LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Aurelija Ajauskaitė
Yersinia spp. bakterijų paplitimas kiaulienos
produktuose
Prevalence of Yersinia spp. in pork products
Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: lekt., dr. Aleksandr Novoslavskij
2
DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Yersinia spp. bakterijų paplitimas kiaulienos
produktuose“:
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (INSTITUTE)
(aprobacijos data) (katedros (instito) vedėjo (-os)
vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) 2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 91.1. Yersinia spp. bakterijų savybės ... 9
1.2. Yersinia spp. bakterijų paplitimas ... 11
1.2.1. Bakterijų paplitimas aplinkoje ... 11
1.2.2. Bakterijų paplitimas maisto produktuose ... 12
1.3. Sergamumas jersinioze ... 14
1.3.1. Sergamumas jersinioze Europos Sąjungoje ir Lietuvoje ... 14
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 17
2.1. Tyrimo objektas ... 17
2.2. Mėginių paėmimas ... 17
2.3. Bakterijų kultūrų išskyrimas ... 18
2.4. Yersinia spp. bakterijų identifikavimas ... 18
2.4.1. DNR mišinio išskyrimas ... 18
2.4.2. Jersinijų identifikavimas polimerazės grandinine reakcija (PGR) ... 19
2.5. Statistinis duomenų apdorojimas ... 20
3. REZULTATAI ... 21
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 27
IŠVADOS ... 29
PADĖKA ... 30
4
SANTRAUKA
Yersinia spp. bakterijų paplitimas kiaulienos produktuose
Aurelija Ajauskaitė
Magistro baigiamasis darbas
Yersinia enterocolitica ir Yersinia pseudotuberculosis bakterijos yra Yersinia spp. atstovai
sukeliantis žmonių virškinamojo trakto susirgimą – jesiniozę. Lietuvoje kasmet nustatoma daugiau kaip 200 jersiniozės atvejų. Nepaisant stebimo susirgimo skaičiaus mažėjimo, sergamumo rodiklis 100 tūkst. gyventojų Lietuvoje išlieka vienas didžiausių visoje Europos Sąjungoje. Manoma, kad jersinijomis užkrėsti ir termiškai netinkamai apdoroti kiaulienos produktai yra vieni iš svarbiausių žmonių užsikrėtimo šaltinių. Svabu paminėti, kad šiuo metu trūksta informacijos apie žmonėms patogeninių jersinijų paplitimą kiaulienos produktuose mažmenynėje rinkoje Lietuvoje.
Tyrimo metu buvo surinkta 60 mėginių, iš kurių 30 buvo kiaulių liežuvių mėginiai ir 30 kiaulienos faršo mėginiai. Yersinia spp. išskyrimas ir identifikavimas buvo atliktas tiek klasikiniais tiek molekuliniais mikrobiologiniais tyrimo metodais. Bakterijų kultūros buvo išskirtos naudojant šaltajį mėginių pagausinimo metodą bei selektyvias jersinijų auginimo terpes. Atliekant šaltajį mėginių pagausinimo metodą mėginiai buvo laikomi 4ºC temperatūroje 2 savaites PMB tirpale. Po pagausinimo, prieš sėjant, tam kad sumažinti pašalinę mikroflorą buvo atliekamas mėginių šarminis apdorojimas, sėjimas ir kultivavimas ant CIN agaro. Jersinijos buvo identifikuojamos remiantis PGR reakcija pagal Thisted Lambertz ir Danielsson-Tham (2005) metodiką. Reakcijos metu buvo įvertinti rfb, ail, virF bei 16SrRNA genai.
Tyrimų rezultatai parodė, kad ištyrus 60 kiaulienos produktų mėginių 75 proc. atvejų buvo nustatytos Yersinia spp. bakterijos, tačiau iš jų 65 proc. atvejų buvo patvirtintas žmonėms nepavojingas Y. enterocolitica biotipas 1A. Patogeninės Y. enterocolitica O:3 serotipo bakterijos buvo aptiktos keturiuose iš 60 mėginių. Nustatėme, kad šios žmonėms susirgimus sukeliančios bakterijos buvo aptiktos trijuose (10 proc.) kiaulių liežuvių ir viename (3 proc.) kiaulienos faršo mėginiuose. Atlikus vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, kad Y. enterocolitica O:3 serotipo paplitimas kiaulienos produktuose neprikalusė nuo produkto rūšies (R2 =0.01786; p=0.3087).
Gauti tyrimo rezultatai patvirtina, kad jersinijomis užkrėsti kiaulienos produktai (kiaulių liežuviai ir kiaulienos faršas) yra vieni iš svarbausių žmonių užsikrėtimo šaltinių.
5
SUMMARY
Prevalence of Yersinia spp. in pork products Aurelija Ajauskaitė
Master‘s Thesis
Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis bacteria belong to genus Yersinia
and are causative agents of human yersiniosis. More then 200 cases of human yersiniosis are confirmed in Lithuania each year. Decrease in number of confirmed yersiniosis cases is observed during the last decade; however, the incidence rate per 10 000 population in Lithuania remains as one of the highest among European Union countries. Improperly heat-treated pork products have been described as important sources of human infection. However, there is lack of information about the prevalence of pathogenic Yersinia in pork products in retail markets in Lithuania.
A total of 60 samples (30 pig tongues samples and 30 minced pork samples) were collected and tested for prevalence of Yersinia spp. Traditional and molecular microbiology methods were used in this study. Bacteria isolation was performed with cold enrichment method and Yersinia selective growth media. Samples were stored at 4ºC temperature in PMB broth for two weeks during cold enrichment procedure. The alkali treatment of all samples (reduction of background microflora) was performed before the inoculation on CIN agar. Yersinia spp. was confirmed by PCR method described by Thisted Lambertz ir Danielsson-Tham (2005) and rfb, ail, virF and
16SrRNA genes were evaluated during PCR reaction.
The study revealed that Yersinia spp. was found in 75% of tested samples. In total 65% of isoaled bacteria starns were comfirmed as human non–pathogenic Y. enterocolitica biotype 1A. Meanwhile, four out of the 60 tested samples were confirmed as positive for human pathogenic Y.
enterocolitica serotype O:3. We found that human pathogenic yersinia were isolated from three pig
tongues samples (10%) and from one minced pork meat sample (3%). One–way anova analysis showed that prevalence of Y. enterocolitica serotype O:3 in pork products does not depend on product type (R2 =0.01786; p=0.3087).
Research results revealed that Yersinia contaminated pork products (pig tongues and minced pork meat) might be one of the infection sources for humans in Lithuania.
6
SANTRUMPOS
ES – Europos Sąjunga
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos ULAC – Užkrečiamų ligų ir AIDS centras DNR – deoksiribonukleino rūgštis
CIN – cefsulodin-irgasan-novobiocin agaras BHA – smegenų širdies agaras
BHI – smegenų širdies buljonas
PGR – polimerazės grandininė reakcija PMB – fosfato buferinis druskos tirpalas KOH – kalio šarmas
7
ĮVADAS
Žmonėms susirgimus sukeliantys Yersinia genties atstovai yra Yersinia pestis (etiologinis maro sukėlėjas), Yersinia pseudotuberculosis ir Yersinia enterocolitica (žmonių jersiniozė) (1). Rizika susirgti jersinioze priklauso nuo užkrato dozės, sukėlėjų patogeniškumo, žmogaus amžiaus ir organizmo atsparumo (2).
Y. enterocolitica yra plačiai paplitusi gamtoje. Bakterija gali būti randama kiaulėse,
naminiuose paukščiuose, karvėse, avyse. Dauguma atliktų tyrimų parodė, jog pagrindinis jersinijų rezervuaras yra kiaulės (3). Naujagimiai paršeliai lengvai užkrečiami jersinijomis ir tampa šių bakterijų nešiotojais. Nustatyta, kad 12–14 savaičių kiaulės išskiria šiuos patogenus su išmatomis (4). Daugiausiai jersinijų randama kiaulių liežuviuose, ypač tonzilėse, taip pat limfmazgiuose, virškinamajame trakte ir išmatose (5).
Manoma, kad termiškai netinkamai apdorota kiauliena yra pagrindinis žmonių užsikrėtimo jersinijomi šaltinis (3). Susirgimo protrūkio metu Belgijoje ir Norvegijoje nustatyta, jog kiaulienos vartojimas yra rizikos faktorius užsikrėsti šiomis bakterijomis (6). Kiauliena dažniausiai užkrečiama skerdimo metu nuo virškinamojo trako bei tonzilių. Nesilaikant geros gamybos praktikos, kiaulienos produktai, gali būti užkrečiami kryžminės taršos metu (7).
Daugelyje pasaulio šalių kiaulienos produktuose labiausiai paplitęs yra Y. enterocolitica O:3 serotipas, tuo tarpu Y. enterocolitica serotipai O:5,27 ir O:9 yra rečiau aptinkami. Y.
pseudotuberculosis ženkliai rečiau randama kiaulienos produktuose negu Y. enterocolitica, o
labiausiai paplitę yra O:3, O:2c, O:4b serotipai (8).
Nors 2008–2014 metais Europos gyventojų sergamumas jersinioze turėjo tendenciją mažėti, 2014 metais jersiniozė buvo trečia dažniausiai registruota zoonozė Europos sąjungoje. Iš viso 2014 metais buvo užregistruoti 6625 jersiniozės atvejai. Dažniausiai susirgimo metu buvo nustatomos Y.
enterocolitica bakterijos t.y. 97,7 proc. visų užregistruotų atvejų Europoje. Susirgimo metu
serotipas O:3 buvo nustatomas 83,2 proc., serotipas O:9–14,0 proc. atvejų, o serotipas O:5,27–1,7 proc. atvejų (9).
Remiantis Lietuvos užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro duomenimis, lyginant 2013 m. su 2014 m. laikotarpiu, sergamumas jersinioze sumažėjo (34,47 proc.), tačiau jersiniozė Lietuvoje yra vis dar aktuali visuomenės sveikatos problema. Kasmet mūsų šalyje nustatoma virš 200 jersiniozės susirgimo atvejų, o sergamumo rodiklis 100 tūkst. gyventojų išlieka vienas didžiausių visoje Europos Sąjungoje (9).
8
rinkoje, todėl mūsų darbo tikslas buvo nustatyti Yersinia spp. bakterijų paplitimą kiaulienos produktuose. Tikslui pasiekti buvo iškelti atitinkami darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Yersinia spp. bakterijų paplitimą kiaulienos produktuose klasikiniais mikrobiologiniais metodais
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Yersinia spp. bakterijų savybės
Yersinia spp. bakterijos pradėtos tirti nuo XIX amžiaus septintojo dešimtmečio vidurio.
Intensyvesnis mokslininkų susidomėjimas šiomis bakterijomis yra siejamas su Y. enterocolitica sukeltais žmonių jersiniozės protrūkiais Europoje, JAV ir Japonijoje (4).
Yersinia gentis priklauso Enterobacteriaceae bakterijų šeimai ir šią gentį sudaro mažiausiai
16 bakterijų rūšių (10, 11). Žmonėms susirgimus sukeliantys Yersinia genties atstovai yra Y. pestis (etiologinis maro sukėlėjas), Y. pseudotuberculosis ir Y. enterocolitica bakterijos (žmonių jersiniozės sukelėjai) (1, 12).
Y. enterocolitica yra žmonių patogenas, kuris plačiai paplitęs gamtoje. Tai mažos (0,5–0,8 μm
pločio ir 1–3 μm ilgio), sporų ir kapsulių neformuojančios bakterijos (13). Skirtingai nei daugelis patogenų Y. enterocolitica geba daugintis aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygomis. Nors optimali augimo temperatūra yra 28–29ºC, bakterijos geba daugintis ir žemoje, t.y. 4ºC temperatūroje (14).
Y. enterocolitica bakterijos neišgyvena terminio apdorojimo metu (bakterija inaktyvuojama apie
60ºC temperatūroje termiškai apdorojant maisto produktus 1–3 minutes) (1). Y. enterocolitica
nefermentuoja melibiozės, rafinozės. Bakterijos gamina indolą bei rūgštį iš ksilozės ir trehalozės (1 lentelė) (13, 15).
1 lentelė. Y. enterocolitica ir Y. pseudotuberculosis biocheminės savybės (15).
Y. enterocolitica Y. pseudotuberculosis Biotipas 1A 1B 2 3 4 5 1 2 3 4 Melibiozė - - - - - - + - - + Citratas - - - - - - - - + - Rafinozė - - - - - - - - - + Pyrazinamidasė + - - - - - - - - - Eskulinas + - - - - - + + + + Indolas + + + - - - - - - - Ksilozė + + + + - - + + + + Trehalozė + + + + + - + + + +
Y. enterocolitica gali būti išskirta į 6 biotipus (1A, 1B, 2, 3, 4, ir 5) (1 lentelė) ir apie 60
10
infekcijomis. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad skirtingi Y. enterocolitica serotipai dominuoja skirtingose geografinėse zonose: JAV paplitęs O:8 ir O:3 serotipai, Europoje jersiniozę dažniausiai sukelia serotipai O:3 ir O:9, O:5,27 (16, 17, 19).
Kitas žmonių jersiniozės sukelėjas Y. pseudotuberculosis yra gram neigiama, laktozės nefermentuojanti bakterija (14). Y. pseudotuberculosis gali būti suskirstyta į 4 biotipus (1–4) (1 lentelė) ir 15 serotipų (O:1–O:15) ir į 10 potipių (O:1a–O:1c; O:2a–O2c; O:4a–O:4b; O:5a–O5b). Nustatyta, kad Europoje labiausiai paplitę O:1–O:3 serotipai, tuo tarpu Azijoje dažnai nustatomi Y.
pseudotuberculosis O:4–O:15 serotipai (15, 18, 20).
Y. enterocolitica ir Y. pseudotuberculosis patogeniškumas priklauso nuo Yersinia
virulentiškos plazmidės (pYV), kuri koduoja Yersinia adhesiną A (YadA), kuris tarpininkauja rišant bakteriją su ląstelės-šeimininkės membrana ir lėtina įsiveržimo greitį į ląsteles. Y. enterocolitica biotipas 1B ir Y. pseudotuberculosis serotipai O:1 ir O:3 papildomai turi didelio patogeniškumo salą (HPI), kuri apibrėžiama kaip kompleksas veiksnių nulemenčių bakteirjos virulentiškumą (2 lentelė) (21, 22).
2 lentelė. Y. enterocolitica ir Y. pseudotuberculosis paplitimas ir patogeniškumas (17).
Rūšis Biotipas Serotipas Virulentiškumas Paplitimas
Europoje
pYV HPI
Y. e.
4 O:3 P ++++a Taip Ne
2 O:9; O:5,27 P ++ iki +++ Taip Ne
3 O:3; O:5,27 P + Taip Ne
1B O:8; O:21; O:13; O:7 ir kiti LP ≈0 Taip Taip
5 O:3; O:2,3; O:1,2,3 P ≈0 Taip Ne
1A O:8; O:5; O:7, O:13 ir kiti NP ++++ Ne Ne
Y. p.
NT I LB ++ iki +++ Taip Taip
NT III P arba LP ++ Taip Taip
NT II, IV, V ir kiti P + Taip Ne
Y.e. – Yersinia enterocolitica; Y. p. – Yersinia pseudotuberculosis
NT – netaikomas
LP – labai patogeniškas; P – patogeniškas; NP – nepatogeniškas a: paplitimo laipsnis
11
1.2. Yersinia spp. bakterijų paplitimas
1.2.1. Bakterijų paplitimas aplinkoje
Jersinijos yra plačiai paplitusios gamtoje. Bakterijos gali būti randamos kiaulėse, naminiuose paukščiuose, karvėse, avyse (3, 23). Jersinijos buvo išskirtos iš apie 60 rūšių žinduolių ir apie 27 rūšių paukščių išmatų (2). Moksliniais tyrimais nustatyta, kad Y. enterocolitica Kinijoje buvo labiausiai paplitusi tarp kiaulių (12,91 proc.), šunų (9,80 proc.), vištų (4,50 proc.), graužikų (3,40 proc.), galvijų (2,78 proc.) ir avių (0,89 proc.). Žmonėms patogeninės bakterijų padermės daugiausiai buvo išskirtos iš kiaulių (73,50 proc.) ir šunų (59,44 proc.) (16).
Pagrindiniai žmonėms patogeninių jersinijų paltintojai ir nešiotojai yra kiaulės ir graužikai (24, 25). Naujagimiai paršeliai lengvai užkrečiami jersinijomis ir tampa šių bakterijų nešiotojais. Nustatyta, kad 12–14 savaičių kiaulės išskiria šiuos patogenus su išmatomis (4). Keli užsikrėtę paršeliai gali paskleisti patogeną po visą kiaulių bandą (26). Daugiausiai jersinijų randama kiaulių liežuviuose, ypač tonzilėse, taip pat limfmazgiuose, virškinamajame trakte ir išmatose (3 lentelė) (5, 21, 27). Kiaulės nešioja didelį kiekį Y. enterocolitica bakterijų tonzilėse keletą mėnesių, tačiau išmatose šio patogeno paplitimas greitai sumažėja. Todėl kiaulių išmatos yra mažiau užterstos jersinijomis negu tonzilės (8). Eksperimentinio tyrimo metu naujagimiai paršeliai buvo užkrėsti Y.
enterocolitica O:3 serotipu. Jersinijų skaičius išmatose pradėjo mažėti arba visai išnyko po 30-70
dienų nuo pradinio užkrėtimo (28).
3 lentelė. Patogeninių Y. enterocolitica paplitimas kiaulių ūkiuose (21).
Šalis Mėginio tipas Mėginių skaičius Teigiamų mėginių skaičius (%)
Belgija Tonzilės 10 8 (80)
Danija Tonzilės 99 81 (82)
Suomija Tonzilės 48 34 (71)
Didžioji Britanija Tonzilės 45 31 (69)
Kanada Išmatos 31 15 (48)
Vokietija Išmatos 30 13 (43)
JAV Išmatos 47 17 (36)
12
pseudotuberculosis buvo aptiktos tik viename mėginyje (29). Graužikų užkrėstumas jersinijomis
buvo įvertintas ir Japonijoje: tyrimo metu iš graužikų buvo išskirti Y. enterocolitica O:3, O:8 ir O:9 serotipai (15).
Kitas galimas žmonių užsikrėtimo šaltinis yra šunys ir katės. Šie naminiai augintiniai gali būti jersinijų nešiotojais jei buvo šeriami jersinijomis užkrėsta mėsa arba kontaktuojant su kitais užkrėstais gyvūnais per seiles ar išmatas. Didžiausią riziką užsikrėsti jersinijomis po bendravimo su augintiniais turi vaikai ir žmonės, kurie nesilaiko tinkamų higienos sąlygų (7, 30, 31).
1.2.2. Bakterijų paplitimas maisto produktuose
Dauguma atliktų tyrimų parodė, kad pagrindinis jersinijų rezervuaras yra kiaulės. Todėl manoma, kad šviežia kiauliena yra pagrindinis jersinijų šaltinis (3, 32). Išsamios rizikos analizės Belgijoje ir Norvegijoje metu nustatyta, kad kiaulienos vartojimas yra svarbus rizikos faktorius žmonėms užsikrėsti jersinijomis (6).
Dėl didelio Yersinia spp. bakterijų paplitimo kiaulių tonzilėse bei išmatose, kiaulių skerdenos taip pat gali būti užterštos jersinijomis. Skerdenos užkrėtimas dažniausiai įvyksta nesilaikant skerdimo technologijos reikalavimų kuomet įvyksta kryžminė tarša tarp skedenos ir tonzilių, kiaulių išmatų bei virškinamojo trakto turinio. Nustatyta, kad kiaulės galva ir krūtinės sritis yra dažniau užkrečiama Y. enterocolitica bakterijomis nei oda ar pilvo ir dubens ertmė. Manoma, kad tonzilės yra labiau tikėtinas šaltinis užkėsti skerdeną nei virškinamasis traktas (8, 33).
Maišelių dėjimas aplink kiaulių tiesiąją žarną bei galvos pašalinimas gali sumažinti skerdenų užkrėtimą jersinijomis (34). Nustatyta, kad skerdenos užkrėtimo rizika Y. enterocolitica bakterijomis nuo tiesiosios žarnos turinio taikant maišelius sumažėja nuo 26 proc. iki 19 proc. Atlikti moksliniai tyrimai parodė, jog Norvegijoje skerdenos užkrėtimas jersinijomis, taikant šią procedūrą, sumažėjo nuo 8 proc. iki 2 proc., o Švedijoje nuo 7 proc. iki 2 proc. Kiaulių galvos pašalinimas su liežuviu ir tonzilėmis gali sumažinti skerdenų užkrėtimą Y. enterocolitica O:3 serotipu iki 40 proc. Mėsos tikrinimo procedūros tokios kaip limfmazgių pjovimas taip pat gali užkrėsti skerdenas Y. enterocolitica bakterijomis, kadangi šios bakterijos kolonizuojasi limfiniame audinyje (21).
13
Mažmeninėje prekyboje Y. enterocolitica bakterijos gali būti randamos parduotuvėse ant stalo, įrankių ar darbo pirštinių paviršių. Nesilaikant geros gamybos praktikos, kiaulienos produktai, gali būti užkrečiami kryžminės taršos metu. Y. pseudotuberculosis rečiau randama kiaulienos produktuose negu Y. enterocolitica bakterijos (8).
Patogeniškų Yersinia serotipų pasiskirstymas kiaulienoje ir kiaulienos produktuose yra panašus kaip ir bakterijose nustatomose iš kiaulių mėginių iš ūkių ar skerdyklų. Daugelyje pasaulio šalių labiausiai paplitęs yra Y. enterocolitica O:3 serotipas, tuo tarpu, Y. enterocolitica serotipai O:5,27 ir O:9 yra rečiau aptinkami. Svarbu paminėti, kad nepatogeniškas Y. enterocolitica A1 biotipas taip pat dažnai aptinkamas kiaulienos produktuose (35). Kalbant apie Y. pseudotuberculosis bakterijas, nustatyta, kad labiausiai kiaulienos produktuose paplitę serotipai yra O:3, O:2c, O:4b (8, 36).
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad Y. enterocolitica nustatymas kiaulienos produktuose priklauso nuo aptikimo metodo. Tikslesni rezultatai gaunami atliekant polimerazės grandininę reakciją (PGR) negu mėginius tiriant su klasikiniais mikrobiologiniais metodais. Taip pat įtakos gali turėti ir pats kiaulienos produktas. Kiaulių liežuviuose jersinijų paplitimas būna didesnis nei kiaulienos farše (8). Atlikti tyrimai Bavarijoje (Vokietija) parodė, kad Y. enterocolitica serotipas O:3 mažmeninės prekybos kiaulienoje buvo aptiktas 1 proc. kiaulienos faršo ir 26 proc. kiaulių liežuvių mėginiuose (49). Belgijoje Y. enterocolitica bioserotipo 4/O:3 daugiausiai rasta maltoje kiaulienoje ir kiaulių liežuviuose (15). Malaizijoje Y. enterocolitica paplitimas siekė 2 proc. maltoje kiaulienoje (7), tuo tarpu Kinijoje mažmeninės prekybos kiaulienos produktuose – 8,9 proc. (3).
Jersinijos gali būti aptinkamos taip pat piene bei jo produktuose. Bakterijos dažnai aptinkamos žaliame piene, nes tradicinis pieno pasterizavimas inaktyvuoja jersinijas. Po pasterizavimo bakterijos gali patekti į pieną kryžminės taršos metu. Y. enterocolitica dauginimasis piene priklauso nuo laikymo temperatūros. Patogeninės jersinijos piene kelia didelį pavojų visuomenės sveikatai, kadangi jos gali daugintis atšaldytame arba vakuuminiu būdu supakuotame piene (38).
14
Yersinia spp. gali būti randama ir naminiuose paukščiuose avyse, žuvyse ir kituose
gyvūnouse. Ispanijoje atlikto tyrimo buvo įvertintas Yersinia spp. paplitimas vištų skerdenose. Tyrimų rezultatai parodė, jog 52 mėginiai buvo patvirtinti kaip Yersinia spp. teigiami. Dažniausiai t.y. 45 mėginiuose buvo aptiktas žmonėms nepatogeniškas Y. enterocolitica 1A biotipas (42). Taip pat Y. enterocolitica buvo rasta avyse Švedijoje. Tačiau visos Y. enterocolitica bakterijos priklausė 1A biotipui (43).
1.3. Sergamumas jersinioze
Y. enterocolitica ir Y. pseudotuberculosis sukelia žarnyno infekcinę ligą – jersinijozę. Y. enterocolitica bakterijų sukeltas susirgimas žmonėms dažniausiai pasireiškia diarėja ir pilvo
skausmais, rečiau pasireiškia pykinimas ir vėmimas, kartais stebimi simptomai panašius į apendicitą (13). Dažniausiai jersinioze serga maži vaikai ir vyresni asmenys bei žmonės, kurių organizmo atsparumas sumažėjęs. Inkubacinis laikotarpis gali trukti nuo 3 iki 19 dienų (vidutiniškai 5 – 7 dienos) (2).
Y. pseudotuberculosis Europoje dažniau siejama su gastroenteritu, kurio simptomai yra
panašūs į apendicitą, o rytų vastybėse ši infekcija dažniau sukelia bėrimus ir artritą (13).
1.3.1. Sergamumas jersinioze Europos Sąjungoje ir Lietuvoje
Nors 2008-2014 metais Europos gyventojų sergamumas jersinioze turėjo tendenciją mažėti, tačiau 2014 metais jersiniozė buvo trečia dažniausiai registruota zoonozė Europoje. Iš viso 2014 metais buvo užregistruoti 6625 atvejai (4 lentelė). Daugiausiai užregistruotų atvejų buvo Suomijoje ir Danijoje (1,62 ir 7,71 patvirtinti atvejai 100000 gyventojų). Sezoniškumo nepastebėta, tačiau daugiausiai užregistruotų susirgimo atvejų buvo gegužės–rugsėjo mėnenesiais.
15 4 lentelė. Jersiniozės atvejų skaičius 2010–2014 metais ES šalyse (9).
Šalies pavadinimas 2014 metai 2013 metai 2012 metai 2011 metai 2010 metai Atvejų skaičius Patvirtintų atvejų skaičius Patvirtintų atvejų skaičius 100000 gyventojų
Patvirtintų atvejų skaičius
Austrija 107 107 1,26 158 130 119 84 Belgija 309 309 - 350 256 214 216 Bulgarija 20 20 0,28 22 11 4 5 Kroatija 20 20 0,47 - - - - Kipras 0 0 0,00 1 0 0 0 Čekijos Respublika 557 557 5,30 526 611 460 447 Danija 434 434 7,71 345 291 225 193 Estija 62 62 4,71 72 47 69 58 Suomija 579 579 10,62 549 565 554 522 Prancūzija 574 574 - 430 314 294 238 Vokietija 2485 2470 3,06 2579 2690 3381 3346 Graikija - - - - Vengrija 43 43 0,44 62 53 93 87 Airija 5 5 0,11 4 2 6 3 Italija 18 18 - 25 14 15 15 Latvija 28 28 1,40 25 28 28 23 Lietuva 197 197 6,69 262 279 370 428 Liuksemburgas 19 19 3,46 15 - - - Malta 0 0 0,00 0 0 0 1 Olandija - - - - Lenkija 215 215 0,57 199 201 235 205 Portugalija - - - - Rumunija 32 32 0,16 43 26 47 27 Slovakija 172 172 3,18 164 181 166 166 Slovėnija 19 19 0,92 26 22 16 16 Ispanija 436 436 3,13 243 221 264 325 Švedija 248 248 2,57 313 303 350 281 Jungtinė Karalystė 61 61 0,10 59 54 59 55 Iš viso: 6640 6625 1,92 6479 6339 6969 6741
Sergamumo jersinioze tendencijos Lietuvoje ir Europos Sąjungoje 2008–2014 metais buvo panašios. Remiantis Užkrečiamų ligų ir aids centro (ULAC) duomenimis, lyginant 2014 m. su 2013 m. laikotarpį, sergamumas jersinioze sumažėjo 34,47 proc., tačiau jersiniozė Lietuvoje yra vis dar aktuali visuomenės sveikatos problema (44).
16
dažniau nei kaimo gyventojai. Sergamumo rodiklių santykis tarp miesto ir kaimo buvo 1,4:1,0. Vyrų ir moterų sergamumo rodikliai buvo vienodi. Rodiklių santykis buvo 1,0:1,0 (44).
Nustatyta, kad žmonės jersinioze sirgo visose amžiaus grupėse. Dažniausiai susirgimų buvo registruota iki 6 metų amžiaus grupėje. Registruotų susirgimų skaičius suaugusių žmonių grupėje pagal amžiaus grupes reikšmingai nesiskyrė (44).
17
2.
TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimams buvo renkami kiaulių liežuvių ir kiaulienos faršo mėginiai. Mikrobiologiniai mėginių tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos Akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedros Mikrobiologijos laboratorijoje. Tyrimo planas buvo suskirstytas į trys etapus: mėginių surinkimas, Yersinia spp. išskirymas ir identifikavimas klasikiniais mikrobiologijos metodais ir Yersinia spp. identifikavimas molekulinės mikrobiologijos metodais (1 pav.).
1 pav. Tyrimo schema
2.2. Mėginių paėmimas
Mėginiai tyrimams buvo surinkti 2015 metų spalio–gruodžio mėnesiais iš įvairių prekybos vietų Kauno mieste ir Kauno rajone: prekybos centrai, turgavietės. Iš viso buvo surinkta 60 mėginių, iš kurių 30 buvo kiaulių liežuvių mėginiai ir 30 kiaulienos faršo mėginiai (1 pav.). Paimti mėginiai buvo gabenami 4ºC temperatūroje ir tą pačią dieną buvo pristatyti į Maisto saugos ir kokybės katedros Mikrobiologijos laboratoriją.
1. Mėginių surinkimas
(30 kiaulių liežuvių mėginiai ir 30 kiaulienos faršo mėginiai)
2. Yersinia spp. išskyrimas ir identifikavimas klasikiniais mikrobiologiniais metodais (šaltas mėginių pagausinimas, šarminis apdorojimas, sėjimas ir kultivavimas ant CIN agaro)
18
2.3. Bakterijų kultūrų išskyrimas
Yersinia spp. išskyrimas ir identifikavimas mikrobiologiniais tyrimo metodais buvo atliktas
naudojant šaltajį mėginių pagausinimo metodą bei selektyvias jersinijų išskyrimo terpes. Atliekant šaltajį mėginių pagausinimo metodą mėginiai buvo laikomi 4ºC temperatūroje 2 savaites PMB (Fosfato buferinis druskos tirpalas su 1 proc. manitolio ir 0,15 proc. tulžies druskos koncentracija) tirpale.
Po pagausinimo, prieš sėjant, tam kad sumažinti pašalinę mikroflorą buvo atliekamas mėginių šarminis apdorojimas su 0,25 proc. kalio šarmo (KOH) tirpalu (0,5 ml mėginio +4,5 ml KOH). Ant cefsulodin-irgasan-novobiocin (CIN) agaro (Yersinia selective agar base, Liofilchem, Via Scozia, Italija) buvo sėjama po 0,1 ml pagausinto apdoroto mėginio. Užsėtos Petri lėkštelės buvo inkubuojamos 30ºC temperatūroje 24 val. Tipinės bakterijų kolonijos (remmiantis ISO 10273:2003 standartu - ryškus raudonas centras, apsuptas beveik permatoma išorine zona bei apie 1 mm skersmens dydžio) buvo persėjamos į BHA (Smegenų širdies agaras) (Brain heart agar, Liofilchem, Via Scozia,Italija) agarą ir inkubuojamos 24 val. 28ºC temperatūroje.
Po kultivavimo, bakterijų kultūra nuo BHA agaro buvo perkeliama su 10 µl kilpele į šaldymo mėgintuvėlius su 1 ml BHI sultinio (Brain heart infusion broth, Liofilchem, Via Scozia, Italija) su 30 proc. glicerolio koncentracija. Bakterijų kultūros buvo laikomos minus 80ºC temperatūroje.
2.4. Yersinia spp. bakterijų identifikavimas
2.4.1. DNR mišinio išskyrimas
19
2.4.2. Jersinijų identifikavimas polimerazės grandinine reakcija (PGR)
Jersinijos buvo identifikuojamos remiantis PGR reakcija pagal Thisted Lambertz ir Danielsson-Tham (2005) metodiką. Reakcijos metu buvo įvertinti rfb, ail, virF bei 16SrRNA genai (5 lentelė).
5 lentelė. Pradmenys, panaudoti Yersinia spp. identifikavimui
Pradmuo Pradmenų sekos Fragmento dydis (bp)
11A-virF AAG GTT GTT GAG CAT TCA CAA GAT GG
700
12A-virF TTT GAG TGA AAT AAG ACT GAC TCG AGA
ACC
9A-ail TTA TCA ATT GCG TCT GTT AAT GTG TA
454
10A-ail ATC GAG TTT GGA GTA TTC ATA TGA AG
rfbCa CGC ATC TGG GAC ACT AAT TCG
405
rfbCb CCA CGA ATT CCA TCA AAA CCA CC
YeI-16SrRNA ATA CCG CAT AAC GTC TTC G 328
YeII-16SrRNA TTC TTC TGC GAG TAA CGT C
Remiantis atliktos reakcijos rezultatais galima įvertinti ar pasirinkta bakterijų kolonija priklauso Y. enterocolitica seoripui O:3, Y. enterocolitica serotipui kitam negu O:3 (t.y. O:8, O:9, O:5,27), arba Y enterocolitica biotipui 1A (6 lentelė).
6 lentelė. PGR reakcijos metu nustatomi Y. enterocolitica genai
Genas Y. enterocolitica O:3 Y. enterocolitica kitas serotipas negu
O:3 (O:8, O:9, O:5,27)
Y. enterocolitica 1A
virF + + -
ail + + -
rfb + - -
16SrRNA + + +
20
termociklerį (Veriti 96 Weel Thermal Cycler, Jungtinės Amerikos Valstijos) nustačius 30 ciklų programą, kurios sąlygos buvo:
94°C – 3 minutės; 94°C – 30 sekundžių; 55°C – 60 sekundžių; 72°C – 60 sekundžių; 72°C – 5 minutės.
PGR produktai buvo analizuojami elektroforezės gelyje pagalba. Gelis buvo gaminamas iš 1,43 g agarozės miltelių ir 110 ml 1xTAE (Tris-acetate-EDTA) (Thermofisher Scientific, Lietuva) buferio. Mišinys buvo kaitinamas mikrobangų krosnelėje apie 3 min., kas 30 s išimant ir pamaišant, po to atvėsinamas ir į jį įpilama 6,5µl etidium bromido tirpalo. Gelis buvo pamaišomas, supilamas į paruoštą geliui vonelę su šukomis ir 20-30 min. paliekams sustingti. Po sustingimo nuimamos šukos, gelis nardinamas elektoforezės vonelėje į TAE buferį, kad jis būtų apsemtas. Po to 10 µl kiekvieno PGR produkto įleižiama į agarozės gelio šulinėlius. Į pirmąjį ir paskutinį gelio šulinėlius patalpinamas 10 µl molekulnis markeris The GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder (Thermofisher Scientific, Lietuva). Elektroforezė buvo vykdoma apie 50 min. Po elektroforezės reakcijos, gelis analizuojamas naudojant gelių dokumentavimo kompiuterinę programą.
2.5. Statistinis duomenų apdorojimas
21
3. REZULTATAI
Klasikiniais mikrobiologijos metodais buvo įvertintas Yersinia spp. bakterijų paplitimas kiaulių liežuvių ir kiaulienos faršo mėginiuose. Iš viso buvo tirta 60 mėginių, iš kurių 30 kiaulienos faršo ir 30 kiaulių liežuvių mėginiai. Tipinės bakterijų kolonijos (remiantis ISO 10273:2003 standartu) buvo ištirtos PGR metodu.
Reakcijos metu Y. enterocolitica O:3 serotipą nustatėme pagal tai, kad turėjo ail, virF, rfb ir
16SrRNA genus (2 pav.). Kitam Y. enterocolitica serotipui negu O:3 (t.y. O:8, O:9, O:5,27)
priskyrėme tas bakterijų padermes, kurios neturėjo rfb geno. Y. enterocolitica A1 biotipui priskyrėme tas bakterijų padermes, kurios neturėjo ail, virF ir rfb genų ir kuriuose buvo nustatytas tik 16SrRNA genas (2 pav.). PGR tyrimo rezultatai pateikti 3 ir 4 paveiksluose.
2 pav. Y. enterocolitica genai aptinkami PGR metodu
1 – molekulinis markeris (100-3000 bp), 2 – neigiama kontrolė, tipinė Y. enterocolitica bakterija išskirta iš kiaulių liežuvio mėgino, 4 – teigiama kontrolė Y. enterocolitica O:3 (DSM 13030)
virF (700 bp) ail (454 bp) rfb (405 bp) 16SrRNA (328 bp)
22
3 pav. Yersinia spp. bakterijų išskirtų iš kiaulių liežuvių identifikavimas PGR metodu
Šulinėliai 1, 9, 18, 19, 29, 38 – molekulinis markeris (100-3000 bp); šulinėliai 2, 4, 8, 10, 12, 15, 16, 24, 25, 26, 27, 18, 30, 31, 32, 34, 35, 36 – Y. enterocolitica A1; šulinėliai 6, 22, 33 – Y.
enterocolitica O:3; šulinėliai 17, 37 – neigiama kontrolė
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
23 4 pav. Yersinia spp. bakterijų išskirtų iš kiaulienos faršo identifikavimas PGR metodu
Šulinėliai 1, 11, 18, 28, 37 – molekulinis markeris (100-3000 bp); šulinėlis 2 – Y. enterocolitica O:3; šulinėliai 3, 4, 5, 7, 9, 12, 13, 14, 16, 19, 20, 23, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35 – Y.
enterocolitica biotipas A1; šulinėliai 6, 8 – Y. enterocolitica serotipas kitas negu O:3 (O:8; O:9,
O:5,27); šulinėliai 17, 36 – neigiama kontrolė.
Rezultatai parodė, kad ištyrus 60 kiaulienos produktų mėginių Yersinia spp. bakterijos buvo nustatytos 45 mėginiuose. Iš jų 39 mėginiuose nustatytos bakterijos buvo priskirtos nepatogeniniam
Y. enterocolitica 1A biotipui, keturiuose mėginiuose buvo nustatytos bakterijos, kurios priskirtos Y. enterocolitica O:3 serotipui ir dviejuose mėginiuose bakterijos, kurios buvo priskirtos Y. enterocolitica serotipui kitam negu O:3 (t.y. O:8, O:9, O:5,27) (5 pav.).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
24 5 pav. Yersinia spp. bakterijų paplitimas (proc.) kiaulienos produktuose
Įvertinus jersinijų paplitimą pagal atskiras produktų grupes nustatėme, kad iš 30 kiaulių liežuvių mėginių 18 mėginiuose nustatytos bakterijos buvo priskirtos nepatogeniniam Y.
enterocolitica 1A biotipui, trijuose mėginiuose buvo nustatytos bakterijos, kurios priskirtos Y. enterocolitica O:3 serotipui. Y. enterocolitica serotipas kitas negu O:3 (t.y. O:8, O:9, O:5,27)
nebuvo nustatytas kiaulių liežuvių mėginiuose (6 pav.)
6 pav. Yersinia spp. bakterijų paplitimas (proc.) kiaulių liežuviuose
65% 6,7% 3,3% Y. enterocolitica 1A Y. enterocolitica O:3
Kitas Y. enterocolitica serotipas negu O:3 (t.y. O:8, O:9, O:5,27)
60 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70
Y. enterocolitica A1 Y. enterocolitica O:3 Kitas Y. enterocolitica serotipas nei O:3
25
Tiriant kiaulienos faršą nustatėme, kad iš 30 kiaulienos faršo mėginių 21 mėginyje nustatytos bakterijos buvo priskirtos nepatogeniniam Y. enterocolitica 1A biotipui, viename mėginyje buvo nustatytos bakterijos, kurios priskirtos Y. enterocolitica O:3 serotipui ir dviejuose mėginiuose bakterijos, kurios buvo priskirtos Y. enterocolitica serotipui kitam negu O:3 (t.y. O:8, O:9, O:5,27) (7 pav.).
7 pav. Yersinia spp. bakterijų paplitimas (proc.) kiaulienos farše
Lyginant mėginius iš skirtingų prekybos vietų nustatyta, kad daugiau užkrėstų mėginių
Yersinia spp. bakterijomis kiaulių liežuviuose buvo nustatyta turgavietėje. Prekybos centruose
jersinijomis buvo užkrėsti 9 mėginiai, o turgavietėse 12 mėginių (8 pav.).
8 pav. Yersinia spp. bakterijų paplitimas (proc.) kiaulių liežuviuose surinktose skirtingose prekybos vietose 70 3 6.7 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Y. enterocolitica A1 Y. enterocolitica O:3 Kitas Y. enterocolitica serotipas nei O:3
Pr o ce n tai ( %) Kiaulienos faršas 30 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Prekybos centrai Turgavietės
26
Tyrimų rezultatai parodė, kad daugiau užkrėstų mėginių Yersinia spp. bakterijomis kiaulienos farše buvo nustatyta turgavietėje. Prekybos centruose jersinijomis buvo užkrėsti 9 mėginiai, o turgavietėse 15 mėginių (9 pav.).
9 pav. Yersinia spp. bakterijų paplitimas (proc.) kiaulienos farše surinktame skirtingose prekybos vietose
Tyrimo metu buvo atliktas duomenų statistinis apdorojimas siekaint įvertinti ar yra statistišką patikimi skirtumai tarp bakterijų papltimo ir jų išskirimo šaltino. Atlikus vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, kad Y. enterocolitica O:3 serotipo paplitimas kiaulienos produktuose neprikalusė nuo produkto rūšies (R2 =0.01786; p=0.3087).
30 50 0 10 20 30 40 50 60
Prekybos centrai Turgavietės
27
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Dauguma atliktų tyrimų parodė, jog pagrindinis jersinijų rezervuaras yra kiaulės. Todėl manoma, kad šviežia kiauliena yra pagrindinis jersinijų šaltinis (3). Atsižvelgiant į jersinijų savybes, t.y. gebėjimas išgyventi ir netgi daugintis žemoje temperatūroje, šiomis bakterijomis užkrėstos kiaulių skerdenos yra tarsi “vartai” tolimesniam bakterijų plitimui maisto grandinėje (45). Tyrimų rezultatai parodė, kad ištyrus 60 mėginių Yersinia spp. bakterijų paplitimas kiaulienos produktuose siekė 75 proc. tačiau iš jų 65 proc. atvejų buvo patvirtintas žmonėms nepavojingas Y.
enterocolitica 1A biotipas. Didelis nepatogeninių Yersinia spp. bakterijų paplitimas kiaulienos
produktuose gali būti dėl didelio šių bakterijų paplitimo aplinkoje. Y. enterocolitica 1A gali būti randama skerdyklos aplinkoje, perdirbimo įmonių ir parduotuvių įrangos (46). Remantis kitų moklininkų atliktais tyrimai Yersinia spp. bakterijų paplitimas kiaulienos produktuse gali siekti iki 80 proc. Čekijoje kiaulių liežuviuose šių bakterijų paplitimas sudarė 80 proc., kiaulių širdyse - 40 proc. ir maltoje kiaulienoje - 55,9 proc. (45). Nustatyta, kad šiems rezultatams įtakos galėjo turėti bakterijų išskyrimo metodas, sezonas, geografinė vieta, mėginių skaičius. Didesnis Yersinia spp. paplitimas būdingas šaltesnėms geografinėms zonoms (3,50). Mūsų tyrimo metu mėginiai buvo rinkti rudens – žiemos sezonais.
Daugiausiai jersiniozės susirgimų sekelia Y. enterocolitica serotipas O:3 (9). Ištyrus kiaulienos produktus nustatėme, kad kiaulių liežuviuose Y. enterocolitica O:3 paplitimas siekė 10 proc. Kitų mokslininkų tyrimai parodė, jog patogeninių Y. enterocolitica bakterijų paplitimas kiaulių liežuviuose buvo didesnis. Bavarijoje (Vokietija) šios bakterijos buvo nustatytos 26 proc. tirtų kiaulienos liežuvių meginiuose (49) tuo tarpu Prancūzijoje – 12,5 proc. (47). Kiaulių liežuviai gali būti užkrėsti Y. enterocolitica bakterijomis skerdimo proceso metu kuomet tonzilės yra pašalinamos ir kartu pakabinamos su kiaulių liežuviais kepenimis, plaučiais ir širdimi. Šie produktai gali būti užkrėsti kryžminės taršos metu skerdyklose, o vėliau ir prekybos vietose (45, 37). Kitas rizikos veiksnys gali būti užkrėstų gyvūnų kraujas bei plovimo vanduo, kuris gali paskleisti bakterijas ir užkrėsti kiaulių liežuvius (48). Patogeninės Y. enterocolitica padermės taip pat gali būti išskirtos iš skerdyklos aplinkos (45). Šios bakterijos gali būti aptinkamos skerdyklose ant grindų, ore, įrenginių ir net darbuotojų persirengo kambarių (21).
28
Dėl didelio Y. enterocolitica bakterijų paplitimo kiaulių tonzilėse bei išmatose, kiauliena gali būti užteršta jersinijomis. Šviežios kiaulienos užkrėtimas dažniausiai įvyksta nesilaikant skerdimo technologijos reikalavimų kuomet įvyksta kryžminė tarša tarp skedenos ir tonzilių, kiaulių išmatų bei virškinamojo trakto turinio. Taip pat parduotuvėse, tiesioginio kontakto metu su šviežia kiauliena galima lengvai užkrėsti kitus maisto produktus Y. enterocolitica bakterijomis, nes jersinijos gali būi perduomos per įvairius paviršius. Be to, šios bakterijos gali išlikti ir daugintis žaliavoje ir maisto produktuose šaldymo temperatūroje laikymo metu (45). Netinkamas maisto tvarkymas, ruošimas bei nepakankamas terminis apdorojimas yra rizikos faktoriai užsikrėsti jersinijomis (7). Neatmetama galimybė, kad mūsų tyrimo metu mėginiai, kurie buvo paimti tą pačią dieną, iš tos pačios parduotuvės galėjo būti užkrėsti kryžminės taršos metu.
Lyginant mėginius tirtus iš skirtingų prekybos vietų nustatėme, kad kiaulų liežuvių ir kiaulienos faršo mėginiai iš turgaviečių buvo labiau užkrėsti jersinijomis nei mėginiai surinkti iš prekybos centrų. Manome, kad tokiems rezultatams įtakos galėjo turėti nepakankamos turgaviečių higienos sąlygos, kuomet kiaulienos produktai užkrečiami kryžminės taršos metu.
29
IŠVADOS
1. Tyrimų rezultatai parodė, kad ištyrus 60 kiaulienos produktų mėginių Yersinia spp. bakterijos nustatytas 75 proc. atvejų, tačiau iš jų 65 proc. atvejų buvo patvirtintas žmonėms nepavojingas Y.
enterocolitica biotipas 1A.
2. Patogeninės Y. enterocolitica O:3 serotipo bakterijos buvo aptiktos keturiuose iš 60 mėginių. Nustatėme, kad šios žmonėms susirgimus sukeliančios bakterijos buvo aptiktos trijuose (10 proc.) kiaulių liežuvių ir viename (3 proc.) kiaulienos faršo mėginiuose.
30
PADĖKA
31
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. CliverDO, Riemann HP. Foodborne infections and intoxications.3rd ed. In: Nesbakken T, editor. Yersinia infections. London: Academic press; 2005. Chapter 8; p. 289-293.
2. Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras (ULAC). Užkrečiamosios ligos. Jersiniozė [elektroninis
išteklius]. Prieiga per internetą: http://www.ulac.lt/ligos/J/jersinioze. [žiūrėta 2016 m. 08 mėn. 10 d. ].
3. Ye Q, Wu Q, Hu H, Zhang J, Huang H. Prevalence and characterization of Yersinia
enterocolitica isolated from retail foods in China. Food Control. 2016;61:20-27.
4. Novoslavskij A. Enteropatogeninių Yersinia enterocolitica ir Yersinia pseudotuberculosis
paplitimas kiaulių bandose Lietuvoje ir šių bakterijų charakterizavimas: daktaro disertacija. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. 2012.
5. Fondrevez M, Minvielle B, Labbé A, Houdayer C, Rose N, Esnault E et al. Prevalence of pahogenic Yersinia enterocolitica in slaughter-aged pigs during a one-year survey 2010-2011, France. International Journal of Food Microbiology. 2014;174:56-62.
6. CliverDO, RiemannHP. Foodborne diseases. 2nd ed. London: Academic press; 2002.
7. Tan LK, Ooi PT, Thong KL. Prevalence of Yersinia enterocolitica from food and pigs in selected states of Malaysia. Food Control. 2014;35:94-100.
8. Laukkanen-Ninios R, Fredriksson-Ahomaa M, Korkeala H. Enteropathogenic Yersinia in the pork production chain: challenges for control. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2014;13:1165-1191.
9. European Food Safety Authority (EFSA). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2014. EFSA Journal. 2015;13:4329.
10. Murros-Kontiainen A, Fredriksson-Ahomaa M, Korkeala H, Johansson P, Rahkila R, Björkroth J. Yersinia nurmii sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2011a; 61:2368-2372.
11. Murros-Kontiainen A, Johansson P, Niskanen T, Fredriksson-Ahomaa M, Korkeala H, Björkroth J. Yersinia pekkanenii sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2011b; 61:2363-2367.
12. European Food Safety Authority (EFSA). Scientific Report of EFSA on Technical specifications for harmonised national surveys on Yersinia enterocolitica in slaughter pigs. The EFSA Journal. 2009;7:1374.
32 14. Nutrition and food sciences. Yersinia enterocolitica and Y. pseudotuberculosis as foodborne pathogens [Internet]. 2016 Aug 24 [modified 2008 May 15]. Available from:
http://www.cabi.org.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/nutrition/datasheet/59059.
15. Simjee S. Infectious Disease. In: Fredriksson-Ahomaa M, editor. Yersinia enterocolitica and
Yersinia pseudotuberculosis. New Jersey: Humana press; 2007. Chapter 4; p. 79-113.
16. Liang J, Duan R, Xia S, Hao Q, Yang J, Xiao Y et al. Ecology and geographic distribution of Yersinia enterocolitica among livestock and wildlife in China. Veterinary Microbiology. 2015;178:125-131.
17. Andreoletti O, Budka H, Buncic S, Colin P, Collins JD, Koeijer AD et al. Monitoring and identification of human enteropathogenic Yersinia spp. Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards. EFSA Journal. 2007;595:1-30.
18. Bonardi S, Bruini I, D'Incau M, Van Damme I, Carniel E, Brémont S et al. Detection, seroprevalence and antimicrobial resistance of Yersinia enterocolitica and Yersinia
pseudotuberculosis in pig tonsils in Northern Italy. International Journal of Food
Microbiology. 2016;235:125-132.
19. Fredriksson-Ahomaa M, Korkeala H. Low occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica in clinical, food, and environmental samples: a methodological problem. Journal of Clinical Microbiology. 2003;220-229.
20. Niskanen T, Laukkanen R, Murros A, Björkroth J, Skurnik M, Koekeala H et al. Characterization of non-pathogenic Yersinia pseudotuberculosis-like strains isolated from food and environmental samples. International Journal of Food Microbiology. 2009;150-156.
21. Laukkanen R. Enteropathogenic Yersinia in pork production: Academic dissertation. University of Helsinki. 2010.
22. Imori PF, Passaglia J, Souza RA, Rocha LB, Falcão JP. Virulence-related genes, adhesion and invasion of some Yersinia enterocolitica-like strains suggests its pathogenic potential.
Microbial Pathogenesis. 2017;104:72-77.
23. Mikula KM, Kolodziejczyk R, Goldman A. Yersinia infection tools-characterization of structure and function of adhesions. Frontiers Cellular Infection Microbiology. 2013;169:1-14.
24. Platt-Samoraj A, Ugorski M, Szweda W, Szczerbaturek A, Wojciech K, Procajlo Z. Anglysis of the presence of ail, ystA and ystB genes in Yersinia enterocolitica strains isolated from aborting sows and aborted fetuses. Journal of Veterinary Medicine. 2006;53:341-346.
33 26. Vrtanen S, Salonen L, Laukkanen-Ninios R, Fredriksson-Ahomaa M, Korkeala H. Piglets are a source of pathogenic Yersinia enterocolitica on fattening-pig farms. Applied and Environmental Microbiology. 2012;78:3000-3003.
27. Damme VI, De Zutter L, Jacxsens L, Nauta MJ. Control of human pathogenic Yersinia
enterocolitica in minced meat: comparative analysis of different interventions using a risk
assessment approach. Food Microbiology. 2017;64:83-95.
28. Nesbakken T, Iversen T, Eckner K, Lium B. Testing of pathogenic Yersinia enterocolitica in pig herds based on the natural dynamic of infection. International Journal of Food Microbiology. 2006;111:99-104.
29. Backhans A, Fellstrom C, Lambertz TS. Occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in small wild rodents. Epidemiology and Infection. 2011;134:1230-1238.
30. Stamm I, Hailer M, Depner B, Kopp PA, Rau J. Yersinia enterocolitica in diagnostic fecal samples of European dogs and cats: identification by FT-IR and MALDI-TOF MS. Journal of Clinical Microbiology. 2013;51:887-893.
31. Wang X, Cui Z, Wang H, Tang L, Yang J, Gu L et al. Pathogenic strains of Yersinia
enterocolitica isolated from domestic dogs (Canis familiaris) belonging to farmers are of the
same subtype as pathogenic Y. enterocolitica strains isolated from humans and may be a source of human infection in Jiangsu Province. China Journal of Clinical Microbiology. 2010;1604-1610.
32. Estrada CSM, Velázquez LDC, Favier GI, Genaro MSD, Escudero ME. Detection of
Yersinia spp. in meat products by enrichment culture, immunomagnetic separation and
nested PCR. Food Microbiology. 2012;157-163.
33. Damm I, Berkvens D, Bare J, De Zutter L. Influence of isolation methods on the occurrence of plasmid-carrying Yersinia enterocolitica serotype O:3 in slaughter pig tonsils, faeces and carcass surface swabs. International Journal of Food Microbiology. 2013;164:32-35.
34. Laukkanen R, Ranta J, Dong X, Hakkinen M, Martínez P, Lundén J. Reduction of enteropathogenic Yersinia in the pig slaughterhouse by using bagging of the rectum. Journal of Food Protection. 2010b;73:2161-2168.
35. Lake R, Hudson A, Cressey P. Risk profile: Yersinia enterocolitica in pork. A Crown Research Institute. 2004;1-54.
36. Laukkanen R, Martínez OP, Siekkinen K, Ranta J, Maijala R, Korkeala H. Transmission of
Yersinia pseudotuberculosis in the pork production chain from farm to slaughterhouse.
34 37. Fredriksson-Ahomaa M, Korte T, Korkeala H. Contamination of carcasses, offals, and the environment with yad A-positive Yersinia enterocolitica in a pig slaughterhouse. Journal of Food Protection. 2000;63:31-35.
38. Najdenski H, Heyndrickx M, Herman L, Werbrouck H, Coillie EV. Quantification of
Yersinia enterocolitica in raw milk using qPCR. Veterinary Microbiology. 2012;160:428-
434.
39. Andreoletti O, Baggesen DL, Bolton D, Butaye P, Cook P, Davies R et al. Scientific Opinion on the risk posed by pathogens in food of non-animal origin. Part 2 (Salmonella, Yersinia,
Shigella and Norovirus in bulb and stem vegetables, and carrots). The EFSA Journal.
2014;3937;1-5.
40. Nousiainen L, Joutsen L, Lunden S, Hänninen J, Fredriksson-Ahomaa M. Bacterial quality and safety of packaged fresh leafy vegetables at the retail level in Finland. International Journal of Food Microbiology. 2016;232:73-79.
41. Söderqvist K, Lambertz ST, Vågsholm I, Boqvist S. Foodborne bacterial pathogens in retail prepacked ready-to-eat mixed ingredient salads. Journal of Food Protection. 2016;79:978-985.
42. Capita R, Alonso-Calleja C, Prieto M, Garcı́a-Fernández MC, Moreno B. Incidence and pathogenicity of Yersinia spp. isolates from poultry in Spain. Food Microbiology. 2002;19:295-301.
43. Söderqvist K, Boqvist S, Wauters G, Vågsholm I, Thisted-Lambertz S. Yersinia
enterocolitica in sheep – a high frequency of biotype 1A. Acta Veterinaria Scandinavica.
2012;54.
44. Užkrečiamų ligų ir AIDS centras (ULAC). Sergamumo užkrečiamomis ligomis Lietuvoje
2014 m. apžvalga. Vilnius. 2015;1-157.
45. Lorencova A, Slany M. Prevalence of pathogenic Y. enterocolitica in minced meat, pig tongues and hearts at the retail level in Czech Republic detected by real time PCR. Scientific Journal for Food Industry. 2016;282-286.
46. Terentjeva M, Berzinš A. Prevalence of Yersinia enterocolitica 4/O:3 in raw pork at retail
market in Latvia. Journal of Food Safety and Food Quality. 2013;125-156.
35 48. Fredriksson-Ahomaa M, Bucher M, Hank C, Stolle A, Korkeala H. High prevalence of
Yersinia enterocolitica 4/O:3 on pig offal in southern Germany: a slaughtering technique
problem. Systematic and Applied Microbiology. 2001;24:457-463.
49. Messelhäusser U, Kämpf P, Colditz J, Bauer H, Schreiner H, Höller C, Busch U. Qualitative and quantitative detection of human pathogenic Yersinia enterocolitica in different food matrices at retail level in Bavaria. Foodborne Pathogens and Disease. 2011;8:39-44.
50. Jiang GC, Kang DH. Enrichment procedures and plating media for isolation of Yersinia
