FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
KRISTINA GRINCEVIČIŪTĖ
VAISTINIO SKAISTENIO (TANACETUM PARTHENIUM L.)
VAISTINĖS AUGALINĖS ŽALIAVOS IR „FEVERFEW“ KAPSULIŲ
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas Prof. dr. Daiva Majienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
VAISTINIO SKAISTENIO (TANACETUM PARTHENIUM L.)
VAISTINĖS AUGALINĖS ŽALIAVOS IR „FEVERFEW“ KAPSULIŲ
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas
Prof. dr. Daiva Majienė Data
Recenzentas Darbą atliko ... Magistrantė
TURINYS
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Vaistinio skaistenio (Tanacetum parthenium L.) botaninis apibūdinimas, vartojimo indikacijos... 10
1.2. Pagrindinių T.parthenium veikliųjų medžiagų charakteristika ... 12
1.2.1. Terpenai ... 12
1.2.2. Fenoliniai junginiai ... 14
1.2.3. Eteriniai aliejai ... 15
1.3. T.parthenium biologinis poveikis ... 16
1.3.1. Antimigreninis poveikis ... 17
1.3.2. Antitrombozinis poveikis ... 18
1.3.3. Priešuždegiminis poveikis ... 19
1.3.4. Sąveika su sutraukiamaisias agonistais ... 21
1.3.5. Priešvėžinis poveikis ... 21
1.3.6. Antimikrobinis poveikis ... 23
1.4. ROS įtaka patogenezei ir T.parthenium antioksidacinis poveikis ... 24
1.4.1. ROS susidarymas ir poveikis ... 24
1.4.2 Antioksidacinis ir prooksidacinis aktyvumas bei jo biologinė reikšmė ... 25
1.4.3. T.parthenium antioksidacinis aktyvumas ... 25
1.5. Etanolinių ištraukų gamybos metodai ... 26
2. METODIKA ... 28
2.1. Naudotos medžiagos, reagentai ir aparatūra ... 28
2.1.1. Naudotos medžiagos, reagentai ... 28
2.1.2. Naudota aparatūra ... 29
2.2.1. Etanolinės ištraukos gamyba iš augalinės žaliavos ... 29
2.2.2.Etanolinės ištraukos ruošimas iš „Feverfew“ preparato kapsulės ... 29
2.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu būdu ... 30
2.4. Vandenilio peroksido koncentracijos tyrimas ... 30
2.5. Ląstelių kultūros kultivavimas ... 31
2.5.2. Ląstelių tankio nustatymas ... 31
2.6. Viduląstelinių ROS nustatymas DCFH metodu ... 32
2.7. Viduląstelinių superoksido radikalų koncentracijos tyrimas ... 33
3. REZULTATAI ... 34
3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu būdu ... 34
3.2. Vandenilio peroksido koncentracijos tyrimas ... 35
3.3. Viduląstelinių ROS tyrimas DCFH metodu ... 37
3.4. Viduląstelinių superoksido radikalų koncentracijos tyrimas ... 43
IŠVADOS ... 46
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47
SANTRAUKA
VAISTINIO SKAISTENIO (TANACETUM PARTHENIUM L.) VAISTINĖS AUGALINĖS ŽALIAVOS IR „FEVERFEW“ KAPSULIŲ ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
K. Grincevičiūtės magistro baigiamasis darbas/mokslinė vadovė prof. dr. D. Majienė; LSMU Farmacijos fakultetas, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra – Kaunas. Raktiniai žodžiai: vaistinis skaistenis, antioksidacinis aktyvumas, fenoliniai junginiai.
Tyrimo tikslas pagaminti etanolines ištraukas iš vaistinio skaistenio (T.parthenium) augalinės žaliavos bei „Feverfew“ kapsulių, įvertinti ir palyginti bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą. Tyrimo uždaviniai: 1. Pagaminti etanolines ištraukas iš T.parthenium žolės ir „Feverfew“ kapsulių, nustatyti bei palyginti jose esančias fenolinių junginių koncentracijas; 2. Ištirti tiriamųjų preparatų gebėjimą neutralizuoti vandenilio peroksidą; 3. Įvertinti pagamintų ištraukų poveikį viduląstelinių radikalų generacijai; 4. Ištirti pagamintų ištraukų poveikį viduląstelinių superoksido radikalų koncentracijai.
SUMMARY
INVESTIGATION OF ANTIOXIDATIVE ACTIVITY OF FEVERFEW (TANACETUM
PARTHENIUM L.) RAW MATERIAL AND „FEVERFEW“ CAPSULES
Master thesis written by K. Grinceviciute, supervisor prof. dr. D. Majiene, Department of Drug Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. Kaunas
Key words: feverfew, antioxidative activity, phenolic compounds.
Aim: to prepare ethanol extracts from feverfew (T.parthenium) raw material and „Feverfew“ capsules and to evaluate and compare total amount of phenolic compounds and antioxidative activity.
Tasks: 1. To produce ethanol extracts from T.parthenium raw material and „Feverfew“ capsules and to identify and compare concentrations of phenolic compounds that they contain. 2. To investigate the ability of prepared preparations to neutralize hydrogen peroxide. 3. To evaluate the effect of produced extracts on the generation of intracellular ROS in C6 cells. 4. To identify the effect of produced extracts on intracellular concentration of the superoxide radical.
Methods: ethanol extracts of T.parthenium plant material and dried powder of feverfew contained in „Feverfew“ capsules, were produced by maceration method. Total amount of phenolic compounds was identified by using Folin – Ciocalteu reagent. An ability to neutralize hydrogen peroxide was evaluated by fluorimetric method, using Amplex Red. Superoxide radical concentration was evaluated by fluorescence microscopy method, using 2´, 7´- dichlorofluorescein diacetate. Superoxide concentration was evaluated by fluorimetric method, using MitoSOX Red dye.
Results: The amount of phenolic compounds indicated in the ethanol extract, produced from raw material, was three times greater than in those produced from „Feverfew” capsules. Hydrogen peroxide, in samples with the extract from T.parthenium raw material, neutralizes more than in samples with the extract from „Feverfew“ capsules: 35,4 proc., and 21,9 proc., respectively. Nevertheless, the amount of ROS in C6 cells also effectively reduces ethanol extracts from the raw material than from „Feverfew” capsules. Moreover, our results have shown, that the extract from T.parthenium plant material reduces superoxide radical concentration in cells more than the ethanol extract from „Feverfew“ capsules: 14,8 and 8,8 proc., respectively.
SANTRUMPOS
ROS – reaktyviosios deguonies formosMGL – alfa-metileno-gama-laktono grupė
ADP – adenozino difosfatas
STAT – transkripcijos signalo keitiklis ir aktyvatorius
MAP – mitogenu aktyvintas baltymas
TNF-α – naviko nekrozės faktorius α
GSH – glutationas
HPLC (angl. high performance liquid chromatography) – efektyvioji skysčių chromatografija
DCFH-DA 2´, 7´-dichlorofluoresceino diacetatas
DCF – dichlorofluoresceinas
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas
PBS (angl. Phosphate Buffer Saline) – fosfatinis druskos buferis
AMR – Amplex red reagentas
HPR - krienų peroksidazė
FBS (angl. Fetal bovine serum) – fetalinis veršelio serumas
HBSS (angl. Hanks' Balanced Salt Solution) – Hankso subalansuotas druskos tirpalas
SOD - superoksido dismutazė
IC50 - pusė (50%) maksimalios tiriamosios medžiagos koncentracijos inhibuojančios biologinę ar
ĮVADAS
Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, medicinoje naudojama 35 – 75 tūkstančiai augalų rūšių, o tai sudaro 14 – 28 proc. visų augalų rūšių.[1] Vaistiniuose augaluose esančios biologiškai aktyvios medžiagos, jų panaudojimas sveikatinimo tikslais kelia vis didesnį mokslininkų susidomėjimą. Todėl nuolatos yra atliekami įvairūs tyrimai, ieškoma efektyvių ekstrahavimo metodų išskirtoms medžiagoms nustatyti ir įvertinti.
Vaistinis skaistenis (lot. Tanacetum parthenium L., angl. Feverfew) – tai astrinių (Asteraceae Bercht. & J.Presl) šeimos vaistinis augalas. Medicininis vaistinio skaistenio naudojimas migrenai ir galvos skausmams gydyti Europoje yra aprašytas šimtmečius, o jo augaliniai produktai skirti migrenos gydymui Europos Sąjungoje yra prieinami daugiau nei 30 metų.[2] Atlikti tyrimai įrodo šio augalo priešuždegiminį, antitrombozinį, priešvėžinį, antimikrobinį, antioksidacinį veikimą. Platų farmakologinį poveikį lemia T.parthenium augalinėje žaliavoje esančios biologiškai aktyvios medžiagos. Atliktų tyrimų duomenimis šis augalas kaupia terpenus, fenolinius junginius, eterinius aliejus. Svarbiausios nustatytos biologiškai aktyvios medžiagos yra seskviterpeniniai laktonai, ir vieni pagrindiniai iš jų – partenolidai.[3]
Laisvieji radikalai yra vieni iš svarbiausių veiksnių ląstelėje sukeliančių pažaidas, be to, jie dažnai siejami su organizmo senėjimo procesais. Augalai antioksidantai slopina laisvųjų radikalų susidarymą, skatina jų suirimą arba pašalina juos, taip apsaugodami organizmą nuo galimo žalingo jų poveikio.[4] Darbe spektrofotometriniu būdu buvo įvertintas bendras fenolinių junginių kiekis. Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti pasirinktas fluorimetrinis metodas.
Temos aktualumas, naujumas, ištirtumas
Vaistinio skaistenio (T.parthenium) žaliava nuo senų laikų buvo naudojama įvairiems negalavimas šalinti, tačiau farmacijos rinkoje preparatų pasiūla yra maža visame pasaulyje. Lietuvos vaistinėse šio augalo žiedų ekstraktas randamas tik vieno maisto papildo sudėtyje. Siauras pritaikymas medicinoje gali būti siejamas su atliktų tyrimų trūkumu. .
Daugiausia pasaulyje ištyrinėtas yra vaistinio skaistenio poveikis migrenos gydymui bei profilaktikai. Pastaruoju metu intensyviau atliekami priešvėžiniai tyrimai. Tačiau, žymiai mažiau dėmesio skiriama kitiems jo poveikiams, tarp jų, ir antioksidaciniam šio augalo veikimui.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas pagaminti etanolines ištraukas iš vaistinio skaistenio (T.parthenium) augalinės žaliavos bei „Feverfew“ kapsulių, įvertinti ir palyginti bendrą fenolinių junginių kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.
Tyrimo uždaviniai:
1. Pagaminti etanolines ištraukas iš T.parthenium žolės ir „Feverfew“ kapsulių, nustatyti bei palyginti jose esančias fenolinių junginių koncentracijas.
2. Ištirti tiriamųjų preparatų gebėjimą neutralizuoti vandenilio peroksidą. 3. Įvertinti pagamintų ištraukų poveikį viduląstelinių radikalų generacijai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Vaistinio skaistenio (Tanacetum parthenium L.) botaninis apibūdinimas,
vartojimo indikacijos
1 pav. Vaistinis skaistenis (Tanacetum parthenium L.)[3]
Sistematika
Karalystė: augalai (Plantae)
Pokaralystė: induočiai (Tracheobionta) Skyrius: magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: astražiedžiai (Asteridae) Eilė: astriečiai (Asterales)
Šeima: astriniai (Asteraceae) Gentis: bitkrėslė (Tanacetum)
Rūšis: vaistinis skaistenis (Tanacetum parthenium) [3]
Vaistinis skaistenis yra daugiametis, iš išvaizdos panašus į ramunę, aromatingas augalas. Jis skleidžia stiprų ir aitroką kvapą. Naudojamos antžeminės šio augalo dalys. Vaistinio skaistenio aukštis 0,3 - 1 m. Stiebas – status, padengtas pūkeliu. Lapai gelsvai žalios spalvos, būna iki 8 cm ilgio, pražanginiai, plunksniškai skaldyti, padengti trumpais plaukeliais. Žiedai yra maždaug iki 2 cm skersmens, panašūs į ramunės žiedelius, dėl kurių kartais šie augalai painiojami tarpusavyje. Jie turi geltoną disko formos vidurį, o vainiklapiai yra liežuviški, balti. Žiedai telkiasi į skėčio formos šluoteles. Vaisius – lukštavaisis. Skaistenis žydi liepos – spalio mėnesiais.[7;8;9;10;11]
Vaistinio skaistenio gimtinė laikoma Balkanų pusiasalyje. Dabar šis augalas randamas Australijoje, Europoje, Kinijoje, Japonijoje ir Šiaurės Afrikoje. JAV aptiktas XIX-ame amžiuje. Ten augalas auga pakelėse, laukuose, apleistuose plotuose ir palei miškus nuo Rytų Kanados iki Merilando ir į vakarus prie Misūrio.[2;6]
Pirmojo amžiaus graikų gydytojas Dioskoridas skaistenį naudojo mažinti karščiavimui ir jį apibūdino kaip vaistą nuo „visų karštų uždegimų“. Skaistenis taip pat buvo žinomas kaip „viduramžių aspirinas“ ar XVIII-ojo amžiaus „aspirinas“.[6;12;13] Augalu buvo gydomas artritas, astma, vidurių užkietėjimas, dermatitas, ausų, galvos skausmas, įvairūs uždegimai, vabzdžių įkandimai, mėnesinių sutrikimai, psoriazė, spazmai, pilvo skausmas, patinimas, spengimas ausyse, danties skausmas, galvos svaigimas. Skaistenis taip pat buvo naudojamas abortui sukelti, nuo kirminų, kaip insekticidas, gydyti kosuliui bei peršalimui. Tradiciškai, žolė buvo naudojama mažinti karščiavimui, dėl šios indikacijos kilo ir augalo dabartinis angliškas pavadinimas.[14;15;16;17;18]
Centrinėje ir Pietų Amerikoje vaistinis skaistenis buvo naudojamas gydyti įvairiems sutrikimams. Andų kalnų indėnai naudojo šį augalą gydant dieglius, inkstų skausmus, rytiniams pykinimams ir pilvo skausmams mažinti nėštumo metu. Kostarikoje buvo naudojamas žolelių nuoviras šalinti virškinimo sutrikimus ir gydyti menstruacijų sutrikimus. Taip pat kostarikos gyventojai naudojo jį kaip kardiotonininį preparatą ir kaip vaistą nuo kirminų. Meksikoje, augalas buvo naudojamas kaip antispazminis ir menstruacijų ciklą reguliuojantis preparatas. Venesueloje buvo naudojamas gydant ausies skausmą.[3;6]
Buvo vartojami švieži arba džiovinti lapai, įprasta paros dozė 2-3 vnt. Jų kartumas dažnai saldintas prieš nurijant. Skaistenį sodindavo aplink namus valyti orą, nes jam būdingas stiprus, ilgai išliekantis kvapas. Skaistenio žiedų tinktūra buvo naudojama kaip priemonė apsauganti nuo vabzdžių, o balzamas – po įkandimų. Taip pat jis buvo naudojamas kaip priešnuodis perdozavus opijaus.[3;5]
skaistenis sėkmingai startavo dėl migrenos gydymo, buvo atlikti in vitro biologinio veikimo tyrimai, nustatytos augale esančios biologiškai aktyvios medžiagos.[2;19;20] Tada imtąsi ir toliau jį tyrinėti įvariais aspektais: nustatytas antimigreninis, priešuždegiminis, antitrombozinis, priešvėžinis, antimikrobinis, antioksidacinis šio augalo veikimas.[2;13;20]
Nuo 2007 m. balandžio mėnesio ES, kaip tradicinis augalinis vaistinis preparatas migrenai, buvo įregistruotos kietos kapsulės, kurių sudėtyje yra 100 mg skaistenio žolės miltelių, (direktyva 2001/83/EB 16str. su pakeitimais).[2] Lietuvos vaistinėse šiuo metu galime rasti tik vieną preparatą, kurio sudėtyje yra šio augalo žiedų ekstrakto – maisto papildą „Mirozan“ (Vox Pharmaceutica).
Nors šis augalas yra labai perspektyvus, dar nėra atlikta pakankamai tyrimų, kad jis taptų populiarus ir žinomas visose pasaulio šalyse, tarp jų ir Lietuvoje.
1.2. Pagrindinių T.parthenium veikliųjų medžiagų charakteristika
1.2.1. Terpenai
Terpenai – tai grupė nesočiųjų angliavandenilių, kurių sudėtis C10H16. Daugelis jų yra eterinių
aliejų sudedamosios dalys. Terpenų molekulėse yra dvigubų jungčių (viena arba dvi), todėl jiems būdingos prijungimo reakcijos.[21]
Kartu su terpenais aptinkama ir kitų, tokios pat empirinės sudėties, bet didesnės molekulinės masės angliavandenilių, pavyzdžiui: seskviterpenų C15H24, diterpenų C20H32, ir bendrai politerpenų (C5H8)n.
Seskviterpenai (lotyniškai „sesqui“ reiškia „pusantro“) – izopreno polimerizacijos produktai. Jų junginiai su deguonimi vadinami seskviterpenoidais (pvz., farnezolis).[7;12]
partolidas. Eudesmanolidams priklauso: magnolialidas, reinosinas, santamarinas, 1-β - hidroksiarbuskulinas ir 5-β- hidroksireinosinas.[3;7;12]
Partenolidas Kostunolidas 3-β-hidroksi-parhenolidas
Sekotanapartenolidas Epoksisantamarinas
1.2.2. Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai – tai viena gausiausių augalinių junginių grupių. Plačiausiai ištyrinėtos flavonoidų ir fenolinių rūgščių klasės.[8;9]
Flavonoidai – tai 2-fenil-benzo-gama-pirono dariniai su C6-C3-C6 anglies atomų struktūra.
Pavadinimas kilo iš lotyniško žodžio „flavus“ (lot. „flavus“ – geltonas), nes pirmieji iš augalų išskirti junginiai buvo geltonos spalvos. Tai yra didžiausia augalinių polifenolinių junginių klasė. Šie dariniai sintetinami iš aromatinių amino rūgščių, fenilalanino, tirozino, acetato liekanų. Jie kaupiasi augalo lapų, vaisių, šaknų, žiedų audiniuose. [23]
Vaistiniame skaistenyje (T.parthenium) nustatyti šie flavonoidai: 6-hidroksikamferol 3,6-dimetil eteris, 6-hidroksikamferol 3,6,4-trimetil eteris (tanetinas), kvercetagetin 3,6-dimetil eteris, kvercetagetin 3,6,3-trimetil eteris, kvercetinas, apigeninas, luteolinas, santinas, jaceidinas, chrisoeriolis ir centaureidinas. Vieni labiausiai tyrinėtų: apigeninas (C15H10O5) ir luteolinas (C15H10O6).[24;25]
Apigeninas Luteolinas
6-hidroksikamferol 3,6-dimetil eteris 6-hidroksikamferol 3,6,4′-trimetil eteris (tanetinas)
Pastaruoju metu augalinės žaliavos, turinčios flavonoidų yra plačiai tyrinėjamos. Taip pat domimąsi ir pačių flavonoidų antioksidacinėmis savybėmis. Neretai jie yra vadinami augaliniais antioksidantais. Nustatyta, kad flavonoidai gali padėti apsisaugoti nuo laisvųjų radikalų sukeliamo pavojaus. Tą jie gali padaryti veikdami įvairiais mechanizmais: prisijungdami laisvuosius radikalus, aktyvuodami antioksidacinius fermentus, redukuodami α-tokoferolio radikalus, sudarydami chelatinius junginius su metalais, slopindami oksidazes, mažindami azoto sukeltą oksidacinį stresą, padidindami šlapimo rūgšties kiekį. Flavonoidai išsiskiria savo netoksiškumu ir greitu pasišalinimu iš organizmo. Antioksidacinių junginių vertinimas tapo labai svarbus įvairių ligų gydyme, profilaktikoje bei naujų vaistų kūrime.[23;26;27]
Flavonoidai, kurie randami vaistiniame skaistenyje, gali būti laikomi vienais jiš pagrindinių biologiškai aktyvių junginių, lemiančių antioksidacinį aktyvumą. Nustatyta, kad flavonoidų vartojimas mažina mirtingumą nuo koronarinių širdies ligų, turi įtakos mažesniam pagyvenusių žmonių pirmojo miokardo infarkto prognozės dažniui. Dėl šių reikšmingų flavonoidų poveikių žmogaus organizmui, svarbu žinoti, kiek ir kokių fenolinių junginių kaupia tiriamas vaistinis skaistenis.[27;28]
D.Britanijos ir Vokietijos mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu buvo palygintas vaistinio skaistenio (T.parthenium) ir paprastosios bitkrėslės (T.vulgare) fenolinių junginių, iš jų lapų ir žiedų, priešuždegiminis veiksmingumas. Tiksliau, T.parthenium flavonolių 6-hidroksi kamferolio ir kvercetagetino metilo eteriai, su T.vulgare metilo eteriais iš skutelareino ir 6-hidroksi luteolino flavonų. Nustatytas šių dviejų augalų flavonolių ir flavonų metilo eterių farmakologinis aktyvumas, bei parodyta, kad jie įvairiai slopina pagrindinius arachidono rūgšties metabolizmo kelius leukocituose. Tačiau pastebėti ir reikšmingi skirtumai tarp poveikio stiprumo. Nustatyta, kad kaip ciklooksigenazės inhibitoriai, bitkrėslės flavonai buvo mažiau aktyvūs nei skaistenio flavonoliai. Moksliniais tyrimais taip pat įrodytas T.parthenium esančio flavonoido tanetino priešuždegiminis poveikis. Šio tyrimo rezultatai įrodo T. parthenium veiksmingumą artrito gydymui.[24]
1.2.3. Eteriniai aliejai
eteriniai aliejai yra mišiniai įvairių organinių junginių, daugiausiai terpenų, aldehidų, ketonų, alkoholių, rūgščių, eterių, esterių bei kitų dideliu lakumu pasižyminčių junginių. Augaluose rasto eterinio aliejaus sudėtyje, galima nustatyti nuo kelių iki keliasdešimties komponentų. Tačiau, įvairiose augalo dalyse jo sudėtis gali būti skirtinga. Šių aliejų kiekis augaluose svyruoja 0,001 – 26 proc. Kiekis priklauso nuo augalo šeimos, vystymosi fazės, augimo vietos bei meteorologinių sąlygų. [31] Šiuo metu intensyviai atliekami eterinių aliejų biologinių savybių tyrimai. Nustatytas antioksidacinis, priešvėžinis, priešuždegiminis, antimikrobinis aktyvumas. Taip pat nustatyta, jog eteriniai aliejai stimuliuoja centrinę nervų sistemą, gerina virškinamojo trakto veiklą. Jų molekulėje esantis deguonis ir neigiami jonai ore reaguoja su kenksmingomis medžiagomis, jas suskaldo ir pašalina nemalonų, kenksmingą kvapą. Dėka savo specifinės struktūros, eteriniai aliejai gali stiprinti imuninę sistemą. Eteriniai aliejai turi ne tik didelę mokslinę reikšmę, bet ir praktinę, kurią įrodo augantis jų suvartojimas ir produkcijos kiekis pasauliniu mastu.[29;30]
Vaistiniame skaistenyje eterinių aliejų randama 0,02-0,07 proc. Viso identifikuoti dvidešimt trys junginiai, sudarantys 90,1 proc. ir daugiau visų eterinių aliejų. Pagrindiniai komponentai yra: kamparas (56,9 proc.), kamfenas (12,7 proc.), p-cimenas (5,2 proc.), bornilacetatas (4,6 proc.). Kitos nustatytos sudėtinės dalys:, α-tujenas, α-pinenas, β-pinenas, α-felandrenas, α-terpinenas, γ-terpinenas, pinokarvonas, borneolis, terpinen-4-olis, ρ-cimen-8-olis, α-terpineolis, mirtenalis, karvakrolis, eugenolis, trans-mirtenolio acetatas, isobornil 2-metil butanoatas ir kariofileno oksidas.[32;33]
Mokslininkas F. Mohsenzadeh su kolegomis tyrė Irano vakarų regiono, T. Parthenium sudėtyje esančių eterinių aliejų, antibakterinį aktyvumą. Išgauti eteriniai aliejai buvo analizuojami dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu. Didžiausia šių medžiagų koncentracija buvo nustatyta augalo žydėjimo etape. Daugiausia rasta kamparo (18,94 proc.), bornilacetato (18,35 proc.), kamfeno (13,74 proc.), borneolio (10,93 proc.). Nustatytas veiksmingumas minimaliomis koncentracijomis prieš Staphylococcus subtilis ir Entrobacter aerogenes bakterijas. Šis tyrimas įrodė, kad tirti eteriniai aliejai turi palyginti gerą antibakterinį aktyvumą, be reikšmingo toksinio poveikio.[33]
1.3. T.parthenium biologinis poveikis
keletą biologinių savybių, tokių kaip priešvėžinis, antimikrobinis, antitrombozinis, priešuždegiminis poveikis. Ši medžiaga taip pat sąveikauja su sutraukiamaisiais antagonistais, turi antimigreninių savybių. [2]
Nustatyta, kad vaistinis skaistenis (T.parthenium) slopina prostaglandinų sintezę, tačiau poveikio ciklooksigenazei nedaro. Be to, šis augalas nuo COX nepriklausančiu mechanizmu slopina tromboksano sintezę. Skaistenis taip pat slopina fosfolipazės A2 sintezę trombocituose, tokiu būdu užkirsdamas kelią
arachidono rūgšties atpalaidavimui ir tolesnei konversijai į prostaglandinus bei tromboksaną. Skaistenis taip pat slopina adenozino difosfato (ADP), kolageno ir trombino sukeliamą trombocitų agregaciją, o tai rodo, kad šis augalas slopina trombozę.[34]
Dauguma farmakologijos mokslo tyrimų yra atlikta su partenolidu. Šio junginio biologinis veiklumas didžiąja dalimi priklauso nuo alfa-metileno-gama laktono (MGL) grupės. Kadangi biologinėse sistemose nukleofiline dalimi labai dažnai esti tiolio (sulfhidrilo) grupė, ši MGL grupė gali veikti kaip tokias tiolio liekanas alkilinanti medžiaga, tokiu būdu gerokai sutrikdydama ląstelių funkciją. (Tiolio grupės, tokios kaip cisteino liekanos baltymuose arba fermentuose, yra svarbios plazminės membranos ir citoskeleto sudedamosios dalys, kurios, dalyvauja fagocitozėje ir degranuliuojant neutrofilams).[9;10;34]
1.3.1. Antimigreninis poveikis
IkappaB-alfa (IκB-α) baltymų sumažėjimas. Partenolidas (3 mg/kg, žiurkėms švirkščiamas į pilvaplėvės ertmę) slopina IkappaB-alfa degradaciją, NF-kappaB aktyvavimą ir iNOS ekspresiją po glicerolio trinitrato infuzijos.[35]
Dar vienas svarbus atradimas šiame tyrime rodo, kad skaistenio ekstraktas, kuriame yra 26 proc. partenolido (100 mg/kg per parą 6 dienas švirkščiant į pilvaplėvės ertmę) ir partenolidas (15 mg/kg per parą 6 dienas švirkščiant į pilvaplėvės ertmę) sumažino glicerolio trinitrato sukeltą C-Fos (onkogeno) aktyvaciją žiurkių smegenyse. Skaistenio ekstraktas, kuriame buvo mažai partenolido (0,8 proc.), buvo neaktyvus. C-Fos ekspresija yra netiesioginis neuronų aktyvumo matas. Veikimas pasireiškė pagrindinėje smegenų srityje, dalyvaujančioje migrenos patogenezėje, branduolyje trigeminalis caudalis. Išgrynintas partenolidas buvo geriau toleruojamas, nei augalinis ekstraktas.[22]
Mokslininko Palevich su kolegomis atliktame atsitiktinių imčių, dvigubai aklame, placebu kontroliuojamame tyrime, buvo įrodyta, kad pacientams, kasdien gėrusiems skaistenio kapsulių, kuriose buvo 0,2 mg veikliosios medžiagos – partenolidų ekvivalento, žymiai sumažėjo skausmo intensyvumas ir kiti migrenos simptomai, pavyzdžiui, vėmimas ir padidėjęs jautrumas šviesai.[36]
T.parthenium ir jame esančio partenolido poveikis migrenai yra plačiausiai ištyrinėtas iš visų šio augalo poveikių, atlikti klinikiniai tyrimai. Tačiau dar nėra galutinai išsiaiškintas jų veikimo mechanizmas šiai indikacijai. Todėl svarbu ir toliau atlikti kuo daugiau tyrimų, analizių, kad ateityje šis augalas migrenos gydyme taptų puikia alternatyva cheminiams vaistams.
1.3.2. Antitrombozinis poveikis
T.parthernium aktyvumas buvo įrodytas in vitro tyrimais. Chloroformo/metanolio ir vandeniniai skaistenio ekstraktai in vitro tyrimuose slopino kraujo trombocitų ir polimorfonuklearinių leukocitų sekrecijos veiklą. Buvo slopinamas serotonino atpalaidavimas iš trombocitų, kurį sukėlė agreguojančiosios medžiagos. Skaistenio poveikis trombocitams buvo kitoks, nei kitų trombocitų agregacijos inhibitorių, o poveikis polimorfiniams neutrofilams – žymesnis, nei buvo pastebėtas naudojant labai didelės koncentracijos NVNU tirpalus. Vandeninis skaistenio ekstraktas slopino ADP, kolageno ir trombino sukeltą trombocitų agregaciją, tačiau arachidono rūgšties sukelta agregacija nebuvo paveikta. Tromboksano B2 sintezė trombocituose, inkubuojant juos su arachidono rūgštimi, taip pat nebuvo
antitrombocitinis veikimas pasireiškia dėl fosfolipazės slopinimo, neleidžiant išsiskirti arachidono rūgščiai.[10;34]
Keli skaistenio ekstraktai buvo tirti dėl antisekrecinės veiklos trombocitų bioteste ir palyginti su partenolidų standartų poveikiu. Pastebėtas glaudus ryšys tarp partenolidų turinio ekstraktuose ir jų antisekrecinės veiklos, tačiau kiti seskviterpeniniai laktonai skaistenyje taip pat buvo aktyvūs. Partenolido kiekis ir skaistenio biologinis aktyvumas labai kito, priklausomai nuo vietovės, skirtinguose Europos regionuose. Tirtuose skaistenio komerciniuose preparatuose (arbatose, tabletėse, lašuose) buvo taip pat stebimas slopinamasis trombocitų sekrecijos poveikis, nors jis buvo mažesnis lyginant su šviežiai paruoštu skaisteniu.[10;22] Skaistenio ekstraktai keičia trombocitų sąveiką su kolageno substratais, slopina trombocitų plitimą ir trombų formavimąsi kaip agregatų ant kolageno paviršiaus. Skaistenio chloroformo ekstraktas veikė kaip stiprus inhibitorius trombocitų-kolageno sąveikoje in vitro modelyje išbandant antitrombozinius vaistus.[22]
Pirmieji tyrimai dėl antitrombozinio T.parthenium poveikio atlikti jau 1985m.[2]. Jie parodė, jog šis augalas, kaip antitrombozinis preparatas, yra labai perspektyvus. Tačiau šiandien, šis vaistinio skaistenio poveikis yra primirštas. Vis dar trūksta išsamių tyrimų, kurie leistų šiam augalui konkuruoti su kitais augaliniais ar cheminiais preparatais, skirtais trombozių profilaktikai.
1.3.3. Priešuždegiminis poveikis
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad partenolidas in vitro slopino ciklooksigenazę. Be to, partenolidas in vitro slopino indukuojamosios ciklooksigenazės (COX-2) ir uždegimą skatinančių citokinų raišką lipopolisacharidais (LSP) stimuliuotuose makrofaguose, o tai koreliavo su mitogeno aktyvintos proteinkinazės slopinimu. Buvo teigiama, kad slopinimą lemia MGL grupė. Vis dėlto vandeniniai viso augalo ar lapų ekstraktai slopino prostaglandinų, bet ne COX, biosintezę.[34] Taip pat partenolidas in vitro neslopino COX aktyvumo (naudojant iš avino sėklinių pūslelių gautą fermentą). Kiti tyrimai rodo, kad seskviterpeno laktonai, įskaitant partenolidą, slopino arachidono rūgšties išsiskyrimą iš membranos fosfolipidų sankaupų, bet ne jo konvertavimą į tromboksaną B2 COX keliu.[37]
atrastas atliekant Meksikos ir Indijos augalų atrankinius tyrimus. Izoheleninas, kuris kaip ir skaistenyje esantys laktonai yra seskviterpeno laktonas su MGL grupe, taip pat slopina NF-kappaB aktyvavimą. Kiti seskviterpeno laktonai be šio konkretaus radikalo nebuvo veiklūs. Manyta, kad galimas veikimo mechanizmas yra slopinamųjų baltymų IkappaB-alfa ir -beta degradacijos prevencija. Taip pat buvo nustatyta, kad partenolidas slopina NF-kappaB aktyvavimą veikdamas IkappaB kinazės (IKK) kompleksą. Tyrimai in vitro rodo, kad partenolidas tiesiogiai prisijungia prie IKK ir jį slopina.[38,40;41]
Partenolido priešuždegiminis veikimas slopinant NF-kappaB aktyvaciją įrodytas daugeliu in vitro ir in vivo modelių. Pavyzdžiui, jis slopino in vitro lipopolisacharidų (LPS) stimuliuotą uždegiminį atsaką slopindamas NF-kappaB ir šiuo požiūriu buvo ypač veiksmingas, palyginus su kitomis natūraliomis medžiagomis. Be to, in vitro taip pat buvo slopinamas iNOS, stimuliuotuose žmogaus kraujo T-ląstelėse. .[35;42]
Tikriausiai dėl NF-kappaB aktyvacijos, ciklofosfamidas yra susijęs su hemoraginio cistito sukėlimu ir šlapinimosi sutrikimais. Pradinis gydymas partenolidu (4 mg/kg kūno svorio per parą 3 dienas švirkščiant po oda) ciklofosfamido gavusioms žiurkėms nuslopino šlapimo pūslės uždegimą ir pernelyg didelį veiklumą.[22]
Išgertas skaistenio ekstraktas sukėlė reikšmingą antinocicepcinį poveikį prieš acto rūgšties sukeltą pelių raičiojimąsi bei priešuždegiminį poveikį prieš karagenino sukeltą letenėlių edemą žiurkėms. Šie poveikiai priklausė nuo dozės (10,20,40 mg/kg). Partenolidas (1 ir 2 mg/kg kūno masės švirkščiant į pilvaplėvės ertmę) taip pat sukėlė antinocicepcinį ir priešuždegiminį poveikius. Opiatų antagonistas naloksonas (1 mg/kg kūno masės švirkščiant į pilvaplėvės ertmę) skaistenio ir partenolido sukelto antinocicepcinio poveikio nepanaikino. Pelėms sugirdytos didesnės skaistenio ekstrakto dozės (40 ir 60 mg/kg kūno masės) nei judėjimo aktyvumo nepakeitė, nei prailgino pentobarbitono sukelto miego trukmę. Jis taip pat nepakeitė temperatūros žiurkių tiesiojoje žarnoje. Autoriai priėjo išvados, kad sukeldamas antinocicepcinį ir priešuždegiminį poveikį skaistenio ekstraktas normalios elgsenos nekeičia. [43]
1.3.4. Sąveika su sutraukiamaisias agonistais
Manoma, kad partenolidas veikia serotonino receptorius. Yra tyrimų, parodančių, jog jis slopino žiurkių skrandžio dugno susitraukimo (susijusį su serotonino atpalaidavimu) atsaką į du netiesiogiai veikiančius serotonino receptorių agonistus, bet ne į patį serotoniną.[44]
Kita mokslininkų grupė nustatė, kad šviežio skaistenio ekstraktas sukėlė nuo dozės ir laiko priklausantį izoliuotų lygiųjų raumenų susitraukimo atsakų slopinimą, t.y. tokį patį poveikį, kaip veikiant audinio receptorius agonistais, tokiais kaip serotoninas ir fenilefrinas. Džiovintų skaistenių chloroforminiai ekstraktai, kuriuose nebuvo partenolido nespecifiškai slopino lygiųjų raumenų susitraukimus izoliuotame audinyje nuo laiko priklausomu būdu.[22]
Buvo gauti žiurkių skrandžio dugno ir klubinės žarnos izometriniai atsakai į serotoniną ir netiesioginę serotonerginę medžiagą D-fenfluraminą. Partenolidas slopino fenfluramino poveikius, tačiau poveikis šių audinių serotonino receptoriams buvo tik lėtas, tuo tarpu skaistenio ekstraktas buvo neveiklus. Panašūs rezultatai buvo stebėti žiurkes šeriant nesuardyto ir suardyto skaistenio milteliais (20 mg/kg per parą, 30 dienų, ir švirkščiant į pilvaplėvės ertmę partenolido (23,4 µg žiurkei per parą, 7 dienas). Skaistenio milteliai buvo veiksmingesnė antiserotonerginė medžiaga už jo ištraukas ar gryną partenolidą. Visi šie rezultatai rodo, kad augale yra ir kitų junginių, veikiančių serotonino receptorius.[22]
Tyrimų, patvirtinančių vaistinio skaistenio ar partenolido sąveiką su sutraukiamaisiais agonistas yra atlikta vos keli. Tai yra puiki niša mokslininkams, kuri leistų įrodyti dar platesnį šio augalo veikimą.
1.3.5. Priešvėžinis poveikis
2010 metais atliktoje apžvalgoje pažymėta, kad seskviterpeno laktonai, tokie kaip partenolidas, nuo 1960-ųjų metų yra tiriami kaip priešvėžiniai vaistai. Daugybė tyrimų įrodo partenolido veiklumą prieš įvairias navikinių ląstelių linijas. Vėlgi manoma, kad NF-kappaB veiklos slopinimas (arba sąveikos su IKK būdu, arba tiksliau tiesiogiai su jos p65 subvienetu), yra vienas pagrindinių veikimo mechanizmų. Be to, STAT (transkripcijos signalo keitiklio ir aktyvatoriaus) ir MAP (mitogenu aktyvuoto baltymo) kinazių veiklos slopinimas bei nepertraukiamos JNK (C-Jun N-terminalinės kinazės) indukcija po gydymo skaisteniu gali padidinti vėžinių ląstelių jautrumą chemoterapijai ir radioterapijai.[41;45]
būdu atkurdamas kai kurių slopinamų genų ekspresiją. Be to, partenolidas sumažina glutationo kiekį vėžinėse ląstelėse, po kurio susikaupia aktyviosios deguonies formos. Unikali savybė yra jo gebėjimas pasirinktinai vėžio ląstelėse sužadinti ląstelės žūtį išsaugant sveikąsias ląsteles. Taip pat atrodo, kad jis galimai nusitaiko į tam tikro vėžio kamieninės ląsteles, pavyzdžiui, krūties ar prostatos.[22;43]
Kai kurių, neseniai atliktų partenolido in vitro tyrimų metu buvo tirtas veikimas prieš kepenų vėžio ląsteles, cholangiokarcinomos ląsteles, leukemijos kamienines ląsteles, melanomos ląsteles ir skrandžio vėžio ląsteles.[46] Be to, nustatytas in vitro skaistenio ekstraktų priešvėžinis aktyvumas. Buvo įrodytas veikimas prieš dvi žmogaus krūties vėžio ląstelių linijas ir vieną gimdos kaklelio vėžio ląstelių liniją. Nustatyta, kad šioje vaistažolėje esantys flavonoidai galėtų pasižymėti silpnu sinergetiniu poveikiu su partenolidu.[22]
2008 metais paskelbtoje apžvalgoje, kurioje nagrinėti nuo partenolido priklausomo vėžinių ląstelių proapoptozinio veikimo molekuliniai mechanizmai, buvo pasiūlyta keletas galimų mechanizmų. Vienas iš jų: partenolidas slopina NF-kappaB ir STAT priklausomą antiapoptozės genų transkripciją. Proapoptotinis veikimas apima viduląstelinius ir ekstraląstelinius mechanizmus. Sužadinant vidinį proapoptozinio signalo perdavimo kelią dalyvauja didesnis reaktyvių deguonies formų kiekis ir BCL-2 šeimos baltymų modifikavimas. Be to, partenolidas sustiprina apoptozės signalą didindamas vėžinių ląstelių jautrumą išorės TNF-α sukeliamai apoptozei. Šie poveikiai yra specifiniai naviko ląstelėms.[45;22]
Partenolido priešvėžinis veikimas taip pat buvo tirtas in vivo, nors tokių tyrimų atlikta mažiau. Dauguma iš in vivo tyrimų rezultatų buvo susiję su partenolido vaidmeniu slopinant NF-kappaB aktyvavimą. Pelių krūties vėžio ksenografiniuose modeliuose partenolidas (40 mg/kg per parą, peroraliai) kartu su docetakseliu sumažino metastazes ir pagerino išgyvenamumą (tokiomis pačiomis dozėmis). Partenolidas slopino pelių (3 µg/kg kūno masės, pelei po oda) naviko augimą inkstų ląstelių karcinomos ksenograftiniame modelyje. Pelių plaučių vėžio ksenograftiniame modelyje partenolidas (20 mg/kg per parą) taip pat sumažino priešvėžinio vaisto cisplatinos sukeltą inkstų pažaidą, padidino taksolio veiksmingumą. Partenolidas (1 mg/kg per parą) sumažino žiurkėms osteofitinių metastazinių kaulų pažaidas po W256 vėžinių ląstelių injekcijos. UVB sukelto odos vėžio modelyje buvo stebėtas partenolido (1 mg/pelei per parą) prevencinis veikimas.[22]
1.3.6. Antimikrobinis poveikis
Iš skaistenio izoliuoti eudesmanolidai (10mg/ml) turėjo antibakterinį aktyvumą prieš S.aureus, E.coli ir Salmonella spp. Partenolidas slopino gramteigiamų bakterijų ir grybų augimą in vitro. Bacillus rūšis be endosporų buvo ypač jautri.[22]
Partenolidas, panaudotas koncentracija 0,81 µg/ml in vitro 50 proc. nuslopino promastigotinės Leishmsnia amazonensis formos gyvybingumą.[47] Guiainolidai iš skaistenio taip pat buvo aktyvūs prieš šių parazitų rūšis in vitro. Taip pat buvo nustatytas šviežio skaistenio ekstrakto ir partenolido (IC50 µg/ml)
aktyvumas prieš Trypanosoma cruzi epimastigotinę formą in vitro. Partenolidas taip pat pasižymėjo sinergistiniu poveikiu su benzidazolu prieš šį parazitą in vitro.[48]
Eterinis aliejus gaunamas iš skaistenio žiedų parodė baktericidinį ir fungicidinį aktyvumą prieš daugelį tirtų 27 mikroorganizmų, tyrimui naudojant difuzijos į agarą ir skiedimo metodus. Dveji skaistenio ekstraktai buvo išbandyti panašiu būdu, naudojant tuos pačius bandymus su daugeliu rūšių, įskaitant Staph. Aureus, Strep.haemoliticus, Sarcina Fara ir E. coli. Gramneigiamos rūšys buvo daug mažiau
jautrios nei gramteigiamos rūšys, grybai ir dermatofitai.[23]
Kita mokslininkų grupė taip pat nustatė, kad vaistinio skaistenio (T.parthenium) eterinis aliejus turi baktericidinių ir fungicidinių sąvybių. Tačiau, šio tyrimo rezultatai yra priešingi prieš tai minėto tyrimo rezultatams. Šie mokslininkai nustatė, kad gramteigiamos bakterijos pasižymi žymiai mažesniu jautrumu nei gramneigiamos bakterijos, dermatofitai ir kai kurie grybai. Jų tyrimo rezultatai parodė, kad eterinis aliejus turi stiprų baktericidinį poveikį tik prieš gramteigiamas Bacillus rūšis, bei stipriai veikia daugelį gramneigiamų rūšių: Escherichia coli, Klebsiella oxitoca, Salmonella, Shigella SP sonnei, Serratia marcescens. Taip pat, kad eterinis aliejus turi stiprų fungicidinį poveikį prieš Candida tropicalis C. pseudotropicalis ir C. Apicola rūšis bei antimikrobiškai veikia prieš Aspergillus flavus, A. ochraceus A. Niger rūšis ir dermatofitus (Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes ir Epidermophyton floccosum).[49]
1.4. ROS įtaka patogenezei ir T.parthenium antioksidacinis poveikis
1.4.1. ROS susidarymas ir poveikis
Gyvybiniams procesams yra būtinas molekulinis deguonis O2, tačiau jis taip pat gali sukelti ir kitus
oksidacinius procesus, kurie gali pažeisti biologines molekules (DNR, baltymus, lipidus). Šis procesas vadinamas „deguonies paradoksu“, kadangi gyvybę palaikančios medžiagos formos yra nuodingos ląstelei. 1956 m. mokslininkas D.Harman iškėlė hipotezę, jog fermentinių redukcijos bei oksidacijos reakcijų metu, kaip šalutiniai produktai, ląstelėse susidaro deguonies radikalai ir kitos aktyvios deguonies junginų formos. Jos visos bendrai yra vadinamos ROS (angl. − reactive oxygen species) – reaktyviomis deguonies formomis.[4;50]
ROS chemiškai aktyvesnės už molekulinį deguonį. Tai yra nestabilios molekulės, turinčios neporinį elektroną. ROS yra linkusios prijungti ar atiduoti elektronus ir įgauti stabilesnę būseną, kai elektronai būna suporuoti. Nors ir nestabilios, jos gali tam tikrą laiką gyvuoti laisva forma. Šie junginiai kartu su RNS (reaktyviomis azoto formomis) yra vadinami laisvaisiais radikalais.[51;52]
Laisvųjų radikalų reakcijų pradžią lemia susidarę įvairūs reaktyvūs deguonies junginiai: superoksido radikalas (O•-2), hidroksilo radikalas (OH•), azoto monoksidas (NO•), peroksilo radikalas
(ROO•), vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorinės rūgštis (HOCl), singuletinio deguonis (1O2) ir kt.
ROS susidarymo procesą skatina įvairūs veiksniai: radiacija, sausra, temperatūros stresas, audinių pažaida bei atsakas į uždegimą, ląstelėse vykstanti medžiagų apykaita (elektronų transporto grandinės veikla), tam tikrų medžiagų (vaistų, oro taršalų, cigarečių dūmų, herbicidų,) pateikimas į organizmą.[51]
Nedideli laisvųjų radikalų kiekiai yra reikalingi normalioms fiziologinėms funkcijoms palaikyti (genų raiškai, ląstelių augimui, apsaugai nuo infekcijų). Nepalankių sąlygų poveikyje padidėjus ROS koncentracijai ląstelės, veikiant antioksidacinei sistemai, gali atlaikyti nežymius oksidacinės – redukcinės sistemos stabilumo pakitimus bei atgauti pradinę būseną. Tačiau, padidėjus laisvųjų radikalų koncentracijai ląstelėse ir nebesugebant jų detoksikuoti yra sukeliamas oksidacinis stresas, kuris gali pažeisti beveik visas svarbiausiais ląstelių struktūras – membranas, branduolį, makromolekules (baltymus, nukleorūgštis, angliavandenius, lipidus).[51;52]
organizmo sistema (sumažėja GSH kiekis kepenyse ir kituose organuose, sutrikdoma antioksidacinių fermentų veikla) yra padaroma daugiausiai žalos organizmui.[53;51;4;52]
Uždegiminės, lėtinės ligos, tokios kaip aterosklerozė, cukrinio diabeto komplikacijos, kancerogenezė, katarakta, reumatoidinis artritas ir kt. yra bene ryškiausi laisvųjų radikalų poveikio pavyzdžiai. Oksidacinis stresas taip pat yra viena iš organizmo senėjimo priežasčių.[52;53;54]
1.4.2 Antioksidacinis ir prooksidacinis aktyvumas bei jo biologinė reikšmė
Evoliucijos metu gyvosios ląstelės įgavo gebėjimą apsisaugoti nuo ROS pažaidos. Medžiagos, mažinančios arba panaikinančios laisvųjų radikalų sukeltą ląstelių pažeidimą, vadinamos antioksidantais. Antioksidacinė ląstelės apsauga būna kelių rūšių – fermentai, mažos molekulinės masės gaudyklės, jungiantys pereinamųjų metalų jonus baltymai.[4]
Antioksidantai slopina laisvųjų radikalų susidarymą, skatina jų suirimą arba pašalina juos, taip apsaugodami organizmą nuo galimo žalingo poveikio. Net ir maži jų kiekiai yra pakankamai efektyvūs.
Nors dažnai pabrėžiamas fenolinių junginių antioksidacinis veikimas, esant tam tikroms sąlygoms jie gali elgtis kaip prooksidantai, t.y. virsti cheminėmis medžiagomis, sukeliančiomis oksidacinį stresą.[55]
Tačiau prooksidacinis poveikis gali būti ne tik žalingas, bet ir naudingas. Jis sukelia lengvo laipsnio oksidacinį stresą, suaktyvina ląstelių antioksidacinę apsaugą ir netgi gali padidinti ksenobiotikus metabolizuojančių fermentų kiekį, o šių veiksnių pasekoje ląstelė apsaugoma nuo žalingo aplinkos poveikio.[55]
1.4.3. T.parthenium antioksidacinis aktyvumas
Atlikti tyrimai su T.parthenium įrodo šio augalo antioksidacinį veikimą. Mokslininkas Yang Yao su kolegomis ištyrė skaistenio sudėyje esančio aktyviausio seskviterpeninio laktono partenolido antioksidacinį poveikį. Tyrimas buvo atliktas, siekiant nustatyti apsauginį partenolido veikimą, prieš žmogaus lęšiuko epitelio (HLE) ląstelėse sukeliamą apoptozę, sukeltą oksidacinio streso ir galimus veikimo mechanizmus. HLE ląstelės (SRA01-04) buvo inkubuojamos su 50 μM H202, esant skirtingoms
kaspazės-9 ekspresija, sukelta H202 HLE ląstelėse bei kaspazės-3 ir kaspazės-9 aktyvumas, priklausomai
nuo koncentracijos. Autoriai padarė išvadą, kad partenolidai apsaugo HLE ląsteles nuo oksidacinio streso sukeltos apoptozės, slopindami kaspazės-3 ir kaspazės-9 aktyvaciją, o tai rodo galimą apsauginį poveikį prieš kataraktos formavimąsi.[56]
Mokslininkės Martin K. su kolegomis atliktame tyrime buvo nustatyta, kad skaistenio ekstraktas turi laisvuosius radikalus neutralizuojantį poveikį. In vitro jis susilpnina UV sukeltą vandenilio peroksido generaciją ir sumažina pro-uždegiminių citokinų išsiskyrimą. In vivo – sumažina UV sukeltą epidermio hiperplaziją, DNR pažeidimus ir apoptozę. Klinikiniame tyrime nustatyta, kad gydymas šiuo ekstraktu žymiai sumažino eritemą, lyginant su placebu, po 24 h UV spindulių poveikio. Autoriai teigė, kad per gebėjimą neutralizuoti laisvuosius radikalus, T.parthenium sumažina DNR pažaidą ir pagerina DNR reparaciją. Taigi, vaistinio skaistenio ekstraktas gali apsaugoti odą nuo daugybės kenksmingų poveikių su kuriais susiduriama kasdien bei sumažinti oksidacijos iššauktos pažaidos žalą.[57]
Pastebima, kad daugiausia pasaulyje ištyrinėtas yra vaistinio skaistenio poveikis migrenos ir artrito gydymui bei profilaktikai. Pastaruoju metu intensyviau atliekami priešvėžiniai tyrimai. Tačiau, žymiai mažiau dėmesio skiriama kitiems jo poveikiams, tarp jų, ir antioksidaciniam šio augalo veikimui. Iki šiol atlikti moksliniai tyrimai įrodo, kad vaistinis skaistenis veikdamas įvairiais mechanizmais, pasižymi antioksidaciniu veikimu. Todėl aktualu tęsti pasaulyje pradėtus šio aktyvumo tyrimus su T.parthenium ir parodyti kuo platesnį šio augalo biologinį poveikį.
1.5. Etanolinių ištraukų gamybos metodai
Tinktūros – tai skystos ištraukos, dažniausiai gaunamos iš sausos augalinės žaliavos. Jos dažniausiai gaminamos maceracijos, perkoliacijos, ar kitu tinkamu įteisintu farmakopėjose būdu, naudojant tam tikros koncentracijos etanolį. Taip pat jos gali būti gaunamos ištirpinus ar praskiedus ekstraktus tinkamos koncentracijos alkoholiu.[58]
Pagrindinės tinktūrų gamybos stadijos: ekstrakcija, išvalymas ir standartizavimas.[59]
išspaudžiama, perplaunama nedideliu kiekiu grynojo tirpiklio ir dar kartą išspaudžiama. Nupiltos ar išspaustos ištraukos turi sudaryti 5 arba 10 tūrio dalių. Jos supilamos į vieną indą, kuriame leidžiama pastovėti, esant ne aukštesnei kaip 8°C temperatūrai keletą dienų, filtruojama.[58]
Mokslininkai, norėdami ištirti anksčiau minėtus vaistinio skaistenio poveikius, naudojo įvairius ekstrakcijos tirpiklius, gamybos ir analizės metodus. Gaminant T.parthenium preparatus ekstrakcijai dažniausiai naudojami tirpikliai yra: chloroformas, petrolio eteris, acetonas, acetonitrilas, 90% acetonitrilas, metanolis, 50% metanolis, alkoholis ir kt. Dažniausiai renkamąsi šildymo vandens vonelėje, maišymo, veikimo ultragarsu, Soksleto ekstrahavimo metodą. Tarp analizės metodų labiausiai paplitusi yra efektyvioji skysčių chromatografija.[60]
Changqing Wu su kolegomis tirdamas antioksidacinį T.Parthenium poveikį aprašė tokį vaistinio skaistenio ekstrakto paruošimą: skaistenio milteliai (1,5 g) buvo pasverti ir įdėti į 250 ml stiklinį buteliuką, su magnetine maišykle. Mėginys ekstrahuojamas 10 min. su 100 ml 80% (V/V) etanoliu, energingai maišant kambario temperatūroje. Po filtracijos per Whatman Nr.1 filtro popierių, buvo gautas ekstraktas (16,67 mg/ml), skaičiuojant nuo sausos medžiagos masės. Norint kiekybiškai nustatyti flavonoidus skaistenio ekstrakte efektyviosios chromatografijos būdu (HPLC), skaistenio milteliai (5,1 g) buvo pasverti ir apdorojami prieš tai nurodytais būdais. Tuomet ekstraktas sukoncentruotas iki 25 ml (204 mg/ml) esant 50°C, naudojant sukamąjį vakuuminį garintuvą. Naudojant C18 HPLC frakcijų rinkimui analizėje, DPPH laisvųjų radikalų aktyvumui bei aktyvumui dėl Fe2+ chelatų susidarymo nustatyti,
skaistenio milteliai (5,6 g) buvo ekstrahuojami pagal tas pačias anksčiau minėtas procedūras, tuomet sukoncentruojami iki 15 ml (373,33 mg/ml), naudojant sukamąjį vakuuminį garintuvą 50 °C.[61]
Mokslininkė Juliana Siqueira Chaves su kolegomis, kurdama geriamąsias dengtas T.parthenium tabletes, naudojo hidroalkoholinį šio augalo esktraktą, kuris buvo gautas perkoliacijos būdu su 70% etanoliu, pagal Vokietijos farmakopėjos specifikacijas. Šis procesas buvo atliktas trimis etapais: 1) brinkinimas 2 h su 1:3 tirpikliu; 2) tarpinis maceravimas (24 val); 3) perkoliacija (4-6 lašai/min). Seskviterpeninis laktonas partenolidas, kuris yra pagrindinė, veiklioji medžiaga šiame augale buvo įvertintas HPLC metodu, nustatytas jo kiekis (1,06% ekstrakte). Taip pat nustatytas bendras flavonoidų kiekis UV spektroskopijos būdu (1,05 % ekstrakte).[62]
ištirpinta etilo acetate arba heksane ir pavadinta pagal naudojamą tirpiklį. Vandeninio (ACE), etil-acetato (ECE), ir heksano (HCE) ekstraktų antimikrobinis poveikis buvo tiriamas prieš L. Amazonensis pirmuonis.[47]
Zhou ir kiti mokslininkai atliko tyrimą, kuriame palygino T.parthenium ekstrahavimo efektyvumą Soksleto ekstrahavimo ir maišymo metodu. Aprašytas Soksleto metodas apima 24 h ekstrakciją Soksleto aparate, 60 °C temperatūroje. Jie nustatė, kad lyginant su Soksleto ekstrahavimu, maišymo metodas, atliekamas 30 min. kambario temperatūroje, gali pasiekti tokį patį ar net didesnį ekstrahavimo efektyvumą, jei buvo pasirinktas tinkamas ekstrahavimo tirpiklis. Be to, ši ekstrahavimo procedūra yra daug paprastesnė.[63]
Vaistinis skaistenis ir jame esantis seskviterpeninis laktonas partenolidas buvo tirti naudojant įvairius ekstrahavimo metodus, su įvairiais ekstrakcijos tirpikliais. Mes, šiame tyrime panaudojame paprasčiausią etanolinių ištraukų gamybos būdą – maceraciją. Nors tai pats seniausias ištraukų iš sausos augalinės žaliavos gamybos metodas, bet jis po šiolei yra naudojamas gaminti ištraukas, skirtas naudoti moksliniams tyrinėjimams. Yra tyrimų, kuriuose nustatyta, kad šiuo metodu išekstrahuojama daugiau veikliųjų medžiagų nei kitais metodais (pvz.: perkoliacijos).[64]
2. METODIKA
2.1. Naudotos medžiagos, reagentai ir aparatūra
2.1.1. Naudotos medžiagos, reagentai
1) Vaistinio skaistenio žolė;2) Džiovinti vaistinio skaistenio milteliai iš „Feverfew“ kapsulės (Lindens Apothecary Ld., UK); 3) C2H5OH - etanolis 96% (UAB „Stumbras“ Lietuva);
4) Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Sigma-Aldrich); 5) Amplex Red reagentas (Sigma-Aldrich);
7) Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich);
8) Sudėtinis antibiotikų tirpalas (Penicilino – streptomicino tirpalas) (Sigma-Aldrich); 9) Tripsino/EDTA tirpalas (0,25%) (Sigma-Aldrich);
10) Triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich); 11) 2´, 7´-dichlorofluoresceino diacetatas (DCFH-DA).
2.1.2. Naudota aparatūra
1) Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) HF-1200 GD, A&D Company; 2) Spektrofotometras ,,IMPLEN“;
3) Fluorimetras ,,Fluorascan Ascent Themo Scientific“; 4) Fluorescencinis mikroskopas OLYMPUS IX71S1F-3; 5) Centrifuga „Eppendorf“.
2.2.1. Etanolinės ištraukos gamyba iš augalinės žaliavos
Etanolinė T. parthenium ištrauka buvo gaminama maceracijos būdu: gaminant paimta 0,5 g džiovintos augalinės žaliavos ir apipilta 5 ml 70 % (V/V) etanoliu. Palikta 7 paroms kambario temperatūroje, dažnai pamaišant. Po to skystis nupiltas, augalinė žaliava išspausta, perplauta nedideliu kiekiu 70 % etanolio (grynojo tirpiklio), ir dar kartą išspausta.
2.2.2.Etanolinės ištraukos ruošimas iš „Feverfew“ preparato kapsulės
2.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu būdu
Fenolinių junginių kiekio įvertinimui buvo pasirinktas spektrofotometrinis metodas. Tai optinis analizės metodas, kuris yra pagrįstas šviesos absorbcijos matavimu. Spektrofotometrinė analizė turi nemažai privalumų: ji yra ganėtinai greita, jai būdingas didelis atrankumas, naudojama santykinai nebrangi aparatūra, tiriamoji medžiaga tyrimo metu nėra suardoma, pasižymi didele metodikų gausa, kurias galima nesunkiai modifikuoti. Atliekant kiekybinį tyrimą spektrofotometriniu metodu, kaip pagrindas taikomas Bugero, Lamberto, Bero dėsnis. Juo nustatoma optinio tankio tiesioginė priklausomybė nuo šviesą sugeriančios medžiagos koncentracijos tirpale.[65;66]
Tyrimui buvo paruošti tiriamų mėginių atitinkamai praskiesti tirpalai. 1 ml tiriamo tirpalo sumaišytas su 4 ml paruošto Folin - Ciocalteu reagento ir 6 ml Na2CO3 7,5 % vandeninio tirpalo. Po 2 h
inkubacijos kambario temperatūroje, absorbcija matuota spektrofotometru esant bangos ilgiui 760 nm. Fenolinių junginių kiekis nustatytas pagal galo rūgšties kalibracinę kreivę.
2.4. Vandenilio peroksido koncentracijos tyrimas
Polifenoliniai junginiai geba sujungti laisvuosius radikalus, neutralizuoti reaktyvias deguonies (ROS) formas, dėl to jiems būdingas antioksidacinis aktyvumas. Preliminarūs augalinių žaliavų antioksidacinio aktyvumo tyrimai atliekami in vitro analitiniais metodais.
Antioksidacinis T.parthenium tiriamųjų mėginių aktyvumas šiame tyrime buvo tiriamas fluorimetriniu metodu. Fluorescencijos intensyvumas tiesiogiai proporcingas tiriamos medžiagos antioksidaciniam aktyvumui. Šiame tyrime vandenilio peroksido (H2O2) kiekiui nustatyti naudojamas
Amplex Red (10-acetil-3,7-dihidroksifenoksazinas) reagentas. Amplex Red (AMR) reagentas, esant krienų peroksidazei (HPR), reaguoja su H2O2 santykiu 1:1. Šios reakcijos metu susidaro raudonai
fluorescuojantis resurfinas (14 pav.) [67;68]
Eksperimentams naudojamos fluorimetrinės lėkštelės šulinėlių tūris yra 200 µl. Tikslūs reagentų tūriai parenkami eksperimentiškai. Į šulinėlį dedamas pasirinktas kiekis tiriamosios medžiagos tirpalo bei H2O2 tirpalo, 5 µM AMR tirpalo, 2 U/ml HPR tirpalo ir apskaičiuotas kiekis terpės – fosfatinio buferio.
2 pav. AMR virtimas fluorescuojančiu resurfinu [68]
2.5. Ląstelių kultūros kultivavimas
2.5.1.Ląstelių sėjimo metodika
Tyrimui buvo naudojama C6 ląstelių kultūra išgauta iš žiurkės smegenų auglio Glioblastoma multiforme. Ląstelėms augti buvo naudojama auginimo terpė DMEM su gliutamatu. Į terpę dedame FBS ir antibiotiko Penicilino/Streptomicino tirpalo (10000 IU/ml – 10000 μg/ml), tam kad nesidaugintų mikroorganizmai. Ląstelės buvo laikomos termostate, 37°C temperatūroje, 5 % CO2.
Ląstelių atkėlimui buvo naudojamas 0,25 % tripsino/EDTA tirpalas. Atšokusios ląstelės buvo centrifuguojamos 5 minutes 1500 apsisukimų/min greičiu.
2.5.2. Ląstelių tankio nustatymas
3 pav. Hemocitometro kamera. Ši kamera yra padalinta į devynis kvadratus 1.0 mm x 1.0 mm, kurie yra atskirti vienas nuo kito trigubomis linijomis. Kiekvienas kvadratas yra 1 mm² ploto [69]
Ląstelių skaičius 1 mililitre apskaičiuojamas pagal formulę: n = (a+b+c+d)*4*2*5000, kur:
n – ląstelių skaičius 1 ml;
a, b, c, d – ląstelių skaičius langeliuose; 5000 – konstanta;
2 – skiedimų skaičius.
2.6. Viduląstelinių ROS nustatymas DCFH metodu
4 pav. 2',7'-dichlorodihidrofluoresceino diacetatas (H2DCF-DA). Šio dažo chemiškai redukuota ir
acetilinta forma nefluorescuoja. Dažui patekus į ląstelės vidų esterazės nukerpa lipofilines acetato grupes. ROS oksiduoja šį dažą ir gaunamas stipriai fluorescuojantis junginys 2‘,7′-dichlorofluoresceinas (DCF) .[70]
2.7. Viduląstelinių superoksido radikalų koncentracijos tyrimas
Tyrimas buvo atliktas naudojant dažą MitoSOXRed, kuris yra mitochondrijose generuojamo superoksido indikatorius.
Ląstelės išsėjamos į 24 šulinėlius, po 5000 kiekviename šulinėlyje ir inkubuojama 24 h. Po inkubacijos pašalinama ląstelių augimo terpė, jas 2 kartus praplaunant PBS. Po to šulinėliai užpildomi HBSS su atitinkama koncentracija tiriamų tirpalų ir pridedama dažo MitoSOXRed (5 μM/ml), inkubuojama 10 min 37°C temperatūroje, apsaugotoje nuo šviesos vietoje.
Po 10min. inkubacinio periodo fotografuojama florescenciniu mikroskopu. Padaroma po 4 nuotraukas. Naudojant programą ImageJ paskaičiuojamas fluorescencinis intensyvumas.
Duomenų statistinis apdorojimas
3. REZULTATAI
3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu būdu
Vaistinio skaistenio augalinė žaliava ir iš jo pagamintas preparataas „Feverfew“ kapsulės (maisto papildas, Lindens Apothecary Ld., UK) buvo panaudoti etanolinių ištraukų gamybai. Ištraukos buvo gaminamos klasikinės maceracijos metodu, nufiltruotos ir toliau panaudotos tyrimams. Pirmuoju tyrimu buvo siekta įvertinti veikliųjų junginių kiekį etanolinėse ištraukose. Tyrimų rezultatai pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Fenolinių junginių kekis tiriamuosiuose tirpaluose
Tiriamasis tirpalas Fenolinių junginių koncentracija mg/ml
„Feverfew“ kapsulė 1,3 ± 0,2mg/ml *
Augalinė žaliava 3,9 ± 0,3 mg/ml
*Gauti rezultatai laikomi kaip statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su augaline žaliava (p < 0,05)
Tyrimų rezultatai parodė, kad fenolinių junginių kiekis nustatytas ištraukose, pagamintose iš augalinės žaliavos yra žymiai didesnis (net tris kartus) nei iš „Feverfew“ kapsulių.
Prashanth S. Su kolegomis įvairiais metodais atliko vandeninio ir etanolinio T.parthenium lapų ekstrakto fitocheminę analizę, kurios metu nustatė jo sudėtyje esančias medžiagas: angliavandenius, flavonoidus, terpenodus, glikozidus ir steroidus.[71]
Mokslininkas Changqing Wu su kolegomis nustatė, kad skaistenio ekstrakte, išgautame su 80 proc. alkoholio tirpalu yra: 0,30 ± 0,08 proc. kamparo, 0,22 ± 0,03 proc. partenolido, 0,84 ± 0,10 proc. liuteolino ir 0,68 ± 0,07 proc. apigenino. Bendras fenolinių junginių kiekis skaistenio ekstrakte buvo matuojamas 21,21 ± 2,11 mg galo rūgšties ekvivalentu sausos medžiagos miligrame.[61]
Kita mokslininkė Daniela Hanganu su kolegomis taip pat atliko tyrimą su vaistinio skaistenio ekstraktu, išgautu su 70 proc. etanoliu. Jie nustatė, jog T.parthenium ekstrakto sudėtyje bendras fenolinių junginių kiekis yra 3,48 ± 0,17/100g galo rūgšties ekvivalentu sausos medžiagos miligrame. [72]
3.2. Vandenilio peroksido koncentracijos tyrimas
Vandenilio peroksidas H2O2 – tai ne radikalas, tačiau aktyvus deguonies junginys, dalyvaujantis
susidarant kitiems radikalams. Jis ląstelėje gali susidaryti iš superoksido radikalo dismutacijos reakcijos metu. Žmogaus organizme vandenilio peroksidas susidaro fagocituojančiose ląstelėse, mitochondrijose, mikrosomose. H2O2 yra stabilus deguonies redukcijos produktas. Šis junginys laisvai keliauja vandeninėje
aplinkoje. Jis pasižymi silpnomis oksidacinėmis savybėmis, pažeisdamas biologines molekules, turinčias SH grupes ar FeS.[50;51;52]
Norint geriau įvertinti antioksidacinį aktyvumą bei stebėti fenolinių junginių įtaką H2O2 radikalo
neutralizavimui buvo dedamos skirtingų tūrių tiriamosios medžiagos. Tiriant T.parthenium etanolinių ištraukų preparatus pastebėta antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo bendro fenolinių junginių kiekio – didėjant fenolinių junginių kiekiui didėja H2O2 radikalo neutralizavimo geba.
5 pav. H2O2 kitimas veikiant jį skirtingais etanolinės ištraukos iš augalinės žaliavos (1:10) kiekiais
*p < 0,05 lyginant su kontrole
Vandenilio peroksidą veikiant skirtingais, dešimt kartų praskiestos etanolinės ištraukos iš augalinės žaliavos, kiekiais buvo nustatyti tokie pokyčiai: mėginiuose su 1 µl ir 2 µl tiriamosios medžiagos, lyginant su kontrole, neutralizuotas H202 kiekis nebuvo žymus: 3,6 proc., ir 8,5 proc.,
atitinkamai. Kituose mėginiuose, lyginant su kontrole, neutralizuotas H202 kiekis buvo didesnis: su 5 µl –
15,9 proc., su 10 µl – 26,8 proc., su 15 µl – 35,4 proc.
6 pav. H2O2 kitimas veikiant jį skirtingais etanolinės ištraukos iš „Feverfew“ kapsulės (1:10) kiekiais
*p < 0,05 lyginant su kontrole
Vandenilio peroksidą veikiant skirtingais, dešimt kartų praskiestos etanolinės ištraukos iš „Feverfew“ kapsulės, kiekiais buvo nusatyti tokie pokyčiai: lyginant su kontrole, mėginiuose su 1 µl, neutralizuotas H202 kiekis buvo 1,2 proc., su 3 µl – 4,9 proc., o su 5 µl – 9,7 proc. Mėginiuose su 10 µl ir
15 µl, lyginant su kontroliniu bandymu, H202 kiekis buvo ženkliai mažesnis – 17,1 proc., ir 21,9 proc.,
atitinkamai.
Šie rezultatai taip pat parodė, jog mėginiuose, kuriuose yra didesnis kiekis (µl) tiriamosios medžiagos, H2O2 kiekis (%) yra maženis.
Apibendrinimas. Lyginant gautus rezultatus, nustatėme, kad vandenilio peroksidas mėginiuose su 10 kartų praskiesta etanoline ištrauka iš T.parthenium augalinės žaliavos neutralizuotas stipriau nei su 10 kartų praskiesta etanoline ištrauka iš „Feverfew” kapsulės: 35,4 proc., ir 21,9 proc., atitinkamai. Taip pat pastebime, kad paveikus mėginius etanoline ištrauka iš T.parthenium augalinės žaliavos, stastistiškai reikšmingas vandenilio peroksidą neutralizuojantis poveikis, atsiranda greičiau. Dėl to stebimas antioksidacinis aktyvumas yra didesnis augalinės žaliavos ištraukoje.
Šie rezultatai įrodo fenolinių junginių gebėjimą neutralizuoti laisvuosius radikalus, kadangi prieš tai nustatėme, kad mūsų pagamintose etanolinėse ištraukose iš augalines žaliavos yra net tris kartus didesnis fenolinių junginių kiekis nei ištraukose iš „Feverfew“ kapsulių.
Kiti autoriai tirdami vaistinį skaistenį įvairiais metodais taip pat nustatė antioksidacinį šio augalo poveikį.
Mokslininko Changqing Wu su kolegomis atlikto tyrimo metu taip pat nustatytas skaistenio ekstrakto antioksidacinis aktyvumas, neutralizuojant laisvuosius radikalus 1,1-difenil 2-pikrilhidrazil (DPPH) ir dvivalentės geležies chelatinį pajėgumą. Jie nustatė, jog skaistenio alkoholinis ekstraktas turi stiprų DPPH laisvųjų radikalų neutralizavimo aktyvumą (84,4 proc.) bei vidutinį aktyvumą Fe2+ chelatų
susidarymui (53,1 proc.). Be to, nustatytas stiprus luteolino DPPH radikaus neutralizuojantis poveikis (maždaug 80 proc., kai p 0,52 mg/ml). Partenolidas turėjo silpną DPPH radikalus neutralizuojantį poveikį (15 proc.) bei vidutinį – dvivalentės geležies chelatų susidarymui (beveik 60 proc.). Panašus vidutinio stiprumo poveikis dvivalentės geležies chelatų susidarymui (apie 60 proc.) buvo pastebėtas tiriant luteoliną ir apigeniną, esant 2 mg/ml koncentracijai.[61]
3.3. Viduląstelinių ROS tyrimas DCFH metodu
Laisvieji radikalai yra vieni iš svarbiausių veiksnių ląstelėje sukeliančių pažaidas, be to, jie dažnai siejami su organizmo senėjimo procesais. Todėl pasaulyje daug dėmesio skiriama su ROS susijusiems tyrimams. Viduląsteliniams procesams tirti dažniausiai naudojami dažai, kurie reaguodami su ROS fluorescuoja. Fluorescencija gali būti nustatoma spektrofotometriniu būdu. Literatūroje dažnai minimas 2′,7′-dihidrodichlorofluorescein diacetatas (H2DCF-DA). Šis dažas reaguoja su įvairiom ROS
formom.[51;70]
7 pav. viduląstelinių ROS kiekio kitimas, veikiant jį 10 kartų praskiestos augalinės žaliavos etanoline ištrauka
1 µl yra 0,39 µg fenolinių junginių; *p < 0,05 lyginant su kontrole.
Pradiniame matavimo taške (0 min.) mėginiuose su 1-3 µl tiriamosios medžiagos, poveikis viduląstelinių ROS kiekiui nepastebėtas. Tuo tarpu mėginiuose su 4-6 µl tiriamosios medžiagos jau matomas viduląstelinių ROS kiekį mažinantis poveikis– 20,2-22,1 proc.
Po 15 min. viduląstelinių ROS kiekis, lyginant su pradiniu tašku kontrolėje, padidėjo 12 proc. Kituose mėginiuose su tiriamąja medžiaga, viduląstelinių ROS kiekis padidėjo sekančiai: su 1-2 µl tarp 11,5-10 proc., su 3-4 µl – 9,3-8,6 proc., o su 5-6 µl – 8,3-5,8 proc.
Po 30 min. viduląstelinių ROS kiekis, lyginant su kontroliniu mėginiu nuliniame taške, padidėjo 35 proc., o kituose mėginiuose jis didėja priklausomai nuo koncentracijos: su 1-3 µl – 28,7-24,4 proc., o su 4-6 µl – 17-14,1 proc.
Po 60 min. viduląstelinių ROS kiekis kontroliname mėginyje, lyginant su kontrole pradiniame taške, padidėja 50,2 proc., o rezultatai kituose mėginiuose lieka mažesni ir svyruoja nuo 36 proc. iki 47 proc.
Po 90 min. viduląstelinių ROS kiekis kontrolėje, lyginanant su pradiniu tašku, didėja 62 proc., o kituose mėginiuose didėja tarp 47,7-54 proc.
Mėginiuose su 4-6 µl, viduląstelinių ROS kiekis visuose laiko tarpuose buvo mažesnis nei kituose mėginiuose, kuriuose buvo 1-3 µl tiriamosios medžiagos. Tačiau, kontrolėje šių medžiagų kiekis, visuose laiko tarpuose, vistiek išliko didžiausias.
8 pav. viduląstelinių ROS kiekis, veikiant juos 10 kartų praskiesta etanoline ištrauka iš „Feverfew“ kapsulės
1 µl yra 0,13 µg fenolinių junginių; *p < 0,05 lyginant su kontrole
Pradiniame periode visuose mėginiuose nustatytas daugmaž vienodas viduląstelinių ROS kiekis. Po 15 min. kontrolėje, lyginant su pradiniu matavimo tašku, viduląstelinių ROS kiekis padidėja 12 proc., tuo tarpu su mūsų tirta medžiaga (1-6 µl) padidėja 11,8-8,3 proc.
Po 30 min. pradėjo matytis ryškesni skirtumai. Kontrolėje, lyginant su pradiniu tašku, viduląstelinių ROS kiekis padidėjo 35,3 proc., o tirtoje medžiagoje H2O2 priklausė nuo tiriamosios
medžiagos kiekio mėginyje: su 1µl – 32,5 proc., mažėjančia tvarka iki – 17,2 proc.(su 6 µl).
Po 60 min. viduląstelinių ROS kiekis kontrolėje, lyginant su pradiniu tašku (0 min.) padidėjo iki 50,2 proc., tuo tarpu tirtoje medžiagoje buvo tarp 45,1-48,6 proc.
Po 90 min. viduląstelinių ROS kiekis kontrolėje (lyginant su pradiniu tašku (0 min.)) – 62,1 proc., o mėginiuose su mažiausiu kiekiu (1 µl) tiriamosios medžiagos padidėjo iki 58,3 proc., o kai kuriuose – 50,2-49,7 proc. (su 5-6 µl).
Po 150 min. kontrolėje viduląstelinių ROS kiekis buvo beveik 80 proc. (79,9 proc.), tuo tarpu mėginiuose su tiriamąja medžiaga 73,8-76,1 proc.
Pastebima, jog daugumoje mėginių, kuriuose yra didesnis kiekis (µl) tiriamosios medžiagos, viduląstelinių ROS kiekis (%) yra maženis.
9 pav. viduląstelinių ROS kitimas veikiant juos augalinės žaliavos etanoline ištrauka
1 µl yra 3,9 µg fenolinių junginių; *p<0,05 lyginant su kontrole
Pradiniame matavimo taške (0 min.), mėginiuose su 1-4 µl tiriamosios medžiagos, lyginant su kontrole, statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo. Tačiau pridėjus 5-6 µl tiriamosios medžiagos jau stebėtas statistiškai reikšmingai mažesnis viduląstelinių ROS kiekis – 29-36,7 proc.
Po 15 min. jau galime pamatyti didesnius skirtumus visuose mėginiuose. Kontrolėje, lyginant su pradiniu matavimo tašku, viduląstelinių ROS kiekis padidėjo 12 proc., su 1 µl tiriamosios medžiagos – 10,8 proc., su 2 µl tiriamosios medžiagos – 10,2 proc., su 3 µl – 9,2 proc., su 4 µl –8,3 proc., su 5 µl – 5,9 proc., su 6 µl – 5,4 proc.
Po 30 min., lyginant su kontroliniu tašku nuliniame laike, kontrolėje viduląstelinių ROS kiekis buvo pakilęs 35 proc., mėginiuose su 1-3 µl tiriamosios medžiagos jis nustatytas 27-25,2 proc., o su 4-6 µl 25-23,8 proc.
