Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

GRETA PAPLAUSKAITĖ

IN SILICO PAREMTA 5-VINILSULFONAMIDO TETRAZOLO

SINTEZĖ, GRYNINIMAS IR ANALIZĖ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

prof. dr. Hiliaras Rodovičius

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, ____________ Data 2017 __ __

IN SILICO PAREMTA 5-VINILSULFONAMIDO TETRAZOLO SINTEZĖ, GRYNINIMAS IR

ANALIZĖ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius, ___________ Data 2017 __ __

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė

______________________ Greta Paplauskaitė, _______________ Data 2017 __ __ Data 2017 __ __

TURINYS

1. Tetrazolų struktūra ir jų fizikocheminės savybės ... 12

1.1.Struktūra ir tautomerizacija ... 12

1.2.Rūgšties-bazės savybės ... 13

2. Tetrazolai kaip bioizosterai ... 14

3. Tetrazolų biologinis aktyvumas bei panaudojimas ... 16

4. Duomenų bazės ... 19

4.1.PubChem duomenų bazė ... 20

4.2.PubChem duomenų bazės pritaikymas virtualiai atrankai ... 21

4.3.SID, CID ir AID ... 21

4.4.Struktūros paieška ... 22

4.5.Struktūrų parsisiuntimas... 22

METODIKA ... 24

1. Tetrazolo struktūrinio fragmento in silico tyrimų metodika ... 24

2. Naudotos medžiagos ir tirpikliai ... 24

3. Junginių sintezės metodikos ... 24

4. Junginių analizės metodikos ... 25

4.1.FT-IR spektroskopija ... 25

4.2.ESC-MS spektrometrija ... 26

4.3.UV spektrofotometrija ... 28

4.4.Preparatyvinė chromatografija ... 28

1. Tetrazolo ir sulfonamido fragmentų atranka ... 30

2. Tetrazolo sintezė ... 34

3. Junginių analizės rezultatai ... 34

3.1.FT-IR spektroskopijos rezultatai ... 34

3.2.ESC-MS analizės rezultatai ... 35

3.3.UV spektrofotometrijos analizės rezultatai ... 39

3.4.Preparatyvinės chromatografijos analizės rezultatai ... 40

IŠVADOS ... 42

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43

SANTRAUKA

Magistro baigiamąjį darbą, tema „In silico paremta 5-vinilsulfonamido tetrazolo sintezė, gryninimas ir analizė“, atliko Greta Paplauskaitė. Darbo vadovas – prof. dr. Hiliaras Rodovičius. Darbo atlikimo vieta – Lietuvos Sveikatos Mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Vaistų chemijos katedra, Kaunas.

Darbo tikslas – sintezuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą, remiantis in silico parametrais. Darbo uždaviniai:

1. Optimizuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą, remiantis in silico atliktais tyrimais. 2. Atlikti PubChem duomenų bazės tetrazolo žiedą turinčių darinių kiekybinę analizę. 3. Sintetinti 5-vinilsulfonamidtetrazolą, atlikti jo gryninimą ir analizę.

4. Remiantis 5-vinilsulfonamidtetrazolo fragmentu sukurti virtualią biblioteką in silico.

Tyrimo metodika: Nustatant tetrazolo, kaip struktūrinio fragmento, parametrus in silico, buvo panaudoti šie programiniai paketai: Jchem for excel; Schrodinger; Schrodinger modulis Canvas; Interactive enumeration, Instant Jchem. Junginių struktūrų paieškai naudotas PubChem paieškos įrankis. Virtuali biblioteka sukurta naudojantis Maestro Schrodinger Interactive Enumeration paketu. Atlikta junginių sintezė ciklizacijos bei adicijos metodu.Vykdytas galutinio produkto gryninimas preparatyvinės chromatografijos pagalba. Gautų produktų tapatybei ir grynumui nustatyti buvo atliekama FT-IR, UV ir MS spektrų analizė.

Tyrimo rezultatai: apskaičiuoti struktūrinių fragmentų parametrai in silico, jie analizuoti bei

sudaryta biblioteka, iš kurios pasirinktas junginys sintezei. Pirmos pakopos sintezės metu gautas junginys aminotetrazolas, vėliau antrosios pakopos metu iš šio produkto sintezuotas 5-vinilsulfonamido tetrazolas. Sintezuoto junginio grynumas - 95 %.

Tyrimo išvados: Remiantis in silico rezultatais buvo aptimizuotas tetrazolo struktūrinis fragmentas. Nustatyta, kad tetrazolas, turintis sulfanilamido fragmentą, lyginant su tetrazolu bei 5-aminotetrazolu, turi pagerintą LogS, LogP, LogD, pKa, pKb, PSA. Be to, tetrazolo sulfanilamido junginys turi geresnes minėtas reikšmes esant skirtingoms pH reikšmėms. Atlikus PubChem duomenų bazės junginių, turinčių struktūrinę tetrazolo žiedą kiekybinę analizę, nustatyta, kad iš 682603 substruktūrų tik 533 substruktūros turi pagerintą, tetrazolo sulfanilamido fragmentą. Papildomų struktūrinių kriterijų paieška parodė, jog 5-vinilsulfonamidtetrazolo nebuvo rasta. Sintezuotas pasirinktas 5-vinilsulfonamidtetrazolas, gauta 65% išeiga, atlikus preparatyvinę chromatografiją nustatytas 95% grynumas. Šis junginys buvo susintezuotas pirmą kartą, literatūros apie jį nerasta. Dėl 5-vinilsulfonamidtetrazolo hidrofiliškumo įprastais analizės metodais bei keičiant kolonėles (stacionarias fazes ir fizinius parametrus) nebuvo galima identifikuoti, junginys išsiplauna su tuščiu

kolonėlės tūriu. Tuomet buvo taikyta derivatizacijos reakcija su benzoilchloridu, buvo stebima atskirta junginio smailė, sulaikymo trukmė 14,823 min. 5-vinilsulfonamidtetrazolo fragmento įvedimas į in silico sukurtą junginių biblioteką, dėl savo struktūrinių ypatumų, išreikšto didesnio LogS, LogP, LogD ir kitų fizikochemininių parametrų, potencialiai pagerina ADME parametrus.

SUMMARY

Master thesis of Greta Paplauskaitė ― „In silico driven synthesis of 5-vinylsulfonamide tetrazole“. Tutor Hiliaras Rodovičius, professor, Ph.D. Lithuanian University of Health Sciences, faculty of Pharmacy, department of Drug Chemistry.

Aim of study: to perform synthesis of tetrazole structural fragment based on in silico. Study objectives:

1. To depick tetrazole structural fragment based on in silico parameters.

2. To accomplish quantitative analysis of depickted tetrazole ring derivatives in PubChem database. 3. To synthesize 5-vinylsulfonamidtetrazole, perform purification and analysis.

4. To design virtual library in silico based on 5-vinylsulfonamidtetrazole fragment.

Study methods: in determining the tetrazole as a structural fragment parameters in silico, were used following software packages: Jchem for excel; Schrodinger; Schrodinger Canvas; Instant Jchem. In search for structures of compounds used PubChem search tool. Virtual library created with Maestro Schrodinger Interactive Enumeration package. Synthesis of compounds were done by cyclization and addition reactions. Purification of the final product conducted by preparative chromatography. The final product structiure and purity was confirmed by means of FT-IR, UV and LC-MS analitic methods.

Study results: the parameters of structural fragments in silico was calculated, analyzed and composed virtual library, from which the compound for the synthesis was selected. The first step the intermidiate 5-aminotetrazole was synthetized by cyclization. Further reaction with ethenesulfonyl fluoride yielded target 5-vinylsulfonamidtetrazole. The purity after preparative purification of the final product was 95%.

Conclusions: on the basis of parameters in silico, tetrazole structural fragment was optimized. In silico results showed that tetrazole with sulphanilamide fragment, comparing with tetrazole and 5-aminotetrazole, has improved LogS, LogP, LogD, pKa, pKb, PSA. Furthermore, sulphanilamide tetrazole compound has improved above mentioned meaning at different pH values. After structural quantitative analysis in PubChem database, there was found 682 603 substructures of witch only 533 substructures has improved sulphanilamide tetrazole moiety. Additional criteria for structural analysis showed that 5-vinylsulfonamidtetrazole hasn‘t been found. The synthesis of 5- vinylsulfonamidtetrazole was achieved in 65% yield, after preparative chromatography obtained 95% purity. This compound has been synthesized for the first time. Because of 5-vinylsulfonamidtetrazole hydrophilicity by conventional methods of analysis and by changing the colums (stationary phase and physical parameters) it was not possible to identify, compound elutes with the empty volume of the column. There was applied derivatization reaction with benzoyl chloride, it was observed the peak separation of

the compound, retention time 14,823 min. 5-vinylsulfonamidtetrazole fragment introduction into the in silico generated library of compounds, due to its structural features, expressed improved LogS, LogP, LogD and others physico chemical parameters, pottentially improved ADME parameters.

SANTRUMPOS

pKa – rūgšties disociacijos konstanta, rūgštingumo konstanta, apibūdina vandenilio jonų atskilimo

laipsnį nuo vandenyje ištirpusios rūgšties. Ϭp – polinės jėgos parametras,

π – pakaitų hidrofobiškumo rodiklis, MR – molekulinis refraktyvumas

Å – angstremas, ilgio matavimo vienetas, lygus 10-10 metro, juo matuojami atomų dydžio objektai. FT-IR – Furje transformuota infraraudonųjų spindulių spektrometrija.

ESC-MS – efektyvioji skysčių chromatografija-masių spektometrija. MS/MS – tandeminė masių spektrometrija.

m/z – masės-krūvio santykis

SĄVOKOS

Tautomerija – dinaminė izomerija, rėiškinys, kai vienas tautomeras lengvai virsta kitu ir tarp jų nusistovi pusiausvyra.

Bioizosterai – tai pakaitai ar grupės, kurie suteikia panašias biologines savybes cheminiui junginiui. Planarinė struktūra – struktūra plokštumoje.

Duomenų bazė – tai organizuotas duomenų rinkimas bet kurioje srityje.

PubChem – yra vieša informacijos apie chemines medžiagas ir jų biologinį aktyvumą saugykla, sukurta 2004 metais kaip JAV Nacionalinio sveikatos instituto dalis.

ĮVADAS

Heterocikliniai junginiai, savo struktūroje turintys kelis azoto atomus, yra mokslininkus dominantis objektas dėl savo ypatingų savybių. Šie junginiai itin lipofiliški bei pasižymi plačiu biologiniu aktyvumu. Vienas iš tokių junginių – tetrazolas, penkianaris žiedas, savo struktūroje turintis net 4 azoto atomus. Susidomėjimas tetrazolų molekuline struktūra, fizikocheminėmis savybėmis ir pritaikymu nuolat auga [1].

Pirmasis tetrazolas buvo susintetintas 1885 metais švedų mokslininko J.A. Bladin‘o, Upsalos universitete vykdant cianogeno ir fenilhidrazino kondensacijos produkto – dicianofenilhidrazino – reakcijų tyrimus [2]. Vėliau tyrinėjant šį junginį buvo atrastos įvairios savybės, suteikiančios jam unikalumą.

Tetrazolo žiedas egzistuoja dvejomis tautomeriškomis formomis, pasižymi ir rūgštinėmis, ir bazinėmis savybėmis. Taip pat jis yra ne klasikinis karboksirūgšties bioizosteras. Šios savybės atradimas paskatino mokslininkus dar labiau susidomėti tetrazolo struktūrinio fragmento pritaikymo galimybėmis vaistinių medžiagų sintezėje [3].

Šios įvairios unikalios fizikocheminės tetrazolo savybės bei platus tetrazolo darinių biologinis aktyvumas paskatino pasirinkti šį fragmentą virtualios bibliotekos kūrimui ir sintezei.

Darbo tikslas – sintezuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą, remiantis in silico parametrais. Darbo uždaviniai:

1. Optimizuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą remiantis in silico atliktais tyrimais. 2. Atlikti PubChem duomenų bazės tetrazolo žiedą turinčių darinių kiekybinę analizę. 3. Sintetinti 5-vinilsulfonamidtetrazolą, atlikti jo gryninimą ir analizę.

LITERATŪROS APŽVALGA

1. Tetrazolų struktūra ir jų fizikocheminės savybės

1.1. Struktūra ir tautomerizacija

Tetrazolas – tai penkianaris poliazo junginys su dvigubai neprisotintu žiedu, kurį sudaro vienas anglies ir keturi azoto atomai [4]. Patys tetrazolai gali egzistuoti dvejomis tautomeriškomis formomis – I, kur vandenilio atomas yra prie 1 azoto (1H-tetrazolas) bei II, kur vandenilio atomo pozicija yra prie 2 azoto (2H-tetrazolas). Abu tautomerai pavaizduoti 1 paveikslėlyje, b dalyje [5].

Šios dvi formos tirpaluose egzistuoja pusiausvyroje. Jų santykis kiekviename tirpale priklauso nuo tirpiklio poliariškumo bei pakaito, esančios 5 padėtyje, prigimties, jo savybių [6]. 2H-tetrazolas yra stabilesnis už tautomerinę 1H-tetrazolo formą [7]. Del esamos tautomerijos yra žinomi mono- ir di- substituoti tetrazolų dariniai. Be to, tetrazolo žiedas gali įeiti į kondensuotų heterociklinių junginių struktūras [5].

N

H

N

N

N

N

H

N

N

N

N

N

N

H

N

I

II

a)

b)

1 pav. Tetrazolo žiedo numeracija ir tautomerizacija

a) Pavaizduota tetrazolo IUPAC nomenklatūrinė numeracija. Žiedas numeruojamas parodant žemiausią heteroatomų (azoto) poziciją [8]. b) Pateiktos 1H-tetrazolo (I) bei 2H-tetrazolo

struktūros (II).

Ši heteroaromatinė sistema turi didžiausią galimą azoto atomų skaičių po pentazolo, kurį sudaro net penki azoto atomai [9]. Pentazolo struktūra pavaizduota 2 paveikslėlyje. Būtent dėl didelio azoto atomų skaičiaus savo struktūroje tetrazolai demonstruoja ekstremalias rūgštingumo, bazingumo ir kompleksų susidarymo konstantų reikšmes [10].

N

N

H

N

N

N

2 pav. Pentazolo struktūra

1.2. Rūgšties-bazės savybės

Rūgštingumas. Tetrazolai yra heterociklinės NH rūgštys, kurių pKa reikšmių diapazonas yra nuo 1 iki 7 pH vienetų. Atsižvelgiant į prototropinę tautomerizaciją, tetrazolų disociacija pavaizduota 3 paveikslėlyje [11]. H₂O ₊ N H N N N R N N NH N R H₂O + N N N N R - + H3O + K_T K_a2 K_a1 T

-3 pav. Rūgštinė tetrazolų disociacija

Ka1 ir Ka2 yra 1H ir 2H tautomerų disociacijos konstantos, T- yra tetrazolo anijonas.

Pakaito, pridėto prie žiede esančio anglies atomo, pobūdis turi lemiamą poveikį tetrazolų rūgštingumui [11]. Pats tetrazolas [12] yra vidutinio stiprumo rūgštis. Apibendrinant galima būtų pastebėti, kad 5 padėtyje substitutų tetrazolų pKa reikšmės panašios į karboksilinių rūgščių reikšmes [11].

Baziškumas. Tetrazolai yra silpnos organinės bazės ir yra protonizuojamos, kai ištirpinamos rūgštyse. Protono prisijungimo vieta yra sunkiai prognozuojama, kadangi tetrazolo žiedas turi keletą potencialių protono prisijungimo centrų. Tetrazolų disociacija rūgštyse pavaizduota 4 paveikslėlyje.

N

H

N

H

N

N

+

H

_N

H

N

N

N

H

_N

N

N

N

H2

+

4 pav. Bazinė tetrazolų disociacija

Paveikslėlyje pavaizuota kaip tetrazolo žiedas protonizuojamas jį ištirpinus rūgštyse.

Tetrazolo žiede 1 arba 4 pozicijose esantys azoto atomai gali būti protonizacijos centrais, priklausomai nuo to, kur elektronų tankio pasiskirtymas tetrazolo žiede yra maksimalus [13, 14]. Protonizacijos vieta taip pat gali priklausyti nuo pakaitų, esančių žiede, pobūdžio bei padėties [11].

2. Tetrazolai kaip bioizosterai

Bioizosterai – tai pakaitai ar grupės, kurie suteikia panašias biologines savybes cheminiui junginiui. Bioizosterai gali būti skirstomi į klasikinius ir neklasikinius. Abiejų grupių pavyzdžiai pateikiami 5 paveikslėlyje. Klasikiniai bioizosterai yra skirstomi į monovalenčius (D ir H; F ir H; NH ir OH; RSH ir ROH; F, OH, NH2 ir CH3; Cl, Br, SH ir OH; C ir Si), bivalenčius (C=C, C=N, C=O, C=S; –CH2–, –NH–, –O–, –S–; RCOR', RCONHR', RCOOR', RCOSR') ir trivalenčius (R3CH, R3N; R4C, R4Si, R4N+; alkenai, iminai; –CH=CH–, –S–; –CH= IR –N=C). Ne klasikiniai bioizosterai gali būti skirstomi į ciklinius ir neciklinius. Be to, ne klasikiniai izosterai taip pat gali turėti keičiamosios grupės izosterizmą, kuriame atskirų funkcinių elementų savybės yra vienos kitą pamėgdžiojančios [15].

5 pav. Bioizosterų grupės

Paveikslėlyje pateikiama bioizosterų klasifikacija.

Vieno bioizostero keitimo kitu tikslas – sureguliuoti bioaktyvių juginių farmakokinetines ir farmakodinamines savybes [10]. Vienas iš dažniausiai vykdomų monovalentinių izosterinių mainų yra vandenilio keitimas fluoru, siekiant pagerinti metabolinį stabilumą. Klasikinis tokių mainų pavyzdys yra antineoplastinis vaistas 5-fluorouracilas (5-FU). Vandenilio pakeitimas fluoru taip pat pritaikytas ir kondensuotuose naftildiazepinuose. Šie minėti izosteriniai mainai pavaizduoti 6 paveikslėlyje [16].

Bioizosterai

Klasikiniai bioizosterai

Monovalenčiai Bivalenčiai Trivalenčiai

Ne klasikiniai bioizosterai Cikliniai ir necikliniai Keičiamos grupės izosterizmas

N N H O O R H N N H O O R F N N O H3C H N N O H3C F

a)

b)

6 pav. Monovalentiniai izosteriniai mainai

Paveikslėlyje pavaizduotas vandenilio pakeitimas fluoru a) 5-fluorouracilo molekulėje; b) naftildiazepino molekulėje.

Daugelio klasikinių bioizosterinių junginių cheminis ir fizinis panašumas yra akivaizdus, pvz. vandenilis ir fluoras, esteris ir amidas, fenilas ir tiofenas, tačiau yra nemažai ne klasikinių bioizosterinių pakaitų, kurie neturi fizikocheminių panašumų [10]. Bioizosterinių junginių panašumas pavaizduotas 7 paveikslėlyje. H O O R N O R S

a)

b)

c)

7 pav. Bioizosterinių junginių panašumas

Paveikslėlyje vaizduojamas klasikinių bioizosterinių junginių panašumas: a) vandenilio ir fluoro; b) esterio ir amido; c) fenilo ir tiofeno.

Tetrazolais mokslininkai susidomėjo dėl jų neklasikinio bioizosteriškumo vienam iš dažniausiai naudojamų fragmentų – karboksilo [3]. 1 lentelėje pateikiamas fizikocheminių savybių karboksigrupės ir jos anijoninio darinio su tetrazolu, neutralios bei anijoninės būklės, palyginimas.

1 lentelė. Karboksilinės rūgšties ir tetrazolo fizikocheminių savybių palyginimas [16]

Ϭp – polinės jėgos parametras, π – pakaitų hidrofobiškumo rodiklis, MR – molekulinis refraktyvumas.

Bioizosterai Ϭp π MR O O H 0,45 -0,32 6,9 O O 0,00 -4,36 6,0 N H N N N 0,56 -0,48 15,6 N N N N 0,35 -3,55 14,6

Tetrazolai yra jonizuoti esant fiziologiniam pH ir eksponuoja planarinę struktūrą kaip ir karboksirūgštis. Tačiau buvo nustatyta, kad anijoniniai tetrazolai yra beveik 10 kartų lipofiliškesni nei atitinkami karboksilatai, nors turi panašų rūgštingumą [17]. Be to, tetrazolo radikalas yra metaboliškai stabilesnis nei pati karboksigrupė. Planarinės tetrazolo žiedo bei šios rūgšties struktūros pateikiamos 8 paveikslėlyje.

N

N

N

N

O

O

2,6 Å

2,2 Å

8 pav. Karboksirūgšies ir tetrazolo žiedo planarinės struktūros

Paveiklėlyje pateikiamas karboksirūgšties ir tetrazolo žiedo struktūrinis panašumas.

3. Tetrazolų biologinis aktyvumas bei panaudojimas

Tetrazolų dariniai gana plačiai naudojami medicinoje. Vienas pirmųjų medicininių preparatų, turinčių savo struktūroje tetrazolo fragmentą, gana plačiai naudotas, buvo ciklopentametilentetrazolas (Corazole) [18]. Kiti pavadinimai: pentyleno tetrazolas, kardiazolas, metrazolas.

Ciklopentametilentetrazolas – yra prototipinis anksiogeninis vaistas [19]. Žmonių farmakoterapijoje jis buvo naudojamas kaip prieštraukulinis vaistas, bet vėliau buvo atrasta, jog šis preparatas terapinėmis dozėmis sukelia nerimą ir panikos priepuolius [20–22]. Šio junginio struktūra pavaizduota 9 paveikslėlyje.

N

N

N

N

Paveikslėlyje pavaizduotas vienas pirmųjų medicininių preparatų, turinčių savo struktūroje tetrazolo fragmentą (Corazole).

Tetrazolai dažniausiai naudojami kaip metabolizmui atsparūs izosteriniai karboksirūgščių pakaitalai. Jie yra atsparūs biologinei degradacijai. Ši savybė leidžia naudoti tetrazolus kaip izosterinius įvairių funkcinių grupių pakaitus kuriant naujus biologiškai aktyvius junginius. Tetrazolo motyvas buvo naudotas įvairių vaistų farmakoforų sintezei, kaip tinkamas karboksirūgščių fragmento pakaitas, naudojant skirtingus metodus sintezei bei skirtingas reakcijų sąlygas [10].

Nors tetrazolų junginiai tik labai retais atvejais randami natūraliai gamtoje, tačiau tetrazolų dariniai pasižymi labai įdomiomis farmakologinėmis bei biologinėmis savybėmis ir plačiu biologiniu aktyvumu. Iki šiol daugelis tetrazolo pagrindą turinčių darinių, buvo sėkmingai ištirti, praėjo klinikinius tyrimus arba yra jų ketvirtoje fazėje bei pradėti vartoti klinikinėje praktikoje. Keletas jų pavyzdžių – antihipertenzinis vaistas losartanas [23], antibakterinis preparatas ceforanidas [24], antikoaguliantas cilostazolis [25], priešastminis preparatas pranlukastas [25], diuretikas azosemidas [26] ir skausmą blokuojantis alfentanilis [27]. Šių vaistų struktūros pavaizduotos 10 paveikslėlyje.

N S O NH O NH₂ O O H S N N N N O OH H H N Cl OH N N N H N N Losartanas Ceforanidas O N H O N N N N O NH O O N NH N N O Cilostazolis Pranlukastas

S

NH

N

N

H

N

N

S

O

O

N

H

Cl

N

N

N

N

N

O

N

O

O

10 pav. Įvairaus biologinio aktyvumo vaistai, turintys savo struktūroje tetrazolo fragmentą

Paveiksle pavaizduoti junginiai pasižymi tokiu biologiniu aktyvumu: losartanas – antihipertenziniu, ceforanidas – antibakteriniu, cilostazolis – antikoaguliaciniu, pranlukastas –

Be to, nemažai tetrazolo darinių yra pradinėse klinikinių tyrimų stadijose. Neseniai atliktas tyrimas su 5-(o-tolyl)-1H tetrazolo dariniais, kur buvo vertinti šių junginių tyrimų rezultatai in vivo su gyvūnais. Rezultatai parodė, jog kai kurie šios grupės junginiai pasižymi geru prieštraukuliniu aktyvumu, ypač aktyvūs ir mažai toksiški buvo 1-(3-fluorobenzyl)-5-(o-tolyl)-1H tetrazolas bei 1-(2-methylbenzyl)-5-(o-tolyl)-1H tetrazolas. Šie junginiai gali būti toliau modeliuojami, modifikuojami ir tiriami, siekiant sukurti dar aktyvesnius analogus [28]. Minėti junginiai pavaizduoti 11 paveikslėlyje.

N N

N

N

F

N N

N

N

a)

b)

11 pav. 5-(o-tolyl)-1H tetrazolo dariniai

a) 1-(3-fluorobenzyl)-5-(o-tolyl)-1H tetrazolas; b) 1-(2-methylbenzyl)-5-(o-tolyl)-1H tetrazolas

4. Duomenų bazės

Duomenų bazė – tai organizuotas duomenų rinkimas bet kurioje srityje. Mokslinės duomenų bazės kaupia ir sistemina mokslinę informaciją iš mokslinių, apžvalginių straipsnių, konferencijų, atvejų ataskaitų, publikuojamų profesionaliuose žurnaluose, patentų bei informaciją iš kitų platformų. Duomenų bazės suteikia informaciją apie temas, autorius, talpina straipsnių santraukas, leidinių pavadinimus ir tipus bei nuorodas [29]. Šias duomenų bazes kuria įvairios institucijos, tokios kaip profesionalios cheminės organizacijos (ChemSpider), akademinės įstaigos (ZINC), ar viešosios visuomenės pelno nesiekiančios (Vikipedija). Tik rinkti duomenis nepakanka, taip pat labai svarbu užtikrinti, kad tie duomenys būtų teisingi. Viešose duomenų bazėse tai daroma peržiūrint duomenis, atnaujinant ir taisant klaidas bei validuojant (formalios tyrimo procedūros skirtos įvertinti, ar tam tikri duomenys yra teisingi). „Vartotojų“ pateikti šaltiniai, tokie kaip Vikipedija yra sunkiai kuruojami. Techniškai kontroliuojamos duomenų bazės, tokios kaip PubChem yra geriau kontroliuojamos (pvz. automatiškai tikrinama, kad anglies atomai neturėtų daugiau nei keturių jungčių) [30].

4.1. PubChem duomenų bazė

PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) yra vieša informacijos apie chemines medžiagas ir jų biologinį aktyvumą saugykla, sukurta 2004 metais kaip JAV Nacionalinio sveikatos instituto dalis (part of the Molecular Libraries and Imaging (MLI) component of the National Institutes of Health (NIH) Roadmap for Medical Research initiative) [31]. Pastaruosius vienuoliką metų ši duomenų bazė išaugo į gana didelę sistemą, veikiančią kaip cheminės informacijos šaltinis mokslinių tyrimų bendruomenei. PubChem sudaro trys tarpusavyje susijusios duomeų talpyklos – Medžiagos (PubChem Substance), Junginiai (PubChem Compound) ir Bioaktyvumas (PubChem BioAssay).

PubChem duomenys yra teikiamos iš daugiau nei 500 tiekėjų (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/sources/), įskaitant universitetų laboratorijas, valstybines

organizacijas, farmacines kompanijas, cheminių medžiagų pardavėjus, leidėjus ir daugelį kitų cheminių, biologinių šaltinių. Duomenys, patvirtinti šių šaltinių apima ne tik mažas molekules, bet ir siRNR, miRNR, angliavandenius, lipidus, peptidus, cheminiu būdu modifikuotas makromolekules ir pan. PubChem duomenų organizacija pavaizduota 12 paveikslėlyje [32]. Ši pateikta schema parodo duomenų tėkmę tarp trijų pagrindinių duomenų bazių.

12 pav. Duomenų organizacija PubChem duomenų bazėje

PubChem Medžiagos (PubChem Substance) duomenų bazė talpina cheminių mėginių aprašus, depozitorių patvirtintus duomenis ir nuorodas duomenis apie biologinį aktyvumą. Aprašai turi PubChem Junginių identifikatorius (CID), jei junginių cheminė struktūra yra gerai žinoma. Nuorodos į biologinio aktyvumo informaciją apima PubMed (http://pubmed.gov) citatas, baltymų 3D

struktūras[33], nuorodas į tiekėjų internetinius puslapius ir biologinių testų rezultatus, esančius PubChem Bioaktyvumo duomenų bazėje.

PubChem Junginių duomenų bazė talpina unikalių cheminių struktūrų informaciją iš PubChem Medžiagų duomenų bazės. Junginiai gali būti ieškomi pagal apskaičiuotas chemines savybes ir yra suskirstyti pagal struktūros sugretinimą, atsižvelgiant į tapatumą bei panašumą. Kur tik įmanoma, pateikiamos nuorodos per PubChem Medžiagų duomenų bazę į jų biologinio aktyvumo informaciją.

4.2. PubChem duomenų bazės pritaikymas virtualiai atrankai

PubChem duomenų bazė siūlo visapusišką cheminę informaciją, naudingą vaistų atradimui. Ji taip pat suteikia kelias programines prieigas, kurios yra svarbios norint sukurti virtualias atrankos gaires, kurios padėtų išnaudoti PubChem duomenis. PubChem esantys duomenis apie biologinį junginių aktyvumą, informacija apie jų farmakologiją, toksikologiją, veikimo mechanizmus, 3D struktūros – visa ši informacija padeda vaistų paieškos pradinėse stadijose. Ypač naudinga informacija apie cheminių medžiagų tiekėjus ir patentus, ji padeda atsirinkti dominančius junginius tolimesnei atrankai.

Ši duomenų bazė naudota daugelyje studijų vaistų paieškoje. Pavyzdžiui, PubChem bioaktyvumo duomenys buvo panaudoti apskaičiuoti bioaktyvumą, toksiškumą arba atrasti polifarmakologinius, kelis taikinius turinčius ligandus. Kai kuriuose tyrimuose buvo naudojami parengti duomenų rinkiniai, kurie leido objektyviai įvertinti skirtingus virtualios atrankos metodus [34].

4.3. SID, CID ir AID

Esminiai ryšiai tarp trijų PubChem duomenų bazių yra nesudėtingi. PubChem Medžiagų identifikatoriai (SIDs) susiję su PubChem Junginių identifikatorius (CIDs) per cheminių struktūrų standartizaciją. Kiekviena standartizuota medžiaga turi atitinkamą CID, kuris yra pagrindinė tos

standartizuotos medžiagos forma, reprezentuojanti visą struktūrą. Taip pat gali būti „komponento formos“ CIDs, kurios apima informaciją apie unikalias kovalentinių ryšių jungtis, kai medžiaga yra mikstūra arba rūgštis/bazė su krūviu ar neutralizuota forma, kai medžiaga jonizuota. Pirminiai junginiai priskiriami kiekvienam CID‘ui, kur tik įmanoma, pirminės organinės medžiagos identifikacijai. PubChem tyrimų identifikatoriai (AIDs) talpina aktyvumo duomenis SID‘ams. Jei medžiaga yra susijusi su junginiu, tyrimų rezultatai skirti SID‘ui gali būti netiesiogiai susiję taip pat ir su CID [31].

4.4. Struktūros paieška

PubChem struktūros paieškos įrankis leidžia pateikti vieną užklausą pagal įvairius cheminės struktūros paieškos tipus ir pasirinktinus filtrus. Cheminės struktūros paieškos paslauga gali būti tiesiogiai atidaroma naudojant URL: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/ [31]. Palaikomi užklausos įvesties formatai yra SMILES, SMARTS [35], InChI, CID, molekulinė formulė ir SDF [36]. Taip pat yra interaktyvios paieškos paslauga piešiant cheminę struktūrą su JavaScript programa, su kuria struktūra gali būti piešiama rankiniu būdu, redaguojama ar importuojama. Piešimo programa yra suderinta su moderniomis interneto naršyklėmis ir nereikalauja specialios programinės įrangos [31].

4.5. Struktūrų parsisiuntimas

Suradus dominančias struktūras PubChem duomenų bazėje, vartotojui yra svarbu eksportuoti gautus medžiagų ar junginių duomenis iš duomenų bazės tolesnei analizei. Struktūrų parsisiuntimo įrankis paruošia PubChem Medžiagų ar PubChem Junginių duomenis eksportui iš Entrez daugeliu formatų. Struktūrų parsisiuntimo įrankis gali būti tiesiogiai pasiekiamas naudojant URL:

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/pc_fetch/. Naudotis parsisiuntimo paslauga yra paprasta. Vartotojas tik turi atlikti paiešką pasitelkiant bet kokią Entrez kombinaciją bei PubChem specifinius paieškos įrankius, tuomet eiti į atsisiuntimo puslapį iš PubChem Medžiagos ar Junginiai Entrez Doc-Sum naudojant parsisuntimo nuorodą, kuri nurodoma kaip mygtukas ar disko ikona. Po to, kai vartotojas pasirenka eksporto formatą, failas, kuriame yra eksportuojami duomenys, yra paruoštas ir tuomet nurodžius parsisiuntimo vietą pateikiamas kaip URL. Labai svarbu yra suprasti, kad duomenys, gauti

iš PubChem Medžiagos, talpina orginalią deponuojamą informaciją, o PubChem Junginiai yra standartizuotos deponuotos struktūrinės informacijos formos [31].

METODIKA

1. Tetrazolo struktūrinio fragmento in silico tyrimų metodika

Nustatant tetrazolo kaip struktūrinio fragmento parametrus in silico, buvo panaudoti šie programiniai paketai: Jchem for excel; Schrodinger; Schrodinger modulis Canvas; Interactive Enumeration, Instant Jchem. Junginių struktūrų paieškai naudotas PubChem paieškos įrankis. Virtuali biblioteka sukurta naudojantis Maestro Schrodinger Interactive Enumeration paketu.

2. Naudotos medžiagos ir tirpikliai

Aminoguanidino bikarbonatas, azoto rūgštis, natrio nitritas, natrio karbonatas, sulfato rūgštis, etanolis, 5-aminotetrazolas, trietilaminas, etensulfonilfluoridas, acetonitrilas. Naudoti reagentai buvo analitinio grynumo.

3. Junginių sintezės metodikos

Reakcijos pradžioje vykdoma aminoguanidino bikarbonato neutralizacijos reakcija azoto rūgštyje, išsiskiriant anglies dioksidui, į aminoguanidino nitrato tirpalą pridedamas natrio nitrito tirpalas, diazotinimo proceso pabaigoje tirpalo spalva pasikeičia į rudai raudoną. Reakcijos mišinys veikiamas natrio karbonatu ir šildomas 4val. Karštas mišinys neutralizuojamas 30 % sulfato rūgštimi, vėstant iškrenta 5-aminotetrazolo kristalai, kurie plaunami vandeniu ir rekristalizuojami. Šios sintezės reakcijos lygtys pavaizduotos 13 paveikslėlyje.

N

H

NH

NH

NH

.

H

CO

HNO

N

H

NH

NH

NH

.

HNO

N

H

NH

NH

NH

.

HNO

NaNO

, HCl

N

N

N N

H

NH

13 pav. 5-aminotetrazolo sintezės schema

Toliau reakcija vykdoma išgrynintą 5-aminotetrazolą (0,3 g, 3,5266 mmol) ir trietilaminą (7ml) veikiant su etensulfonilfluoridu (0,58246 g, 5,2899 mmol) acetonitrile (35ml). Kaitinama 10 – 12 val.. Produktas gryninamas preparatyvinės chromatografijos pagalba. Produktas koncentruojamas rotaciniu vakuumu. Vykdytų procesų schema pateikiama 14 paveikslėlyje.

N

N

N N

H

NH

+

S

O

F

O

Et

N, MeCN

R.T. 10-12h

N

N

N N

H

NH

S

O

O

14 pav. 5-(vinilsulfamido)-tetrazolo sintezės schema

4. Junginių analizės metodikos

Gauto produkto struktūrinė ir priemaišų analizė atliekama FT-IR spektroskopu, UV spektroskopu bei ESC-MS/MS spektrometru.

4.1. FT-IR spektroskopija

Gauto junginio FT-IR spektrai nuskenuoti PerkinElmer UATR Two spektrometru. Tiriant medžiagas su šiuo spektrometru, medžiagų IR spindulių sugertį apibūdinantis dydis yra bangos

skaičius n (cm-1

). PerkinElmer UATR Two spektrometro bangos skaičius apima 450-4000 cm-1 intervalą. Gauto produkto kristalai yra uždedami ant prietaise esančio deimanto, IR spinduliuotė nukreipiama per junginį ir kompiuterinė programa užrašo gautą FT-IR spektrą. Šiame spektre gauti pikai rodo tiriamo junginio molekulės vibracijas, kurių dėka yra identifikuojamos tiriamojo junginio funkcinės grupės bei pirštų atspaudų regionas.

Gautas spektras yra palyginamas su pradinių medžiagų FT-IR spektrais, gaunamais tuo pačiu metodu. Lyginant spektrus, nustatomos pranykusios ir naujai atsiradusios smailės, kurios leidžia daryti prielaidą apie pranykusias ar atsiradusias funkcines grupes ar papildomus ryšius tarp atomų. Tai leidžia įsitikinti, jog sintezės metu gautas reikiamas junginys, jog reakcija įvyko sėkmingai. Užrašius spektrą atliekamos smailių ATR korekcijos, jas vykdyti rekomenduoja prietaiso gamintojai.

4.2. ESC-MS spektrometrija

Susintetinti junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF ESC/MS prietaisą (parametrai nurodyti 2 ir 3 lentelėse). Mėginių paruošimas: atsveriama 1mg junginio ir tirpinama 1ml metanolio. Gautas tirpalas yra koncentruotas, todėl papildomai praskiedžiamas, paimant 10 μl tirpalo ir skiedžiant jį 1ml metanolio. Gaunamas 10 μl/ml tirpalas, kuris filtruojamas ir injekuojamas į efektyvųjį skysčių chromatografą Agilent Technologies Infinity 1260 chromatografinei ir masių spektrometrinei analizei. Prietaiso parametrai nurodyti 2 ir 3 lentelėje.

2 lentelė. Efektyviosios skysčių chromatografijos junginių išskirstymo parametrai junginių grynumo tyrimams

Parametrai Agilent 1260 Infinity ESC sistema

Chromatografinės kolonėlės

ACE Generix C8 kolonėlė 4,6x250 mm, 5 µm; ZIC-HILIC HPLC kolonėlė 4,6x150 mm, 3,5 µm, Zorbax C18 2,1 × 50 mm, 1,8-µm Kolonėlių

temperatūra 25°C

Injekavimo tūris 1-10 µl Injekavimo greitis 500 µl/min

Mobili fazė

Junginių grynumo tyrimai:

A: 0,1% skruzdžių rūgštis (vandeninis tirpalas)

Tėkmės greitis 0,25 – 1,25 ml/min

Gradientas

Junginio grynumo tyrimai

Laikas A: B: 0,00 min 100 % 0 % 3,00 min 100 % 0 % 12,00 min 0 % 100 % 16,00 min 0 % 100 % 17,50 min 100 % 0 % 18,00 min 100 % 0 % Detektorius

Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio intervalas 190-400 nm, diapazono plotis po 1 nm, <0,0031 min (atsako laikas 0,031s), (80Hz) A: 254/1 nm Ref. 550/100 nm B: 230/1 nm Ref. 550/100 nm C: 10/1nm Ref.50/100 nm D: 215/1 nm Ref.550/100 nm E: 360/1nm Ref. 550/100 nm F: 200/1nm Ref. 550/100 nm G: 310/1 nm Ref.550/100 nm H: 280/1 nm Ref.550/100 nm Analizės trukmė 18 minučių sintezuotų junginių grynumo tyrimams

Post-analizės

trukmė 10 minučių

3 lentelė. Optimizuoti 5-vinilsulfonamido masių spektrometrijos parametrai

Parametrai Agilent 6530 Q-TOF MS sistema

Jonizacija Teigiama (+), neigiama (-)

Jonizacijos šaltinis Agilent Dual Jet Stream elektropurkštuvinis jonizatorius (ESI)

Kapiliarinė įtampa 3250 V(+), -3500 V(-)

Purkštuvo įtampa 250 V

Fragmentatoriaus įtampa 120 V Džiovinimo dujų temperatūra 350oC

Džiovinimo dujų tėkmė 10 l/min

Purkštuvo slėgis 40 psig

Apgaubiančiųjų dujų temperatūra 325o C Apgaubiančiųjų dujų tėkmė 9 l/min

MS ribos 80 – 450 m/z

Kolizijos energija 0 V

MS registravimo dažnis 2 spektrais/s

Etaloninė masė (+): 121,050873 ir 922,009798 Instrumento rėžimas Didelės raiškos rėžimas (4 GHz)

Programinė įranga duomenų analizei:

• Agilent MassHunter Qualitative Analysis (Qual) B.07.00; • Agilent MassHunter Profinder B.06.00, sp. 1.

4.3. UV spektrofotometrija

Tiriamojo junginio spektras nuskanuotas naudojant Agilent Technologies Cary 8454 UV-VIS spektrofotometrą. Prietaise UV absorbcija yra matuojama esant 200-600 nm bangos ilgiams. Mėginiai paruošiami pagal tą pačią metodiką, aprašytą ESC-MS spektrometrijai. Į kiuvetę įpilama metanolio, ši dedama į spektrofotometrą, kuriame užrašomas metanolio sugerties spektras, kuris yra atimamas. Po to analogiškai užrašomi tiriamųjų junginių tirpalų UV sugerties spektrai.

4.4. Preparatyvinė chromatografija

Tiriamasis junginys grynintas preparatyvinės chromatografijos būdu naudojantis Rainin preparatyvine sistema. Mėginys injekuotas rankiniu būdu. Prietaiso parametrai nurodyti 2 ir 3 lentelėje.

4 lentelė. Preparatyvinės chromatografijos parametrai junginio gryninimui

Parametrai Rainin preparatyvinė sistema

Tėkmės greitis 20 ml/min

Chromatografinė kolonėlė Delta Pak C18 21 x 250 mm, 7 µm

Detektorius

Rainin UV asorbance detektorius Preparatyvinė celė 9mm-1mm Fiksuotas bangos ilgis 215nm Frakcijų kolektorius Gilson 203B

Mobili fazė

Junginių grynumo tyrimai:

A: 0,1% skruzdžių rūgštis (vandeninis tirpalas)

B: Metanolis, turintis 0,1% skruzdžių r. (analitinio švarumo >99,5%)

Gradientas

Junginio grynumo tyrimai

Laikas A: B: 0,00 min 100 % 0 % 15,00 min 100 % 0 % 75,00 min 0 % 100 % 90,00 min 0 % 100 % 100,00 min 100 % 0 % 115,00 min 100 % 0 %

Programinė įranga duomenų analizei: • Chromatography CDS N2000.

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

1. Tetrazolo ir sulfonamido fragmentų atranka

Junginių biblioteka kurta remiantis tetrazolo struktūriniu fragmentu dėl jau minėtų unkialių poliazo žiedo fizikocheminių savybių. Dvivalentės sieros fragmentas dažnai randamas biologiškai aktyviuose junginiuose, bet siera su aukštesnio laipsnio valentingumu, pvz., šešiavalentė, kur kas rečiau. Tačiau toks didesnio valentingumo fragmentas turi papildomų ypatybių, gali sudaryti papildomus vandenilinius ryšius su biologiniais taikiniais bei formuoja erdvinę molekulės konformaciją. Aptartos ypatybės pavaizduotos 15 paveikslėlyje.

N N

N N

H

NH

S

O

O

R

N

N

N

N

N

RS

O

O

H

H

H R

H R

N N

N N

H

NH

S

O

O

R

15 pav. Šešiavalentės sieros ypatybės

Kairėje paveiksliuko dalyje pavaizduoti sieros sudaromi vandeniliniai ryšiai, dešinėje 3D struktūra. Šie faktoriai paskatino junginių bibliotekos kūrimui pasirinkti tetrazolo fragmentą ir šešiavalentį sulfonilo fragmentą, norint susintezuoti mažai ištyrinėtą junginį. Be to, vinilo grupės prijungimas prie tokio junginio praplečia cheminių reakcijų įvairovę.

Sulfanilamido tetrazolo fragmento įterpimas įterpimas į virtualią biblioteką praplečia struktūrinį diversiškumą bei potencialiai suteikia virtualiai bibliotekai pagerintas ADME savybes, t. y. pagerintą tirpumą (žemesnis LogP rodiklis), geresnį praeinamumą per biologines membranas, geresnį pasiskirstymą organizmo audiniuose ir pan. 4 lentelėje yra tirpumo parametrai esant skirtingam pH, 5 lentelėje pateikta fizikocheminiai parametrai, svarbūs ADME savybių įvertinimui.

4 lentelė. Tetrazolo fragmentų tirpumo parametrų palyginimas

Fragmento struktūra LogD (pH=7) LogD (pH=5) LogD (pH=9) LogS (pH=7) LogS (pH=5) LogS (pH=9) LogS -2,35 -1,16 -2,46 2,28 0,68 2,28 0,27 -2,25 -1,26 -3,01 1,09 0,59 1,09 -0,94 -2,36 -1,18 -2,96 1,14 -0,36 1,46 -0,53

5 lentelė. Tetrazolo fragmentų fizikocheminiai parametrai

Fragmento struktūra Rotacinių jungčių skaičius Vandenilio akceptorių skaičius Vandenilio donorų skaičius pKa pKb PSA (pH=2) PSA (pH=7) PSA (pH=9) 0 3 1 4,81 -0,85 54,46 51,56 51,56 0 4 2 4,54 0,04 80,48 77,58 77,58 1 5 2 5,34 -0,9 100,63 97,73 97,73

Iš pateiktų duomenų galima matyti, jog pereinant nuo tetrazolo struktūros link sulfonilamido tetrazolo struktūros, esant skirtingiems fiziologiniems pH, tirpumo parametrai gerėja. Taip pat 5

lentelėje matyti, jog gerėja ne tik tirpumo parametrai, bet ir fizikocheminiai rodikliai, kurie atitinka keliamus ADME kriterijus.

PubChem duomenų bazėje struktūros paieškos įrankyje nupiešiame savo pasirinktas struktūras bei išfiltruojame esančius substruktūrų duomenis pagal juos. Substruktūra – tai junginio pamatinis fragmentas. Jis atsikartoja visuose išfiltruotuose junginiuose. Nupiešus tetrazolo žiedą, duomenų bazė randa 682603 substruktūras, nupiešus 5-aminotetrazolą randami 43255 junginiai. Prijungus sulfonamido grupę prie trazolo žiedo randami 630 junginių, o eteno sulfonamido – 533 substruktūros. Tačiau identiškos 5-vinilsulfonamido tetrazolo struktūros PubChem duomenų bazėje nebuvo rasta. 16 paveikslėlyje pavaizduota išfiltruotų junginių diagrama.

16 pav. Išfiltruotų junginių diagrama

Diagramoje pavaizduota, kiek junginių pateikė PubChem duomenų bazės paieškos sistema pagal pasirinktus fragmentus. 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 1 2 3 4 682603 43255 630 533 1 2 3 4

Ju

n

g

in

ių

sk

aičiu

s

5-aminosulfonamido tetrazolo pagrindu sugeneruotoje virtualioje junginių bibliotekoje yra daugiau nei 50 000 junginių. Nors biblioteką sudaro diversifikuotos cheminės struktūros, tačiau dėl sulfonilamidtetrazolo fragmento biblioteka pasižymi geresniais ADME parametrais. Šios in silico bibliotekos fragmentas pateikiamas 17 paveikslėlyje.

N H N N N N H S O O N H N N N N H S O O R N H N N N N H S O O R N H N N N N H S O O _N R N H N N N N H S O O _N R N H N N N N H S O O N _N R N H N N N N H S O O N N R N H N N N N H S O O N N N R N H N N N N H S O O N _N R N H N N N N H S O O N N N R N H N N N N H S O O N H R N H N N N N H S O O N N H N R N H N N N N H S O O N S N R N H N N N N H S O O N O N R N H N N N N H S O O N N H N N R N H N N N N H S O O N O N N H N N N N H S O O _NH R N H N N N N H S O O R N H N N N N H S O O HN _NH R N H N N N N H S O O N _N R N H N N N N H S O O N R N H N N N N H S O O N R N H N N N N H S O O N N R N H N N N N H S O O _N N R N H N N N N H S O O R

R= -Me, -Et, i-Pr, n-Pr, i-Bu, n-Bu, -CF₃, -OCF₃, -OH, -NO₂, -H, -F, -Cl, -Br, -I, -SO₂NH₂, -SH, -CO2H, -CO2Alk, -OAlk, -NH2, -N3;

17 pav. Virtuali biblioteka 5-aminosulfonamido tetrazolo pagrindu

2. Tetrazolo sintezė

Susintetinti du junginiai: 5-aminotetrazolas ir 5-vinilsulfonamido tetrazolas. Reakcijų išeiga 40% ir 65%.

3. Junginių analizės rezultatai

3.1. FT-IR spektroskopijos rezultatai

Norint preliminariai patvirtinti, jog sintezė įvyko sėkmingai, užrašomas gauto produkto bei pradinių medžiagų spektrai. Analizuojamos išnykusios ir naujai atsiradusios smailės. Rezultatai pateikiami 6 lentelėje.

5-aminotetrazolo spektras pateikiamas 18 paveikslėlyje, 5-vinilsulfonamido spektras pateikiamas 19 paveikslėlyje. X ašis – bangos ilgis, cm-1, Y ašis – pralaidumas (%).

19 pav. 5-vinilsulfonamido tetrazolo FT-IR spektras

6 lentelė. Junginių IR spektrų pikai ir juos atitinkančios funkcinės grupės

Junginys Funkcinė grupė Spektro pikas (cm-1)

5-aminotetrazolas NH 3330 C=N 1640 C-N 1045 NH2 997 5-vinilsulfonamidtetrazolas C=N 1650 C-N 1020 S=O 1300 CH2=CH2 950

3.2. ESC-MS analizės rezultatai

Gautas junginys tiriamas Efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos metodu, naudojant Agilent 1260 Infinity ESC-MS sistemą. Atlikus pirminę chromatografinę analizę, naudojant Zorbax C18 kolonę, analizuoti junginiai nebuvo užlaikyti joje ir išsiplovė su tuščiu tūriu (t0) [37]. Neišskirstyto junginio (5-aminotetrazolo) chromatograma pavaizduota 20 paveikslėlyje. Nustatytas tuščias tūris esamomis chromatografinėmis sąlygomis yra 0,56 min, kuris sutampa su iš kolonėlės išplaunamomis analitėmis (5-aminotetrazolas ir 5-vinilsulfonamidtetrazolas).

20 pav. 5-aminotetrazolo chromatograma

Chromatogramoje pavaizduota 5-aminotetrazolo analitė, kurios sulaikymo trukmė sutampa su tuščiu tūriu (tR = t0 = 0,56 min).

Norint atlikti gerą chromatografinį junginių išskirstymą, iškeltos dvi hipotezės:

 keičiamos kolonėlės, kurios užpildytos skirtingomis stacionariomis fazėmis (Zorbax C18, ACE C8, Merck Sequant ZIC HILIC) [38, 39];

 arba atliekama junginių derivatizacija su benzoilchloridu arba vanilinu.

Kita pasirinkta kolonėlė, norint išskirstyti analizuojamus junginius, Merck Sequant ZIC HILIC. Ši kolonėlė ypatinga tuo, jog tai yra ne tik atvirkštinė stacionari fazė, bet ir turi zviterjoninį pakaitą, kuris leidžia išskirstyti joninius junginius [40, 41]. Tačiau šios kolonėlės trūkumas yra siauros pH ribos (pH = 3-8). Norint suteikti analizuojamiems junginiams krūvį, šios paverčiamos į druskas. Junginių pavertimų druskomis procesai pavaizduoti reakcijos lygtyse 21 paveikslėlyje.

N

N

N N

H

NH

+

H

Cl

N

N

N N

H

NH

Cl

-N

N

N N

H

NH

S

O

O

+

NaHCO

N

N

N

Na

N

-NH

S

O

O

21 pav. Krūvį suteikiančios 5-aminotetrazolo bei 5-vinilsulfonamidtetrazolo reakcijos

N

H

N

N

N

N

H

Gauti junginiai leidžiami per kolonėlę, užrašytų chromatogramų analičių smailės yra išplatėjusios dėl neoptimizuoto ir netinkamo pH, dėl to dalis junginio yra jonizuotoje formoje, o kita dalis molekulinėje. Tam kad junginys būtų pilnai jonizuotas, reikia atitinkamų pH sąlygų, kurių negalima pasiekti dėl kolonėlės limitacijų. Su HCl pH turėtų būti mažiau negu 2, o su NaHCO3 – daugiau negu 12. Šios chromatogramos pateikiamos 22 ir 23 paveikslėlyje.

22 pav. Dalinai jonizuoto 5-aminotetrazolo chromatograma

Junginys paverstas vandenilio chlorido druska, esant pH=3.

23 pav. Dalinai jonizuoto 5-vinilsulfonamidtetrazolo chromatograma

Junginys paverstas natrio druska, esant pH=8.

ZIC HILIC kolonėlė netinkama šių dviejų junginių analizei dėl per didelio smailių išplatėjimo, dėl to bandyta junginį išskirsti naudojant ACE C8 kolonėlę. Su šia kolonėle užrašytoje chromatogramoje nėra gero išskirstymo, nors tuščias tūris ir yra atskirtas nuo analitės, tačiau raiška tarp dviejų smailių yra pernelyg maža[42]. Ši chromatograma pateikiama 24 paveikslėlyje.

N H N N N N H S O O N N N Na+N -N H S O O N H N N N NH₂ N N N N H NH₃+Cl

-24 pav. 5-vinilsulfonamidtetrazolo chromatograma

Nepakankamas junginio išskirstymas su ACE C8 kolonėle. Stebima per maža raiška tarp tuščio tūrio ir analitės (raiškos koeficientas RS<1,5).

Keičiant kolonėles su skirtingomis stacionariomis fazėmis, nepavyko pasiekti gero chromatografinio junginių išskirstymo, taigi atliekama junginio derivatizacija su benzoilchloridu. Reakcijos lygtis pateikiama 25 paveikslėlyje.

N N

N N

H

NH

+

Cl

O

N

O

N

N

N

NH

25 pav. 5-aminotetrazolo derivatizacija su benzoilchloridu [43]

Derivatizuoto junginio chromatogramoje, vykdytoje su 1,8 μm Zorbax C18 kolonėle (Agilent Technologies), matoma, jog junginys yra grynas, pilnai išskirstytas, sulaikymo trukmė 14,823 min. Taip pat matyti, jog derivatizacijos reakcija pilnai įvyko, nes chromatogramoje matoma vienos analitės smailė. Chromatograma pateikiama 26 paveikslėlyje.

N H N N N N H S O O

26 pav. Derivatizuoto 5-aminotetrazolo chromatograma

Atlikta derivatizacijos reakcija su benzoilchloridu, stebima atskirta junginio smailė, sulaikymo trukmė 14,823 min.

Junginio struktūrinei tapatybei patvirtinti buvo užrašytas masių spektras naudojant Agilent 1260 Infinity ESC-MS sistemą. Nustatytas 5-vinilsulfonamidtetrazolo tikslus masės ir krūvio santykis (m/z), kuris yra 176,0268 [M+H]+. Apskaičiuotas teorinis masės ir krūvio santykis, kuris yra lygus 176,0267 [M+H]+. Tirto junginio MS spektras pateikiamas 27 paveikslėlyje.

27 pav. Nustatytas 5-vinilsulfonamidtetrazolo masių spektras

Užrašytas tikslus junginio MS spektras, kurio masės ir krūvio santykis (m/z) yra 176,0268 [M+H]+ .

3.3. UV spektrofotometrijos analizės rezultatai

Pirmasis spektras yra nederivetizuoto junginio, absorbcijos maksimumas stebimas esant 220 nm bangos ilgiui, o atlikus derivatizaijos reakciją su benzoilchloridu stebimi du absorbcijos maksimumai – prie 235 ir 270 nm. Dėl įvykusios reakcijos stebimi du UV spektriniai efektai –

O N N N N NH₂

batochrominis (raudonasis) bei hiperchrominis efektai. Šie efektai atsiranda dėl įvesto aromatinio žiedo. UV spektrai pateikiami 28 ir 29 paveikslėlyje.

28 pav. Nederivatizuoto junginio UV spektras

Stebimas absorbcijos maksimumas prie 220nm bangos ilgio.

29 pav. Derivatizuoto junginio UV spektras

Stebimi du absorbcijos maksimumai prie 235 ir 270nm bangos ilgio. Tai lemia derivatizacijos reakcijos metu įvykę batochrominis ir hiperchrominis efektai.

3.4. Preparatyvinės chromatografijos analizės rezultatai

Sintezės metu gautas junginys (5-vinilsulfonamidtetrazolas) papildomai grynintas preparatyvinės chromatografijos būdu. Surenkamos frakcijos, pirmasis chromatografinės smailės trečdalis, nuo 7 iki 11 min prie fiksuoto detektoriaus bangos ilgio 230 nm. Likusios priemaišos yra išplaunamos į atliekas. Pasirinktas per mažas tėkmės greitis, kolonėlės stacionarios fazės dalelių dydis bei per didelė injekuojamo junginio koncentracija. Šios priežastys nulemia maža išskirstymą tarp smailių. Didesnio tėkmės greičio ir mažesnio stacionarios fazės dalelių dydžio, pvz. 5 μm, nebuvo

N

H

N

N

N

N

H

galima pasirinkti dėl ribotų pompos parametrų (sukeliamas slėgis yra didesnis nei galimas darbinis pompų slėgis). Gauta preparatyvinė chromatograma yra pateikiama 30 paveikslėlyje.

30 pav. 5-vinilsulfonamidtetrazolo preparatyvinė chromatograma

N

H

N

N

N

N

H

S

O

O

IŠVADOS

1. Remiantis in silico rezultatais buvo aptimizuotas tetrazolo struktūrinis fragmentas. Nustatyta, kad tetrazolas, turintis sulfanilamido fragmentą, lyginant su tetrazolu bei 5-aminotetrazolu, turi pagerintą LogS, LogP, LogD, pKa, pKb, PSA. Be to, tetrazolo sulfanilamido junginys turi geresnes minėtas reikšmes esant skirtingoms pH reikšmėms.

2. Atlikus PubChem duomenų bazės junginių, turinčių struktūrinę tetrazolo žiedą kiekybinę analizę, nustatyta, kad iš 682603 substruktūrų tik 533 substruktūros turi pagerintą, tetrazolo sulfanilamido fragmentą. Papildomų struktūrinių kriterijų paieška parodė, jog 5- vinilsulfonamidtetrazolo nebuvo rasta.

3. Sintezuotas pasirinktas 5- vinilsulfonamidtetrazolas, gauta 65% išeiga, atlikus preparatyvinę chromatografiją nustatytas 95% grynumas. Šis junginys buvo susintezuotas pirmą kartą, literatūros apie jį nerasta. Dėl 5-vinilsulfonamidtetrazolo hidrofiliškumo įprastais analizės metodais bei keičiant kolonėles (stacionarias fazes ir fizinius parametrus) nebuvo galima identifikuoti, junginys išsiplauna su tuščiu kolonėlės tūriu. Tuomet buvo taikyta derivatizacijos reakcija su benzoilchloridu, buvo stebima atskirta junginio smailė, sulaikymo trukmė 14,823 min.

4. 5- vinilsulfonamidtetrazolo fragmento įvedimas į in silico sukurtą junginių biblioteką, dėl savo struktūrinių ypatumų, išreikšto didesnio LogS, LogP, LogD ir kitų fizikochemininių parametrų, potencialiai pagerina ADME parametrus.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Shao, Yuling, Weihua Zhu, and Heming Xiao. 2013. Structure-property relationships of energetic nitrogen-rich salts composed of triaminoguanidinium or ammonium cation and tetrazole-based anions. Journal of Molecular Graphics and Modelling 40. Elsevier Inc.: 54–63. doi:10.1016/j.jmgm.2012.12.003.

2. Bladin, J. A. 1885. Ueber von Dicyanphenylhydrazin abgeleitete Verbindungen. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft 18: 1544–1551. doi:10.1002/cber.188501801335.

3. Herr, R. Jason. 2002. 5-Substituted-1H-tetrazoles as carboxylic acid isosteres: Medicinal chemistry and synthetic methods. Bioorganic and Medicinal Chemistry 10: 3379–3393. doi:10.1016/S0968-0896(02)00239-0.

4. Benson, F. R. 1967. The Tetrazoles in Heterocyclic Compounds. Edited by R. C. Elderfield. vol. 8. New York: John Wiley & Sons, Inc.

5. Benson, Frederic R. 1947. The Chemistry of the Tetrazoles. Chemical Reviews 41: 1–61. doi:10.1021/cr60128a001.

6. Ostrovskii, Vladimir A., and Andrei O. Koren. 2000. Alkylation and related electrophilic reactions at endocyclic nitrogen atoms in the chemistry of tetrazoles. Heterocycles 53: 1421– 1448. doi:10.3987/REV-00-530.

7. Lenda, Fatimazohra, Farhate Guenoun, Bouchra Tazi, Najib Ben Iarbi, Hassan Allouchi, Jean Martinez, and Frédéric Lamaty. 2005. Synthesis of new tetrazole-substituted pyroaminoadipic and pipecolic acid derivatives. European Journal of Organic Chemistry: 326–333. doi:10.1002/ejoc.200400328.

8. Altman, F P. 1976. Tetrazolium salts and formazans. Progress in histochemistry and cytochemistry. Vol. 9. Gustav Fischer Verlag · Stuttgart. doi:10.1016/S0079-6336(76)80015-0.

9. Janoschek, Rudolf. 1993. Pentazole and Other Nitrogen Rings. Angewandte Chemie International Edition in English 32: 230–232. doi:10.1002/anie.199302301.

Ahmad Shiekh. 2014. Tetrazoles as carboxylic acid isosteres: Chemistry and biology. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 78: 15–37. doi:10.1007/s10847-013-0334-x.

11. Koldobskii, G. I., V. A. Ostrovskii, and B. V. Gidaspov. 1980. Tautomerism and acid-base properties of tetrazoles (review). Chemistry of Heterocyclic Compounds 16: 665–674. doi:10.1007/BF00557732.

12. V.A. Ostrovskii, G. I. Koldobskii, N. P. Shirokova, I. Yu. Shirobokov, and B. V. Gidaspov. 1978. No Title. Zh. Org. Khim. 14: 1697.

13. V.A. Ostrovskii, N. S. Panina, G. I. Koldobskii, B. V. Gidaspov, and I. Yu. Shirobokov. 1979. No Title. Zh. Org. Khim. 15: 844.

14. Pujol, M. Rouche and L. 1970. No Title. Bull. Soc. Chim. Ft No. 1: 273.

15. Meanwell, Nicholas A. 2011. Synopsis of some recent tactical application of bioisosteres in drug design. Journal of Medicinal Chemistry 54: 2529–2591. doi:10.1021/jm1013693.

16. Patani, George A, and Edmond J LaVoie. 1996. Bioisosterism: A Rational Approach in Drug Design. Chemical Reviews 96: 3147–3176. doi:10.1021/cr950066q.

17. C. Hansch, A. Leo, and D. Hoekman. Exploring QSAR: Hydrophobic, Electronic, and Steric Constants. Washington: American Chemical Society.

18. Koldobskii, G I, V A Ostrovskii, and V S Poplavskii. 1981. Advances in Tetrazole Chemistry. Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinenii: 1299–1326.

19. Woodbury, D.M. 1980. Antiepileptic Drugs: Mechanismsof Action. Edited by D.M. G.H., Penry, J.K., Woodbury. New York: RavenPress.

20. EA, Rodin. 1958. Metrazol tolerance in a “normal” volunteer population. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 10: 433–46.

21. Rodin EA, Calhoun HD. 1970. Metrazol in a “normal” and volunteer population. J Nerv Ment Dis 150: 438–50.

22. Schenberg LC, Bittencourt AS, Sudre ECM, Vargas LC. 2001. Modeling panic attacks. Neurosci Biobehav Rev 25: 647–59.

23. Flack, John M., Elijah Saunders, Alan Gradman, William E. Kraus, F. Martin Lester, J. Howard Pratt, Michael Alderman, et al. 2001. Antihypertensive efficacy and safety of losartan alone and in combination with hydrochlorothiazide in adult African Americans with mild to moderate hypertension. Clinical Therapeutics 23: 1193–1208. doi:10.1016/S0149-2918(01)80101-6.

24. Lefrock, Jack L, William Holloway, Bernice B Carr, and Ronald F Schell. 1984. In Vitro and Clinical Evaluation of Ceforanide. The American Journal of the Medical Sciences 287: 21–25. doi:http://dx.doi.org/10.1097/00000441-198403000-00005.

25. R. Vardanyan, V. Hruby. 2016. Synthesis of Best-Seller Drugs. Boston: Academic Press.

26. K. Y. Choi, Y. C. Kim, M. G. Lee. 2006. No Title. Life Sci 78: 1057–1062.

27. D. Mehta, E. L. Bradley, I. Kissin. 1991. No Title. J. Clin. Anesth. 3: 280–284.

28. Dong, Shiyang, Tiantian Wang, Huayu Wang, Kun Qian, Zhongli Zhang, Yueming Zuo, Guangming Luo, Yi Jin, and Zengtao Wang. 2017. Synthesis and Evaluation of 5-( o -Tolyl)-1 H -tetrazole Derivatives as Potent Anticonvulsant Agents. Archiv der Pharmazie 350: 1600389. doi:10.1002/ardp.201600389.

29. Masic, Izet. 2012. Review of most important biomedical databases for searching of biomedical scientific literature. Donald School Journal of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology 6: 343– 361. doi:10.5005/jp-journals-10009-1258.

30. Walker, Martin A. 2014. Public Chemical Databases and the.

31. Bolton, Evan E., Yanli Wang, Paul A. Thiessen, and Stephen H. Bryant. 2008. Chapter 12 PubChem: Integrated Platform of Small Molecules and Biological Activities. Annual Reports in Computational Chemistry. Vol. 4. Elsevier B.V. doi:10.1016/S1574-1400(08)00012-1.

32. Kim, Sunghwan, Paul A. Thiessen, Evan E. Bolton, Jie Chen, Gang Fu, Asta Gindulyte, Lianyi Han, et al. 2016. PubChem substance and compound databases. Nucleic Acids Research 44: D1202–D1213. doi:10.1093/nar/gkv951.

33. Chen, Jie, John B. Anderson, Carol DeWeese-Scott, Natalie D. Fedorova, Lewis Y. Geer, Siqian He, David I. Hurwitz, et al. 2003. MMDB: Entrez’s 3D-structure database. Nucleic Acids Research 31: 474–477. doi:10.1093/nar/gkg086.

34. Kim, Sunghwan. 2016. Getting the most out of PubChem for virtual screening. Expert Opinion on Drug Discovery 11: 843–855. doi:10.1080/17460441.2016.1216967.

35. http://www.daylight.com/dayhtml/doc/theory/theory.smarts.html.

36. Dalby, Arthur, James G. Nourse, W. Douglas Hounshell, Ann K. I. Gushurst, David L Grier, Burton a Leland, and John Laufer. 1992. Description of several chemical structure file formats used by computer programs developed at Molecular Design Limited. Journal of Chemical Information and Modeling 32: 244–255. doi:10.1021/ci00007a012.

37. Nováková, Lucie, and Petr Solich. 2005. A comparison of performance of various analytical columns in pharmaceutical analysis: Conventional C18 and high throughput C18 Zorbax columns. Journal of Chromatography A 1088: 24–31. doi:10.1016/j.chroma.2004.12.039.

38. Kahsay, Getu, Huiying Song, Ann Van Schepdael, Deirdre Cabooter, and Erwin Adams. 2014. Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) in the analysis of antibiotics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 87. Elsevier B.V.: 142–154. doi:10.1016/j.jpba.2013.04.015.

39. Aral, Tarik, Hayriye Aral, Berrin Ziyadanoǧullari, and Recep Ziyadanoǧullari. 2015. Synthesis of a mixed-model stationary phase derived from glutamine for HPLC separation of structurally different biologically active compounds: HILIC and reversed-phase applications. Talanta 131: 64–73. doi:10.1016/j.talanta.2014.07.060.

40. Xiong, Xin, and Yanmeng Liu. 2016. Chromatographic behavior of 12 polar pteridines in hydrophilic interaction chromatography using five different HILIC columns coupled with tandem mass spectrometry. Talanta 150. Elsevier: 493–502. doi:10.1016/j.talanta.2015.12.066.

41. Weber, Günther, Nicolaus von Wirén, and Heiko Hayen. 2008. Hydrophilic interaction chromatography of small metal species in plants using sulfobetaine- and phosphorylcholine-type zwitterionic stationary phases. Journal of Separation Science 31: 1615–1622. doi:10.1002/jssc.200800060.

42. Sentkowska, Aleksandra, Magdalena Biesaga, and Krystyna Pyrzynska. 2013. Effects of the operation parameters on HILIC separation of flavonoids on zwitterionic column. Talanta 115. Elsevier: 284–290. doi:10.1016/j.talanta.2013.05.005.

43. Mohite, P B, S G Khanage, and V H Bhaskar. 2009. a Novel Approach for Synthesis of Substituted Tetrazoles 4: 803–807.