LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GABRIELĖ GUOKAITĖ
ANTIDEPRESANTŲ AMITRIPTILINO IR VENLAFAKSINO
MIŠINIO IŠSKYRIMO IŠ KRAUJO PLAZMOS OPTIMALIŲ
SĄLYGŲ NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Daiva Kazlauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas: Vitalis Briedis 2014-_______ mėn -___d.
ANTIDEPRESANTŲ AMITRIPTILINO IR VENLAFAKSINO
MIŠINIO IŠSKYRIMO IŠ KRAUJO PLAZMOS OPTIMALIŲ
SĄLYGŲ NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Daiva Kazlauskienė 2014-_______ mėn -___d.
Recenzentas Darbą atliko
Vardas, pavardė, parašas Magistrantė
Gabrielė Guokaitė
2014-_______ mėn -___d. 2014-_______ mėn -___d.
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Antidepresantai ... 10 1.1.1. Tiriamosios medžiagos ... 11 1.1.2. Klinikinės indikacijos ... 12 1.1.3. Farmakologinis poveikis ... 12 1.1.4. Farmakokinetinės savybės ... 13 1.1.5. Farmakodinaminės savybės ... 14 1.1.6. Metabolizmas ir ekskrecija ... 15 1.1.7. Kontraindikacijos ... 15
1.1.8. Specialios atsargumo priemonės ... 16
1.1.9. Vartojimas, dozavimas ... 16
1.1.10. Nepageidaujamas poveikis ... 17
1.1.11. Perdozavimas ... 18
1.1.12. Tiriamųjų medžiagų analizės metodai ... 18
1.1.13. Kiekybinis nustatymas ... 20
1.2. Mėginių ruošimas ... 21
1.2.1. Skysčių – skysčių ekstrakcija (SSE) ... 22
1.2.2. Kietafazė ekstrakcija (KFE) ... 25
1.3. Metodikos validacija ir jos parametrai ... 28
1.3.1. Metodikos atrankumas (specifiškumas, selektyvumas) ... 29
1.3.2. Analitės nustatymo tikslumas ... 29
1.3.3. Rezultatų glaudumas ... 29
1.3.4. Tiesiškumo ribos ir kalibracijos kreivės ... 30
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 32
2.1. Tyrimų objektas ir reagentai ... 32
2.1.2. Tirpikliai ... 32
2.1.3. Standartiniai tirpalai ... 32
2.1.4. Skystos fazės ekstrakcijos tirpalai ... 32
2.1.5. Kietos fazės ekstrakcijos tirpalai ... 33
2.1.6. Kraujo plazmos paruošimas ... 33
2.1.7. Naudotos priemonės ... 34
2.2. Tyrimo metodika ... 34
2.2.1. Skysčių – skysčių ekstrakcijos metodas ... 34
2.2.2. Kietafazės ekstrakcijos metodas ... 35
2.2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas ... 35
2.2.4. Duomenų statistinė analizė ... 36
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 36
3.1. Kietafazės ekstrakcijos optimizavimas ... 36
3.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 37
4. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 39
4.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos validacija ... 39
4.1.1. Metodikos specifiškumas ... 39
4.1.2. Rezultatų glaudumas ... 41
4.1.3. Rezultatų pakartojamumas ... 41
4.1.4. Tiesiškumo ribos ir kalibracinės kreivės ... 42
4.2. Tiriamųjų medžiagų identifikavimas ... 44
4.3. Skysčių – skysčių ekstrakcija (SSE) ... 46
4.4. SSE rezultatų statistinis įvertinimas ... 46
4.5. Kietafazė ekstrakcija ... 47
4.5.1. Metodikos optimizavimas ... 47
4.5.2. Rezultatų matematinis - statistinis įvertinimas ... 48
4.5.3. Kiekybinis KFE rezultatų įvertinimas ... 49
5. IŠVADOS ... 55
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 56
SANTRAUKA
G. Guokaitės magistro baigiamasis darbas „Antidepresantų amitriptilino ir venlafaksino mišinio išskyrimo iš kraujo plazmos optimalių sąlygų nustatymas“/ mokslinė vadovė doc. dr. D. Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas, 2014.
Raktiniai žodžiai: amitriptilinas, venlafaksinas, skysčių – skysčių ekstrakcija, kietafazė ekstrakcija,
efektyvioji skysčių chromatografija.
Tyrimo objektas ir metodai: kraujo plazmos mišinys su antidepresantais: amitriptilino hidrochloridu,
venlafaksino hidrochloridu ir paroksetino hidrochloridu (vidinis standartas). Metodai: skysčių – skysčių ekstrakcija (SSE), kietafazė ekstrakcija (KFE), efektyvioji skysčių chromatografija (ESC).
Darbo tikslas: nustatyti optimalias sąlygas amitriptilino ir venlafaksino mišinio išskyrimui iš kraujo
plazmos ir medžiagų identifikavimui bei kiekybiniam nustatymui ESC metodu.
Darbo uždaviniai: Atlikti mokslinių literatūros šaltinių apžvalgą, susijusią su antidepresantų
(amitriptilino ir venlafaksino) cheminėmis, fizikinėmis, farmakologinėmis savybėmis ir ekstrakcijos metodais, naudojamais antidepresantams išskirti iš kraujo plazmos; pritaikyti ir validuoti ESC metodiką antidepresantų, išskirtų iš kraujo plazmos, identifikavimui ir kiekio nustatymui, kaip vidinį standartą naudojant paroksetiną; skystos fazės ir kietos fazės ekstrakcijos būdais išskirti antidepresantų mišinį iš kraujo plazmos; optimizuoti pasirinktą ekstrakcijos metodą ir gautus rezultatus statistiškai įvertinti.
Išvados: Atlikta mokslinių literatūros šaltinių apžvalga. Tiriamųjų medžiagų identifikavimui ir
kiekybinei analizei pritaikyta ir validuota efektyvioji skysčių chromatografija. Antidepresantų mišinys išskirtas iš kraujo plazmos kietos fazės ekstrakcijos metodu. KFE metodas optimizuotas keičiant eliuentą ir eliuento pH. Atliktas optimizacijos sąlygų palyginimas. Nustatyti 3 organiniai tirpikliai, kuriais efektyviausiai eliuuojamos sorbente sulaikytos tiriamosios medžiagos bei gauti statistiškai patikimi rezultatai (p>0,05) : 2 proc. etano rūgšties tirpalas 100 proc. metanolyje, 2 proc. etano rūgšties tirpalas 80 proc. metanolyje ir 2 proc. metano rūgšties tirpalas 100 proc. metanolyje.
SUMMARY
G. Guokaitė “The determination of optimal conditions of isolation antidepressant amitriptyline and venlafaxine mixture from human plasma”/ scientific tutor doc. dr. Daiva Kazlauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas, 2014.
Key words: amitriptyline, venlafaxine, liquid – liquid extraction, solid-phase extraction, high
performance liquid chromatography.
Objective and methods: human blood plasma mixture with antidepressants: amitriptyline
hydrochloride, venlafaxine hydrochloride and paroxetine hydrochloride (internal standard). Methods: liquid-liquid extraction (LLE), solid-phase extraction (SPE), high performance liquid chromatography (HPLC).
Aim: to determine the best conditions for extraction of amitriptyline and venlafaxine mixture in blood
plasma samples and best conditions for antidepressant identification and quantification using HPLC method.
Objective: to perform research of scientific literature supporting antidepressant (amitriptyline and
venlafaxine) chemical, physical, pharmacological properties and analytical methods, to perform extraction from blood plasma samples; to apply and validate HPLC analytical method (using internal standard) for identification and quantification of antidepressants extracted from plasma; to perform LLE and SPE for antidepressant mixture in blood plasma; to perform optimization of chosen extraction method and statistical result evaluation.
Results: performed research of scientific literature. Applied and validated high performance liquid
chromatography for identification and quantification of target compounds. Antidepressant mixture extracted from blood plasma samples using LLE and SPE methods. SPE method was optimized by changing the elutor and its pH. Three organic solvents were determined, which best elute target compounds from sorbent and show statistical confidence (p>0,05): 2 proc. acetic acid in 100 proc. methanol solution, 2 proc. acetic acid in 80 proc. methanol solution and 2 proc. formic acid in 100 proc. methanol solution.
SANTRUMPOS
5-HT - serotoninasACN – acetonitrilas
APM – apsisukimai per minutę
CNS – centrinė nervų sistema
DC – dujų – skysčių chromatografija
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
KFE – kietafazė ekstrakcija
LD50 – vidutinė letalinė (mirtina) dozė
MAOI – monoamino oksidazės inhibitoriai
MI – miokardo infarktas
NE – norepinefrinas
ODV - O-Desmetilvenlafaksinas
Rf – sulaikymo rodiklis
SNRI – serotonino norepinefrino reabsorbcijos inhibitoriai
SSE – skysčių – skysčių ekstrakcija
SSN – santykinis standartinis nuokrypis
SSRI – selektyvūs serotonino reabsorbcijos inhibitoriai
TCA – tricikliai antidepresantai
TFA – trifluoracto rūgštis
THK – Tarptautinė Harmonizavimo konferencija
ĮVADAS
Šių dienų viena iš opiausių problemų tampa neracionalus vaistų vartojimas. „Baltic statistics on medicine“ duomenimis, žmonėms skirtų vaistų rinka Lietuvoje nuo 2009 iki 2012 metų išaugo net 15,93 proc.[30]. Viena iš dažniausiai vartojamų vaistų grupių – nervų sistemą veikiantys vaistai, psichoanaleptikai. Dažniausiai vartojama šių vaistų grupė – antidepresantai. Klinikinėje praktikoje antidepresantais gydoma skirtingų tipų depresija ir kiti psichiniai sutrikimai, tokie kaip fobijos, nerimas, baimė, neuropatinis skausmas [27,29,33]. Lietuvoje pagal valstybinės vaistų kontrolės tarnybos (VVKT) 2013 m. ataskaitą vaistų vartojimas didėjo, o remiantis šios ataskaitos duomenimis antidepresantų (ATC kodas (tretinis lygis): N06A) vartojimas nuo 2012 iki 2013 metų išaugo 5 proc.[5].
Didėjant vaistų vartojimui daugėja ir apsinuodijimų. Remiantis statistiniais duomenimis, iš visų apsinuodijimų gydytų stacionare, net 35 proc. – narkotikais, vaistais ir biologinėmis medžiagomis [1]. Šie duomenys rodo, kad reikalingas naujų metodų kūrimas ir pritaikymas apsinuodijimus sukėlusioms medžiagoms analizuoti. Greiti, atrankūs, efektyvūs analizės metodai leistų greičiau identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti apsinuodijimą sukėlusias medžiagas. Siekiant išanalizuoti kiekvieną atvejį, vykdoma kokybinė ir kiekybinė toksikologinė analizė biologiniuose mėginiuose. Dažniausiai apsinuodijimų atvejais reikia greitai, patikimai ir tiksliai identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti cheminius preparatus biologinėse matricose. Tokiai analizei atlikti būtinas mėginių ruošimo etapas, kurio metu svarbiausia pasirinkti tinkamą mėginių ruošimo metodą ir pasirinktam metodui nustatyti optimalias sąlygas. Todėl darbo tikslas nustatyti optimalias sąlygas, kurias pritaikant bus pasiekiamas didžiausias tiriamųjų medžiagų atkuriamumas ir tiksliausi kiekybinės analizės rezultatai.
Mokslinio darbo naujumas ir praktinė reikšmė
Antidepresantų mišinys yra išskirtas iš kraujo plazmos, panaudojant skystos ir kietos fazės ekstrakcijas. Nustatytos kietos fazės ekstrakcijos optimalios sąlygos antidepresantų mišiniui išskirti.
Moksliniuose literatūros šaltiniuose nerasta atliktų tyrimų apie tiriamųjų medžiagų mišinio ekstrakciją. Pirmą kartą apibendrintas mažai mokslinėje literatūroje analizuojamas ekstrakcijos optimizavimo klausimas. Optimizuotas kietafazės ekstrakcijos metodas bei validuota efektyvioji skysčių chromatografija, antidepresantų mišinio išskyrimui ir identifikavimui iš biologinių mėginių, pagreitins ir palengvins tolesnius mokslinius tyrimus.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - nustatyti optimaliausias sąlygas amitriptilino ir venlafaksino mišinio
išskyrimui iš kraujo plazmos ir medžiagų identifikavimui bei jų kiekybiniam įvertinimui efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti išsamią mokslinių literatūros šaltinių apžvalgą. Joje išanalizuoti antidepresantų (amitriptilino hidrochlorido ir venlafaksino hidrochlorido) chemines, fizikines, farmakologines savybes ir ekstrakcijos metodus, naudojamus antidepresantams išskirti iš kraujo plazmos.
2. Pritaikyti ir validuoti ESC metodiką antidepresantų, išskirtų iš kraujo plazmos, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui, kaip vidinį standartą naudojant paroksetino hidrochloridą.
3. Pritaikant skystos fazės ekstrakciją išskirti antidepresantų mišinį iš kraujo plazmos. 4. Pritaikant kietos fazės ekstrakciją išskirti antidepresantų mišinį iš kraujo plazmos.
5. Optimizuoti ekstrakcijos sąlygas antidepresantų mišinio (amitriptilino ir venlafaksino) išskyrimui iš kraujo plazmos, pasirinkta ekstrakcijos metodika ir atlikti statistinį gautų rezultatų įvertinimą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Antidepresantai
Antidepresantai – tai psichotropiniai vaistai dažniausiai vartojami nuotaikos (afektiniams) sutrikimams, depresijai gydyti. Šiems vaistams būdinga skirtinga cheminė sudėtis, tačiau dauguma jų sukelia reikšmingą poveikį neurotransmiteriams, ypač norepinefrinui (NE) ir serotoninui (5-HT) bei jų receptoriams. Antidepresantai klasifikuojami pagal jų veikimo mechanizmą [4].
Tricikliai antidepresantai (TCA), taip vadinami dėl būdingo trijų žiedų branduolio, klinikinėje praktikoje vartojami jau beveik keturis dešimtmečius [18]. Šie vaistai, dėl daugelio pašalinių reiškinių, yra pirmo pasirinkimo tik trečiajai depresijos fazei gydyti (perdozavimo rizikos ir sąveikos su daugeliu vaistų), skirtingai nei selektyvūs serotonino reabsorbcijos inhibitoriai (SSRI) ir antros kartos antidepresantai [3]. TCA savo sudėtimi panašūs į fenotiazino grupės antipsichozinius vaistus ir turi farmakologinio poveikio panašumų. TCA slopina norepinefrino ir 5-HT reabsorbciją (atgalinį įsiurbimą į presinapsinį neuroną). Manoma, kad tai stiprina neurotransmiterių poveikį posinapsinio neurono receptoriams [4].
Serotonino norepinefrino reabsorbcijos inhibitoriai (SNRI) - šiems vaistams priklauso venlafaksinas, desvenlafaksinas ir duloksetinas. Jie inhibuoja tiek serotonino, tiek norepinefrino reabsorbciją ir gali būti efektyvūs gydant depresiją, kai SSRI neveiksmingi. Pacientams, sergantiems depresija, dažnai būdingas lėtinis nugaros ar raumenų skausmas. Šis skausmas, iš dalies, atsiranda dėl serotonino ir norepinefrino metabolinių kelių centrinėje nervų sistemoje (CNS). Kadangi tiek TCA, tiek SNRI inhibuoja serotonino ir norepinefrino reabsorbciją, jie gali būti efektyvūs, palengvinant neuropatinio skausmo fizinius simptomus, tokius kaip diabetinė periferinė neuropatija. Tačiau SNRI silpnai veikia arba visai neveikia adrenerginių, muskarininių ir histamininių receptorių, todėl nesukelia su šiais receptoriais susijusių šalutinių reiškinių, kaip TCA [17].
1.1.1. Tiriamosios medžiagos
Amitriptilino hidrochloridas (Amitriptylini hydrochloridum)
1 pav. Amitriptilino hidrochlorido struktūrinė formulė [13]
C20H24ClN
Mr = 313.9
CAS – 549-18-8 [7]
IUPAC pavadinimas: 3-(10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]cikloheptan-5-yliden)-N,N-dimetilpropan -1-amino hidrochloridas [7].
Fizikinės savybės: Bespalviai kristalai arba balta pudra. Tirpus vandenyje santykiu 1 su 1, 1
su 1,5 etanolio, 1 su 56 acetono, 1 su 1,2 chloroformo, ir 1 su 1 metanolio, praktiškai netirpus eteryje. pKa 9,4 (25 o). LogP (oktanolis/vanduo), 2,18 [7,13].
Patentuoti pavadinimai: Adepril, Amavil, Amiline, Amineurin, Amioxid, Amitid, Amitril,
Amitrip, Amitrol, Domcal, Elatrol, Elavil, Endep, Equilibrin, Klotriptyl, Laroxyl, Lentizol, Levate, Meravil, Novoprotect, Novotriptyn, Redomex, Saroten, Sarotex, Syneudon, Triptyl, Tryptanol, Tryptil, Tryptizol. Jis įeina į Etrafon, Limbatril, Limbitrol, Triavil, Triptafen sudėtį [7].
Venlafaksino hidrochloridas ( Venlafaxini hydrochloridum)
C17H28ClNO2
Mr= 313,9
CAS – 93413-69-5 [7]
IUPAC pavadinimas: 1-[(1RS)-2-(dimetilamino)-1-(4-metoksifenil)etil]-cikloheksanolio
hidrochloridas [7].
Fizikinės savybės: balta arba beveik balta pudra. Lengvai tirpus vandenyje ir metanolyje,
tirpus bevandeniame etanolyje, mažai tirpus arba beveik netirpus acetone. Jam būdingas polimorfizmas [14]. Tirpūs vandenyje 572 g/L. (-) ir (+) formos kristalizuojasi iš metanolio/eterio [7].
Patentuoti pavadinimai: Dobupal, Efexor, Effexor, Trevilor, Trewilor, Vandral [7].
1.1.2. Klinikinės indikacijos
Indikacijos : depresija, panikos sutrikimas, obesinis – kompulsinis sindromas, enurezė, lėtinis skausmas [18].
Amitriptilinas skiriamas didžiajam depresijos epizodui gydyti. TCA labai veiksmingi ir
dažnai skiriami esant psichomotoriniam sutrikimui, sutrikus miegui, pablogėjus apetitui ir mažėjant kūno svoriui. Taip pat amitriptilinas gali būti vartojamas enurezei (nevalingas šlapinimasis) gydyti [4].
Venlafaksinas dažniausiai skiriamas generalizuoto nerimo sutrikimo gydymui, esant panikai
(su agarofobija ar be jos), socialinei fobijai. Taip pat venlafaksinas gali būti skirimas bipoliniam sutrikimui gydyti. Esant dėmesio sutrikimams, hiperaktyvumui, valgymo sutrikimams, karštam prakaitavimui, susijusiam su diagnozuotu vėžiu, menopauziniam paraudimui, obesiniam-kompulsiniam sutrikimui, potrauminio streso sutrikimams, premenstruaciniams disforiniams sutrikimams, periodiniam didžiosios depresijos epizodui, įtampos tipo galvos skausmui [22].
1.1.3. Farmakologinis poveikis
Centrinei nervų sistemai (CNS). Vaistai, blokuojantys norepinefrino atgalinį įsiurbimą
CNS, pvz., tricikliai antidepresantai, venlafaksinas, taip pat slopina norepinefrino reabsorbciją autonominės nervų sistemos nervinėse galūnėse (1 lentelė) [4,18].
Sedacija. TCA ir kai kurie keturcikliai sukelia mieguistumą. Ši savybė gali būti naudinga
ligoniams, turintiems miego sutrikimų [4].
Antimuskarininis poveikis. TCA, ypač amitriptilinas, blokuoja muskarininius receptorius,
sukeldamas stiprų antimuskarininį poveikį. Keturcikliai antidepresantai (venlafaksinas) tokio poveikio neturi [4].
Širdies ir kraujagyslių sistema. TCA sukelia silpnesnį poveikį. Šie antidepresantai blokuoja
alfa adrenoreceptorius ir mažina kraujospūdį, sutrikdo širdies laidumą ir gali sukelti gyvybei pavojingas aritmijas [4].
Taukuliai. TCA mažina traukulių slenkstį, todėl didesnės jų dozės gali sukelti traukulių
priepuolius.
Tolerancija ir priklausomybė. Vartojant TCA, retai gali pasireikšti tolerancija sedaciniam ir
autonominės nervų sistemos poveikiui [4].
1 lentelė. Amitriptilino ir venlafaksino farmakologinis poveikis (10=nėra; + = nedidelis; ++ =
vidutiniškas; +++ = didelis) [18]
Vaistas Sedacinis
veikimas
Antimuskarininis veikimas
Aminų siurblio blokas
Serotoninas Norepinefrinas Dopaminas
Amitriptilinas +++ +++ +++ ++ 0
Venlafaksinas 0 0 +++ ++ 0,+
1.1.4. Farmakokinetinės savybės
Tricikliai antidepresantai pasižymi šiomis farmakokinetinėmis savybėmis:
Absorbcija: dažniausiai antidepresantai yra geriami, tačiau amitriptilinas gali būti
injekuojamas į raumenis. Taip pat dauguma gerai absorbuojami iš virškinamojo trakto [4,17,18,22].
Pasiskirstymas: Stipriai jungiasi su baltymais ir gana gerai tirpsta lipiduose (lipofiliniai
dariniai), todėl pasiskirstymo tūriai paprastai labai dideli (10-15 l/kg) (2 lentelė) [4,18,22]
Biotransformacija: tricikliai antidepresantai metabolizuojami kepenyse pirmojo pasažo metu,
dviem pagrindiniais keliais: transformuojant triciklį branduolį ir keičiant alifatinę šoninę grandinę. Monodemetilinant tretinius aminus, formuojami veiklieji metabolitai (nortriptilinas) (2 lentelė) [4,18,22].
Keturciklių antidepresantų farmakokinatinės savybės:
Absorbcija: gerai absorbuojamas per oraliniu būdu, bioprieinamumas 12,6 proc. (kai
farmacinė forma kapsulė), arba net 45 proc. (esant prailginto veikimo kapsulei). Maistas absorbcijos neįtakoja [4].
Pasiskirstymas: pasiskirstymo tūris 7,5 L/kg, 27-30 proc. jungiasi su baltymais (2 lentelė)
[22].
Biotransformacija: venlafaksinas metabolizuojamas kepenyse, taip pat pirmojo pasažo metu,
CYP 450 sistemos, daugiausiai CYP2D6 izofermento, kuris demetilindamas verčia venlafaksiną į aktyvų metabolitą – desvenlafaksiną [22].
Šalinimas: šalinamas per inkstus metabolitų pavidalu (82 proc.), nepakitusio (5 proc.). Taip
pat išskiriamas su išmatomis (5 proc.) [18,22].
2 lentelė. Amitriptilino ir venlafaksino farmakokinetinės savybės ( 1
ir veiklieji metabolitai, 2Nd - nėra duomenų) [18] Vaistas Biopasisavinimas (nuošimtis)1 Jungimasis su baltymais (nuošimtis)1 Plazmos t1/2 (valandos) Veiklūs metabolitai1 Pasiskirsty mo tūris (l/kg)1 Terapinės koncentracijos plazmoje (ng/ml)1 Amitriptilinas 31-61 82-96 31-46 Nortriptilinas 5-10 80-200 iš viso Venlafaksinas Nd (45 proc.)[12] 27-30 4-10 O-desvenlafaksinas Nd (7,5 +/-
3,7)[12]
Nd
1.1.5. Farmakodinaminės savybės
Amitriptilinas, kaip ir visi TCA blokuoja aminų (norepinefrino ar serotonino) susigrąžinimo siurblius, kurie baigia aminų neurotransmisiją. Toks veikimas greičiausiai leidžia neurotransmiteriui ilgiau pasilikti prie receptoriaus [18].
Venlafaksinas – stiprus serotonino susigrąžinimo inhibitorius ir silpniau slopina norepinefrino gabenimą, todėl mažesnės terapinės dozės veikia kaip SSRI. Didelės dozės (daugiau kaip 225 mg/d) nedaug ar vidutiniškai paspartina širdies susitraukimus ir pakelia kraujospūdį, nes slopina norepinefrino susigrąžinimą. 300 mg/d. ir didesnės šio vaisto dozės terapiškai veikia plačiau už SSRI, siekiant išvengti nepalankių poveikių, tokias dozes reikia kruopščiai titruoti [18].
1.1.6. Metabolizmas ir ekskrecija
Amitriptilinas metabolizuojamas kepenyse pirmojo pasažo metu N-demetilinimo ir hidroksilinimo keliais. Gaunamas pirminis aktyvus metabolitas – nortriptilinas. Apytiksliai 50 proc. amitriptilino dozės N-demetilinama iki nortriptilino. N-demetilinimo metu dalyvauja CYP 450 fermentai: CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2, CYP3A4, CYP2D6, CYP2B6, CYP2C8, kurie pirmiausia demetilina amitriptiliną iki nortriptilino. Šiek tiek mažiau gaunama kito veiklaus metabolito veikiant CYP2D6, CYP3A4, CYP2B6 – E-10-hidroksiamitriptilino. Visa dozė išskiriama gliukuronidų ar sulfatų metabolitų pavidalu, tik labai maža dalis nepakitusio vaisto lieka šlapime. 25-50 proc. vienkartinės dozės išskiriama kartu su šlapimu, neaktyvių metabolitų pavidalu, per 24 val. Nedidelis kiekis išsiskiria su išmatomis, tulžies eliminacijos metu. Eliminacijos pusperiodis yra 15 val. (svyruoja nuo 10 iki 50 val.) [11].
Venlafaksinas pirmiausia metabolizuojamas kepenyse pirmojo pasažo metu iki pagrindinio savo veikliojo metabolito, O-Desmetilvenlafaksino (ODV), ir dviejų mažiau veiklių, N-desmetilvenlafaksino ir N,O-diN-desmetilvenlafaksino. ODV susidaro katalizuojant citochromo P450 fermentams (CYP2D6, CYP3A4, CYP2C19, CYP2C9). Pirmiausiai venlafaksinas ir jo metabolitai šalinami per inkstus. Apie 87 proc. dozės randama šlapime po 48 val.: nepakitusio venlafaksino (5 proc.), nekonjuguoto ODV (29 proc.), konjuguoto ODV (26 proc.), ar kitų neaktyvių metabolitų (27 proc.). Ramybės būsenoje venlafaksino plazmos klirensas 1,3 +/- 0,6 L/val/kg. Ramybės būsenoje ODV plazmos klirensas, 4+/- 0,2 L/val/kg [12].
1.1.7. Kontraindikacijos
Amitriptilino negalima vartoti esant alergijai veikliajai medžiagai bei po miokardo infarkto. Draudžiama vartoti kartu su cisapridu, nes gali sukelti QT intervalo pailgėjimą ir padidinti aritmijos riziką. Taip pat su MAOI ar per 14 dienų po MAOI vartojimo, nes gali ištikti hiperpiretinė krizė, sunkūs traukuliai, mirtis [21].
Venlafaksino nereikėtų vartoti esant padidėjusiam jautrumui venlafaksinui ar jo veikliajam metabolitui – desvenlafaksinui. Draudžiama kartu vartoti MAOI, įskaitant ir linezolidą ar (IV) metileno mėlynąjį. Venlafaksino vartojimą reikia nutraukti likus 7 dienoms iki MAOI vartojimo pradžios, o nutraukus gydymą MAOI, venlafaksiną galima pradėti vartoti tik po 14 dienų [22].
1.1.8. Specialios atsargumo priemonės
Vartojant amitriptiliną gali atsirasti savižudiškas elgesys ar matomas depresijos pablogėjimas. Svarbu stebėti pirmuosius terapijos mėnesius. Esant bipoliniam sutrikimui, gali pasireikšti mišrūs manijos epizodai. Amitriptiliną reikia atsargiai vartoti širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimų turintiems asmenims, nes jis gali padidinti sinusinės tachikardijos riziką, sukelti širdies laidumo sutrikimus, aritmijas, miokardo infarktą (MI), insultą. Būdingas konkurencinis veikimas su elektrošoko terapija. Taip pat atsargiai vartoti esant glaukomai, hipertiroidizmui, pablogėjusiai kepenų funkcijai, padidėjusiam akispūdžiui bei pacientams, kuriems būdinga manija, paranoja, šizofrenija [21].
Vartojant venlafaksiną gali atsirasti suicidinės mintys ir elgesys, ar pasunkėjusi depresija, ypač vaikams, paaugliams ir jauniems suaugusiems per pirmuosius terapijos mėnesius ar keičiant dozę. Todėl rekomenduojamas monitoringas. Pastebėtas nenormalus kraujavimas, kartu su gyvybei pavojingomis hemoragijomis. Venlafaksiną vartojant bipoliniam sutrikimui gydyti, padidėja rizika manijos epizodams pasireikšti. Taip pat atsargiai vartoti reikia kartu su nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo (NVNU). Nerekomenduojama vartoti kartu su vaistais skirtais mažinti svorį, tokiais kaip fenterminas. Taip pat nerekomenduojamas esant uždarojo kampo glaukomai. Atsargiai vartoti reikėtų esant hipertenzijai, padažnėjusiam širdies ritmui bei esant kitoms būklėms (hipertiroidizmui, širdies nepakankamumui, MI) [22].
1.1.9. Vartojimas, dozavimas
Amitriptilino dozavimas: leidžiamas į raumenis – pradinė dozė 80-120 mg dienoje, padalinta į 4 dozes. Dozavimas rektaliai: 50 mg žvakutės 2 kartus per dieną. Ambulatoriniams pacientams: pradinė dozė 75 mg per dieną, padalintomis dozėmis. Esant reikalui dozė gali siekti 150 mg per dieną. Dozių koregavimas turėtų būti po pietų ar visai prieš miegą. Hospitalizuotiems pacientams: pradinė dozė 100 mg per dieną, padalintomis dozėmis, didinama iki 200 ar 300 mg per dieną, tik esant reikalui. Palaikomoji dozė: skiriama palaikomoji dozė nuo 50 iki 100 mg per dieną prieš miegą. Kai kuriems pacientams užtenka ir 40 mg per dieną. Terapija trunka 3 mėnesius ar ilgiau siekiant sumažinti atkryčių pavojų [21].
Venlafaksino dozavimas: generalizuoto nerimo sutrikimo gydymui pradinė rekomenduojama dozė yra prailginto veikimo 75 mg per dieną, skiriama kartu su maistu. Vartojamas arba ryte arba vakare, tačiau labai svarbu, kad vaistas būtų vartojamas kasdien, tuo pačiu metu. Naujam pacientui
skiriama 37,5 mg per dieną dozę, tačiau tik 4 dienas, kad pacientas priprastų prie terapijos. Maksimali rekomenduojama dozė 225 mg per dieną. Didžiojo depresijos sutrikimo gydymui – pradinė rekomenduojama venlafaksino dozė yra 75 mg per dieną, skiriama suvartoti per 2-3 kartus per dieną, kartu su maistu. Esant reikalui dozė gali būti didinama iki 75 mg per dieną, intervalais per keturias dienas. Sunkiai depresijos formai maksimali dozė gali būti 350 mg per dieną. Gydant paniką skiriama 37,5 mg per dieną per os, septynioms dienoms. Po savaitės dozė gali būti didinama iki 75 mg per dieną. Pacientams, kuriems nebūna atsako arba efektas per mažas, didinama 75 mg dienoje, padidinama ne mažiau nei per 7 dienas. Maksimali dozė 225 mg per parą [22].
1.1.10. Nepageidaujamas poveikis
Daugelis amitriptilino nepageidaujamų reiškinių, būdingi ir visiems TCA, susiję su antimuskarininiu veikimu. Antimuskarininiai reiškiniai dažni ir pasireiškia greičiau nei sulaukiamas antidepresanto poveikis. Būdingas burnos džiūvimas, vidurių užkietėjimas, kuris pereina į žarnų nepraeinamumą, šlapimo susilaikymas, neryškus matymas, pusiausvyros sutrikimai, padidėjęs akispūdis ir hipertermija. Dažnas mieguistumas, nervingumas, nemiga. Rečiau pasireiškia kiti neurologiniai šalutiniai reiškiniai, kaip galvos skausmas, periferinė neuropatija, tremoras, ataksija, epileptiniai traukuliai, spengimas ausyse ir kartais ekstrapiramidiniai simptomai, kaip kalbos sutrikimai (dizartrija). Gali pasitaikyti konfūzija, haliucinacijos, delyras ar kiti elgesio sutrikimai. Būdingi gastroenterologiniai simptomai, kaip rūgštus ar metalo skonis burnoje, stomatitas, pykinimas ir vėmimas. TCA taip pat neigiamai veikia širdies ir kraujagyslių sistemą. Gali ištikti ortostatinė hipotenzija ir tachikardija pacientams, kurie prieš tai neturėjo jokių šios sistemos sutrikimų. Šie vaistai itin pavojingi vyresniame amžiuje. Pasitaiko padidėjusio jautrumo reakcijos, dilgėlinė ar angioedema bei fotosensitizacija, retai cholestazinė gelta ar kraujo sutrikimai, eozinofilija, kaulų čiulpų slopinimas, trombocitopenija, leukopenija ir agranuliocitozė. Endokrininei sistemai poveikis pasireiškia sėklidžių padidėjimu, ginekomastija, krūtų padidėjimu, ir galaktorėja, rečiau seksualinė disfunkcija. Retai hiponatremija [21].
Vartojant venlafaksiną gali pasireikšti neigiamas poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai: hipertenzija (3 – 13 proc.), širdies nepakankamumas, padažnėjęs širdies ritmas, palpitacijos, pailgėjęs QT intervalas, vazodilatacija [22,35]. Naujesnių tyrimų metu pastebėta ir streso sukelta kardiomiopatija [25]. Dermatologiniai nepageidaujami reiškiniai: prakaitavimas (6,7 – 25 proc.). Yra duomenų apie keratodermos, psoriazės formos išsivystymą. Gali būti ir hiperkeratozė, alopecija
[10,22]. Endokrininiai – metaboliniai: svorio mažėjimas, augimo sulėtėjimas, karščio bangos, hiponatremija, cholesterolio kiekio serume padidėjimas, trigliceridų kiekio serume padidėjimas. Neigiamas poveikis virškinimo sistemai : vidurių užkietėjimas, apetito praradimas, pykinimas, kserostomija. Taip pat pasitaiko virškinimo trakto hemoragijų, dantų griežimas, vėmimas, viduriavimas. Neurologiniai nepageidaujami reiškiniai: astenija, svaigulys, miego sutrikimai, galvos skausmas, nemiga, mieguistumas, tremoras [22]. Nustatyta akatizijos atvejų [16]. Neramių kojų sindromas [31].
Regos sutrikimai : neryškus matymas, glaukoma, midriazė. Psichiatriniai sutrikimai: būdingas nervingumas, nerimas, haliucinacijos, hipomanija, manija, paranoja, savižudiškos mintys, savižudybė. Reprodukcinei sistemai: nenormali ejakuliacija, impotencija. Sumažėjęs libido. Taip pat pranešta apie kelis sunkių pašalinių reiškinių atvejus. Pranešta apie 2 intersticinės pneumonijos atvejus, vienas daugybinis organų pažeidimo atvejis, dozė nenurodoma [22,35].
1.1.11. Perdozavimas
Amitriptilino vidutinė mirtina (letalinė) dozė LD50=350 mg/kg (pelėms). Perdozavimo
simptomai: žemas kraujospūdis, sutrikimas, traukuliai, išsiplėtę vyzdžiai ir kitos akių problemos, koncentracijos praradimas, mieguistumas, haliucinacijos, sutrikusi širdies funkcija, greitas ar nereguliarus širdies ritmas, sumažėjusi kūno temperatūra, stuporas, sąmonės netekimas, koma [18].
Sunkiai apsinuodijus venlafaksinu, pasireiškia depresija, serotonino toksiškumas, širdies smūgis ar širdies laidumo sutrikimai. Toksinė dozė 900 mg, viršijus toksinę dozę gali ištikti mirtis [12].
1.1.12. Tiriamųjų medžiagų analizės metodai
Šiuo metu laboratorinėje praktikoje amitriptilino ir venlafaksino identifikavimui ir kiekybinei analizei taikomi įvairūs analizės metodai ir jų sistemos (sistemų detali informacija pateikta 3 priede):
1. Plonasluoksnė chromatografija
a. Amitriptilinas.Sistemos: TA – Rf 0,51; TB – Rf 0,50; TC – Rf 0,32; TE – Rf 0,69; TL – Rf
0,15 (Dragendorfo purškalas, teigiamas; parūgštintas jodo platinato tirpalas, teigiamas; Marki testas, rudas) [7].
2. Dujų chromatografija
a. Amitriptilinas. Sistemos: GA –RI 2194; GB –RI 2284; GF - RI 2510; GM –RRT 0,723
[7].
b. Venlafaksinas. Sistema GB –RI 2163, GM –RRT 0,544 [7].
3. Efektyvioji skysčių chromatografija
a. Amitriptilinas.Sistemos: HZ – sulaikymo laikas 7.5 min; HAA – sulaikymo laikas 15.9
min; HAX – sulaikymo laikas 15.8 min; HAY – sulaikymo laikas 7.3 min [7].
b. Venlafaksinas. Sistema HZ – sulaikymo laikas 3,1 min [7].
4. Ultravioletinė spektrofotometrija
a. Amitriptilinas: Vandeninė rūgštis – 239 nm (A11=504a) (3 pav.) [7].
b. Venlafaksinas: Vandeninio parūgštinto tirpalo ( 0,2 mol/l sieros rūgštis) – 225, 273, 280
nm; (0,025 mol/l sieros rūgštis) – 26,5, 274,5 nm; bazinis – 274, 280 nm (3 pav.) [7].
3 pav. Amitriptilino hidrochlorido (A) ir venlafaksino hidrochlorido ultravioletinių spindulių spektrai [7]
5. Infraraudonųjų spindulių spektrofotometrija
a. Amitriptilinas: pagrindiniai pikai ties 756, 770, 746, 969, 1014, 1258 cm-1 (amitriptilino hidrochloridas, KBr diskas) (4 pav) [7].
b. Venlafaksinas: svarbiausi pikai prie 1513, 1243, 1179 cm-1 bangos ilgių (venlafaksino hidrochlorido; KBr diskas) (4 pav) [7].
4 pav. Amitriptilino hidrochlorido (A) ir venlafaksino hidrochlorido(B) infraraudonųjų spindulių spektrai [7]
6. Masių spektras
a. Amitriptilinas: pagrindiniai jonai m/z 58, 59, 202, 42, 203, 214, 217 [7]; b. Venlafaksinas: svarbiausi jonai prie m/z 58, 134, 91, 121, 179, 42, 77, 277 [7].
.
5 pav. Amitriptilino hidrochlorido (A) ir venlafaksino hidrochlorido(B) masių spektrai [7]
1.1.13. Kiekybinis nustatymas
Antidepresantų ir jų metabolitų biologiniuose skysčiuose analizės metu išskyla daug sunkumų. Dėl mėginiuose esančios mažos tiriamosios medžiagos koncentracijos, reikalingas didelis analizės metodo selektyvumas ir jautrumas. Efektyvioji skysčių chromatografija yra viena iš dažniausiai pasirenkamų analizės metodų antidepresantų ir jų metabolitų nustatymui biologiniuose skysčiuose. Šis metodas turi daug privalumų: didelis jautrumas, specifiškumas ir universalumas [28].
1.2. Mėginių ruošimas
Nors analitinėje toksikologijoje galimi ir tiesiogiai su mėginiu atliekami metodai, tokie kaip paprasti spalviniai testai, imunoanalizės ar fermentinės analizės, tačiau daugeliu atveju reikia pirminio mėginio paruošimo. Mėginio ruošimo procedūros sudėtingumas didžiąja dalimi priklauso nuo vaisto ar nuodo prigimties (įvertinamas jo stabilumas, fizinės savybės, metabolizmas, eliminacija) [15].
Nuo mėginių paruošimo priklauso beveik visi tolimesni analizės žingsniai, ir tai yra kritinis žingsnis, kuris įtakoja identifikavimą ir kiekybinį tiriamosios medžiagos nustatymą. Jam priklauso tiriamųjų medžiagų izoliavimas ar pradinis sukoncentravimas iš biologinės matricos bei jų pritaikymas analizei. Mėginių paruošimas standartiškai užima 80 proc. visos analizės laiko ir vykdomas pagal schemą (6 pav.). Kadangi šiuo laikotarpiu organinių molekulių analizei dažniausiai taikomi chromatografiniai metodai, tai mėginių paruošimui naudojama skysčių-skysčių ekstrakcija arba kietafazė ekstrakcija [26].
6 pav. Mėginio ruošimo etapų schema [15]
Sekantys svarbūs uždaviniai ruošiant mėginį: pašalinti netirpias priemaišas, trukdančias atlikti analizę, pakeisti analitės koncentraciją ar praskiedimą, siekiant didesnio tikslumo, teisingai pasirinkti ekstrakcijos sąlygas [15].
Mėginių ruošimas atliekamas iš anksto, tačiau vis didesnio dėmesio susilaukia mėginių automatinis paruošimas, kuris padeda išvengti klaidų, sumažinti tyrėjų atliekamą darbą, ypač vykdant chromatografinius tyrimus [15].
1.2.1. Skysčių – skysčių ekstrakcija (SSE)
SSE – vienas pirmųjų mėginio paruošimo metodų, kuris ir dabar plačiai naudojamas biologinių mėginių analizei. SSE paremta tiriamųjų medžiagų perkėlimu iš vandeninio mėginio į su vandeniu nemaišų organinį tirpiklį. Šios ekstrakcijos trūkumai: susiformuoja emulsijos, naudojami dideli kiekiai mėginio ir toksiškų organinių tirpiklių, dėl to metodas yra brangus, trunka ilgą laiką ir yra kenksmingas aplinkai ir žmonėms. Nepaisant to, metodas vis dar naudojamas laboratorinėje praktikoje biologinių mėginių ruošimui [20,26].
SSE išeiga priklauso nuo pasiskirstymo pusiausvyros (tirpumo), elektrolitų disociacijos (priklauso nuo pH), organinės ir vandeninės fazės tūrių santykio, ekstrakcijos pakartojimų skaičiaus[7].
1.2.1.1. Pasiskirstymo pusiausvyra (tirpumas)
Daugelio centriniu veikimu pasižyminčių vaistų, išgryninimas atliekamas ekstrahuojant biologinį mėginį su inertiniu, vandenyje nemaišiu organiniu tirpikliu, esant tinkamai pH terpei. Geriausia naudoti mažiausiai polinį tirpiklį, kuris efektyviausiai ekstrahuos analitę – pasirinkus tirpiklį su per didele „ekstrakcine jėga“ gali sumažėti metodo selektyvumas, nes galimas pašalinių medžiagų išsiekstrahavimas [6].
Parenkant ekstrahentą, svarbu įvertinti medžiagų maišumą, tirpumą bei tankį. Sumaišius du tirpiklius, turi susidaryti dvi atskiros fazės, tuomet galime teigti, kad jie yra nemaišūs. Taip pat parenkant ekstrahentus, atsižvelgiama į jų tirpumą vienas kitame, nes net ir dalinai vienas kitame tirpūs ekstrahentai sudaro atskiras fazes (3 lentelė) [6].
3 lentelė. Tirpumų lentelė [6]
Organinis tirpiklis Tirpiklių tirpumas vandenyje Vandens tirpumas tirpikliuose Tirpumas 20˚C (proc.)
Chloroformas 0,815 0,056
Dichlorometanas 1,60 0,24
Etilo eteris 6,89 1,26
1.2.1.2. Elektrolitų disociacija (priklausomybė nuo pH)
Analitės charakteristikos (rūgštinės ar bazinės) ir vandeninės fazės pH lemia jonizuotos ir nejonizuotos formos santykį. Jeigu analizuojama medžiaga yra bazinė, tai 99 proc. jos yra protonizuotoje formoje, kai pH=pKa – 2 ir deprotonizuotoje formoje, kai pH = pKa+2, o kai medžiaga
rūgštinė – 99 proc. yra jonizuotoje formoje, kai pH=pKa+2 ir nejonizuotoje formoje pH=pKa – 2.
Vykdant ekstrakciją su linkusiais jonizuotis junginiais geriausiai parinkti tokį pH, kad medžiaga būtų arba pilnai jonizuota arba visai nejonizuota. Tada bus gaunami geriausi rezultatai [6,7].
1.2.1.3. Tirpiklių poliškumas
Poliškumas – savybė, susidedanti iš keleto fizikinių reiškinių – gebėjimas formuoti vandenilinius ryšius, dipolio momentas ir žemos dielektrinės konstantos. Poliškesni tirpikliai išekstrahuoja daugiau medžiagos. Alkanai nesudaro vandenilinių ryšių, turi mažą dipolinį momentą arba jo visai neturi. Jiems būdinga maža dielektrinė konstanta, todėl yra nepoliniai. Alkoholiai, kurie gali sudaryti vandenilinius ryšius ir turi dideles dielektrines konstantas, yra poliniai (4 lentelė).
4 lentelė. Dažniausiai naudojamų organinių tirpiklių fizikinės savybės ( 1Nd – nėra duomenų) [8,23,24] Organinis tirpiklis Tankis (g/ml) Poliškumas Dielektrinė konstanta (ε) Virimo temperatūra (˚C) Degumas Eliucinė galia Chloroformas 1,498 4,1 4,81 61,2 Taip Nd1 Dichlorometanas 1,325 3,1 8,93 40 Taip Nd1 Etanolis 0,789 Nd1 24,6 78,5 Taip 0,88
Etilo eteris[23] 0,713 2,8 4,34 34,6 Taip 0,38
Etilo acetatas 0,894 4,4 6,02 77 Taip 0,58
Metanolis 0,791 5,1 33,1 64,6 Taip 0,95
1.2.1.4. Tiriamosios medžiagos prigimtis
Analizuojamos medžiagos prigimtis taip pat turi įtakos ekstrakcijos laipsniui. Cheminiai junginiai, kurie gali sudaryti vandenilinius ryšius, kaip donorai arba kaip akceptoriai, geriau ekstrahuosis į tirpiklius. Alkoholiai, tokie kaip 2-propanolis ar 3-metil-1-butanolis (sinonimai - izopentilo alkoholis, izoamilo alkoholis) gali būti pridedami į aprotoninius (aprotoninis – toks tirpiklis, kuris nesudaro vandenilinių jungčių) tirpiklius, siekiant paskatinti vandenilinių ryšių formavimą ir taip padidinti ekstrakciją blogai vandenyje tirpių cheminių junginių, ir sumažinti bazinių vaistų absorbciją ant stiklo [15].
1.2.1.5. Organinės ir vandeninės fazės tūrių santykis
Rekomenduojamas fazių santykis 1:2 (organinis : vandeninis). Kai medžiagos sunkiai ekstrahuojasi, geriau parinkti kitą tirpiklį, nei didinti organinės fazės kiekį ar kartoti pačią ekstrakciją daug kartų. Tirpiklio perteklius ir/ar pakartotinės ekstrakcijos tik padidins kartu išsiekstrahuojančių priemaišų kiekį [7].
1.2.1.6. Atlikimo technika
Atliekamas mechaninis organinės ir vandeninės fazių maišymas. Iš maišymo būdų, sūkurinis maišymas yra greičiausias ir efektyviausias metodas santykinai mažo tūrio mėginiams. Sukamieji maišytuvai labiau tinkami didesnio tūrio mėginiams, ekstrahuojant iki 30 ml plazmos/serumo, šlapimo ar skrandžio turinio, taip sumažinama emulsijų susidarymo rizika – energingas maišymas nereikalingas ir netinkamas. Stipriai rūgštinių ar bazinių sąlygų naudojimas yra emulsijų susidarymą skatinantis veiksnys, todėl geriausia būtų pritaikyti švelnesnes sąlygas [15].
Centrifuguoti dažniausiai galima didesnius tūrius medžiagos. Dažniausiai 2000-3000 APM (apsisukimai per minutę) užtenka, kad fazės atsiskirtų ir galėtume atskirti organinę fazę. Reliatyvi centrifugos jėga nėra kritinis reikalavimas fazių atsiskyrimui. Gali būti taikomi ir supamieji rotoriai, nes jie užtikrina, kad sąlytis tarp organinės ir vandeninės fazių yra stačiu kampu į indą, taip palengvinamas organinio tirpiklio atskyrimas.
Kai kurie autoriai po centrifugavimo šaldo vandeninį sluoksnį (-20 iki -60 ˚C), taip lengvindami organinio sluoksnio atskyrimą nupilant [7,15].
Dažniausiai ekstraktas paliekamas nusistovėti ir atskiriamas naudojantis vienkartine Pastero pipete. Kuris sluoksnis nusistovi apačioje ar viršuje, priklauso nuo nemaišių fazių tankio. Po ekstrakto atskyrimo tirpiklis yra garinamas. Garinama suspausto oro arba azoto srove. Garinimo metu taip pat pasiekiamas analitės sukoncentravimas [6,7,15].
1.2.2. Kietafazė ekstrakcija (KFE)
KFE yra pranašesnė ekstrakcinė metodika nei SSE, nes jos metu galima išvengti problemų (pavyzdžiui, nepilno fazių atskyrimo, mažo medžiagų atkuriamumo, naudojamos stiklinės įrangos trapumo bei didelio organinių tirpiklių sunaudojimo), su kuriomis susiduriame vykdant SSE [6,34].
Dažniausiai KFE naudojama skystiems mėginiams ruošti ir ekstrahuoti pusiau lakioms ar nelakioms medžiagoms, tačiau taip pat gali būti pritaikoma kietoms medžiagoms, kurios yra pre-ekstrahuojamos į tirpalus [34].
Kietafazės ekstrakcijos privalumai: didelis ekstrakcijos efektyvumas naudojant mažus mėginių kiekius, paprastesnė procedūra, sunaudojami mažesni tirpiklių kiekiai, ekstrahuojant biologines matricas nesusidaro emulsijos, ekstraktuose yra mažiau pašalinių medžiagų nei SSE, tai greitas ir gali būti automatizuotas metodas [6,7,34].
Kietafazė ekstrakcija pagal fizikines sąveikas gali būti skirstoma į atvirkštinių fazių (angl. reversed phase), normaliųjų fazių (angl. normal phase), jonų mainų (angl. ion exchange), adsorbcijos (angl. adsorbtion) [20,34].
1.2.2.1. Atvirkštinių fazių kietafazė ekstrakcija
Atvirkščių fazių ekstrakcijai priskiriami sorbentai - alkilo arba arilo radikalus turintys silicio dariniai. Hidrofilinės silanolio grupės prie silicio paviršiaus chemiškai modifikuojamos su hidrofobine alkilo ar arilo funkcine grupe reaguojant atitinkamiems silanams. Organinės analitės sulaikomos iš polinių tirpalų (pvz. Vandeninių) ant sorbento dėl pritraukiančių jėgų tarp anglies-vandenilio (C–H) ryšio analitėje ir funkcinės grupės ant silicio paviršiaus. Nepolinė – nepolinė pritraukianti jėga dar
vadinama van der Valso jėga ar dispersijos jėga. Norint pašalinti adsorbuotą medžiagą, naudojamas nepolinis tirpiklis, kuris nutraukia susidariusius ryšius tarp medžiagos ir sorbento [34].
1.2.2.2. KFE kasetės
Dažniausiai naudojamos kasetės, užpildytos medžiagomis su alkilo radikalais. Stacionari fazė yra prisitvirtinusi reaguojant atitinkamam chlorosilanui su dalimi silanolio paviršiaus ant silicio pagrindo, esant bevandenėms sąlygoms. Prisijungusi fazė pagrinde yra susijusi su dalimi silanolio paviršiumi sililoksiniais ryšiais (Si-O-Si). Tačiau daugelis gamintojų naudoja skirtingus silicio pagrindus, skirtingus cheminius prisijungimo principus ir skirtingus užpildus, todėl gaunami rezultatai gali skirtis [15].
Toksinės medžiagos ekstrakcija pasiekiama, vykstant hidrofobinei, hidrofilinei, aromatinei ar elektrostatinei sąveikai. Dažnai įtraukti keli mechanizmai. Šiandien išvystytos tiek selektyvios procedūros, kai žinoma ieškoma analitė, tiek neselektyvios. Todėl dabar toksikologinėje analizėje dažniausiai naudojami kombinuoti sorbentai, kuriais gali būti ekstrahuojamos įvairios medžiagos, nes jie pasižymi hidrofobinėmis ir elektrostatinėmis sąveikomis [7].
Sorbentas parenkamas, įvertinus kokio tipo ekstrakcija bus vykdoma (normaliųjų fazių, atvirkštinių ar kt.), kokios medžiagos savybės, pagal reikalingą porų dydį [39].
1.2.2.3. Atlikimo technika
Kietafazė ekstrakcija yra dažniausiai 5-6 žingsnių procesas. Kai kurie mokslinių šaltinių autoriai siūlo kaip pradinį žingsnį išskirti tinkamą kasetės parinkimą, o visi kiti žingsniai (7 paveiksle) sutampa [15,34].
7 pav. Kietafazės ekstrakcijos procedūros schematinis vaizdas [15]
Kasetė parenkama pagal šiuos kriterijus: analizuojamo mėginio tūris (5 lentelė) ir ekstrakcijos greitis, medžiagų masė, sorbento tipas. Ekstrahuojamų medžiagų masė neturi būti daugiau nei 5 proc. kasetėje esančio sorbento [34]. Atvirkštinės fazės kietafazė ekstrakcija dažniausiai atliekama su C8 ir
C18 medžiagomis. Medžiagų atsikartojamumas siekia 95 proc., kartu su žemu santykiniu standartiniu
nuokrypiu (SSN proc. - santykinis standartinis nuokrypis proc.), ir gali būti atlikta itin jautri kiekybinė analizė (ng) [15].
5 lentelė. Kasetės pasirinkimas įvertinus tiriamojo mėginio tūrį ir ekstrakcijos greitį [34]
Mėginys Kasetė
< 1 ml 1 ml
1 ml iki 250 ml, ekstrakcijos greitis nesvarbus 3 ml 1 ml iki 250 ml ir reikalinga greita ekstrakcija 6 ml
10 ml iki 250 ml 12, 20, 60 ml
<1 l ir nesvarbus ekstrakcijos greitis 12, 20, 60 ml
Kondicionavimas. Dažniausiai kasetė kondicionuojama vandenyje maišiu organiniu tirpikliu,
kaip metanolis, po kurio seka vanduo arba buferinis tirpalas. Metanolis aktyvina sorbento paviršių ir įsiskverbia į ryšiais susijungusias alkilo grupes, leisdamas vandeniui efektyviai sudrėkinti silicio paviršių [7,15,34].
Mėginio įterpimas. Mėginys tiksliai perkeliamas į kasetę, naudojantis volumetrine pipete ar
mikropipete. Negalima naudoti per didelio mėginio tūrio, nes tuomet sorbente nesulaikoma medžiaga, prarandama analitė ir sumažėja ekstrakcijos efektyvumas ir mėginių atkuriamumas [34].
Sulaikymas. Šio žingsnio metu mėginys lėtai juda per ekstrakcijos kasetę, naudojant
vakuumą arba teigiamą slėgį. Tekėjimo greitis gali turėti įtakos medžiagų sulaikymui sorbente. Bendruoju atveju tekmės greitis neturėtų viršyti 5 ml/min [34]. Kai analitė sulaikoma, tada gali būti atliekamos įvairios valymo procedūros (plovimas).
Plovimas. Norint pašalinti priemaišas ar kitas silpnai susilaikiusias sorbente medžiagas,
paprastai kasetė plaunama organiškai stipresniu tirpalu nei mėginio matrica, bet silpnesniu nei tas, kurio reikia norint pašalinti tiriamąją medžiagą. Paprastai tirpalas būna mažesnės organinės koncentracijos nei eliuentas [34]. Atvirkštinių fazių ekstrakcijos metu, vanduo naudojamas kaip priemaišų ploviklis, jis gali pašalinti likusias hidrofilines medžiagas, įskaitant baltymus. Vandens – organinio tirpiklio mišiniai taip pat naudojami, siekiant eliminuoti pašalines medžiagas [15].
Eliuavimas. Geriausias tiriamosios medžiagos pašalinimas nuo sorbento vyksta tada, kai
eliuentas yra praleidžiamas dviem mažomis porcijomis nei viena labai didele. Taip pat svarbus tekėjimo greitis. Naudingiausia, kai eliuentas yra lėtai lašinamas [34]. Jeigu eliuuoti analitę naudojamas minimalus tūris tirpiklio, mėginio sukoncentravimas gali būti nebereikalingas [15].
Atliekant KFE taip pat susiduriame su sunkumais: dalelės mėginyje gali trukdyti ekstrakcijai, todėl patartina filtruoti ar centrifuguoti mėginius (po bet kokių pH pokyčių), prieš juos patalpinant į KFE kasetes. Priemaišos taip pat gali susilaikyti kasetėse, todėl svarbu naudoti didelio grynumo medžiagas. Ekstrakcijos rezultatai gali skirtis ne tik tarp mėginių tipų, tačiau ir pačiame mėginyje. Prastesni rezultatai tiriant plazmą ar serumą gali būti dėl medžiagų susijungimo su baltymais [15].
1.3. Metodikos validacija ir jos parametrai
Validacija – dokumentais pagrįsti įrodymai, kad procesas, vykdomas tam tikromis sąlygomis, gali būti atliekamas efektyviai ir atkartojamai [9]. Pagrindiniai parametrai patvirtinti Tarptautinės Harmonizavimo Konferencijos (THK) yra metodikos atrankumas (specifiškumas), analitės nustatymo tikslumas, rezultatų glaudumas, teisiškumas ir kalibracijos kreivė, metodikos atsparumas [9,19].
1.3.1. Metodikos atrankumas (specifiškumas, selektyvumas)
Terminai selektyvumas ir specifiškumas dažnai naudojami pakaitomis. Specifiškas – šiuo terminu dažniausiai apibūdinamas metodas, kuris reaguoja į vienintelę analitę, o terminas selektyvus – reiškia, kad metodas sukuria atsaką į keletą iš cheminių subjektų. Jeigu šis atsakas yra išskiriamas iš visų kitų atsakų, tai galime teigti, kad metodas yra selektyvus. Kadangi yra tik keletas metodų, kurie yra atrakūs tik vienai analitei, selektyvumo terminas dažniausiai yra labiau tinkamas. Metodo atrankumas Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje apibrėžiamas, kaip metodo gebėjimas tiksliai nustatyti analitės buvimą, net esant priemaišų, tokių kaip sintetiniai prekursoriai, pagalbinės medžiagos, enantiomerai, skilimo produktai, kurie taip pat gali būti mėginyje. Metodo atrankumas vertinamas atliekant kokybinę mėginio analizę. Patvirtinama gaunant teigiamus rezultatus (kad mėginyje rasti tiriamieji junginiai) atlikus analizę mėginio į kurį buvo įterpti tiriamieji junginiai. Ir gaunant neigiamus rezultatus (mėginyje nerasta tiriamųjų junginių) atlikus analizę mėginio, kuriame nėra analitės („tuščio“ mėginio) [9,19,36].
1.3.2. Analitės nustatymo tikslumas
Analitinio metodo tikslumas – tai kai teoriniai metodo rezultatai atitinka eksperimentinius metodo rezultatus. Tikra tikslumo reikšmė gali būti vertinama keliais būdais.
Kai tiriama vaistinė medžiaga, tikslumas tikrinamas, analitiniam metodui naudojant žinomo grynumo medžiagą. Tikslumas privalo būti patvirtintas ribose, kurios aprašomos skirsnyje „Tiesiškumas ir kalibracijos kreivės, ribos“ [9,36].
1.3.3. Rezultatų glaudumas
Metodo tikslumas yra pakartotinių injekcijų serijos apimtis. Individualūs tyrimo rezultatai turi sutapti. Vertinamas standartinis nuokrypis, kuris dar skirstomas į 3 subkategorijas: pakartojamumas, tarpinis preciziškumas ir atkuriamumas [9,36].
Pakartojamumas.
Kai naudojamasi vienu aparatu, esant toms pačioms veikimo sąlygoms, per sąlyginai trumpą laiko tarpą, vienoje laboratorijoje. Tūrėtų būti atlikti bent 5-6 matavimai, trijų skirtingų matricų, esant
dviem ar trim skirtingom koncentracijom. Apskaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis SSN proc. [9,36].
Tarpinis preciziškumas.
Terminas nustatytas THK, kaip ilgalaikė metodo variacija ir yra nustatomas lyginant rezultatus gautus vienoje laboratorijoje per keletą savaičių. Tarpinis preciziškumas atspindi neatitikimus tarp rezultatų, kai jie gaunami tiriant skirtingiems analitikams, esant skirtingiems instrumentams, su standartais ir reagentais iš skirtingų tiekėjų, skirtingų serijų kolonėlėmis ir pan. Tarpinio preciziškumo tikslas – patvirtinti, kad toje pačioje laboratorijoje metodas pateiks tokius pačius rezultatus [9,36].
Atkuriamumas.
Nustatytas THK, išreiškia tikslumą, kuris yra pritaikant metodą skirtingose laboratorijose. Tikslas – patvirtinti, kad metodas pateiks tokius pačius rezultatus skirtingose laboratorijose. Tipiniai veiksniai turintys įtakos metodo atkuriamumui: kambario temperetūros skirtumai, analitikai turintys skirtingą kruopštumą bei patirtį, aparatūros skirtumai, medžiagų skirtumai, sąlygų skirtumai, skirtingo amžiaus įranga ir medžiagos, kolonėlės skirtingo gamintojo ar skirtingų serijų, skirtingos kokybės tirpikliai, reagentai ir kitos medžiagos. Metodo pastovumas – atkuriamumo rezultatų parametras, kuriuo vertinama normaliai atsirandančių sąlygų variacija, tarp laboratorijų ar tarp analitikų [36].
1.3.4. Tiesiškumo ribos ir kalibracijos kreivės
Analitinio metodo tiesiškumas yra jo gebėjimas gauti rezultatus, kurie (tiesiogiai ar matematiškai išreikšti) yra proporcingi analičių koncentracijoms mėginiuose. Tiesiškumas vertinamas: 3 – 6 kartus injekuojant penkis ar daugiau standartinių tirpalų mėginius, kurių koncentracijos tarp 80-120 proc. nuo tikėtinos mėginio koncentracijos. Tiesinės regresijos lygtis išvesta iš gautų rezultatų neturėtų reikšmingai skirtis nuo nulio. Sudaromos kalibracinės kreivės. Pateikiama kreivės charakteristika (R, paklaida). R turi būti ≥ 0,999 [9,19,36].
Ribos – intervalas tarp viršutinės ir apatinės reikšmės, nustatant tikslumą, glaudumą,
linijiškumą. Ribos išreiškiamos tais pačiais matavimo vienetais, kuriais gaunami rezultatai (procentais, milijoninėmis dalimis). Metodo ribos validuojamos, kai patvirtinama, kad analitinis metodas demonstruoja tinkamą glaudumą, tikslumą, tiesiškumą, kai jį pritaikome mėginiams su analite prie kraštutinių ribų, taip pat ir visose ribose:
a. Aptikimo riba – yra žemiausia analitės koncentracija, kurią gali aptikti prietaisas, bet nebūtinai nustatyti jos kiekį. Chromatografijoje aptikimo limitas yra injekuotas kiekis, kuriam esant smailės aukštis mažiausiai du ar tris kartus didesnis nei bazinės linijos triukšmo lygis. Aptikimo riba dažniausiai nustatoma, injekuojant mažus kiekius medžiagos ir stebint, kurį injekavus patikimai nustatoma analitė.
b. Kiekybinio nustatymo riba – tai minimalus injekuotas medžiagos kiekis, kuris pateikia tikslius matavimus, chromatografijoje paprastai reikalingos 10 ar 20 kartų aukštesnės smailės už bazinės linijos triukšmą [9,19,36].
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
2.1. Tyrimų objektas ir reagentai
2.1.1. Tyrimo objektas
Tyrimų objektas – kraujo plazmos mišinys su antidepresantais: amitriptilino hidrochloridu („TCI Europe nv“ Zwijndrecht, Belgija), venlafaksino hidrochloridu („Sigma“, St. Louis, JAV) ir paroksetino hidrochloridu (vidinis standartas) („Sigma-Aldrich Chemie“, Šveicarija). Šios medžiagos jautrios šviesai, todėl viso tyrimo metu, laikoma tamsaus stiklo buteliuke, kambario temperatūroje (20-25˚C) [21,22].
2.1.2. Tirpikliai
Eksperimento metu naudoti tirpikliai: išgrynintas vanduo, metanolis, etanolis, propanolis, trichlormetanas, dichlormetanas, acetonitrilas (ACN), trifluoracto rūgštis (TFA) („Sigma-Aldrich Chemie“, Šveicarija).
2.1.3. Standartiniai tirpalai
Pasigaminame standartinius tiriamųjų medžiagų vandeninius tirpalus: amitriptilino hidrochlorido 0,1 mg/ml, venlafaksino hidrochlorido 0,1 mg/ml. Vidinio standarto (VS) – paroksetino hidrochlorido 0,2 mg/ml.
2.1.4. Skystos fazės ekstrakcijos tirpalai
Iš standartinių tirpalų pagaminami mišinio tirpalai:
0,5 ml amitriptilino hidrochlorido tirpalo (0,1mg/ml), 0,5 venlafaksino hidrochlorido (0,1 mg/ml), 1 ml VS tirpalo, 1 ml vandens;
0,5 ml amitriptilino hidrochlorido tirpalo (0,1mg/ml), 0,5 venlafaksino hidrochlorido (0,1 mg/ml), 1 ml VS tirpalo, 1 ml kraujo plazmos.
Ruošiant plazminius mišinius su tiriamosiomis medžiagomis, jie maišomi vibracine maišykle ir laikoma 5 min ultragarso vonelėje, kad medžiagos gerai išsimaišytų ir pasiskirstytų visame tirpalo tūryje.
Mišinyje: amitriptilino hidrochlorido 0,016 mg/ml, venlafaksino hidrochlorido 0,016 mg/ml, paroksetino hidrochlorido 0,067 mg/ml.
2.1.5. Kietos fazės ekstrakcijos tirpalai
Iš standartinių tirpalų gaminami mišinio tirpalai:
Vandeninis mišinys: 5 ml amitriptilino hidrochlorido, 5 ml venlafaksino hidrochlorido, 5 ml VS tirpalo, 5 ml vandens.
Plazminis mišinys: 5 ml amitriptilino hidrochlorido, 5 ml venlafaksino hidrochlorido, 5 ml VS tirpalo, 5 ml kraujo plazmos.Plazminį tirpalą maišome vibracine maišykle, 5 min laikome ultragarso vonelėje, pilame 20µl fosforo rūgšties (H3PO4). Palaikome 10-15 min ir centrifuguojame 5000 APM. Tirpalas pasidaro
skaidresnis, nusodinami baltymai, mėginys labiau išgryninamas [37,38].
Mišinyje: amitriptilino hidrochlorido 0,025 mg/ml, venlafaksino hidrochlorido 0,04 mg/ml, paroksetino hidrochlorido 0,05 mg/ml.
2.1.6. Kraujo plazmos paruošimas
Žmonių kraujo mėginiai gauti iš LSMU klinikų kraujo centro. Tyrimui atlikti gautas LSMU bioetikos centro leidimas (1 priedas). Kraujo mėginiai gaunami plastiko tūbelėse po 5 ml. Mėginiai centrifūguojami 15-20 min 3500 APM greičiu. Kraujo ląstelės nusėda ir lieka gelsva, skaidri kraujo plazma. Pipete atsikiriama plazma nuo kraujo ląstelių. Kraujo plazma visą eksperimento laikotarpį laikoma šaldytuve 2-8˚C temperatūroje, o mėginiai gaunami dieną prieš eksperimentą.
2.1.7. Naudotos priemonės
Skystos fazės ekstrakcijai naudojami 100 ml talpos dalomieji piltuvai. Įvairaus dydžio pipetės (1 ml, 5 ml, 10 ml). Kolbutės ( 5, 10, 20 ml). Kietos fazės ekstrakcijos (KFE) metu naudojamas KFE aparatas (Supelco visiprep DL), vakuuminis siurblys KNF laboport, Oasis HLB (Waters, Milfordas, JAV) kasetės.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metu analizei naudotas skysčių chromatografas „Waters 2690“, fotodiodų matricos „Waters 996“ detektorius (Waters, Milfordas, JAV). Kolonėlė ACE C18, ilgis – 250 mm, vidinis diametras – 4,6 mm, sorbento dalelių dydis – 5 µm.
Eksperimentams buvo naudojamas Millipore vandens gryninimo sistema (Millipore, Bedford, JAV) išgrynintas vanduo. Mėginių džiovinimui naudojamos azoto dujos.
Abiejų ekstrakcijų metu taip pat naudojama: centrifuga (Centurion Scientific C2 series), ultragarso vonelė (Wise Clean Ultrasonic cleaner set WUC – A06H), vibracinė maišyklė (MS2 Minishaker, IKA), šildyklė (Multi-Block Heater, Barnstead International), filtrai (B/Braun Inject, porų dydis 22µm).
2.2. Tyrimo metodika
2.2.1. Skysčių – skysčių ekstrakcijos metodas
Vykdant SSE su plazminiais mišiniais, kiekvienu atveju imamas mišinys, kuris rūgštinamas 10 proc. oksalo rūgšties tirpalu (pH 2,5), parūgštinus tirpalas maišomas ir laikomas 30 min kambario temperatūroje (20-23˚C). Tuomet pilama 5 ml organinio tirpiklio (trichlormetanas arba dichlormetanas) ir ekstrahuojama dalomajame piltuve 15 min. Dalomasis piltuvas švelniai vartomas (neplakama!). Po to paliekama nusistovėti 10 min, kol atsiskiria tirpiklių sluoksniai. Atskiriamas organinis sluoksnis, ekstrakcija kartojama 3 kartus. Toliau likęs tirpalas šarminamas 10 proc. amonio hidroksido tirpalu (pH 9) ir kartojama ekstrakcija analogiškai.
Surinkti mėginiai džiovinami šildant 40˚C temperatūroje, traukos spintoje, vidutinio stiprumo azoto dujų srove iki sauso likučio. Sausas likutis tirpinamas 1 ml acetonitrilo tirpalo.
2.2.2. Kietafazės ekstrakcijos metodas
Pradedant vykdyti KFE, pirmiausia sujungiama KFE aparatūra. Užtikrinamas sistemos sandarumas. KFE naudojamos Oasis HLB (Waters, Milfordas, JAV) kasetės. Kasetės sorbento aktyvinimas vyksta per ją leidžiant 1 ml metanolio tirpalo (99,9 proc.) ir 1 ml išgryninto vandens tirpalo. Nustatomas tekėjimo greitis, naudojamas vakuuminis siurblys – 1 lašas/4 s. Į aktyvintą kasetę pilamas mišinys ir vyksta jame esančių medžiagų sulaikymas sorbente. Praleidus tiriamąjį mišinį vyksta plovimas 5 proc. vandeniniu metanolio tirpalu, kurio metu eliminuojamos pašalinės medžiagos. Po plovimo fazės seka eliuavimas. Eksperimento metu eliuuojama skirtingų koncentracijų tirpikliais siekiant optimizuoti ekstrakcijos sąlygas. Eliuatas surenkamas į sausą švarų mėgintuvėlį. Surinktas mėginys džiovinamas šildant, 40˚C temperatūroje, traukos spintoje, vidutinio stiprumo azoto srove iki sauso likučio. Sausas likutis tirpinamas mobilioje fazėje –1 ml acetonitrile.
2.2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas
Amitriptilino hidrochlorido ir venlafaksino hidrochlorido nustatymui pasirinktas skysčių chromatografas „Waters 2690“ ir fotodiodų matricos „Waters 996“ detektorius (Waters, Milfordas, JAV). Kolonėlė ACE C18, ilgis – 250 mm, vidinis diametras – 4,6 mm, sorbento dalelių dydis – 5 µm.
Tiriamųjų medžiagų analizei naudota dviejų eliuentų sistema. Eliuentas A – ACN, eliuentas B – 0,1 proc. TFA tirpalas vandenyje. Nustatytas tekėjimo greitis – 1 ml/min. Injekcijos tūris – 10 µl. Chromatogramos fiksuojamos prie 230 nm bangos ilgio. Naudojamos medžiagos – gradientinio švarumo. Buvo taikomas mobilios fazės gradientinis kitimas (6 lentelė). Chromatografinis skirstymas valdytas, chromatogramos fiksuotos ir duomenys apdoroti, naudojant „Empower 2 chromatographic manager system“ (Waters, Milfordas, JAV) programą.
6 lentelė. ESC mobilių fazių gradiento procentinis kitimas
Laikas (min) 0,1 proc. Trifluoracto r. (proc.) Acetonitrilas (proc.) 20,0 21,0 28,0 29,0 12,0 10,0 10,0 95,0 88,0 90,0 90,0 5,0
2.2.4. Duomenų statistinė analizė
Duomenys analizuoti, naudojantis Microsoft Office Excel 2007 ir IBM SPSS Statistics 20.0 duomenų apdorojimo programomis.
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS
3.1. Kietafazės ekstrakcijos optimizavimas
Kietafazės ekstrakcijos optimizavimui remtasi „Waters“ kompanijos rekomendacijomis [6], nes naudojamos, jų pagamintos HLB Oasis kasetės. Jose esantis sorbentas yra universalus ir tinka rūgštinės, neutralios ar bazinės kilmės medžiagoms ekstrahuoti. Jis pagamintas iš tam tikro santykio hidrofilinio N-vinilpirolidono ir lipofilinio m-Divinilbenzeno mišinio [6,39].
Kietafazės ekstrakcijos metodo optimizacijos tikslas – nustatyti sąlygas, kuriomis tiriamosios medžiagos sulaikomos sorbente ir geriausiai eliuuojamos, naudojant skirtingų koncentracijų ir pH reikšmių organinius tirpiklius (eliuentai pateikti 8 paveiksle). KFE ekstrakcijos optimizavimui pasirinkome skirtingus organinius tirpiklius: gaminti skirtingų koncentracijų (99,9, 80, 60, 40, 20 proc.) metanolinių tirpalų mišiniai su 2 proc. metano rūgštimi, 2 proc. etano rūgštimi ir 5 proc. amonio hidroksido tirpalu. Taip pat gryno etanolio, propanolio, dichlormetano, trichlormetano, acetonitrilo tirpalus.
3.2. Efektyvioji skysčių chromatografija
Eksperimentiniu metodu tikrinta, ar amitriptilino hidrochlorido ir venlafaksino hidrochlorido standartinių tirpalų mišinio chromatografinei analizei būtų galima pritaikyti eliuentų gradientinio procentinio kitimo sąlygas (7 lentelė) [2].
7 lentelė. ESC mobilių fazių gradiento procentinis kitimas [2]
Laikas (min) Acetonitrilas (proc.) 0,1 proc. trifluoracto r. (proc.) 0 20 95 45 5 55
Atlikus chromatografinę analizę su standartinėmis medžiagomis, pagal šią metodiką tiriamosios medžiagos aptinkamos kartu su priemaišomis, tai apsunkina jų identifikavimą ir atskyrimą (9 pav.).
9 pav. Amitriptilino ir venlafaksino vandeninių standartinių tirpalų chromatograma, pritaikius gradiento procentinį kitimą, pateiktą 6 lentelėje
Išanalizavus keletą skirtingų gradientinių sistemų, keičiant eliuentų santykinį kiekį (proc.), analizės eigoje nustatytos geriausios chromatografinės sąlygos tiriamųjų junginių identifikavimui ir išskirstymui (8 lentelė).
8 lentelė. ESC mobilių fazių gradiento procentinis kitimas
Laikas (min) 0,1 proc. Trifluoracto r. (proc.) Acetonitrilas (proc.) 20,0 21,0 28,0 29,0 12,0 10,0 10,0 95,0 88,0 90,0 90,0 5,0
Jų tapatybė nustatoma lyginant standartinių medžiagų ir analizuojamų mėginių sulaikymo trukmes ir UV spektrus. Analičių standartinių medžiagų chromatograma pavaizduota 10 paveiksle.
10 pav. Amitriptilino ir venlafaksino standartinių vandeninių tirpalų ESC chromatograma modifikavus gradientines sąlygas (skaičiais pažymėtos šių analičių smailės 1 – venlafaksino hidrochloridas Rf = 12,128 min, 2 – VS paroksetino hidrochloridas Rf = 14,422 min, 3 – amitriptilino
4.
TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos validacija
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija atlikta su standartiniais medžiagų tirpalais, kiekybinis nustatymas buvo atliekamas, naudojant vidinį standartą - paroksetiną. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika validuota, įrodant metodikos specifiškumą, rezultatų glaudumą, rezultatų pakartojamumą, nustačius tiesiškumo ribas.
4.1.1. Metodikos specifiškumas
Specifiškumas vertinamas lyginant tiriamųjų mėginių standartinių tirpalų (11,12 pav.), tiriamųjų mėginių, grynos kraujo plazmos be analičių (13 pav.) ir „tuščio“ mėginio (injekuojamas tik organinis tirpiklis – acetonitrilas) (14 pav.) chromatogramas. Lyginami analičių UV spektrai ir sulaikymo trukmės.
11 pav. Amitriptilino, venlafaksino ir paroksetino (VS) standartinių vandeninių tirpalų mišinio
chromatograma (1 – venlafaksino hidrochloridas Rf = 12,128 min, 2 – VS paroksetino
12 pav. Amitriptilino, venlafaksino ir paroksetino (VS) standartinių vandeninių tirpalų suminė chromatograma
13 pav. „Tuščios“ kraujo plazmos chromatograma (skaičiais pažymėtos numanomos analičių smailių vietos: 1 – venlafaksino hidrochloridas Rf=12,128 min, 2 – VS paroksetino hidrochloridas
