Krūtininės aortos neuroanatominis tyrimas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS ANATOMIJOS INSTITUTAS

Rokas Adamonis

Krūtininės aortos neuroanatominis tyrimas

Medicinos vientisųjų studijų programa BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS

Darbo vadovas: prof. Dainius H. Pauža

2

TURINYS

Etikos komiteto leidimas ... 7

Santrumpos ... 8

Sąvokos ... 9

Įvadas ... 10

Darbo tikslas ir uždaviniai ... 11

Tyrimo metodika ir metodai ... 16

1. Tyrimo planavimas ... 16

2. Medžiaga ... 16

3. Medžiagos ruošimas tyrimui ... 16

4. Medžiagos tyrimas mikroskopu ... 17

5. Duomenų analizės metodai ... 17

Rezultatai ... 18

Rezultatų aptarimas ... 28

Išvados ... 30

Praktinės rekomendacijos ... 31

3

Santrauka

Autorius Rokas Adamonis

Pavadinimas– Krūtininės aortos neuroanatominis tyrimas

Tyrimo tikslas: Ištirti krūtininės aortos inervacijos galimą šaltinį ir nervų eigą į ją.

Uždaviniai. Panaudojant neuroanatominius tyrimo metodus, nustatyti: (1) krūtininės aortos inervacijos galimą šaltinį; (2) parodyti nervų plitimo kelius į krūtininę aortą ir jų eigą jos sienoje. Tyrimo metodas: Tyrimui buvo panaudotos trys vienos dienos amžiaus, 1,4 +/- 0,1kg svorio, kiaulių patelių krūtininės aortos, kurios buvo tiriamos in situ, pašalinus krūtinės ir pilvo ertmėje esančius organus ir palikus intaktišką retroperitoninį tarpą. Paimta tyrimams krūtininė aorta buvo išplaunama fosfatiniame buferiniame fiziologiniame tirpale (PBS) ir 30 minučių chemiškai fiksuojama 4-5 laipsnių temperatūroje 4% paraformeldehido (PFA) tirpalu. Chemiškai užfiksuoti audiniai buvo plaunami Triton X100 ir PBS tirpalu (santykis 1:100) 3 kartus po 10 minučių. Vėliau tiriama aorta su aplinkiniais audiniais buvo perkeliama į acetilcholinesterazės tirpalą, kuriame 2 val. 4-5 laipsnių temperatūroje inkubuojama. Po to audiniai perkeliami į PBS tirpalą ir tiriami stereomikroskopu. Histochemiškai išryškinti į aortą plintantys ir jos sienoje esantys aortos nervai buvo fotografuojami bent iš 3 pusių (kairės, dešinės bei priekio), o gauti vaizdai apjungiami į panoraminį vaizdą.

Tyrimo rezultatai:

Gautų preparatų tyrimas parodė, kad kairėje pusėje, Th 9 krūtininio slankstelio aukštyje į krūtininę aortą driekiasi acetilcholinesterazei pozityvus nervas (AChE+), prie kurio prisijungia plonesni AChE+ nervai, atsišakojantys iš aukščiau esančių simpatinio kamieno mazgų. Minimas nervas ties Th 8 krūtininiu slanksteliu padaro kilpą ir driekiasi kranialiai prie kylančiosios aortos adventicijos. Dėl šios kilpos ir driekimosi krypties šį nervą mes pavadinome kylančios aortos grįžtančiuoju nervu. Prie grįžtančio aortos nervo prisijungia plonesni nervai, atsišakojantys net nuo ketvirtojo krūtininio simpatinio mazgo.

Visuose ištirtuose preparatuose, dešinėje krūtininės aortos pusėje buvo stebimas išilgai šios aortos besidriekiantis nervas, kuris susisiekė su simpatiniu kamienu plonais, nuo 4 iki 8 krūtininių simpatinių mazgų atsišakojančiais, AChE+ nervais. Nuo 9 iki 12 krūtinių simpatinių mazgų ploni nervai susirenka į didįjį krūtininį vidurių nervą, nuo kurio taip pat atsišakoja nervinių skaidulų pluoštai, nusidriekiantys link išilgai dešinės aortos pusės esančio nervo. Kadangi nuo pastarojo nervo

4 atsišakoja ploni nervai į krūtininės aortos dešinės pusės adventiciją, šį nervą mes vadinome dešiniuoju išilginiu aortos nervu.

Tyrimo išvados: 1.Tirto gyvūno krūtininė aorta nervines skaidulas gauna per 3-4 smulkius nervus, kurie atsišakoja nuo simpatinio kamieno ir driekiasi iš abiejų krūtininės aortos pusių kaip prie aortiniai nervai. 2. Kiaulės prie aortinių nervų anatomija varijuoja dvejopai: (A) smulkios simpatinio kamieno šakos, išeinančios iš dešiniojo simpatinio kamieno Th4-Th7 mazgų, jungiasi į stambesnį, besidriekiantį dešinėje, krūtininės aortos nervą, kuris ties bronchinė stemplės arterija pereina į priekinį aortos

paviršių ir leidžiasi iki vidurių kamieno; (B) nuo kairiojo simpatinio kamieno Th6 - Th9 mazgų atsišakoja 3-4 nervų šakos, kurios driekiasi tiesiai link aortos, apsijungia į bendrą, plintantį kranialiai nervą, kurios plonos šakos įsiskverbia į aortos adventiciją. B tipo krūtininės aortos nervų tipas yra dominuojantis.

5

Summary

Author: Rokas Adamonis

Title: Neuroanatomic study of descending thoracic aorta in pigs

Aim of the study: To examine the innervations pattern of the descending thoracic aorta in porcine. Objectives: Using neuroanatomical research methods, to determine: (1) Possible source of thoracic aorta innervations; (2) To demonstrate nerve pathways to descending thoracic aorta wall and nerve distribution in it.

Methods. We have investigated in situ three one day old, 1.4 +/- 0.1kg weight, female newborn porcine descending thoracic aortas. The investigated piglets were dissected removing thoracic and abdominal organs and leaving the retroperitoneum space intact. In this way prepared tissues were washed with phosphate buffering physiological solution (PBS) and chemically fixed 30 minutes at 4-5 C0 in 4% paraformaldehyde solution PFA solution. Chemically fixed tissues were washed with Triton-X100 and PBS (ratio 1:100) 3 times for 10 minutes. Afterwards, aortas with surrounding tissue were incubated in acetilcholinesterase solution for 2 hours at 4-5 Co with a constant movement of the incubation solution. Later the tissues were moved into a chamber with PBS and observed by a stereomicroscope. Histochemically stained nerves spreading to aorta were photographed from 3 sides (left, right and front) and the tainted images were combined into a panoramic view.

Results. Our research showed that acetylcholinesterase positive nerves (AChE+) accessing the descending thoracic aorta originate from the left side thoracic sympathetic chain ganglia at the level of about the 9th thoracic vertebra. Smaller AChE+ nerves derived from the more cranially located sympathetic trunk ganglia join the left sided aorta’s nerve as well. At the 8th thoracic ganglion level, the left sided aorta’s nerve turns cranially and distributes in the adventitia along the wall of aorta. Due to such pattern of this nerve we named this nerve as the left recurrent nerve of aorta. The recurrent nerve joins the smaller nerves that derived from the 4th -8th thoracic sympathetic trunk ganglia.

In the all studied piglets on the right side of descending thoracic aorta, the AChE positive nerve extending longitudinally was observed as well. The right sided longitudinal nerve was supplied by fine nerves derived from the 4th _{and lower thoracic sympathetic ganglia. From the 9}th _{to 12}th_thoracic sympathetic ganglia, neural branches were collected into the great splanchnic nerve which supplied in part the right sided aorta’s nerve also. Since fine branches of the mentioned nerve distribute in the adventitia of descending thoracic aorta, we named it as the longitudinal aorta’s nerve.

6 Conclusions

In the examined animal species, the descending thoracic aorta is supplied by 3-4, nerves deriving from the sympathetic trunk. These nerves enter bilaterally the aorta’s adventitia and therefore they were named as preaortic nerves 2. The porcine preaortic nerves vary in two ways: (A) Small branches derived from the Th4-Th7sympathetic trunk ganglia join the larger nerve that follows anteriorly the descending thoracic aorta up to the bronchoesophageal artery. (B) Nerves derived from the T6- T9 sympathetic trunk ganglia and distribute directly to the aorta’s adventitia. The branching pattern B is predominant.

7

Padėka

Išreiškiu didžiausią padėką savo mokslinio darbo vadovui gerb. prof. D. H. Paužai už tikslius patarimus ir pagalbą savo išmintimi bei įžvalgomis. Kartu dėkoju Dok. T. Ragauskui ir Dr. H. Inokaičiui padedant ruošti preparatus tyrimui.

Interesų konfliktas

Interesų konflikto tyrime nebuvo.

Etikos komiteto leidimas

Leidimą išdavė Valstybinė Maisto ir veterinarijos tarnyba. Leidimo numeris LT 61-19-004.

8

Santrumpos

SNS - Simpatinė nervų sistema NE – Norepinefrinas

eNO – Endotelinis azoto oksidas

CGRP – Su kalcitonino genu susietas peptidas SP - Substancija P

EDHF- Endotelio kilmės hiperpoliarizacijos faktorius PBS – Fosfatinis buferinis tirpalas

PFA –Paraformaldehido tirpalas AChE - Acetilcholinesterazė

KA - Krūtininė nusileidžiančioji aorta

9

Sąvokos

Jatrogeninė komplikacija – komplikacija susijusi su gydymu Ektoderma – embriono išorinis gemalinis sluoksnis

Endotelis – vidinis kraujagyslės sluoksnis Medija – vidurinis kraujagyslės sluoksnis Adventicija – išorinis kraujagyslės sluoksnis

Aortos aneurizma – patologinis kraujagyslės sienelės išsiplėtimas Aortos disekacija – patologinis kraujagyslės sienelės atsisluoksniavimas Vasa vasorum –kraujagyslių sienos kraujagyslės

Antitrombogeninis sluoksnis – trombų agregaciją slopinantis sluoksnis

Elastinė-kontraktilinė funkcija – pasyvaus tamprumo ir aktyvaus susitraukimo funkcija Renervacija– nervinio audinio atsinaujinimas

In vivo – gyvo organizmo modelis

Vasokonstrikcija – kraujagyslės spindžio sumažėjimas Vasodilatacija– kraujagyslės spindžio išsiplėtimas Remodeliacija – audinio savybių atsistatymas Rezekuota – instrumentiškai pašalinta

10

Įvadas

Širdies ir kraujagyslių sistemos ligos pasaulyje tampa vis dažnesniu susirgimu lemiančiu ankstyvą žmonių mirtingumą. Pagal pasaulio sveikatos organizaciją Europoje daugiau kaip pusė mirčių yra susijusios su širdies ir kraujagyslių ligomis [1]. Kraujagyslių ir ypač aortos tyrimai padeda geriau suprasti esamų ligų kaip aortos aneurizma, kraujagyslių aterosklerozė ar aortos disekacija patogenezę. [2]. Siekiant geriau suprasti į aortą ateinančių impulsų įtaką atliekamas tyrimas su laboratorinių gyvūnų aortomis siekiant geriau suprasti nervinius takus esančius žinduoliuose [3]. Tokie tyrimai padės sukurti naujus gydymo bei tyrimų metodus, išvengti jatrogeninių komplikacijų ir išsiaiškinti kaip kinta kardiovaskulinė sistema senstant [4].

Aorta yra plačiai tyrinėjamas objektas, ieškant skirtingų hormoninių ir nervinių reguliacijos kelių. Šiuo metu žinoma, kad senstant organizmui kraujagyslių sienelės struktūra kinta ir prarandamos kompensacinės savybės. Šie pokyčiai vertinami kaip mechaninio poveikio į sienelę išeitis ir dažnai siejami su arterine hipertenzija, tačiau naujausi tyrimai įrodo, kad sienelės struktūra labiau priklauso nuo gaunamo kiekio nervinių impulsų nei nuo amžinio poveikio. Sienelėje esantys lygieji raumenys yra atsakingi už jungiamojo audinio sintezę ir gaudami mažesnį nervinį stimuliavimą gamina mažesnį kiekį elastinių ir kolageninių skaidulų. Sienelei tinkamai neatstatant savo struktūros, ji tampa vis pažeidžiamesnė mechaniniam kraujo tėkmės poveikiui, dėl ko gali vystytis sienelės aneurizma [5].

Paskutinių metų tyrimai parodė, jog aortos sienelė atlieka ir kontraktilinę funkciją, kuri pulsuoja išstumdama kraują ir palengvina širdies raumens darbą. Šis atradimas sukuria naują nišą farmakologiniam gydymui plėtoti ir galimai keisti aortos chirurginį gydymą, siekiant išsaugoti ateinančius nervų takus [5].

Šiuo tyrimu siekiame pagrindinių aortos nervų kelių ir inervacijos šaltinių. Darbo metu pasirinkta kiaulė kaip laboratorinis gyvūnas dėl savo kardiovaskulinės sistemos panašumų į žmogaus. Tyrimo metu dažomas kiaulių aortos krūtininės dalies segmentas acetilcholinesterazės išryškinimo būdu nustatant simpatinio kamieno kelius iki aortos.

11

Darbo tikslas ir uždaviniai

Tyrimo tikslas: Nustatyti krūtininės aortos inervacijos šaltinį ir galimą nervų eigą. Uždaviniai:

1.Nustatyti inervacijos šaltinį.

12

LITERATŪROS APŽVALGA

Aortos struktūra ir patofiziologiniai pokyčiai

Žmogaus organizme aorta yra didžiausia kraujagyslė skirstoma į tris pagrindines dalis: kylančiąją aortą pars ascendens aortae, aortos lanką arcus aortae ir nusileidžiančiąją aortą pars

descendens aortae [6]. Aortos nusileidžiančioji dalis yra dažniausia disekacijos ir aneurizmos vieta,

klinikinėje praktikoje neturinti terapinio gydymo galimybių ir paprastai gydoma operaciniu arba endovaskuliniu būdu. Ryšys tarp disekacijos ir aneurizmos dar nėra nustatytas, bet yra žinoma, kad aneurizmos maišo endotelis linkęs atsisluoksniuoti, o disekuotas aortos segmentas linkęs plėstis [7].

Aortos siena skiriama į tris sluoksnius: vidinis sluoksnis tunica intima dengiamas vienu sluoksniu endotelio ląstelių, vidurinis sluoksnis tunica media sudarytas daugiausia iš lygiųjų raumenų ir elastinių skaidulų, išorinis sluoksnis tunica adventitia, kuriame gausu kolageno, ekstraląstelinio matrikso, smulkaus kraujagyslių tinklo ir mažų baltųjų adipocitų sankaupų [8].

Aortos kraujotaka yra užtikrinama smulkių kraujagyslių tinklo vasa vasorum. Histologiškai stebimas kraujagyslių tinklas skverbiasi nuo išorinio adventicijos sluoksnio per visą vidurinį sluoksnį, tačiau pačios kraujotakos kiekis skiriasi tarp aortos dalių. Krūtininė aorta dalis pasižymi tankesniu kraujotakos tinklu nei pilvinė aorta. Šis anatominis skirtumas siejamas su storesniu

tunica media sluoksniu ir didesniu kiekiu elastiniu skaidulų krūtininėje dalyje nei pilvinėje [9].

Endotelio ląstelės veikia kaip pasyvus ir aktyvus kraujagyslės sienelę saugantis barjeras. Gerai žinoma, kad vidino sluoksnio ląstelės pasyviai sudaro antitrombogeninį sluoksnį, tačiau išsiaiškinama vis daugiau aktyvių funkcijų. Patyrus traumą arba prasidėjus uždegimo procesams, išskiriamas vasokonstriktorius endotelinas [10]. Šis hormonas yra stipriausia žinoma spindį mažinanti medžiaga, tačiau klinikinėje praktikoje nenaudojama dėl ilgos veikimo trukmės [11]. Endotelio ląstelės veikiant pulsinei kraujo srovei išskiria eNO, kuris atpalaiduoja vidurinio sluoksnio lygiąsias raumenines ląsteles ir plečia spindį, taip saugodamas sienelę nuo aterosklerozės [12].

Vidurinis aortos sluoksnis atlieka elastinę - kontraktilinę funkciją. Tyrimuose nustatytas specifinis elastinių skaidulų išsidėstymas žiedinėmis struktūromis, tarp kurių išsidėstę lygiųjų raumenų intarpai [13]. Šios raumenų ląstelės geba mažinti arterijų spindį mažesnėse kraujagyslėse, tačiau aortos sienoje jų kontraktilinės savybės nėra stipriai išreikštos ir manoma, kad aortoje jos atlieka mechanosensorinę funkciją [14-15]. Elastinę funkciją užtikrina elastinės skaidulos, kurias gamina kraujagyslės lygieji raumenys. Priklausomai nuo vietos krūtininėje dalyje raumenų ląstelės daugiau

13 gamina elastines skaidulas, o pilvinės aortos dalyje kolagenines skaidulas [16]. Toks elastinių skaidulų pasiskirstymas aiškinamas „Windkessel“ efektu. Širdies sistolės metu išstumiamas kraujo tūris patenka į aortą, tačiau išsiplečiant aortai tik pusė viso tūrio pasiekia periferines kraujagyslės. Likęs kraujo tūris periferines kraujagysles pasiekia tik diastolės metu taip išlaikant pastovią kraujo srovę [17]. „Windkessel“ efektas aortą aiškina kaip pasyvią struktūrą, kuri neturi įtakos kraujo tėkmei ir veikia kaip vamzdinis organas. Naujausi tyrimai keičia esamą paradigmą, nustatę, kad aortos siena pulsuoja panašiu į širdies ritmu. Šie tyrimai keičia jau 50 metų nusistovėjusią „Winkessel“ teoriją įrodydami ne tik aortos, bet ir miego, šlaunies ir plaučių arterijų susitraukimus. Tokia arterijų pulsacija yra nustatyta laboratorinėse žiurkėse, katėse, šunyse ir, svarbiausia, žmonėse [5].

Taip pat svarbūs yra fiziologiniai pokyčiai, veikiantys kraujagyslės vidurinį sluoksnį. Organizmui senstant, aortos medijos jungiamojo audinio struktūra keičiasi. Dėl pastoviai intensyvios kraujo tėkmės vidurinio sluoksnio elastinės skaidulos įtrūksta ir remodeliacijos procesu keičiamos kolageno skaidulomis [18]. Kintant histologinei sienelės struktūrai dėl elastinių skaidulų pakeitimo į kolageno, aorta ilgėja [19]. Sumažėjus sienos elastinėms savybėms didėja tėkmės spaudimas, plečiantis spindį. Spindžio didėjimas veikia mažindamas širdies pokrūvį ir saugodamas širdį, tačiau tokie pokyčiai yra siejami su aneurizmos formavimusi, sienelės disekacija ir arterine hipertenzija [20].

Dažniausi aortos ligų mechanizmai aiškinami per kraujo, endotelio arba vidurinio sluoksnio pažeidimus, tačiau vis dažniau nustatoma adventicijos įtaka aortos patologijoms. Atliktuose tyrimuose nustatyta, kad baltasis riebalinis audinys, randamas aplink kraujagysles, atlieka uždegiminę funkciją sekretuojant citokinus. Taip pat yra nustatytas adipocitų migravimas iš perivaskulinės erdvės į adventicijos sluoksnį [8]. Vykstant uždegiminiams procesams, adventicijoje esantys fibroblastai gali virsti į miofibroblastus ar lygiųjų raumenų ląsteles. Dėl pakitusio išorinio sluoksnio struktūros, įvyksta kalcifikacija [21]. Toks riebalinių ląstelių migravimas silpnina adventicijos sluoksnį, mažinant kolageno skaidulų kiekį dėl makrofagų uždegiminio fono. Riebalinių ląstelių migracija ir infiltracija uždegiminėmis ląstelėmis gali būti siejama su aortos aneurizmos formavimusi ir sienelės plyšimu [22].

Aortos neurogeninė reguliacija

Formuojantis embriono kardiovaskulinei sistemai, pradžioje susiformuoja aorta kaip pagrindinė kraujagyslė, kurios nugariniame paviršiuje vystosi periferinė nervų sistema. Apie ketvirtą savaitę iš embriono ektodermos lapelio formuojasi nervinis vamzdelis. Šio proceso metu lieka dalis ląstelių už nervinio vamzdelio ribų, kurios sudaro nervinę keterą. Būtent šios simpato-adrenalinės ląstelės, veikiamos aortos kaip pagrindinio signalinio centro, migruoja ir formuoja periferinę nervų

14 sistemą [23-24]. Šiuo metu žinoma, kad simpatinė nervų sistema (SNS) yra būtina kraujagyslių lygiųjų raumenų tonusui palaikyti. Sustabdžius SNS impulsų perdavimus kraujagyslės sienelėse stebimas didėjantis kiekis jungiamojo audinio ir greitesnis lipidų atsidėjimas. Paprastai toks sienelės pokytis būdingas senėjimo proceso metu [25-26]. Taip pat lygiųjų raumenų ląstelės augdamos ir negaudamos užtektinai impulsų, skatina nervines ląsteles augti, išskiriant nervų augimo faktorių [27]. Blokuojant SNS inervaciją in vivo, stebimas hemodinamikos pokytis. R.E. Harvey ir kolegų atliktame tyrime po menopauzinio amžiaus moterims blokuojant SNS impulsus pastebėti padidėjimai aortos pulsinio spaudimo, bendro arterinio kraujo spaudimo ir kairio skilvelio apkrovimas [28]. Esant pažeistai aortos sienai ir susiformavus aortos aneurizmai, SNS aktyvumas padidėja, vyksta aktyvus neuroremodeliacinis procesas. H. Zhipeng su kolegomis 2014 metais nustatė padidėjusį norepinefrino (NE) kiekį, kuris didėja dėl aktyvios SNS veiklos aortos disekacijos metu. Įrodydami, kad NE pagrindinis šaltinis yra neuronų remodialiacija, jie nustatė naujas nervų augimo zonas. Nors tyrimas neatsako kaip SNS veikla daro įtaką aneurizmos formavimuisi, tačiau padeda suprasti aortos renervacijos galimybes [29].

Su kalcitonino genu susijęs peptidas (CGRP) yra vienas svarbiausių neuromediatorių dalyvaujančių aortos inervacijoje. Baltymui veikiant raumenų ląsteles, jos atsipalaiduoja, todėl mažėja kraujospūdis, tačiau esant CGRP stygiui, stebima kraujagyslės vazokonstrikcija, didėja mechaninis poveikis sienelei ir yra pažeidžiamas endotelis. Skirtingai nei cholinerginė inervacija, CGRP nustatomas daugiau pilvinėje aortos dalyje nei krūtininėje [30]. Tyrimuose su žiurkėmis ir jūrų kiaulytėmis nustatytas galimas peptidą nešančių skaidulų skirtumas. Darbo metu atrasta, jog CGRP skaidulos gali būti motorinės ir sensorinės [31]. Nervinės skaidulos nešančios CGRP dažnai būna mišrios su substancijos P (SP) teigiamais nervais [32-33].

Kraujagyslių vasodilatacija dažnu atveju priklauso nuo endotelio išskiriamo azoto oksido (NO). Aplink kraujagysles išsidėsto platus tinklas SP turinčių nervų, kurių dalis siekia endotelio ląsteles. Dėl SP ląstelės išskiria eNO ir ciklooksigenazės inhibitorius ir veikiant per endotelio kilusio hiperpoliariacijos faktorių (EDHF) atsipalaiduoja lygieji raumenys dėl ko pasireiškia vazodilatacija [34, 35]. Šis mechanizmas yra kontraversiškas ir vieno tyrimo metu nustatoma, kad kraujagyslių išsiplėtimas dėl SP veikia tik esant sveikam endotelio sluoksniui, o intimos pažaida slopina vazodilatacines galimybes [36]. Kitame tyrime D. Tousoulis su kolegomis 1999m. įrodo, kad vazodilatacija veikiant SP pasireiškia sveikose ir aterosklerozės pažeistose vainikinėse arterijose [37]. Amžiniai pokyčiai nemažina SP poveikio, o tyrimuose su laboratoriniais gyvūnais nustatytas šio neuropeptido didėjimas senstant organizmui [38].

Adrenerginė inervacija yra didesnė aortos krūtininėje dalyje nei pilvinėje [39]. Esant mažesniam impulsų kiekiui lygiųjų raumenų ląstelės nustoja atlikti kontraktilinę funkciją ir aktyviau

15 gamina kolageno ir elastino skaidulas [40]. Šios nervinės skaidulos didžiąja dalimi siekia medijos sluoksnio išorę, o gilesnių sluoksnių nepasiekia, tačiau gaunami impulsai perduodami ir giliau medijos sluoksniuose esančioms raumeninėms ląstelėms. Šis grupinis kontraktilinis atsakas yra aiškinamas miogeniniu signalo perdavimu. Signalą gavusios raumeninės ląstelės susitraukia paeiliui su artimiausioms raumeninėms ląstelėms sukuriant susitraukimo bangą [41-42].

16

Tyrimo metodika ir metodai

1. Tyrimo planavimas

Planuojant šį darbą ir siekiant pasirinkti tinkamą tyrimo objektą, buvo atlikti pilotiniai tyrimai su skirtingų rūšių gyvūnais. Pradžioje buvo atliktas triušio aortos ir įvairaus amžiaus laboratorinių žiurkių histocheminiai AChE išryškinimai. Kadangi pastarųjų gyvūnų rūšių aortos rezginio nepasisekė vizualizuoti, detalesniems anatominiams tyrinėjimams buvo pasirinkti vienadieniai kiaulių jaunikliai, nes jų aortos rezginys buvo sėkmingai išryškinamas acetilcholinesterazės histocheminiu dažymu ir, reikia pažymėti, visuotinai pripažįstama, kad kiaulių aortos sienos sandara yra panašiausia į žmogaus aortos.

2. Medžiaga

Tyrimui buvo panaudotas 1 dienos amžiaus naminės,1,4kg +/-0,1kg vienos lyties (patelės) kiaulės jaunikliai. Tiriamieji gyvūnai buvo gauti per trumpesnį laiką nei 12 valandų po asfikcijos. Gyvūno ir jo organo panaudojimas moksliniams tikslams buvo atliekamas pagal Lietuvos Respublikos maisto ir veterinarijos tarnybos nustatytas laboratorines praktikos normas. Gyvūno palaikai atvežti į LSMU Anatomijos instituto balzamavimo laboratoriją. Jauniklis nuplautas po tekančia vandens srove, siekiant neužteršti vidinių audinių, atliktas išilginis pjūvis atveriant krūtinės ir pilvo ertmes. Atliekant reperfuziją punktuojant kairį širdies skilvelį, buvo naudojamas PBS. Širdis buvo rezekuojama kartu su aortos vožtuvu kylančiosios aortos pradžioje ir naudojama kitame Anatomijos instituto tyrime. Pašalinti likę krūtinės ir pilvo ertmių organai paliekant aortą ir inkstus in situ. Pasieninės pleuros lapelis paliekamas intaktiškas.

3. Medžiagos ruošimas tyrimui

Aortos modelis praplaunamas PBS šalinant galimus krešulius ir fiksuotas 30 minučių PFA tirpalu. Fiksuoti audiniai buvo plaunami Triton X100 (CarlROTH, Vokietija) ir PBS tirpalu (santykis 1:100) 3 kartus po 10 minučių. Modelis perkeliamas į inkubacinę terpę paruoštą pagal Karovsky roots [43] tirpalą ir 4-5 laipsnių temperatūroje su pastoviu skysčio judėjimu dažomas 2 valandas. Po to audiniai perkeliami į PBS tirpalą ir preparuojami po stereoskopiniu mikroskopu siekiant rezekuoti pasieninį pleuros lapelį nepažeidžiant retroperitoniškai esančių nervinių struktūrų. Modelis grąžinamas į AChE tirpalą dar 1,5 val. pakartotinam dažymui.

17 Visi aortos modeliai užimdavo 500ml (+/-25ml) tūrį. AChE tirpalas ruošiamas 1000ml (+/-1ml) kiekiu siekiant audinio ir tirpalo santykį laikyti 1:2. Ruošiant tirpalą buvo naudoti CarlROTH firmos Acetilthiocholiniodidas (>99%,milteliai), Triton-X100 (tirpalas), trihidruotas natrio acetatas (milteliai), dihidruotas natrio citratas (milteliai), Sigma-Aldrich firmosacto rūgštis (99,8-100,5%, tirpalas), bevandenis vario sulfatas (milteliai), bevandenė kalio druska (milteliai).

4. Preparatų mikroskopavimas

Audiniai fiksuojami, aortos spindyje pravedama aliumininė viela audiniams įtempti. Gautas aortos preparatas mikroskopuojamas stereoskopiniu mikroskopu padidinant 50-100 kartų. Vaizdai fiksuojami AxioVision programine ir technine įranga (Zeis, Gottingen, Vokietija), naudojant dvigubą 3200k apšvietimą iš trijų pusių.

5. Duomenų analizės metodai

Gautos struktūros modelis fotografuojamas pavienėmis nuotraukomis iš trijų pusių (kairės, dešinės ir priekio), gautos nuotraukos suliejamos į panoraminį vaizdą. Surinktos nuotraukos lyginamos su aprašymais literatūroje ir anatomijos atlasuose. Sukurtas schematinis modelis, aiškinantis matomas struktūras.

18

Rezultatai

1. Simpatinio kamieno nervai ir aortą

Tyrimo metu stebėjome didesnį kiekį nervinių skaidulų pluoštus krūtininės aortos (KA) dalyje. Skaidulų pluoštai atsišakoja nuo simpatinio kamieno driekiasi iki aortos audinių ir skyla į platų nervų tinklą, kuris neria gilyn į kraujagyslės audinius (1 pav.). Iš dalies tai aiškinama embriogenezės metu kylančios nervinės keteros ląstelių migravimo pagal ankstyvos aortos formavimąsi. Iš nervinės keteros susiformuojant simpatiniam kamienui, ryšys su aorta išlieka. Taip pat matomi nervai, ateinantys nuo rezekuotos širdies pusės galimai atsakingi už širdies ir aortos sinchronišką pulsavimą, tačiau šios struktūros nėra tiriamos šiame darbe ir nebus toliau nagrinėjamos. Krūtininė aorta, remiantis literatūra, yra labiau inervuota nei pilvinė, tačiau net krūtininiame segmente stebime mažėjantį kiekį nervinių kelių leidžiantis kaudaliau. 11Th-12Th slankstelio aukštyje skaidulų pluoštai į aortą eina sudarydami storesnius nervus apjungdami kelių simpatinio kamieno mazgų atšakas (2 pav.). Aortos paviršiuje aiškiai matome, kaip nervinės galūnės neria gilyn. Šis dėsningumas lengviausiai stebimos proksimalinėje nusileidžiančiosios aortos dalyje dėl gausesnės inervacijos (2 pav.).

Pavaizduotoje schemoje (3 pav.) matome atvaizduotą tiriamo kiaulės jauniklio krūtininio segmento nervų tinklą. Matoma, kad didžioji dalis nervinių skaidulų pluoštų į aortą patenka proksimalinėje dalyje, distaliau Th9 slansktelio aukštyje stebima nervų grupė, sudaranti lanką ir keičianti kryptį kranialiau. Ši grupė apjungdama dalį nervų išeinančių iš simpatinio kamieno skverbiasi į aortos audinį tarp Th7 ir Th9 krūtininių slankstelio.

Priešingoje pusėje nervai atskildami nuo simpatinio kamieno taip pat jungiasi į stambesnes grupes, tačiau neinervuoja aortos audinio tiesiogiai. Nuo proksimaliai matomo Th4 slankstelio aukščio prasidedanti nervų grupė driekiasi šalia aortos. Matomas ryšys su aortos audiniu tik pavieniais nervais, skylančiais nepilnai prisijungiančiais su šalia aortos einančiu nervu. Svarbesnis ryšys stebimas su atskylančiomis arterijomis nuo aortos. Tįsdamas aortos šone nervas skyla į pagrindines šakas šalia a. bronchoesophagealis ir tr. coeliacus.

Distaliau formuojasi didysis vidurių nervas tarp Th8-Th13 slankstelių esančių mazgų (2 pav.). Šis nervas persijungia Th12 slankstelio aukštyje su nervų grupe einančią į aortą, tačiau tyrimo metu nenustatinėjome kiekybiškai persijungiančių neuronų kiekį.

19

1 pav. Proksimalinė aortos dalis. Žalios rodyklės – simpatinis kamienas, baltos rodyklės – tiesioginiai nervai link aortos, rožinės rodyklės – nervų terminalinės galūnės neriančios į aortos audinius, Ao – aorta.

20

2 pav. Tiesiogiai einantys nervai į aortą 11 krūtininio slankstelio aukštyje. Žalios rodyklės – simpatinis kamienas, baltos rodyklės – tiesiogiai einantys nervai link aortos ir jų skverbimasis į audinius, juodos rodyklės – išilginis nervas, Ao – aorta.

21

3 pav. Schematinis kiaulės simpatinio kamieno ir aortos nervų tinklas. Juodos rodyklės – išilginio nervo kamienas, žalios rodyklės grįžtamasis nervas, mėlynos rodyklės tiesioginės šakos nervų einančių į aortą, raudona spalva – aorta su atsišakojimais, melsva spalva – lykinė vena, rudi ruošai abipus simpatinis kamienas, rudi sustorėjimai – simpatinio kamieno mazgai, šalia esantys skaičiai – krūtininių slankstelių aukštis.

22

2. A tipo KA nervinis variantas

Tarp simpatinio kamieno ir aortos stebima stambi nervinė struktūra, prasidedanti aukščiau Th 4 slankstelio ir nusileidžianti žemiau diafragmos skliautų (5 pav.). Iš simpatinio kamieno mazgų, tarp Th 4 ir Th 8 krūtininio slankstelio, atskyla 5-7 nerviniai skaidulų pluoštai prisijungiantys prie matomo nervo kamieno (4 pav.). Nuo Th 8 iki Th 13 slankstelio aukščio iš simpatinio kamieno kyla didysis vidurių nervas, kuris nesijungia su stebimu nervu (2 pav.).

Šią struktūrą išskirėme matydami jos sąsają su stambiomis aortos šakomis. Pats nervas guli iškart po pasienine pleura, o šalia aortos eina adventicijos išore. Driekiantis jis pasižymi stambiomis šakomis tik prie a. bronchoesophagealis ir tr coeliacus. Eidama nuo proksimalinės dalies ties 4 krūtininiu slanksteliu nervinė struktūra keliauja šalia aortos, vadinama prie aortine dalimi. Pasiekus 9 krūtininį slankstelį nervo šaka atskyla į a. bronchoesophagealis ir pats kamienas šliejasi priekyje aortos ir vadinamas prieš aortine dalimi. Šio nervo svarba kardiovaskulinei sistemai nėra aiški, galimai nervas keliauja iki atitinkamų organų šalia kraujagyslės ir inervuoja juos. Tyrime nervas yra AChE+, siekiant geresnio nervo fiziologinės prasmės supratimo reikalingas tolimesnis imunohistocheminis tyrimas.

Šią struktūrą (5pav.) įvardinome kaip išilginį aortos nervą priskirdami jam būdingus bruožus: nervas prasideda kranialiau širdies, prie jo jungiasi atskylantys nervai nuo simpatinio kamieno, būdinga paviršinė nervo eiga, nervas neinervuoja aortos tiesiogiai, o lydi aortą ir jos šakas.

23

4pav. I tipo išilginis nervas proksimaliai surenka simpatinio kamieno atskylančius nervus. Žalios rodyklės – simpatinis kamienas, juodos rodyklės išilginis nervas, raudonos rodyklės - nervai iš simpatinio kamieno, Ao – aorta, M - simpatinio kamieno mazgai, T.A. - tarpšonkaulinės arterijos.

24

5 pav. I tipo išilginis nervas einantis aortos dešinėje pusėje. Žalios rodyklės – simpatinis kamienas, juodos rodyklės išilginis nervas, žydros rodyklės - didysis vidurių nervas, * - a. bronchoesophagus, + - Tr. Coeliacus, Ao – aorta.

25

3. B tipo KA nervinis variantas

Tyrimo metu nustatytas antras tipas nervinio kelio, kurio metu nervai surenkami į stambesnį kamieną iš grupės mazgų, esančių aukščiau ir sudarydami lanką grįžta inervuoti aortos sritis kranialiau (6 pav.). Iš simpatinio kamieno segmento nuo Th 6 iki Th 8 slankstelio aukščio esančių mazgų atskyla nervų pluoštai ir driekiasi kaudaliai iki 9 krūtininio slankstelio aukščio. Čia stebimas nervas, išeinantis iš simpatinio kamieno keliauja tiesiai link aortos audinio priešais v. azygos, susirenka iš aukščiau besidriekiančius nervus ir keliaujant lanku, šliejasi prie aortos (7 pav.). Ši struktūra kyla nuo Th 9 slankstelio aukščio ir šalia aortos kyla iki Th 7 slankstelio, atskildama tik prie a.

bronchoesophagealis, bet jos nelydi. Grįždama kranialiai, struktūra siekia nervinius pluoštus,

atskylančius iš simpatinio kamieno Th 4 slankstelio aukštyje. Dėl savo tendencijos sudaryti lanką ir kilti proksimaliai šią struktūrą įvardinome grįžtamuoju nervu.

6 pav. II tipo grįžtantysis nervas ir jo atsišakojimai nuo simpatinio kamieno. Žalios rodyklės – simpatinis kamienas, baltos rodyklės –simpatinio kamieno atsišakoję nervai prisijungiantys prie grįžtančio nervo, mėlynos rodyklės – pagrindinis grįžtančiojo nervo kamienas, Ao – aorta, v. Az – lykinė vena.

26

7 pav. Grįžtančiojo nervo atsišakojimas nuo simpatinio kamieno. Žalios rodyklės – simpatinis kamienas, mėlynos rodyklės – pagrindinis grįžtančio nervo kamienas, Ao – aorta, v. Az – lykinė vena.

27

8 pav. Grįžtantysis nervas ir pilna jo eiga nuo simpatinio kamieno, lanke surenka iš proksimalinės dalies nusileidžiančius nervus ir grįžtamai įnervuoja aortą. Žalios rodyklės – simpatinis kamienas, juodos rodyklės - grįžtamojo nervo eiga, Ao – aorta, *- a. bronchoesophagealis, v. Az – lykinė vena.

28

Rezultatų aptarimas

Šis tyrimas yra pirmasis, išskiriantis galimus skirtingus nervų kelius nuo simpatinio kamieno iki aortos ir jos šakų. Pirmą kartą pilvinės aortos cholinerginė inervacija buvo aprašyta prof. Krause 1876 metais, pastebėjusio nervines galūnes, kurių terminaliniai galai baigiasi aortos paviršiuje. Nuo tada pradėjus detaliau ieškoti inervacijos šaltinio ir nervinių skaidulų eigos, buvo daugybė darbų, tačiau jų rezultatai skirtingai nurodydavo kokiame gylyje baigiasi terminalinės nervų galūnėlės. 1980m. Amenta atliko grupę tyrimų su triušių, jūrų kiaulyčių, avių ir šunų aortomis [44]. Tyrimų metu jis aprašė aortą, apsuptą dviem aukštais esančių nervinių skaidulų pluoštų, kurių paviršinės skaidulos stambesnės, o giliosios smulkesnės. Aiškinant nervų eigą, jie pateikiami difuziškai pasiskirstę, be aiškios krypties, o gilesni nervai dažniausiai artimai susiję su aortos vasa vasorum ir baigiasi ties kraujagyslės adventicijos ir medijos riba. Šis nervų eigos planas stebimas ir mūsų tyrimo metu. Išilginis nervas eina šalia aortos ir yra stambesnis nei nervai, einantys tiesiai į aortą. Kiti nervai, einantys tiesiai į aortą nuo simpatinio kamieno yra linkę skilti į didelį kiekį smulkesnių nervų ir nerti gilyn į kraujagyslės audinį.

Naujesni tyrimai pritaiko surinktą simpatinio kamieno ir aortos inervacijos informaciją ir atlieka tyrimus vertinant šio ryšio įtaką. Angouras su kolegomis 2010 metais atliko aortos simpatektomiją kiaulėms nuo 1 iki 8 simpatinio kamieno mazgų. Vertinant su kontrolinėmis kiaulėmis, po 3 mėnesių stebėtas krūtininės ir pilvinės aortos sienelių spindžio padidėjimas ir krūtininės aortos sienos sustorėjimas. Pastebėtas prasidėjęs remodeliacinis procesas pakeitė aortos sienos morfologiją didinant kolageno skaidulų kiekį lygiųjų raumeninių skaidulų sąskaita [45]. Mes atradome, kad iš simpatinio kamieno mazgo, esančio 8 krūtininio slankstelio aukštyje, kyla grįžtamasis nervas, kuris kyla proksimaliai ir difuziškai aprūpina aortą iki 7 mazgo aukščio. Angouro tyrime nedetalizuojama kokiame krūtininės aortos aukštyje įvyko sienelės išsiplėtimas ir sustorėjimas, galimai šie grįžtantys nervai būtų renervacijos šaltinis išvengiant pooperacinių aneurizmos formavimosi komplikacijų.

Kitame tyrime vertinant aortos simpatinės nervų sistemą sergant krūtininės aortos aneurizma nustatomas jos padidėjęs aktyvumas [46]. Tyrimo metu mikroskopuojant pooperacinę medžiagą, nustatytas suaktyvėjęs nervinių skaidulų augimas. Taip pat tarp pacientų nustatytas padidėjęs norepinerfrino kiekis kraujyje rodo suaktyvėjusią simpatinę nervų sistemą, formuojantis aortos aneurizmai. Skirtingai nei po Angouras tyrime atliktų simpatektomijų, nervų kamienai nenutraukiami, o terminaliai esančios galūnėlės aneurizmos atveju yra stimuliuojamos lygiųjų raumenų ląstelių [27]. Identifikavus tokias struktūras kaip grįžtamasis nervas žmogaus organizme ir nervų inervuojamus aortos segmentus, sugebėtume išvengti nervų pažeidimų protezuojant aneurizmas, o nervinės struktūros stimuliavimas galimai būtų prevencinis gydymas aortos aneurizmos formavimuisi.

29 Ieškant aortos inervacijos skirtumų avyse, buvo nustatytas segmentinis nervų kiekio skirtumas tarp krūtininės ir pilvinės dalių [47]. Nors tyrime buvo nagrinėjama tik vidinė aortos inervacija ir neieškoma aortos inervacijos šaltinio, tačiau autorius pastebi, kaip nervai įsiskverbia iš išorės į vidinį dangalą. Nustatyta, kad nervų nesimato tik vidinėje krūtininės aortos dalyje, bet signalas gali būti perduodamas raumeninių ląstelių tarpusavio kontakto būdu. Mūsų atliktame tyrime nervai matomi AChE dažymo metu nėra tiriami imunohistochemiškai ir nėra nustatomas nervinių struktūrų vaidmuo aortos inervervacijos procese. Detalesnis tyrimas vertinant iš simpatinio kamieno ateinančius nervus turėtų apjungti makro struktūrų stebėjimą bei imunohistocheminius tyrimus.

Naujausi tyrimai atliekami in vivo pasižymi neinvaziniu nervų stimuliavimu, kuris galės būti pritaikomas ir aortos inervacijos regeneracijai. Atliktame tyrime su laboratorinėmis pelėmis buvo stimuliuojamas sėdimasis nervas fokusuotu ultragarso davikliu [48]. Tyrimo metu buvo pastebėtas efektyvumas skatinant pelių nueinamą atstumą ir vėliau tikrinamas nervų pažeidimas. Gauti rezultatai pirmą kartą įrodė galimą transderminį gilių nervų stimuliavimą, išvengiant chirurginių procedūrų, reikalaujančių įvesti stimuliatorius, veikiančius elektros srove. Žinant tikslius inervuojamus segmentus iš nervų ateinančių nuo simpatinio kamieno iki aortos, atsiveria galimybės stimuliuoti šias struktūras ir didinant jų funkciją slopinti aortos aneurizmos formavimąsi.

Šiuo tyrimu nurodėme galimus nervinio audinio kelių tipus nuo simpatinio kamieno iki aortos kiaulėse. Tolimesni tyrimai su kitais žinduoliais padės geriau suprasti visus galimus nervinio audinio kelius, o anatominiai žmonių tyrimai suteiks pagrindą naujoms intervencinio gydymo taktikoms ir galimai profilaktikos programoms.

Tyrimo trūkumai

Tyrimo metu susidūrėme su kliūtimis, galinčiomis iškreipti mūsų gautus rezultatus. Darbo metu stebėjome tik tris kiaulių jauniklius ir turima imtis gali būti per maža, kad galėtume daryti platesnius apibendrinimus apie tirto gyvūno aortos link plintančius nervus. Šiame tyrime buvo stebimos tik AChE+ nervai, galimai rezultatai būtų tikslesni pasirenkant papildančius šiuos, imunohistocheminius nervinio audinio dažymo būdus. Taip pat ištirti gyvūnai buvo tik naujagimės kiaulaitės, kurių nervinis rezginys aortos adventicijoje galimai dar tik vystosi. Iš literatūros yra žinoma, kad nervinių rezginių anatomija gali kisti ne tik dėl amžinių organizmo pokyčių, bet taip pat gali skirtis tarp įvairių kiaulių veislių.

30

Išvados

1. Tirto gyvūno krūtininė nusileidžiančioji aorta nervines skaidulas gauna per 3-4 smulkius nervus, kurie atsišakoja bilateraliai nuo simpatinio kamieno kaip prie aortiniai nervai.

2. Kiaulės prie aortinių nervų anatomija varijuoja dvejopai:

2.1. Smulkios simpatinio kamieno šakos, išeinančios iš Th 4- Th 7 simpatinio kamieno mazgų jungiasi į stambesnį, besidriekiantį aortos dešinėje pusėje, nervą, kuris ties

a.bronchoesophagealis pereina į priekinį aortos paviršių ir leidžiasi iki vidurių kamieno (A

tipas);

2.2. Nuo Th 6 – Th 9 simpatinio kamieno mazgų atsišakoja 3-4 šakos, kurios driekiasi tiesiai į aortą ir aortos adventicijoje grįžta kranialiau (B tipas). B tipo aortos nervų rezginys yra dominuojantis.

31

Praktinės rekomendacijos

1. Aorta neuroanatomijai histocheminiu AChE būdu tirti turi būti saugoma vėsioje 40C temperatūroje, pH 7.4 buferiniame 4% paraformaldehido tirpale.

2. Siekiant ryškiai vizualizuoti aortos nervinį rezginį, audinius reikia išplauti TritonX100 vieno procento tirpale (apie 2 valandas), o dažymą AChE atlikti 2-3 kartus po 1,5 val. su pertraukomis, pasluoksniui preparuojant audinius.

3. Nustačius aortos regninio anatomiją ir siekiant detaliau nustatyti šio rezginio nervinių skaidulų morfofunkcinius tipus, yra prasminga ištirti juos imunohistochemiškai ir elektromikroskopiškai.

32

Literatūros sąrašas

1. http://www.euro.who.int/en/health-topics/noncommunicable-diseases/cardiovascular-diseases/data-and-statistics 2019

2. Davis FM, Rateri DL, Daugherty A. Mechanisms of aortic aneurysm formation: translating preclinical studies into clinical therapies. 2014

3. Lysgaard Poulsen J, Stubbe J, Lindholt JS. Animal Models Used to Explore Abdominal Aortic Aneurysms: A Systematic Review. 2016

4. Zhang SL, Du X, Chen YQ, Tan YS, Liu L. Potential Medication Treatment According to Pathological Mechanisms in Abdominal Aortic Aneurysm. 2018

5. Allen W. Mangel* A Changing Paradigm for Understanding the Behavior of the Cardiovascular System 2017

6. HoracioMurilloMD, PhD, Michael J.LaneMD, RajeshPunnMD, Dominik Fleischmann MD, Carlos S.Restrepo MD. Imaging of the Aorta: Embryology and Anatomy, 2012

7. F. Charles Brunicardi, Dana K. Andersen, Timothy R. Billiar, David L. Dunn, John G. Hunter, Jeffrey B. Matthews, Raphael E. Pollock. Schwartz's Principles of Surgery, 10e, 2015

8. Scott T. Robinson, W. Robert Taylor. Beyond the adventitia: Exploring the outer limits of the blood vessel wall 2010

9. Tonar Z, Tomášek P, Loskot P, Janáček J, Králíčková M, Witter K.Vasa vasorum in the tunica media and tunica adventitia of the porcine aorta. 2016

10. Hickey KA, Rubanyi G, Paul RJ, Highsmith RF. Characterization of a coronary vasoconstrictor produced by cultured endothelial cells. 1985

11. Davenport AP, Hyndman KA, Dhaun N, Southan C, Kohan DE, Pollock JS, Pollock DM, Webb DJ, Maguire JJ. Endothelin. 2016

12. Young A, Wu W, Sun W, Benjamin Larman H, Wang N, Li YS, Shyy JY, Chien S, García-Cardeña G.Flow activation of AMP-activated protein kinase in vascular endothelium leads to Krüppel-like factor 2 expression. 2009

13. Karimi A1, Milewicz DM2. Structure of the Elastin-Contractile Units in the Thoracic Aorta and How Genes That Cause Thoracic Aortic Aneurysms and Dissections Disrupt This Structure. 2015

14. Jay D. Humphrey, Dianna M. Milewicz, George Tellides, Martin A. Schwartz Dysfunctional Mechanosensing in Aneurysms 2014

33 15. Jay D. Humphrey, Martin A. Schwartz, George Tellides,Dianna M. Milewicz Focus on

Thoracic Aortic Aneurysms and Dissections 2015

16. Ruckman JL1, Luvalle PA, Hill KE, Giro MG, Davidson JM. Phenotypic stability and variation in cells of the porcine aorta: collagen and elastin production. 1994

17. Gustav G. Belz. Elastic properties and Windkessel function of the human aorta. 1995

18. Collins JA, Munoz JV, Patel TR, Loukas M, Tubbs RS. The anatomy of the aging aorta. 2014 19. Hickson SS, Butlin M, Graves M, Taviani V, Avolio AP, McEniery CM, Wilkinson IB. The

relationship of age with regional aortic stiffness and diameter. 2010

20. Martin C, Sun W, Primiano C, McKay R, Elefteriades J. Age-dependent ascending aorta mechanics assessed through multiphase CT. 2013

21. Li N, Cheng W, Huang T, Yuan J, Wang X, Song M. Vascular Adventitia Calcification and Its Underlying Mechanism. 2015.

22. Kugo H, Ikeda Y, Moriyama T, Zaima N. Appearance of Adipocytes in Thoracic Aortic Aneurysm 2018

23. Saito D, Takahashi Y. Sympatho-adrenal morphogenesis regulated by the dorsal aorta. 2015 24. Ronan O’Rahilly and Fabiola MüllerThe development of the neural crest in the human 2007 25. Fronek K. Trophic effect of the sympathetic nervous system on vascular smooth muscle. 1983 26. Creedon D, Tuttle JB. Nerve growth factor synthesis in vascular smooth muscle. 1991

27. Matsuyama A, Takatori S, Sone Y, Ochi E, Goda M, Zamami Y, Hashikawa-Hobara N, Kitamura Y, Kawasaki H. Effect of Nerve Growth Factor on Innervation of Perivascular Nerves in Neovasculatures of Mouse Cornea. 2017

28. Harvey RE, Barnes JN, Hart EC, Nicholson WT, Joyner MJ, Casey DP Influence of sympathetic nerve activity on aortic hemodynamics and pulse wave velocity in women. 2017 29. Angouras DC1, Dosios TJ, Dimitriou CA, Chamogeorgakis TP, Rokkas CK, Manos TA,

Sokolis DP. Surgical thoracic sympathectomy induces structural and biomechanical remodeling of the thoracic aorta in a porcine model. 2012

30. Nilsson H, Goldstein M, Nilsson O. Adrenergic innervation and neurogenic response in large and small arteries and veins from the rat. 1986

31. Mulderry PK, Ghatei MA, Rodrigo J, Allen JM, Rosenfeld MG, Polak JM, Bloom SR Calcitonin gene-related peptide in cardiovascular tissues of the rat. 1985

32. Wharton J, Gulbenkian S, Mulderry PK, Ghatei MA, McGregor GP, Bloom SR, Polak JM. Capsaicin induces a depletion of calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive nerves in the cardiovascular system of the guinea pig and rat. 1986

34 33. Olesen IJ, Gulbenkian S, Valença A, Antunes JL, Wharton J, Polak JM, Edvinsson L. The peptidergic innervation of the human superficial temporal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and vasomotility. 1995

34. Edwards G, Félétou M, Gardener MJ, Glen CD, Richards GR, Vanhoutte PM, Weston AH. Further investigations into the endothelium-dependent hyperpolarizing effects of bradykinin and substance P in porcine coronary artery. 2001

35. Stubbs CM, Waldron GJ, Connor HE, Feniuk W.Characterization of the receptor mediating relaxation to substance P in canine middle cerebral artery: no evidence for involvement of substance P in neurogenically mediated relaxation. 1992

36. Bodelsson G, Stjernquist M. Endothelium-dependent relaxation to substance P in human umbilical artery is mediated via prostanoid synthesis. 1994

37. Tousoulis D1, Tentolouris C, Crake T, Katsimaglis G, Stefanadis C, Toutouzas P, Davies GJ. Effects of L- and D-arginine on the basal tone of human diseased coronary arteries and their responses to substance P. 1999

38. Duckles SP. Effect of age on substance P levels in the rat mesenteric artery and vein. 1985 39. Zhipeng H, Zhiwei W, Lilei Y, Hao Z, Hongbing W, Zongli R, Hao C, Xiaoping

H.Sympathetic hyperactivity and aortic sympathetic nerve sprouting in patients with thoracic aortic dissection. 2014

40. Cowen T, Burnstock G. Quantitative analysis of the density and pattern of adrenergic innervation of blood vessels. A new method. 1980

41. Kamel K. Sercombe C. Mohamed H. Sympathectomy causes aggrevated llesions in large rabbit atherosclerotic arterines 2005

42. Bevan JA, Tayo FM, Rowan RA, Bevan RD. Presynaptic alpha-receptor control of adrenergic transmitter release in blood vessels. 1984

43. Karnovsky MJ, Roots L. A „Direct-coloring“ thiocholine method for cholinesterases. 1964 44. Amenta F, Cavallotti C, Ferrante F, Zomparelli M. The cholinergic innervation of the aorta.

1980

45. Angouras DC, Dosios TJ, Dimitriou CA, Chamogeorgakis TP, Rokkas CK, Manos TA, Sokolis DP. Surgical thoracic sympathectomy induces structural and biomechanical remodeling of the thoracic aorta in a porcine model. 2010

46. Zhipeng H, Zhiwei W, Lilei Y, Hao Z, Hongbing W, Zongli R, Hao C, Xiaoping H. Sympathetic hyperactivity and aortic sympathetic nerve sprouting in patients with thoracic aortic dissection. 2014

35 48. Downs ME, Lee SA, Yang G, Kim S, Wang Q, Konofagou EE. Non-invasive peripheral nerve