoto junginiai dalyvaujantys oksidacinio streso procese galimai pažeidžia aortos sienoje esančias ląsteles ir jas supantį matriksą [75]. Pašalinus šiuos elementus gyvūnų modeliuose buvo išvengta aneurizmų formavimosi [76]. Vis dėlto antioksidantų vartojimas neturi jokio poveikio aneurizmų formavimuisi žmogaus organizme ir nėra jokių kitų sukurtų medikamentų, kurie padėtų gydyti ar išvengti arterijų aneurizmų vystymosi [77].

Aneurizmų formavimasis iki tol sveikoje ir nepažeistoje arterijos sienoje leidžia manyti, kad didelis kiekis pratekančio kraujo ir jo sukeliamo įtempties streso gali sukelti negrįžtamus pakitimus aortos sienoje, kuri negali atlaikyti tokio tipo veikiamų jėgų. Pilvinėje aortoje sukuriamos išskirtinės hemodinaminės sąlygos, kurių kitose aortos vietose nėra. Pilvinėje aortoje atsišakoja stambiausios arterijos: proksimaliai - inkstų arterijos, distaliai – bendrosios klubinės arterijos. Tai nulemia stiprėjančią pulsinę kraujo bangą, dėl palaipsniui siaurėjančio arterijos spindžio nuo aortos šaknies iki aortos šakumos [78]. Santykinai mažesnis elastino ir kolageno skaidulų kiekis pilvinės aortos segmente ir papildomas šių skaidulų praradimas senstant ar esant papildomiems aortos sienos trofikos pokyčiams nulemia tai, kad pilvinė aorta yra ypatingai pažeidžiama nuolatos pasikartojančio didele jėga veikiamo streso [79,80].

Pilvinės aortos aneurizmos dažniausiai formuojasi poinkstiniame jos segmente. Esant aiškiems segmentiniams aortos sienos struktūros skirtumams bei žinant, kad poinkstinėje aortos dalyje susidaro išskirtinės hemodinaminės sąlygos, būtina ištirti aortos inervaciją ir jos skirtumus krūtininėje ir dviejose pagrindinėse pilvinės aortos dalyse.

16

11. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI

Tyrimui buvo panaudotos trijų, abiejų lyčių, juodgalvių avių (36±4kg), naudotų LSMU Veterinarijos akademijos Stambiųjų gyvulių klinikoje (leidimą atlikti tyrimą išdavė valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba, nr. G2-59, išdavimo data 2017 02 15), aortos. Gyvūnų ir jų organų panaudojimas tik moksliniams tikslams buvo atliekamas atsižvelgiant į Lietuvos Respublikos maisto ir veterinarijos tarnybos nustatytas laboratorines praktikos normas. Avys buvo užslopintos panaudojant 0,1mg/kg ksilazino, 0,04mg/kg midazolamo ir nuskausmintos 2mg/kg ketaminu į raumenis. Gyvūnai buvo intubuoti ir ventiliuojami. Gyvūnams taip pat buvo sukelta bendrinė anestezija panaudojant 5µg/kg fentanilio ir palaikant halotano dujomis. Bendrinėje nejautroje avims buvo atliekama centrinė sternotomija ir laparotomija. Operaciją atliko LSMU Kauno klinikų kardiochirurgijos 5-tų metų rezidentas. Operacijos metu iš avių buvo išimamos dar plakančios širdys ir panaudojamos kitiems moksliniams tikslams. Iš tų pačių avių buvo paimtos trys pilno ilgio – nuo širdies iki bendrųjų klubinių arterijų šakumos aortos ir panaudotos šiam aortos inervacijos tyrimui.

Kiekviena aorta padalinta į krūtininės, pilvinės aortos viršinkstinį ir poinkstinį segmentus (1pav.). Iš kiekvienos dalies buvo iškerpami apie 5cm ilgio segmentai (gauti trys 5cm ilgio gabaliukai, iš visų aortų bendrai - 9), kurie pradžioje buvo pamerkiami į 0,01M fosfatinį buferinį tirpalą (FBT) su druska prasiplauti. Išsiplovus kraujui ir krešuliams, audiniai buvo fiksuojami 4% parafolmaldehidu fosfatinio buferio tirpale 2 val., poto laikomi 25% sacharozės tirpale fosfatiniame buferyje +40 temperatūroje 24val. Po to kraujagyslės gabaliukai greitai užšaldomi skystame azote bei laikomi -400C šaldiklyje iki tolimesnio panaudojimo.

11.2 Imunohistocheminis tyrimas

Skirtingų aortos segmentų gabalėliai buvo pjaustomi skersai, kad matytųsi visas aortos spindis bei visi kraujagyslės sienos dangalai. Pjovimui buvo naudojamas kriotomas Cryostar NX70 (Thermo Fisher Scientific, Vokietija). Atlikti 540 (tyrimui buvo imamas kas penktas pjūvis) 16µm storio šaldyti pjūviai, 108 iš jų buvo perkelti ant objektinių stikliukų (SuperFrost, Thermo Fisher Scientific, Vokietija) bei džiovinami kambario temperatūroje.

17

Pradžioje visi preparatai buvo plaunami 3 kartus po 10 min. FBT su 0,5% Triton X-100 (CarlRoth, Karlsruhe, Vokietija). Po to mėginiai ant stikliuko užliejami blokuojančiu tirpalu, turinčiu 5% normalaus asilo serumo (angl. normal donkey serum, NDS. CarlRoth, Vokietija) ir laikomi 2 val. tam, kad šis serumas sumažintų nespecifinę imunohistocheminę reakciją į antikūnius. Vėliau preparatai tris kartus po 10 min. plaunami FBT ir inkubuojami tirpale su pirminiais antikūnais (1 lentelė) 24 val. 40_{C temperatūroje, drėgnoje ir tamsioje aplinkoje. Įvykus reakcijai tarp pirminių}

antikūnų ir antigenų, mėginiai plaunami tris kartus po 10 min. FBT ir 2 val. inkubuojami antrinių antikūnų tirpale. Po 2 valandų preparatai dar kartą tris kartus plaunami FBT po 10 min. Išimti stikliukai su audiniais nusausinami ir užliejami Vectashield (Vector Laboratories, JAV) dengiamąja terpe bei uždengiami dengiamuoju stikliuku.

11.3 Mikroskopinis aortos nervinių struktūrų tyrimas

Visos nervinės aortos struktūros (nervai, nervinės skaidulos) buvo fotografuojamos naudojant fluorescencinį mikroskopą AxioImager M2 su Apotomu bei įdiegta AxioVision 4.8.1 kompiuterine programine įranga (Zeiss, Gottingenm, Vokietija). Taip pat buvo naudota monochrominė skaitmeninė Axiocam MRm fotokamera bei filtrai, kurie sužadina fluoresceino (FITC) ir cianino (Cy3) sujungto su antriniais antikūnais fluorescenciją ir taip išryškindami mikroskopiniame vaizde aortos sienoje esančias nervines struktūras.

Atlikus imunohistochemines reakcijas iš pradžių 5x objektyvu buvo fotografuojami visi pilni skirtingų aortos segmentų skerspjūviai. Medžiaga fotografuota naudojant AxioVision Mosaic modulį. Tai atlikus gautos 108 (po 36 iš kiekvieno segmento) montažinės nuotraukos, kuriose vėliau buvo matuoti aortų skerspjūvių plotai bei inervacijos gylis.

1 lentelė. Tyrime naudotų anktikūnų sąrašas

Antigenas Kilmė Skiedimas Katalogo nr. Gamintojas Pirminiai antikūnai TH Triušis 1:1000 AB 152 Chemicon SP Jūrų kiaulytė 1:1000 AB 10353 Abcam CGRP Pelė 1:1000 AB 81887 Milipore PGP9.5 Triušis 1:1000 AB 1761 Abcam Antriniai antikūnai

Triušį Asilas 1:500 AP 182F Chemicon

Jūrų kiaulytę Asilas 1:500 193C Milipore

18

Vėliau kiekvienas aortos segmentas buvo fotografuojamas 40x objektyvu keturiose skirtingose vidurinio dangalo, tunica media, vietose, kad atspindėtų bendrą aortos vidurinio dangalo inervacijos kiekį (1pav.). Krūtininės aortos segmento pjūviuose, dėl storos aortos sienos, buvo daromos trys vidurinio dangalo mikronuotraukos: 1) išorinės dalies 2) vidurinės dalies ir 3) vidinės dalies. Dėl plonesnės pilvinės aortos sienos tiek viršinkstiniame, tiek ir poinkstiniame segmentuose, buvo daromos tik dvi vidurinio dangalo mikronuotraukos: 1) išorinės dalies ir 2) vidinės dalies. Viso gautos 1 008 mikronuotraukos. Taip buvo fotografuojamos TH ir PGP 9.5 teigiamos nervinės struktūros.

Dėl itin mažo SP ir CGRP teigiamų nervinių skaidulų kiekio aortos sienoje, šių skaidulų buvo ieškoma po visą aortos skerspjūvio vidurinį dangalą ir kiekviena rasta nervinė skaidula buvo fotografuojama 40x objektyvu, siekiant išvengti klaidingai neigiamo rezultato.

Bendras PGP 9.5 ir TH teigiamų nervinių skaidulų plotų vidurkis buvo apskaičiuotas sudėjus visose vidurinio dangalo mikronuotraukose rastų nervinių struktūrų plotus procentine išraiška. SP ir CGRP teigiamų nervinių struktūrų plotai buvo apskaičiuoti sudėjus visuose pilvinės aortos skerspjūviuose rastų nervinių skaidulų plotus, kurie buvo padalinti iš bendro aortos segmento vidurinio dangalo ploto ir išreikšti procentine verte.

Pirminiai duomenys, kurie vėliau buvo naudojami statistinei analizei, buvo surenkami naudojant nemokamą, laisvai prieinamą programinę įrangą ImageJ („National Institutes of Health“, JAV), naudojamą vaizdams analizuoti. Naudojant įvairius šios programinės įrangos modulius buvo gauti duomenys: naudojant 5x objektyvu atliktas montažines nuotraukas gautas aortos vidurinio dangalo bendras plotas (µm2). Vidurinio dangalo storis bei jos inervuota dalis (µm) išmatuota naudojant montažines skerspjūvių nuotraukas. Storis matuotas pasirinkus liniuotės funkciją nuo išorinio aortos dangalo, tunica externa, iki vidinio aortos dangalo, tunica intima. Išmatuotos 432 mikronuotraukos, kiekviename skerspjūvyje po 4 mikronuotraukas skirtingose vietose. Inervuota dalis matuota nuo išorinio dangalo iki aortos viduriniame dangale giliausiai matomų nervinių skaidulų ir išreikšta procentais.

Mikronuotraukos nervinių skaidulų vertinimui, naudojant ImageJ programą, buvo apdorojamos tokia tvarka: pirmiausia buvo nustatomas spalvų slenkstis, pagal kurį programa raudonai pažymi nuotraukoje esančias nervines struktūras. Vėliau fone lieka tik apibrėžtos nervinės skaidulos, kurių plotus programa automatiškai apskaičiuoja ir pateikia procentine išraiška (1 pav.).

19

11.4 Statistinė duomenų analizė

Duomenys buvo statistiškai apdoroti naudojant IBM SPSS v.20.0 programinę įrangą. Pasiskirstymo normalumas imtyje buvo patikrintas Levene‘s testu. Neparametriniai trijų nepriklausomų grupių duomenų vidurkiai ir jų skirtumai buvo statistiškai palyginti naudojant Wilcoxon testą, pasirinkus 95% patikimumo lygmenį (p<0,05).

1 pav. Avies aortos segmentų parinkimas ir inervacijos tankio apskaičiavimas. (A) Trys aortos segmentai, kurie buvo paimti tyrimui. Iliustracijoje pateiktas aortos modelis pritaikytas pagal Tonar et al. 2015 [29]. (B) Schema, pagal kurią buvo fotografuojamas pilvinės aortos vidurinis dangalas inervacijos įvertinimui: fotografuojamos keturios skirtingos aortos vietos (pažymėtos juodais taškais), kiekvienoje vietoje fotografuojamos išorinė ir vidinė vidurinio sluoksnio dalys (žali apskritimai). (C) Pirminės fotografijos, kuri buvo apdorojama su ImageJ programa, pavyzdys. Nuotraukoje matosi

20

žalia spalva imunohistochemiškai išryškintos PGP9.5 teigiamos nervinės skaidulos. (D) Fotografijos, kurioje buvo nustatytas spalvų slenkstis, pavyzdys. Programa raudonai pažymi nuotraukoje esančias nervines struktūras. (E) Baltame fone lieka juodai pažymėtos nervinės skaidulos, kurių plotus automatiškai apskaičiuoja ImageJ programa.

21 0 500 1000 1500 2000 2500 KA VPA PPA % Viduriniojo sluoksnio storis Inervuota dalis

12. REZULTATAI

12.1 Krūtininės ir pilvinės aortos inervacijos gylis

Mikroskopu stebint imunohistochemiškai paruoštus avies aortos audinius matomos nervinės skaidulos, kurios išsidėsto išoriniame ir viduriniame kraujagyslės sienos dangaluose. Skaidulos plonos ir išsidėsto įvairiomis kryptimis. Krūtininės aortos segmente tiek viduriniame, tiek ir išoriniame dangaluose matomos ne tik nervinės skaidulos bet ir stambesni nervai. Vietomis stebima kaip nervas įsiskverbia pro išorinį dangalą į vidinį aortos sienos dangalą. Pilvinės aortos abiejuose segmentuose nervai matomi tik išoriniame dangale, o skaidulos stebimos tiek išoriniame, tiek ir vidiniame dangaluose. Kadangi šiame darbe tyrėme tik viduriniame dangale, tunica media, esančias nervines struktūras, esančias arčiausiai lygiųjų raumenų ląstelių, todėl toliau apie išoriniame dangale esančias skaidulas ir nervus kalbama nebus.

Segmentiniai skirtumai matomi ne tik aortos sienos jungiamajame audinyje, bet ir inervacijoje. Montažinėse nuotraukose nesunkiai pastebimas skirtumas tarp krūtininės ir pilvinės aortos sienos inervuotos dalies storio. Krūtininėje aortoje nervinės skaidulos randamos giliau nei pilvinėje aortoje. Krūtininėje dalyje PGP 9.5 pažymėtos nervinės skaidulos prasiskverbia iki vidurinio dangalo vidinės dalies, o pilvinėje aortoje išsidėsto tik ties išorinio ir vidurinio dangalų riba.

Gauti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp inervacijos gylio krūtininėje aortoje ir pilvinės aortos poinkstiniame ir viršinkstiniame segmentuose. Krūtininėje aortoje PGP 9.5 pozityvių skaidulų viduriniame dangale buvo randama 1161,65±210,09 µm atstumu nuo aortos išorinio dangalo ir tai sudaro 63% viso vidurinio dangalo storio. Tuo tarpu pilvinės aortos viršinkstinėje dalyje nervinių struktūrų buvo randama tik 144,34±94,01 µm atstumu ir tai sudaro tik 26,5% pilvinės aortos vidurinio dangalo storio. Poinkstinėje dalyje skaidulos nutolę 110,67±66,09 µm atstumu, tai yra 20,4% aortos vidurinio dangalo storio. Taigi krūtininėje aortoje nervinės skaidulos prasiskverbia statistiškai reikšmingai giliau negu abiejuose pilvinės aortos segmentuose, p<0,001, (2 pav). Tuo tarpu reikšmingo skirtumo tarp abiejų pilvinės aortos segmentų pastebėta nebuvo.

22

2 pav. Krūtininės ir pilvinės aortos inervacijos gylis. KA – krūtininė aorta, VPA – viršinkstinė pilvinės aortos dalis, PPA –poinkstinė pilvinės aortos dalis.

12.2 Krūtininės aortos vidurinio dangalo nervinės skaidulos

Krūtininėje aortoje gausiai randama simpatinės nervų sistemos skaidulų, kurios pakankamai giliai prasiskverbia į aortos sienos vidurinį dangalą. Tačiau tolstant nuo išorinio dangalo link vidinio, vizualiai šių skaidulų mažėja, nors pagal aprašomą literatūrą lygiųjų raumenų pasiskirstymas yra tolygus visame aortos sienos storyje (3 pav.).

3 pav. Nervinės skaidulos krūtininės aortos vidurinio dangalo, tunica media, išorinėje dalyje. A – PGP9.5(+) skaidulos, B – CGRP(+) skaidulos, C – PGP.5(+) ir CGRP(+) skaidulos. D – TH(+) skaidulos, E – SP(+) skaidulos ir F – TH(+) ir SP(+) skaidulos.

23 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 A V S % Krūtininė aorta PGP9.5 TH

Kiekybiniai PGP 9.5 ir TH (adrenerginės nervinės skaidulos) teigiamų nervinių struktūrų plotų skirtumai krūtininės aortos viduriniame dangale nustatyti lyginant inervaciją ties išorine, vidurine ir vidine jo dalimi. Išorinėje vidurinio dangalo dalyje PGP 9.5 pozityvių nervinių skaidulų plotas sudaro 2,5%, vidurinėje dalyje 1,56%, o ties vidinėje nervinių struktūrų nebuvo rasta. TH pozityvių nervinių skaidulų atitinkamai randama 2,16%, 1,15% ir 0%. Skirtumai statistiškai patikimi, p<0,001. Tolstant nuo aortos išorinio dangalo link kraujagyslės spindžio, krūtininėje aortoje statistiškai reikšmingai mažėja nervinių skaidulų teigiamų tiek PGP 9.5, tiek ir TH, p<0,001 (4 pav.).

4 pav. Krūtininės aortos nervinių struktūrų pasiskirstymas viduriniame dangale. A – išorinėje dalyje, V – vidurinėje dalyje, S - vidinėje dalyje (prie spindžio).

12.3 Krūtininės ir pilvinės aortos bendras nervinių skaidulų (PGP9.5) ir adrenerginių (TH) skaidulų pasiskirstymas

Palyginome nervinių skaidulų pasiskirstymą krūtininės ir pilvinės aortos viršinkstiniame ir poinkstiniame segmentuose (3,5,6 pav.). Apskaičiuoti PGP 9.5 ir TH pozityvių skaidulų plotai µm2 ir jų vidurkiai bei standartiniai nuokrypiai. Krūtininėje aortoje PGP 9.5 teigiamų nervinių skaidulų plotas sudaro 2,5±2,03%. Pilvinės aortos viršinkstinėje dalyje PGP 9.5 nervinės skaidulos užima 0,69±0,33%, o poinkstinėje dalyje – 0,4±0,34%. Krūtininės ir pilvinės aortos segmentų nervinių

24

skaidulų plotų vidurkių skirtumai statistiškai patikimi, p<0,001. Mažesnis inervacijos tankumo skirtumas, tačiau taip pat statistiškai reikšmingas, p<0,05, buvo rastas tarp abiejų pilvinės aortos segmentų.

5 pav. Nervinės skaidulos pilvinės aortos, viršinkstinio segmento vidurinio dangalo, tunica media, išorinėje dalyje. A – PGP9.5(+) skaidulos, B – CGRP(+) skaidulos, C – PGP.5(+) ir CGRP(+) skaidulos. D – TH(+) skaidulos, E – SP(+) skaidulos ir F – TH(+) ir SP(+) skaidulos. G – PGP9.5(+) skaidulos, H – SP(+) skaidulos, I – PGP9.5(+) ir SP(+) skaidulos.

25

6 pav. Nervinės skaidulos pilvinės aortos, poinkstinio segmento vidurinio dangalo, tunica media, išorinėje dalyje. A – PGP9.5(+) skaidulos, B – CGRP(+) skaidulos, C – PGP.5(+) ir CGRP(+) skaidulos. D – TH(+) skaidulos, E – SP(+) skaidulos ir F – TH(+) ir SP(+) skaidulos. G – PGP9.5(+) skaidulos, H – SP(+) skaidulos, I – PGP9.5(+) ir SP(+) skaidulos.

26 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 KA VPA PPA % Aortos segmentai PGP9.5 TH

TH pozityvių nervinių struktūrų plotai krūtininėje aortoje sudaro 2,15±1,45%. Pilvinės aortos viršinkstinėje dalyje 0,4±0,33%, o poinkstiniame segmente 0,34±0,28%. Rasti statistiškai reikšmingi vidurkių skirtumai tarp krūtininės aortos ir abiejų pilvinės aortos segmentų, p<0,001. Statistiškai reikšmingo vidurkių skirtumo tarp abiejų pilvinės aortos segmentų rasta nebuvo (7 pav.).

7 pav. Krūtininės ir pilvinės aortos bendras nervinių skaidulų (PGP9.5) ir TH pozityvių skaidulų pasiskirstymas. KA – krūtininė aorta, VPA – viršinkstinė pilvinės aortos dalis, PPA – poinkstinė pilvinės aortos dalis.

12.4 Substancijos P ir su kalcitonino genu susijusio peptido nervinių skaidulų pasiskirstymas krūtininėje ir pilvinėje aortos dalyse

Juntamosios nervinės skaidulos teigiamos substancijai P (SP) ir su kalcitonino genu susijusiam peptidui (CGRP) buvo matomos pro mikroskopą tiek krūtininėje aortos dalyje, tiek ir pilvinės aortos abiejuose segmentuose. Skaidulos labai retos ir išsidėsčiusios negiliai. Tiek krūtininėje aortoje, tiek ir abiejuose pilvinės aortos segmentuose juntamosios nervinės skaidulos matomos tik ties išorine vidurinio dangalo dalimi (3,5,6 pav.).

Teigiamų CGRP nervinių struktūrų plotai krūtininėje aortoje sudaro 0,0017%. Pilvinės aortos viršinkstiniame segmente šios skaidulos sudaro 0,0019%, o poinkstiniame 0,001%. Teigiamų SP

27 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004 0.0045 KA VPA PPA % Aortos segmentai CGRP SP

skaidulų plotai atitinkamai sudaro 0,00042%, 0.0002% ir 0.0006%. Statistiškai reikšmingas skirtumas buvo rastas tik pilvinėje aortoje tarp SP teigiamų skaidulų pasiskirstymo, p<0,008 (8 pav.).

8 pav. Substancijos P (SP) ir su kalcitonino genu susijusio peptido (CGRP) teigiamų nervinių skaidulų pasiskirstymas krūtininėje ir pilvinėje aortos dalyse. KA – krūtininė aorta, VPA – viršinkstinė pilvinės aortos dalis, PPA – poinkstinė pilvinės aortos dalis.

28

13. REZULTATŲ APTARIMAS

Naudodami imunohistocheminius tyrimo metodus parodėme, kad avies aortos krūtininėje dalyje yra daugiau nervinių skaidulų, negu pilvinės aortos poinkstiniame ir viršinkstiniame segmentuose. Ankščiau atliktuose tyrimuose buvo teigiama, kad galbūt PGP9.5 nepakankamai gerai pažymi visas nervines struktūras, todėl rastas nervinių skaidulų tankis gali būti dar didesnis, o duomenys tikslesni. Yra įrodymų, kad tokie neurožymekliai kaip Kuprolino mėlynasis ir anti-HuC/D gali tiksliau pažymėti visas nervines struktūras [81]. Taip pat rastos SP (substancija P) bei CGRP (su kalcitoninu geno susijęs peptidas) pozityvios nervinės skaidulos tiek krūtininėje, tiek ir pilvinėje aortoje. Tai rodo, kad aortą pasieka juntamosios nervinės skaidulos. Jų tankis nėra didelis ir reikšmingai mažesnis už simpatinės nervų sistemos skaidulų kiekį.

Mažesnis simpatinės nervų sistemos skaidulų kiekis pilvinėje aortoje koreliuoja su didesniu pilvinės aortos aneurizmos išsivystimo dažniu lyginant su krūtinine aortos dalimi [66]. Dažnesnis aneurizmų vystymasis pilvinės aortos poinkstinėje dalyje gali būti taip pat susijęs su plonesniu šio segmento sienos storiu, didesniu kolageno ir mažesniu elastino kiekiu bei menkesniu lygiųjų raumenų tiesioginiu ryšiu su nervinėmis struktūromis.

Aorta atlieka labai svarbų vaidmenį paskirstant arterinį kraują po visą organizmą, tačiau buvo įrodyta, kad tai ne tik elastinis vamzdis, tačiau ir aktyviai pagal širdies veiklą susitraukinėjanti didžiausia organizmo arterija [7]. Taip pat buvo aprašyta ir trofinė simpatinės inervacijos reikšmė aortos matriksui ir lygiesiems raumenims [82]. Mūsų tyrime buvo parodyta, kad simpatinės inervacijos imunohistocheminio žymens TH buvo daugiau rasta krūtininėje aortos dalyje. Galime manyti, kad mažesnis simpatinės inervacijos tankis pilvinėje aortoje laikui bėgant gali sąlygoti trofinius aortos sienos pokyčius. Žinoma kai kurių gerai diferencijuotų, subrendusių audinių trofikos priklausomybė nuo nervinių struktūrų kontrolės. Širdyje išsivystyti ir funkcionuoti normaliems kardiomiocitams reikalinga simpatinė nervų sistema [83]. Panašu, kad ATP metabolizmo produktas adenozinas ir noradrenalinas yra atsakingi už šią funkciją [84,85]. Aortoje atlikus cheminę simpatektomiją jos sienoje suaktyvėjo kolageno sintezė ir padidėjo šių skaidulų kiekis, tai įrodo nervinės sistemos įtaką kraujagyslių sienos struktūrai [86].

Daugumoje atliktų tyrimų su šunų, lamų, žiurkių, kiaulių, pelių, triušių aortomis buvo aprašoma, kad visos nervinės struktūros išsidėsto išorinio-vidurinio dangalų riboje, ties išorine elastine membrana [3]. Mes parodėme, kad krūtininėje aortoje nervinės skaidulos prasiskverbia giliau ir užima daugiau nei pusę vidurinio dangalo storio. Pilvinėje aortos dalyje nervinės skaidulos užima tik apie

29

23% vidurinio dangalo storio. Krūtininėje aortoje tolstant nuo išorinio dangalo link kraujagyslės spindžio mažėja nervinių skaidulų tankis ir ties spindžiu jų ten išvis neberandama. Tai parodo, kad nors ir lygiųjų raumenų randama daugiausiai pilvinėje aortoje, o viduriniame dangale jie išsidėsto tolygiai, stambiosiose kraujagyslėse tik maža dalis efektorinių ląstelių yra tiesiogiai susiję su nervinėmis sinapsėmis. Iki galo nėra aišku kaip neurotransmiteriai pasiekia toliau esančius lygiuosius kraujagyslių raumenis. Manoma, kad tai įvyksta transmiterių difuzijos būdu ir/arba miogeninio sujaudinimo metu, kuomet artimiausia nervinėms struktūroms raumeninė ląstelė perduoda impulsą aplink esančioms ląstelėms [87]. Tačiau ar to pakanka sinchroniniams aortos susitraukimams panašiems į širdies dažnį nėra aišku.

Mūsų atliktame tyrime buvo pastebėta, kad visoje aortoje panašiu tankiu išsidėsto juntamosios skaidulos, teigiamos SP ir CGRP. Yra įrodymų, kad kraujagyslių sensorinė inervacija veikia jų endotelį ir skatina išskirti vazoaktyvias medžiagas [88]. Sensorinė denervacija padidina simpatinės nervų sistemos aktyvumą ir jos sukeliamą vazokonstrikcinį bei trofinį poveikį kraujagyslių sienai [89]. Suaktyvėjusi simpatinė nervų sistema krūtininėje aortoje yra siejama su kitos patologijos, aortos atsisluoksniavimo, išsivystymu [90]. Hu Zhipeng su komanda parodė, kad pacientų aortose su atsisluoksniavimu buvo rastas didesnis TH ir sisteminis noradrenalino kiekis organizme. Buvo iškeltas klausimas, galbūt simpatinės sistemos hiperaktyvumas sukelia aortos atsisluoksniavimus, o sumažėjęs jos poveikis – aneurizmas [90]. D.C. Angour‘as ir komanda nustatė, kad po cheminės simpatektomijos aortos sienoje praėjus 3 mėnesiams buvo stebimi į aneurizmos vystymąsi panašūs procesai [40].

Taigi šiuo tyrimu parodėme, kad avies aortoje labai aiškiai matomi segmentiniai inervacijos skirtumai. Krūtininė aorta yra tankiau inervuota negu pilvinės aortos dalys. Mūsų žiniomis mes pirmą kartą aprašėme tai, kad krūtininėje aortoje nervinės skaidulos aptinkamos žymiai giliau negu tik išorinio-vidurinio dangalų riboje. Avies stambiausią kraujagyslę taip pat pasiekia ir juntamosios skaidulos. Įvairiuose kituose darbuose susijusiuose su aortos inervacijos reikšme spekuliuojama, kad ypatingai simpatinė nervų sistema atlieka labai svarbią trofinę funkciją ir padeda išlaikyti tinkamą aortos sienos struktūrą. Tačiau dar lieka daug neatsakytų klausimų apie trofinę ir vazomotorinę neurotransmiterių reikšmę lygiosioms kraujagyslių raumenų ląstelėms. Todėl tam turi būti atliekami tolimesni išsamūs morfologiniai ir fiziologiniai tyrimai.

30

14. IŠVADOS

1. Avies aortoje daugiausiai yra simpatinės nervų sistemos skaidulų. Juntamosios SP ir CGRP teigiamos nervinės skaidulos buvo retos.

2. Avies aortoje inervacijos tankumas mažėja leidžiantis aortai nuo krūtininės link pilvinės dalių.

3. Krūtininėje aortoje nervinės skaidulos prasiskverbia giliau į vidurinį dangalą lyginant su pilvinės aortos segmentais.

31

15. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Trollope A, Moxon J, Moran C, Golledge J. Animal models of abdominal aortic aneurysm and their role in furthering management of human disease. Cardiovascular Pathology. 2011;20(2):114-123. 2. Nilsson H, Goldsteinj M, Nilsson O. Adrenergic innervation and neurogenic response in large and small arteries and veins from the rat. Acta Physiologica Scandinavica. 1986;126(1):121-133. 3. Cowen T, Burnstock G. Quantitative analysis of the density and pattern of adrenergic innervation of blood vessels. Histochemistry. 1980;66(1):19-34.

4. Ogeng'o J, Stephen K, Malek A. Pattern of adrenergic innervation of aorta in goat (Capra Hircus). Journal of Morphological Sciences. 2011;28(2)(81:83).

5. Filardo G, Powell J, Martinez M, Ballard D. Surgery for small asymptomatic abdominal aortic aneurysms. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2012;.

6. Kacem K, Seylaz J, Issertial O, Aubineau P. Chemical sympathectomy favours vimentin expression in arterial smooth muscle cells of young rats. Journal of the Autonomic Nervous System. 1995;53(1):57-68.

7. Sahibzada N, Mangel A, Tatge J, Dretchen K, Franz M, Virmani R et al. Rhythmic Aortic Contractions Induced by Electrical Stimulation In Vivo in the Rat. PLOS ONE. 2015;10(7):e0130255. 8. Sartore S, Chiavegato A, Faggin E, Franch R, Puato M, Ausoni S et al. Contribution of Adventitial Fibroblasts to Neointima Formation and Vascular Remodeling: From Innocent Bystander to Active Participant. Circulation Research. 2001;89(12):1111-1121.

9. Ichii T, Koyama H, Tanaka S, Kim S, Shioi A, Okuno Y et al. Fibrillar Collagen Specifically Regulates Human Vascular Smooth Muscle Cell Genes Involved in Cellular Responses and the Pericellular Matrix Environment. Circulation Research. 2001;88(5):460-467.

10. Sokolis D. Passive mechanical properties and structure of the aorta: segmental analysis. Acta Physiologica. 2007;190(4):277-289.

11. Nichols W, O'Rourke M, Vlachopoulos C. McDonald's blood flow in arteries. London: Hodder Arnold; 2011.

12. Boudoulas H, Toutouzas P, Wooley C. Functional abnormalities of the aorta. Armonk, N.Y.: Futura Pub.; 1996.

13. Davidson J, Hill K, Mason M, Giro M. Longitudinal gradients of collagen and elastin gene expression in the porcine aorta. The Journal of biological chemistry. 1985;260(3)(1901-8).

14. Glagov S, Wolinsky H. Aortic Wall as a ‘Two-phase’ Material. Nature. 1963;199(4893):606-608.

32

15. Wolinsky H, Glagov S. Structural Basis for the Static Mechanical Properties of the Aortic Media. Circulation Research. 1964;14(5):400-413.

16. Roach M, Burton A. The reason for the shape of the distensibility curves of arteries. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 1957;35(8):681-690.

17. Dobrin P, Canfield T. Elastase, collagenase, and the biaxial elastic properties of dog carotid artery. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 1984;247(1):H124-H131. 18. Dobrin P. Mechanical properties of arteries. Physiological Reviews. 1978;58(2):397-460. 19. Sokolis D, Kefaloyannis E, Kouloukoussa M, Marinos E, Boudoulas H, Karayannacos P. A structural basis for the aortic stress–strain relation in uniaxial tension. Journal of Biomechanics. 2006;39(9):1651-1662.

20. Dinardo C, Venturini G, Zhou E, Watanabe I, Campos L, Dariolli R et al. Variation of mechanical properties and quantitative proteomics of VSMC along the arterial tree. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 2014;306(4):H505-H516.

21. Silver F, Snowhill P, Foran D. Mechanical Behavior of Vessel Wall: A Comparative Study of Aorta, Vena Cava, and Carotid Artery. Annals of Biomedical Engineering. 2003;31(7):793-803. 22. Cox R. Passive mechanics and connective tissue composition of canine arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 1978;234(5):H533-H541.

23. Wiggers C, Wégria R. Active changes in size and distensibility of the aorta during acute hypertension. American Journal of Physiology-Legacy Content. 1938;124(3):603-611.

24. Gentile B, Gross D. Viscoelastic behavior of the thoracic aorta of dogs and rabbits. Circulation Research. 1985;56(5):690-695.

25. Peterson L, Jensen R, Parnell J. Mechanical Properties of Arteries in Vivo. Circulation Research. 1960;8(3):622-639.

26. Rushmer R. Pressure-Circumference Relations in the Aorta. American Journal of Physiology-Legacy Content. 1955;183(3):545-549.

27. Sagawa K. Translation of Otto frank's paper “Die Grundform des arteriellen Pulses” zeitschrift für biologie 37: 483–526 (1899). Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 1990;22(3):253-254. 28. Westerhof N, Lankhaar J, Westerhof B. The arterial Windkessel. Medical & Biological Engineering & Computing. 2008;47(2):131-141.

29. Tonar Z, Kubíková T, Prior C, Demjén E, Liška V, Králíčková M et al. Segmental and age differences in the elastin network, collagen, and smooth muscle phenotype in the tunica media of the porcine aorta. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 2015;201:79-90.

33

30. Connat J, Busseuil D, Gambert S, Ody M, Tébaldini M, Gamboni S et al. Modification of the rat aortic wall during ageing; possible relation with decrease of peptidergic innervation. Anatomy and Embryology. 2001;204(6):455-468.

31. Bevan R. Trophic effects of peripheral adrenergic nerves on vascular structure. Hypertension. 1984;6(6_Pt_2):III19-III19.

32. Henke P. Sympathetic innervation promotes vascular smooth muscle differentiation. Yearbook of Vascular Surgery. 2007;2007:39.

33. Smith P, Venkataraman P, Reddy H. Smooth muscle growth in the mature rat: role of sympathetic innervation. Journal of the Autonomic Nervous System. 1990;31(1):13-20.

34. Failla M, Grappiolo A, Emanuelli G, Vitale G, Fraschini N, Bigoni M et al. Sympathetic tone restrains arterial distensibility of healthy and atherosclerotic subjects. Journal of Hypertension. 1999;17(8):1117-1123.

35. Sonesson B, Vernersson E, Hansen F, Lanne T. Influence of sympathetic stimulation on the mechanical properties of the aorta in humans. Acta Physiologica Scandinavica. 1997;159(2):139-145. 36. Kassab G. Biomechanics of the cardiovascular system: the aorta as an illustratory example. Journal of The Royal Society Interface. 2006;3(11):719-740.

37. Sokolis D, Kefaloyannis E, Kouloukoussa M, Marinos E, Boudoulas H, Karayannacos P. A structural basis for the aortic stress–strain relation in uniaxial tension. Journal of Biomechanics. 2006;39(9):1651-1662.

38. Lydakis C, Momen A, Blaha C, Herr M, Leuenberger U, Sinoway L. Changes of elastic properties of central arteries during acute static exercise and lower body negative pressure. European Journal of Applied Physiology. 2007;102(6):633-641.

39. Lacolley P, Glaser E, Challande P, Boutouyrie P, Mignot J, Duriez M et al. Structural changes and in situ aortic pressure-diameter relationship in long-term chemical-sympathectomized rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 1995;269(2):H407-H416.

40. Angouras D, Dosios T, Dimitriou C, Chamogeorgakis T, Rokkas C, Manos T et al. Surgical Thoracic Sympathectomy Induces Structural and Biomechanical Remodeling of the Thoracic Aorta in a Porcine Model. Journal of Surgical Research. 2012;172(1):68-76.

41. Dimitriadou V, Aubineau P, Taxi J, Seylaz J. Ultrastructural Changes in the Cerebral Artery Wall Induced by Long-Term Sympathetic Denervation. Journal of Vascular Research. 1988;25(3):122-143.

34

42. Kacem K, Sercombe C, Hammami M, Vicaut E, Sercombe R. Sympathectomy Causes Aggravated Lesions and Dedifferentiation in Large Rabbit Atherosclerotic Arteries without Involving Nitric Oxide. Journal of Vascular Research. 2006;43(3):289-305.

43. Dunmore P, Song S, Roach M. A comparison of the size of fenestrations in the internal elastic lamina of young and old porcine aortas as seen with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 1990;68(2):139-143.

44. Bevan J, Chesher G, Su C. Release of adrenergic transmitter from terminal nerve plexus in artery. Agents and Actions. 1969;1(1):20-26.

45. Amenta F, Cavallotti C, Ferrante F, Zomparelli M. The cholinergic innervation, of the aorta. Acta Histochemica. 1980;66(2):197-203.

46. Wharton J, Gulbenkian S. Peptides in the mammalian cardiovascular system. Experientia. 1987;43(7):821-832.

47. Mulderry P, Ghatei M, Rodrigo J, Allen J, Rosenfeld M, Polak J et al. Calcitonin gene-related peptide in cardiovascular tissues of the rat. Neuroscience. 1985;14(3):947-954.

48. Kanazawa I, Jessell T. Post morten changes and regional distribution of substance P in the rat and mouse nervous system. Brain Research. 1976;117(2):362-367.

49. Douglas F, Palkovits M, Brownstein M. Regional distribution of substance P-like immunoreactivity in the lower brainstem of the rat. Brain Research. 1982;245(2):376-378.

50. Geppetti P, Maggi C, Zecchi-Orlandini S, Santicioli P, Meli A, Frilli S et al. Substance P-like immunoreactivity in capsaicin-sensitive structures of the rat thymus. Regulatory Peptides. 1987;18(5-6):321-329.

51. Walsh D, McWilliams D. Tachykinins and the Cardiovascular System. Current Drug Targets. 2006;7(8):1031-1042.

52. Tanaka D, Grunstein M. Vasoactive effects of substance P on isolated rabbit pulmonary artery. Journal of Applied Physiology. 1985;58(4):1291-1297.

53. Severini C. The Tachykinin Peptide Family. Pharmacological Reviews. 2002;54(2):285-322. 54. Johnston K, Rutherford R, Tilson M, Shah D, Hollier L, Stanley J. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Journal of Vascular Surgery. 1991;13(3):452-458.

55. Verhoeven E, Kapma M, Groen H, Tielliu I, Zeebregts C, Bekkema F et al. Mortality of ruptured abdominal aortic aneurysm treated with open or endovascular repair. Journal of Vascular Surgery. 2008;48(6):1396-1400.

56. McFarlane M. The epidemiologic necropsy for abdominal aortic aneurysm. JAMA: The Journal of the American Association. 1991;265(16):2085-2088.

35

57. Gillum R. Epidemiology of aortic aneurysm in the United States. Journal of Clinical Epidemiology. 1995;48(11):1289-1298.

58. Moneta G. Analysis of risk factors for abdominal aortic aneurysm in a cohort of more than 3 million individuals. Yearbook of Vascular Surgery. 2011;2011:103-105.

59. Norman P, Powell J. Abdominal Aortic Aneurysm: The Prognosis in Women Is Worse Than in Men. Circulation. 2007;115(22):2865-2869.

60. Goldstein M, Mascitelli L, Pezzetta F. Letter by Goldstein et al Regarding Article, "Risk Factors for Abdominal Aortic Aneurysms: A 7-Year Prospective Study: The Tromso Study". Circulation. 2010;121(1):e7-e7.

61. Vardulaki K, Prevost T, Walker N, Day N, Wilmink A, Quick C et al. Incidence among men of asymptomatic abdominal aortic aneurysms: estimates from 500 screen detected cases. Journal of Medical Screening. 1999;6(1):50-54.

62. Earnshaw J. Screening for abdominal aortic aneurysms in men. BMJ. 2004;328(7448):1122-1124.

63. Acosta S, Ögren M, Bengtsson H, Bergqvist D, Lindblad B, Zdanowski Z. Increasing incidence of ruptured abdominal aortic aneurysm: A population-based study. Journal of Vascular Surgery. 2006;44(2):237-243.

64. Fitridge R, Thompson M. Mechanisms of vascular disease. Cambridge: Cambridge University Press; 2006.

65. Norman P, Powell J. Site Specificity of Aneurysmal Disease. Circulation. 2010;121(4):560. 66. Cohen J. Current Concepts for the Pathogenesis of Abdominal Aortic Aneurysms. Perspectives in Vascular Surgery and Endovascular Therapy. 1990;3(2):103-111.

67. Nordon I, Brar R, Taylor J, Hinchliffe R, Loftus I, Thompson M. Evidence from cross-sectional imaging indicates abdominal but not thoracic aortic aneurysms are local manifestations of a systemic dilating diathesis. Journal of Vascular Surgery. 2009;50(1):171-176.e1.

68. Hoshina K, Sho E, Sho M, Nakahashi T, Dalman R. Wall shear stress and strain modulate experimental aneurysm cellularity. Journal of Vascular Surgery. 2003;37(5):1067.

69. Johnsen S, Forsdahl S, Singh K, Jacobsen B. Atherosclerosis in Abdominal Aortic Aneurysms: A Causal Event or a Process Running in Parallel? The Tromso Study. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2010;30(6):1263-1268.

70. Ailawadi G, Eliason J, Upchurch G. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 2003;38(3):584-588.

36

71. Goodall S, Crowther M, Bell P, Thompson M. The association between venous structural alterations and biomechanical weakness in patients with abdominal aortic aneurysms. Journal of Vascular Surgery. 2002;35(5):937-942.

72. Baxter B, Davis V, Minion D, Wang Y, Lynch T, McManus B. Abdominal aortic aneurysms are associated with altered matrix proteins of the nonaneurysmal aortic segments. Journal of Vascular Surgery. 1994;19(5):797-803.

73. Satoh K, Nigro P, Matoba T, O'Dell M, Cui Z, Shi X et al. Cyclophilin A enhances vascular oxidative stress and the development of angiotensin II–induced aortic aneurysms. Nature Medicine. 2009;15(6):649-656.

74. McCormick M, Gavrila D, Weintraub N. Role of Oxidative Stress in the Pathogenesis of Abdominal Aortic Aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2007;27(3):461. 75. Xiong W, Mactaggart J, Knispel R, Worth J, Zhu Z, Li Y et al. Inhibition of reactive oxygen species attenuates aneurysm formation in a murine model. Atherosclerosis. 2009;202(1):128-134. 76. Baxter B, Terrin M, Dalman R. Medical Management of Small Abdominal Aortic Aneurysms. Circulation. 2008;117(14):1883-1889.

77. McDonald D. Regional pulse-wave velocity in the arterial tree. Journal of Applied Physiology. 1968;24(1):73-78.

78. Wolinsky H, Glagov S. Nature of Species Differences in the Medial Distribution of Aortic Vasa Vasorum in Mammals. Circulation Research. 1967;20(4):409-421.

79. Dobrin P, Baker W, Gley W. Elastolytic and collagenolytic studies of arteries. Implications for the mechanical properties of aneurysms. Archives of Surgery. 1984;119(4)(405-9).

80. Phillips RJ, Hargrave SL, Rhodos BS, Zopf DA, Powley TL. Quantification of neurons in the myenteric plexus: an evauation of putative pan-neuronal markers. J Neurosci Methods 2004;133:99. 81. Fronek K. Trophic effect of the sympathetic nervous system on vascular smooth muscle. Annals of Biomedical Engineering. 1983;11(6):607-615.

82. Renick SE, Seidler FJ, McCook EC, Slotkin TA. Neuronal control of cardiac and hepatic macromolecule synthesis in the neonatal rat: effects of sympathectomy. Pediatr Res 1997;41:359-363. 83. Osswald W. Mediation by adenosine of the trophic effects exerted by the sympathetic innervation of blood vessels. J Neural Transm Suppl 1991;34:157-162.

84. Burnstock G. Purinergic signaling and vaascular cell proliferation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:364-373.

85. Fronek K., Bloor CM., AmielD, Chvapil M. Effect of long-term sympathectomy on the arterial wall in rabbits and rats. Exp Mol Pathol 1978;28:279-289.

37

86. Bevan J. Some bases of differences in vascular response to sympathetic activity. Circulation Research. 1979;45(2):161-171.

87. Milner P, Burnstock G. Chronic sensory denervation reduces thrombin-stimulated endothelin reliease from aortic endothelial cells. Experentia 1996;52:242-244.

88. Relevic V, Karoon P, Burnstock G. Long-term sensory denervation by neonatal capsaicin treatment augments sympathetic neurotransmission in rat mesenteric arteries by increasing levels of norepinephrine and selectively enhancing postjunctional actions. J Pharmacol Exp Ther 1995;274:64. 89. Zhipeng H, Zhiwei W, Lilei Y, Hao Z, Hongbing W, Zongli R. Sympathetic Hyperactivity and Aortoc Sympathetic Nerve Sprouting in Patients with Thoracic Aortic Dissection. Annals of Vascualr Surgery. 2014;28(5):1243-1248.