LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS
MOLEKULINĖS BIOLOGIJOS KATEDRA
VILŪNĖ ATKOČIŪNAITĖ
PLAZMINOGENO AKTYVATORIAUS INHIBITORIAUS (I)
GENOTIPO ĮTAKA KREŠĖJIMO SISTEMOS AKTYVUMUI
LIGONIAMS, SERGANTIEMS IŠEMINE ŠIRDIES LIGA
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Vacis Tatarūnas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS
MOLEKULINĖS BIOLOGIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. Dr. Vitalis Briedis
PLAZMINOGENO AKTYVATORIAUS INHIBITORIAUS (I)
GENOTIPO ĮTAKA KREŠĖJIMO SISTEMOS AKTYVUMUI
LIGONIAMS, SERGANTIEMS IŠEMINE ŠIRDIES LIGA
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Vacis Tatarūnas
Darbą atliko
Magistrantė
Vilūnė Atkočiūnaitė
Recenzentas
KAUNAS, 2016
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 1. SANTRUMPOS ... 8 SĄVOKOS ... 9 2. ĮVADAS ... 103. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
Darbo uždaviniai: ... 11
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
4.1 Plazminogenas ... 12
4.2 Fibrinolizės aktyvinimas ... 13
4.3 Sąveika tarp PAI-1 ir t-PA su fibrinu ... 14
4.4 PAI-1 genų polimorfizmas ... 14
4.4 IŠEMINĖ ŠIRDIES LIGA ... 16
4.6 ASPIRINAS ... 17
4.6.1 Veikimo mechanizmas ... 17
4.6.2 Farmakologija ... 18
4.5 Darbe naudotų metodų apžvalga ... 18
4.5.1 DNR tyrimas, ekstrakcija: ... 18
4.5.2 DNR polimorfizmo nustatymas: DNR išskyrimas ... 18
4.5.3 DNR kokybės nustatymas ... 19
4.5.4 Tikro laiko PGR ... 19
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 21
5.1. Tyrimų objektas ... 21
5.2 Trombocitų agregacijos tyrimas su adenozindifosfatu ir epinefrinu ... 23
5.3 Genotipo tyrimas tikro laiko PGR metodu ... 23
5.3.2 Statistinė analizė ... 26
6. REZULTATAI IR JŲAPTARIMAS ... 27
6.1 PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui ... 27
6.2 Greta vartojamų vaistų ir genotipo įtaka trombocitų agregacijai ... 28
6.3 PAI-1 4G alelio itaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui ... 31
6.4 Tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo pasiskirstymas tarp vyrų ir moterų ... 32
REZULTATŲ APTARIMAS ... 34
7. IŠVADOS ... 36
SANTRAUKA
Vilūnės Atkočiūnaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr.Vacis Tatarūnas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Kardiologijos institutas, Molekulinės biologijos laboratorija– Kaunas.
Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitoriaus (I) genotipo įtaka krešėjimo sistemos aktyvumui ligoniams, sergantiems išemine širdies liga.
Tikslas: Šio darbo tikslas nustatyti kokią įtaką daro (I) tipo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui.
Uždaviniai: 1. Nustatyti PAI-1 4G/5G genotipo įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į trombocitų
agregacijos, paveikus ADF ir ADR rodiklius, bei TNS.
2. Nustatyti bendrą PAI-1 4G/5G genotipo ir greta vartojamo antiagreganto aspirino įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į trombocitų agregacijos, paveikus ADF ir ADR rodiklius, bei TNS.
3. Įvertinti tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo dažnį vyrams ir moterims.
Tyrimo metodika: Tyrimo metu tirti tie ligoniai, kuriems po atliktų širdies vožtuvų operacijų buvo skiriamas gydymas antiagregantais ir antikoaguliantais. Visiems ligoniams buvo nustatytas PAI1 4G/5G -675 (rs1799889) geno polimorfizmas tikro laiko PGR metodu. Trombocitų agregacija vertinta paveikus agregacijos induktoriais ADF ir ADR Vertintas tarptautinis normalizuotas santykis – TNS.
Rezultatai: Nustatėme naują biožymenį, kuris daro reikšmingą įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, gydant ligonius antikoaguliantais ir antiagregantais po širdies vožtuvų operacijos. PAI-1 darė statistiškai reikšmingą įtaką TNS rodikliui. Ligoniai, turintys 5G/5G turėjo aukštesnius TNS 2,7± 1,29, palyginus su ligoniais, turinčiais 4G/5G TNS 1,70± 0,69 (p=0,003) . Nustatėme tendenciją (p= 0, 07), kad ligoniai, turintys 4G/4G taip pat turėjo žemesnius TNS - 1, 90± 0, 61, nei 5G/5G turintys.
Išvados: Rezultatai parodė, kad aukštesnius TNS rodiklius turėjo 5G/5G ligoniai, nei 4G/5G ar 4G/4G turintys ligoniai. Greta vartojamas aspirinas šio tyrimo metu nedarė reikšmingos įtakos kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui. PAI-1 4G/5G genotipo dažnis vyrams ir moterims reikšmingai nesiskyrė.
Vilūnė’s Atkočiūnaitė’s master's Final Thesis / research leader dr.Vacis Tatarūnas; Lithuanian University of Health Sciences, Institute of Cardiology, Laboratory of Molecular Biology , Kaunas.
Plasminogen activator inhibitor (I) genotype influence to coagulation system activity to patients with coronary heart disease.
The aim: The aim of this research is to set how (I) type of plasminogen activator inhibitor do the influence to the blood coagulation system activity.
The objectives of the study 1) To identify PAI-1 4G / 5G genotype effect for the blood coagulation system activity, according to platelet aggregation, exposured by ADP, ADR indicators and INR.
2) To identify the total PAI-1 4G / 5G genotype and adjacent used antiaggregant aspirin effect on the blood coagulation system activity, according to platelets aggregation, exposured with ADP, ADR indicators and TNS.
3) To evaluate examined patients PAI-1 4G / 5G genotype frequency in men and women.
Research methodology: During the test we examined the patients who after valve surgery were being
treated with atiagreggants and anticoagulation drugs. The aim of our study was to evaluate the association of clinical and genetic factors with coronary artery occlusion in patients with myocardial infarction.All patients had the PAI-1 4G / 5G -675 (rs1799889) polymorphisms detection was achieved by using Sanger sequencing in a sample. Platelet aggregation was evaluated after exposure aggregation inducers of ADP and ADR. Evaluated the international normalized ratio - INR.
Results: We found new biomarkers that have a significant impact on the blood coagulation system activity in patients who were in treatment with anticoagulants and antiplatelets after heart valve surgery. PAI-1 had a statistically significant effect on INR. Patients with 5G / 5G, had a higher INR 2.7 ± 1.29 compared with patients having a 4G / 5G INR 1.70 ± 0.69 (p = 0.003). However we determined a tendency (p = 0, 07) that patients with the 4G / 4G also had lower INR 1, 90 ± 0, 61 comparing with 5G / 5G.
Conclusion:
The results showed that higher INR indicators had 5G / 5G patients than the 4G / 5G or 4G / 4G patients. In addition used aspirin in this study had no significant effect to the blood coagulation system activity. The frequency of PAI-1 4G / 5G genotype in men and women was not significantly different.
PADĖKA
Noriu padėkoti savo magistrinio darbo vadovui Gerb. dr. V.Tatarūnui, kuris visapusiškai rėmė, konsultavo įvairias klausimais ir labai daug padėjo rašant magistrinį darbą. Taip pat nuoširžiai dėkoju LSMU Kardiologijos instituto molekulinės biologijos laboratorijos darbuotojams už Tai, kad padėjo rinkti pirminius duomenis.
1. SANTRUMPOS
ADP Adenozino difosfatas ADR Epinefrinas
COX-1 Ciklooksigenazė – 1
CYP19 Citochromo P450šeimos fermentas, aromatazė DNR Deoksiribonukleorūgštis
iRNR Informacinė RNR IŠL Išeminė širdies liga
PAI-1 Pirmojo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius PGR Polimerazės grandininė reakcija
RNR Ribonukelinorūgštis
TNS Tarptautinis Normalizuotas Santykis tPA Audinių plazminogeno aktyvatorius uPA Urokinazės plazminogeno aktyviklis UV Ultravioletiniai spinduliai
SĄVOKOS
Aleliai- skirtingi geno variantai, susidarantys dėl mutacijų lytinėse ląstelėse.
Aterosklerozė- lėtinė arterijų sienelės liga; nepastebimai prasidedantis ir tyliai besivystantis arterijų
standėjimo bei siaurėjimo procesas
Elektrofarezė- tai krūvį turinčių molekulių judėjimas elektriniame lauke.
Fibrinolizė- Procesas, kurio metu, veikiant trombinui vyksta fibrino krešulio ardymas
Glikoproteinai- baltymųmolekulės, susijungusios su viena ar daugiau oligosacharidų molekulių
PGR– polimerazinė grandininė reakcija Molekulinėsbiologijosmetodas, leidžiantis padauginti DNRin vitro
Proteazės - fermentai, dalyvaujantys baltymų skaidyme Termocikleris- prietaisas, kuriuo atliekamas PGR
2. ĮVADAS
Šiuolaikinė medicina sparčiai tobulėja ir genetikos atžvilgiu vis daugiau naujų variacijų papildo jau atrastąjį racioną. Visoje Europoje IŠL yra svarbiausia mirties priežastis. Tačiau mirtingumo rodikliai tarp šalių ir pačių šalių viduje labai skiriasi. Kaupiantis išeminės širdies ligos epidemiloginių tyrimų duomenims pastebėta, kad ypač kai kurie veiskniai didina riziką susirgti šia liga. Daug tyrimų atlikta ir įrodyta, kad ligai atsirasti reikšmės turi gyvensena: netinkama mityba, rūkymas, fizinis pasyvumas. Minėti veiksniai skatina aterosklerozinius pokyčius. Ypač reikmšingas šiuo atvejus yra ir paveldėjimas, nes jo įtaką stiprina netikamas gyvenimo būdas [1.1].
Šio tyrimo metu bandžiau nutatyti kaip vienas baltymas gali veikti žmogaus kraujo sistemą. Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius-1 (PAI-1) yra gyvūninis baltymas, dalyvaujantis kraujo krešėjimo sistemoje. Jis reguliuoja krešulių tirpinimą-fibrinolizę. Sumažėjus PAI-1 koncentracijai kraujyje suaktyvėja fibrinolizė[2]
XX amžiuje buvo atrasta,kad rizika susirgti širdies ir kraujayslių ligomis įtakoja PAI-1 aktyvumas kraujo sistemoje.Atlikus daug tyrimų pastebėta,kad arterijose PAI-1 aktyvumas ženkliai didesnis nei venų trombuose. Ligoniams sergantiems cukriniu diabetu, nutukusiems žmonėms PAI-1 aktyvumas taip pat buvo didesnis nei tiems,kurie nesirgo. Nagrinėti genotipų variantai,kurie gali turėti įtakos šio fermento aktyvumui, daugiausia tyrimų atlikta su PAI-1 675 4G/5G. 5G/5G turinčiais asmenimis PAI-1 aktyvumas laikomas normaliu. Ligoniams su 4G/5G ir 4G/4G PAI-1 aktyvumas padidėjęs, jie dažniau serga miokardo infarktu,cukriniu diabetu.
Dažniausiai po atliktų širdies vožtuvų operacijų yra skiriamas gydymas antiagregantais (dažniausiai klopidogreliu ir aspirinu) ir antikoaguliantais (varfarinu) , tačiau neretai šie vaistai veikia ne taip, kaip to iš jų tikimąsi - yra įrodyta, kad antiagregantų veikimas priklauso nuo žmogaus genuose užkoduotos informacijos bei aplinkos įtakos [1.3]. Genai koduoja tam tikrų kepenų fermentų išsiskyrimą, kurie lemia viokį ar kitokį vaisto metabolizmą , poveikį [1.4]. Taigi, pagrindinė darbo problema yra ta, kad vaistų norimas poveikis ne visada būna toks kokio norėtumėme ir tai priklauso nuo žmogaus genų. Todėl labai svarbu ištirti kurie genai įtakoja vaistų poveikį tam, kad būtų galima parinkti kuo veiksmingesnį gydymą. Darbo tikslas:
aktyvumui.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Šio darbo tikslas nustatyti kokią įtaką daro (I) tipo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius kraujo krešėjimosistemos aktyvumui.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti PAI-1 4G/5G genotipo įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į trombocitų agregacijos, paveikus ADF ir ADR rodiklius, bei TNS.
2. Nustatyti bendrą PAI-1 4G/5G genotipo ir greta vartojamo antiagreganto aspirino įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į trombocitų agregacijos, paveikus ADF ir ADR rodiklius, bei TNS.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1 Plazminogenas
Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius-1 (PAI-1) (1 pav. ) yra gyvūninis baltymas, dalyvaujantis kraujo krešėjimo sistemoje. Jis reguliuoja krešulių tirpinimą-fibrinolizę. [1] Sumažėjus PAI (I) koncentracijai kraujyje suaktyvėja fibrinolizė. Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius (PAI-1) yra vienos grandinės glikoproteinas (45 kDa) priklausantis serino proteazės inhibitoriaus narių super šeimai. Plazminogenas ir jo aktyvatoriai priklauso antikoaguliacijos sistemai. Plazminogeno aktyvatoriai (inkstų audinio ir šlapimo urokinazė,audinių plazminogeno aktyvatorius) sintezuojasi ir kaupiasi ląstelėse ir esant reikalui išskiriami į kraują.[1.]
1 Pav. Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius PAI-1
PAI-1 yra linijinis glikoproteinas, kuris yra sudarytas iš 379 amino rūgščių ,kurio molekulinė masė 48.000. Jis greitai jungiasi su t-PA ir šlapimo tipo plazminogeno aktyvatoriais,todėl yra labai svarbus fibrinolizės lygio cirkuliacijoje reguliatorius.[2] ( 2 pav.) PAI-1 koncentracijos padidėjimas ypač rytinėmis valandomis kraujo plazmoje yra siejamas su padidėjusia trombozių rizika minėtu paros laikotarpiu.Veiklioji forma PAI-1 yra nestabili, skilimo pusperiodis tik 30 minučių. Aktyvi PAI-1 forma yra greitai veikiantis plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius, kuris yra sintetinamas kraujagyslių endotelyje, tačiau randamas ir ant trombocitų paviršiaus.[3]Kai trombocitai yra stimuliuojami trombino, PAI-1 išleidžiamas ant trombocitų paviršiaus, saugant kraujo krešulį nuo priešlaikinio irimo. Šis mechanizmas sukelia greitą PAI-1 koncentracijos
13
padidėjimą kraujyje. Trombinas taip pat stimuliuoja PAI-1 sintezę endotelio ląstelėse.[4]
2 pav. PAI -1 įtaka fibrinolizei . tPA ir UPA aktyvuoja plazminogeno pavertimą į plazminą, kuris reaguoja su fibrinu ir sukelia jo degradaciją. PAI-1 veikia kaip pagrindinis reguliatorius fibrinolizėje, slopindamas tPA ir UPA per kovalentinę jungtį. Žalios rodyklės žymi aktyvaciją , raudonos rodyklės žymi slopinimą. [5]
PAI-1 taip pat yra susijęs su kraujagyslių uždegimu ateroskleroze, ir metaboliniu sindromu, ,kuris šiuo atveju yra padidėjęs. Suaktyvėjusi PAI-1 veikla buvo rasta tiriant aterosklerozę, ypač žmonėms, kenčiantiems nuo nutukimo ir cukrinio diabeto II tipo. Tiriant ir lyginant ligonius,kurie sirgo cukriniu diabetu ir turėjo išeminę širdies ligą su ligoniais, kurie cukriniu diabetu nesirgo , PAI-1 baltymo ląstelių rasta daugiau ligonių kraujyje, kurie sirgo cukriniu diabetu [6]. Nustatyta, kad padidėjusi PAI-1 koncentracija yra tiesiogiai susijusi su didesniu visceraliniu nutukimu. [7]
Taip pat didelė PAI-1 koncentracija yra susijusi su įvairiais krešėjimo sutrikimais [8,9] ir yra labai svarbus faktorius priešinfarktinės būsenos stebėjimo metu pacientams, kuriems nustatytas miokardo infarktas iki 45 m. amžiaus[10].
4.2 Fibrinolizės aktyvinimas
Plazminas, fermentas, atsakingas už fibrino degradaciją, susidaro tada, kai plasminogenas iš dalies yra suskaldomas t-PA ar šlapimo tipo plazminogeno aktyvatorių. Tiek plasminogenas ,tiek t-PA suriša krešulį į vieną, net kai t-PA yra apsaugotas nuo slopinimo, kurį vykdo PAI-1. Šis procesas palengvina plazminogeno aktyvaciją ir fibrino degradaciją. [11]
Plazminogenas
Plazminas
Fibrinas Fibrino degradacijos produktai
Kai fibrinolizės reakcijos vyksta ant trombosienelių paviršiaus, fibrinolizė yra apribota ir vyksta ne taip sistemingai (3 pav.). Plazminogenas , t-PA ir fibrinas sudaro trijų komponentų kompleksą , kuris skatina formavimąsi plazmino ir vėliau suirusio fibrino. Plazminas ir t-PA yra apsaugoti nuo inaktyvacijos dėl atitinkamų inhibitorių a2 –antiplazmino ir PAI-1. Tačiau PAI-1 taip pat jungiasi su fibrinu. Jungdamasis jis išlaiko savo aktyvumą, slopina nuo t-PA ir u-PA.PAI-1 fibrinolizėje. Monokloninių antikūnų jungimasis prieš PAI-1 formuojant trombus skatina fibrinolizę ir sumažina trombų augimą.[12.]Kraujo apytakoje, didelė dalis t-PA yra apribojama PAI-1, nors tik maža dalis yra laisva arba susijungusi su fibrinu.[13]
3 pav. Audinių plazminogeno aktyvatorius (t-PA) cirkuliuoja kraujo plazmoje kaip kompleksas su plazminogeno-aktyvatoriaus inhibitoriumi 1 (PAI-1) A santykiu 1: 1. Fibrino krešulys suteikia paviršių , ant kurio gali vykti reakcijos. Plasminogenas aktyvuojamas t-PA ar šlapimo tipo plazminogeno aktyvatoriaus (u-PA). Plazminogenas, t-PA, ir fibrinas sudaro trijų komponentų kompleksą, kuris skatina plazmino susidarymą. PAI-1 taip pat jungiasi su fibrinu ir susijungęs išlaiko savo inhibitoriaus aktyvumą prieš t-PA. a2-antiplazminas susijungęs su fibrinu kryžminiškai pagal XIII faktorių.
4.4 PAI-1 genų polimorfizmas
Žmogaus PAI-1 genas randamas 7 chromosomoje ir yra sudarytas iš devynių egzonų ir aštuonių intronų. Duomenys apie PAI-1 genotipo įtaką krešėjimui ir kraujavimui yra įvairiapusiai. 4G alelis yra
Faktorius XIII fibrinas Plazminogeno aktyvatorius Netirpus fibrinas Plazminogenas Plazminas
trombinas Faktorius XIII Fibrino degradacijos produktai Fibrino gijos Fibrino gijos Tirp us fibri nas α² Antiplazminas t-Pa ir PAI-1 kompleksas
15
vadinamas protrombiniu aleliu, jo buvimas siejamas su tromboembolinėmis komplikacijomis. [14] Medicininėje literatūroje aptinkama duomenų, kad heterozigotinis genotipas, priešingai nei homozigotinis 4G/4G, yra susijęs su didesne fibrinolize, nes mažiau slopina audinių plazminogeno aktyvatorių. [15]. Žinoma, kad 5G alelį turintys pacientai turi labiau išreikštą fibrinolizę bei mažesnes PAI-1 koncentracijas kraujo plazmoje [16]. 4G/5G genotipas yra tromboembolinių komplikacijų rizikos faktorius, kaip ir 4G/4G genotipas yra reikšmingai susiję su padidėjusia giliųjų venų trombozių rizika, o pats 4G alelis yra siejamas su hiperkoaguliacijos išsivystymu [17].
Išskiriami trys PAI-1 genetiniai polimorfizmo tipai. Polimorfizmas apibūdinamas pagal tai, kiek guanozino sekų turi alelių pora. Galimi variantai – aleliai, turintys po penkias arba po keturias guanozino sekas (GGGG arba GGGGG) taip pat galimi turintys mišrius alelius. Pacientai, turintys alelius su dvejomis 4 guanozino sekomis (4G/4G), yra vadinami homozigotiniais, kaip ir po penkias guanozino sekas (5G/5G) turintys pacientai. Mišrius alelius turintys pacientai vadinami heterozigotiniais pagal PAI-1 genotipą. [18] 4G/5G polimorfizmas -675 pozicijoje veikia transkripciją bei PAI-1 koncentraciją kraujo plazmoje. Padidėjusi geno transkripcija yra susijusi su keturiomis guanino bazėmis (4G alelis) bei sąlygoja tik transkripcinio aktyviklio prisijungimą prie aktyvatoriaus. (4 pav.) Dėl to PAI-1 koncentracija kraujo plazmoje didėja. Penkios guanino bazės (5G alelis) susijusios ne tik su transkripcijos aktyviklio prisijungimu, tačiau ir su baltymo slopintojo prisijungimu prie aktyvatoriaus, dėl to transkripcijos aktyviklio prisijungimas sumažėja. Tokiu keliu mažėja PAI-1 inhibitoriaus koncentracija kraujo plazmoje. [19]Nustatyta, kad tokių pacientų kraujo plazmoje yra gerokai padidėjęs PAI-1 aktyvumas (kai kurių autorių duomenimis – net iki 25 proc.[20] ), o fibrinolizė yra stipriai slopinama, lyginant su 5G homozigotiniais ar su 4G/5G heterozigotiniais pacientais. 5G homozigotinių bei heterozigotinių PAI-1 fenotipų fibrinolizė yra slopinama mažiau, todėl fibrinolitinis aktyvumas pas šiuos pacientus būna didesnis [21]
4 pav. PAI-1 geno struktūra ir 4G/5G genotipo vieta aktyvatoriaus regione [11]
4.4 IŠEMINĖ ŠIRDIES LIGA
Išeminė šidies liga- Išeminė šidires liga (IŠL) yra ūminis ar lėtinis sutrikimas, kuris atsiranda sumažėjus miokardo aprūpinimui arteriniu krauju ir pasireiškia ūminiais ar lėtiniais išeminias sindromais. Klinikiniai požymiai išryškėja, jei ateroskelrozinė plokštelė trikdo vainikinių arterijų hemodinamiką . Išeminės širdies ligos pradžia besimptomė. Atsiranda kraujagyslių sienelės pažeidimų, kuriems įtakos turi infekcijos sukeltas uždegimas. Ant pažeistos vidinės sienelės prilimpa kraujo plokštelės ir leukocitai. Vėliau išsiplečia lygiųjų raumenų ląstelės, kaupiasi lipidai, ištinka arterijų sienelės hipoksija (deguonies stygius), o
vėliau ir nekrozė.
Tuo tarpu ant kraujagyslės sienelės, iš vidinės jos pusės, formuojasi ateroma, o jai įplyšus –trombas. Jam atitrūkus ir krauju nukeliavus toliau nuo pažeidimo vietos, atsiranda organo ar kūno dalies išemija. Trombui pasiekus širdį maitinančias kraujagysles, žmogų ištinka ūmus miokardo infarktas [22].
Vainikinės Arterijos
Plokštelės susiaurina kraujo pratekėjimą į vainikines arterijas
17
5 pav. Žmogaus širdis . Vainikinėse kraujagyslėse plokštelės susiaurino kraujo pratekėjimo spindį.
Išeminės širdies ligos klasifikacija :
Remianti 10 Tarptautine statistine ligų klasifikacija / PSAO,1992 / , IŠL skirstoma: 120. Krūtinės angina
121.Ūminis miokardo infarktas 122. Kartotinis miokardo infarktas
123.Ūminio miokardo infarkto komplikacijos 124. Kitos ūminės IŠL formos
125. Lėtinė išeminė širdies liga [22]
4.6 ASPIRINAS
Aspirinas yra vienas geriausiai rinkoje ištyrinėtų preparatų. Šis vaistas jau keletą dešimtmečių plačiai naudojamas kardiologų ir neurologų klinikinėje praktikoje visame pasaulyje. Aspirinas daugiau nei 50 šalių yra pripažintas kaip geriausia prevencinė priemonė siekiant apsisaugoti nuo pirmojo širdies smūgio ar insulto.
4.6.1 Veikimo mechanizmas
Acetilsalicilo rūgštis negrįžtamai slopina ciklooksigenazę – 1 (COX–1), kuri arachidono rūgštį verčia į prostaglandiną H2. Šis prostaglandinas skatina tromboksano A2 susidarymą, kuris
susidarymą ir stabdo trombocitų agregaciją [30-31] 4.6.2 Farmakologija
Suaugusiems aspirinas rekomenduojamas 3-4 kartus per dieną 1-2 tabletes (500-1000 mg), didžiausia paros dozė – 6 tabletės (3 g). Išgėrus vaisto per os, jis greitai absorbuojamas iš skrandžio ir dvylikapirštės žarnos. Vaisto bioprieinamumas maždaug 50%. Aukščiausia koncentracija plazmoje pasiekiama apytiksliai po 1 val. Pusinis eliminacijos laikas apie 20 min. Iš organizmo pašalinamas per kepenis. [32]
4.5 Darbe naudotų metodų apžvalga
4.5.1 DNR tyrimas, ekstrakcija:
DNR (Deoksiribonukleorūgštis)- nukleorūgštis, kuri koduoja genetinę informaciją.
Deoksiribonukleorūgštis susideda iš nukleotidų – deoksinukleotidas ir deoksiribunukleotidas tuo tarpu
deoksinukleotidai iš 4 skirtingų azoto bazių: Adeninas (A) , timinas (T), guaninas (G) ir citozinas (C) . Azoto bazės jungdamosis komplementariai sudaro tiltelius, tiltelių sąjuga sudaro erdvinę dvigubą spiralę. Deoksiribonukleotidą sudaro heterociklinės azoto bazės ir angliavandenis deoksiribozė.[23]
Polimorfizmas – tai sąvoka, kuri apibūdina įvairių organizmų tam tikrų formų variacijas ir padeda atskirti vienas organizmų rūšis nuo kitų. Genetikai naudoja sąvoką genetinis polimorfizmas, kuris apibūdina savitą DNR seką. Ši seka kiekvieno žmogaus genomą padaro unikaliu [24]
4.5.2 DNR polimorfizmo nustatymas: DNR išskyrimas
DNR ekstrakcija – Tai procesas, kurio metu DNR yra išskiriama iš kraujo ar kitų audinių. Tik išskyrus DNR galima nustatyti jos polimorfizmą. DNR ekstrakcija atliekama šiais etapais: 1. Ląstelių suardymas naudojant fizikinius ir cheminius metodus – maišymą, malimą, ultragarsą. 2. Lipidų pašalinimas iš membranų pridedant detergentų ar surfaktantų, kurie atlieka ląstelių lizę. 3. Baltymų pašalinimas pridedant proteazių.
19
4.5.3 DNR kokybės nustatymas
Norint nustatyti ar po DNR ekstrakcijos tiriamąjame mėginyje nėra priemaišų, yra atliekamas kokybinis nustatymas. Šis nustatymas atliekamas gel-elektroforezės tyrimu.
Elektrofarezė – tai krūvį turinčių molekulių judėjimas elektriniame lauke. DNR ir RNR molekulė yra įkrauta teigiamai, todėl elektriniame lauke juda link neigiamo elektrodo. [26]. Nustatant DNR kokybę šiuo metodu visų pirma pagaminamas agarozės gelis, kuris dedamas į vonelę, pripildytą buferio (6 paveikslas). Į agarozės gelio šulinėlius įterpiami pavyzdžiai, kurie prieš tai sumaišomi su tam tikru dažu (etidžio bromidu). Tuomet vonelė uždengiama ir įjungiamas maitinimo blokas. Kuomet dažai pasiekia tam tikrą ribą arba gelio pabaigą, tuomet elektros energijos šaltinis išjungiamas. Po elektroforezės agarozės gelis atsargiai išimamas iš vonelės ir dedamas į UV šviestuvą, kuriame gelis vizualizuojamas ir nufotografuojamas [27].
6 pav. Gel elektoroforezės vonelė
4.5.4 Tikro laiko PGR
PGR - tai šiuolaikiškas ir modernus molekulinės biologijos metodas, įgalinantis tiksliai, greitai ir patikimai gauti norimą rezultatą.Be dažniausiai naudojamo PGR galima išskirtitikro laiko
paveikslas).
7 pav. Tikro laiko PGR reakcijos pagrindinė linija ir slenkstis [27] (Applied biosystems, life technologies. Real-time PCR handbook)
Tikro laiko PGR gausinimo stebėjimui pasitelkiame fluoresncenciją. Metodas plačiai taikomas: kiekybiniams genų nustatymams, kokybės kontrolei ir tyrimų validacijai, patogenų aptikimui, genotipavimui, kopijų kiekio variacijoms, virusų kiekiui. Įprastas PGR metodas turi daugiau trūkumų :mažiau tikslus, nejautresnis , žema rezoliucija, rezultatai neišreiškiami skaičiais. Tikro laiko PGR turi didesnį dinaminį aptikimo diapazoną, aptikimo riba keičiasi iki dviejų kartų, augimo fazė yra eksponentiška [29].
Slenkstis
Pagrindinė linija
21
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI
5.1.
Tyrimų objektas
Tyrimo kriterijus atitinkantys ligoniai būdavo atrenkami stacionare, gydytojo pokalbio su ligoniu metu. Į tyrimą įtraukti ligoniai, kurie sutiko dalyvauti tyrime bei pasirašė sutikimo formas. Buvo įtraukti tie ligoniai, kuriems po atliktų širdies vožtuvų operacijų buvo skiriamas gydymas antiagregantais (dažniausiai klopidogreliu ir aspirinu) ir antikoaguliantais (varfarinu) ne mažiau kaip 3 mėnesių laikotarpiui. Ligoniui grįžus iš reabilitacijos įstaigos, praėjus ne mažiau kaip 3 mėnesiams, ligonis buvo kviečiamas atvykti tyrimams. Į tyrimą itraukti 49 asmenys, iš jų 30 vyrų (61.23%) ir 19 moterų (38,77%), (1 lentelė).
1 Lentelė.
Rodiklis Vyrai Moterys Bendras vidurkis
Amžius 65,37 ± 9,82 66,53 ± 13,35 65,82 ± 11,2 Svoris 86,23 ± 13,62 74,68 ± 10,69 81,76 ± 13,69
TNS 1,98 ± 0,98 2,04 ± 0,92 2,01 ± 0,95
ADP 71,40 ± 18,32 79,21 ± 12,09 74,43 ± 16,50
ADR 74,07 ± 24,30 83,11 ± 21,07 77,57 ± 23,31
TNS -Tarptautinis Normalizuotas Santykis
ADP – trombocitų agregacija paveikus adenozindifosfatu ADR – trombocitų agregacija paveikus epinefrinu
geno polimorfizmas tikro laiko PGR metodu. Trombocitų agregacija (TA) vertinta paveikus agregacijos induktoriais ADF (adenozindifosfatu) ir ADR (epinefrinu).
Ligonių kraujas tyrimams būdavo imamas LSMU MA Kardiologijos poliklinikoje. Į du 4,5 ml tūrio kraujui imti skirtus mėgintuvėlius su natrio citratu buvo imamas kraujas trombocitų agregacijos tyrimams atlikti. Į 1 mėgintuvėlį su koaguliantu imamas kraujas biocheminiams tyrimams. Į vieną 3 ml tūrio
mėgintuvėlį su kalio etildiaminotetraacetatu imamas kraujas hematologiniams tyrimams. Ligoniai buvo sveriami, matuojamas jų ūgis.
Gydytojas kardiologas apžiūrėdamas ligonį surinkdavo šiuos duomenis:
1. Įvertindavo gretutines ligas 2. Vartojamus vaistus ir jų dozę.
23
5.2 Trombocitų agregacijos tyrimas su adenozindifosfatu ir epinefrinu
Tyrimas trombocitų funkcijai nustatyti buvo atliekamas LSMU MA Kardiologijos instituto
Molekulinės kardiologijos laboratorijoje, remiantis validuotu, standartiniu Born`o metodu, paveikus ADF (adenozindifosfatu) ir ADR (epinefrinu). Trombocitų agregacijai sužadinti naudotas ChronoLog (JAV) ADF (3,8 mmol/l) ir epinefrinas (3,8 mmol/l).
Tyrimas atliktas naudojant agregometrą „Chrono-Log 490-2D“ (JAV), matuojant trombocitinės plazmos optinio tankio pokytį agregacijos eigoje, lyginant su betrombocitine plazma, kurios šviesos pralaidumas laikytas lygus 100 proc. Pokytis išreikštas kaip agregacijos procentas (proc.agr).
Trombocitinė plazma ruošta centrifūguojant 100G 15 min. Betrombocitinė plazma, iš kurios pašalinti trombocitai, ruošta pakartotinai centrifūguojant trombocitinę plazmą 1000G 30 min.
5.3 Genotipo tyrimas tikro laiko PGR metodu
Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje naudojant tikro laiko PGR termociklerį ABI 7900HT Fast Real-Time PCR (ABI, JAV) bei komercinius Taqman molekulinius žymenis (LifeTechnologies, JAV), skirtus PAI-1 rs1799889 polimorfizmui tirti.
Tikro laiko polimerazės grandininė reakcija atlikta standartinėmis gamintojo rekomenduojamomis sąlygomis (laikantis temperatūros režimo bei sudėtinių reakcijos komponentų koncentracijų, pagal gamintojo pateiktą protokolą). Naudotas universalus Taqman 2x (LifeTechnologies, JAV arba Thermo Fisher Scientific, Lietuva) mišinys. Tirtosios DNR buvo imama 10ng, kaip ir rekomenduojama gamintojo.
Kiekvieną kartą atliekant reakcijas, siekiant išvengti klaidų, buvo dedami sekoskaitos būdu nustatytų genotipų standartai. Standartinės reakcijos sąlygos genotipavimo reakcijai paruošti :
1. TAQMAN žymenų - 1,25µl (20x) (Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė)
2. Taqman 2x universalaus reakcijos mišinio – 12,5µl (Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė arba Thermo Fisher Scientific, Lietuva)
4. 1 µl ligonio genominės DNR (10 ng/tyrimui).
8 pav. Rezultatų vaizdinimas tikro laiko PGR metodu
5.3 Sekoskaitos metodo taikymas tikro laiko PGR metodo patvirtinimui
Sekoskaita atlikta Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje naudojant 8 kapiliarų ABI 3500 Genetic Analyzer sekvenatorių (ABI, JAV). Sekoskaitai atlikti naudoti 3500 serijai skirti reagentai ir priemonės. Sekoskaitos būdu buvo identifikuojami 3 skirtingą genotipą turintys ligoniai, kurių DNR naudota tikro laiko PGR reakcijų atlikimo patikrinimui.
25
2 Paveikslas. 4G/4G homozigotas
3 Paveikslas. 4G/5G heterozigotas
4 Paveikslas. 5G/5G homozigotas
5.3.1Pradmenų kūrimas
Sekos pradmenų kūrimui buvo paimtos iš JAV Nacionalinio biotechnologinės informacijos centro (National Center for Biotechnology Information, JAV) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Pradmenys reikiamam geno fragmentui pagausinti, buvo kuriami atsižvelgiant į pradmenų kūrimo taisykles [1].
Sekoskaitos reakcijų paruošimas ir sekoskaita:
1. DNR pagausinamas įprastinio PGR metodu. Dedami sekai specifiniai pradmenys
2. Reakcijos mišinys valomas silikagelio kolonėlėmis, skirtomis pašalinti reakcijos liekanas. Gel-elektroforezės metodu frakcionuojamas PGR produktas ir vertinama jo kokybė.
3. Ruošiamas reakcijos mišinys su BigDye (LifeTechnologies, JAV) terminatoriumi, kuris į seką įterpia dideoksinukleotidus
4. Reakcijos mišinys valomas specialiomis kolonėlėmis, skirtomis pašalinti reakcijos komponentų liekanas
5. Reakcijos mišinys dedamas į specialiai tam skirtas reakcijos plokšteles ir nuskaitomos fragmentų sekos. Vertinamas ir interpretuojamas rezultatas.
5.3.2 Statistinė analizė
Tyrimo rezultatai pateikti kaip vidurkis±standartinis nuokrypis (SN). Ligonių genotipo dažnis pateiktas procentais. Pearson`o χ2 ir Fisher`io tikslusis testas taikyti kategorinių kintamųjų analizei. Skirtumas laikytas statistiškai reikšmingas, kai p≤0,05.
6. REZULTATAI IR JŲAPTARIMAS
Moterų ir vyrų amžius nesiskyrė, tačiau vyrai svėrė daugiau, nei moterys (1 lentelė). Trombocitų agregacijos rodikliai paveikus ADP ir ADR buvo aukštesni moterims, nei vyrams.
6.1 PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui
Lyginome kraujo krešėjimo sistemos aktyvumą, atsižvelgiant į PAI-1 genotipą ir šiuos rodiklius: ADP, ADR ir TNS. Šis genotipas nedarė jokios įtakos trombocitų agregacijos rodikliams, paveikus ADP ir ADR. Duomenys pateikiami lentelėse 2, 3. PAI-1 darė statistiškai reikšmingą įtaką TNS rodikliui (4 lentelė ). Ligoniai turintys 5G/5G, kurių buvo 26, 5 proc. turėjo aukštesnius TNS 2, 7± 1, 29, palyginus su ligoniais, turinčiais 4G/5G TNS 1, 70± 0, 69(p=0,003). Nustatėme tendenciją (p= 0, 07), kad ligoniai, turintys 4G/4G taip pat turėjo žemesnius TNS 1, 90± 0, 61, nei 5G/5G turintys. 4G/4G ligonių buvo 22, 5 proc., o 4G/5G - 51proc.
2 lentelė. PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo aktyvumui pagal ADP
PAI-1 genotipas N (proc.) ADP vidurkis Standartinis nuokrypis
4G/4G 11 (22,45) 74.73 21.25
4G/5G 25 (51,02) 75.00 15.01
5G/5G 13 (26,53) 73.08 16.13
PAI-1 genotipas N (proc.) ADR vidurkis Standartinis nuokrypis
4G/4G 11 (22,45) 82.91 17.97
4G/5G 25 (51,02) 78.92 22.67
5G/5G 13 (26,53) 70.46 28.12
Iš viso 49 (100) 77.57 23.31
4 lentelė. PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo aktyvumui pagal TNS
PAI-1 genotipas N (proc.) TNS vidurkis Standartinis nuokrypis
4G/4G 11 (22,45) 1.90 0.61
4G/5G 25 (51,02) 1.70 0.69
5G/5G 13 (26,53) 2.70 1.29
Iš viso 49 (100) 2.01 0.95
Statistiškaireikšmingas skirtumas nustatytas tarp šių genotipų: 4G/5G vs 5G/5G: p=0,003; 4G/4G vs 5G/5G: p=0,071
6.2 Greta vartojamų vaistų ir genotipo įtaka trombocitų agregacijai
Lyginome ADP, ADR ir TNS reikšmes vartojantiems ir nevartojantiems aspiriną asmenims.
Lentelėse 5,6,7 matome ,kad aspirinas nedarė jokios įtakos kraujo krešėjimo aktyvumui atsižvelgiant į ADP,ADR, TNS.
5 lentelė. PAI-1 genotipo ir kartu vartojamo aspirino įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į ADP
PAI-1 genotipas Aspirinas N (proc.) ADP vidurkis Standartinis nuokrypis 4G/4G Nevartojo 11 (100) 74.73 21.25 Iš viso 11(100) 74.73 21.25 4G/5G Nevartojo 23 (92) 75.57 15.08 Vartojo 2 (8) 68.50 17.68 Iš viso 25(100) 75.00 15.01 5G/5G Nevartojo 10 (76,9) 76.50 14.61 Vartojo 3 (23,1) 61.67 18.61 Iš viso 13(100) 73.08 16.13
Iš viso Nevartojo 44 (90) 75.57 16.32
Vartojo 5 (10) 64.40 16.29
Iš viso 49(100) 74.43 16.51
6 lentelė. PAI-1 genotipo ir kartu vartojamo aspirino įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į ADR
PAI-1 genotipas Aspirinas N (proc.) ADR vidurkis Standartinis nuokrypis 4G/4G Nevartojo 11 (100) 82.91 17.97
4G/5G Nevartojo 23 (92) 82.09 20.04 Vartojo 2 (8) 42.50 24.75 Iš viso 25(100) 78.92 22.67 5G/5G Nevartojo 10 (76,9) 77.20 22.32 Vartojo 3 (23,1) 48.00 38.97 Iš viso 13(100) 70.46 28.12 Iš viso Nevartojo 44 (90) 81.18 19.75 Vartojo 5 (10) 45.80 30.36 Iš viso 49(100) 77.57 23.31
7 lentelė. PAI-1 genotipo ir kartu vartojamo aspirino įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į TNS
PAI-1 genotipas Aspirinas N (proc.) TNS vidurkis Standartinis nuokrypis 4G/4G Nevartojo 11 (100) 1.89 0.61 Iš viso 11(100) 1.89 0.61 4G/5G Nevartojo 23 (92) 1.76 0.68 Vartojo 2 (8) 1.01 0.01 Iš viso 25(100) 1.70 0.69 5G/5G Nevartojo 10 (76,9) 2.71 1.46
Vartojo 3 (23,1) 2.64 0.57
Iš viso 13(100) 2.69 1.29
Iš viso Nevartojo 44 (90) 2.01 0.96
Vartojo 5 (10) 1.97 0.99
Iš viso 49(100) 2.01 0.95
6.3 PAI-1 4G alelio itaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui
Lyginome ADP, ADR ir INR reikšmes atsižvelgiant į PAI-1 alelius. Alelis neturėjo jokios įtakos ADP (8 lentelė) ir ADR (9 lentelė). 5G alelį turintiems asmenims TNS buvo aukštesnis , nei 4G alelį turintiems asmenims (10 lentelė).5G alelį turintiems TNS buvo aukštesnis 2,70±1,29, palyginus su 4G alelį turinčiais ligoniais – 1,76±0,66, p=0,0017.
8 lentelė. Kraujo krešėjimo sistemos aktyvumas pagal ADP, atsižvelgiant į PAI-1 kombinacijas PAI-1 kombinacija N (proc.) ADP vidurkis Standartinis nuokrypis 4G/4G ir 4G/5G 36 (73,4) 74.92 16.84
5G/5G 13 (26,6) 73.08 16.13
Iš viso 49(100) 74.43 16.51
9 lentelė. Kraujo krešėjimo sistemos aktyvumas pagal ADR, priklausomai nuo PAI-1 kombinacijos PAI-1 kombinacija N (proc.) ADR vidurkis Standartinis nuokrypis 4G/4G ir 4G/5G 36 (73,4) 80.14 21.18
Iš viso 49(100) 77.57 23.31
10 lentelė. Kraujo krešėjimo sistemos aktyvumas pagal TNS, atsižvelgiant į PAI-1 kombinacijas PAI-1 alelis N (proc.) TNS vidurkis Standartinis nuokrypis 4G/4G ir 4G/5G 36 (73,4) 1.76 0.66
5G/5G 13 (26,6) 2.70 1.29
Iš viso 49(100) 2.01 0.95
Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas tarp šių genotipų : 4G vs 5G: p=0,0017
6.4 Tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo pasiskirstymas tarp vyrų ir moterų
Gauti rezultatai parodo,kad 4G/5G genotipo dažnis tarp lyčių reikšmingai nesiskyrė, χ2=0,574, p=
0,751 (11 lentelė). Gauti rezultatai parodo, kad 4G/5G alelių dažnis tarp lyčių reikšmingai nesiskyrė, χ2=0,478, p= 0,489 (12 lentelė).
11 lentelė. Ligonių pasiskirstymas pagal lytį ir PAI-1 genotipą PAI-1 genotipas Iš viso 4G/4G 5G/5G 5G/5G Lytis Vyras 6 (54,5) 15 (60) 9 (69,2) 30 Moteris 5 (45,5) 10 (40) 4 (30,8) 19 Iš viso 11 (100) 25 (100) 13 (100) 49 (100)
12 lentelė. Ligonių pasiskirstymas pagal lytį ir PAI-1 kombinaciją
Kombinacijos Iš viso
4G/4G ir 4G/5G 5G/5G
Lytis
Vyras 21 (58,3) 9 (69,2) 30 Moteris 15 (41,7) 4 (30,8) 19
REZULTATŲ APTARIMAS
Nustatėme naują biožymenį, kuris daro reikšmingą įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, gydant ligonius antikoaguliantais ir antiagregantais po širdies vožtuvų operacijos. Šio tyrimo metu parodėme, kad PAI-1 5G/5G genotipą turintiems TNS rodikliai buvo reikšmingai didesni, nei kitokį genotipą turintiems ligoniams. Nustatyti PAI-1 genotipui, priešingai nei kiti autoriai, naudojome pažangesnį tikro laiko (TL) PGR (tuo tarpu, dažniausiai kitų autorių naudotas metodas buvo – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo PGR metodas). Sanger metodo sekoskaitą naudojome patvirtinti gautus rezultatus [33-34].
Klinikinėje praktikoje po širdies vožtuvų operacijų skiriami antikoaguliantai ir antiagregantai, kad nuslopinti kraujo krešėjimo sistemos aktyvumą ir išvengti trombozių, kurios gali būti pavojingos gyvybei. Neretai vartojami vaistai veikia ne taip, kaip to iš jų tikimąsi. Ne visuomet aiškūs veiksniai, kurie daro įtaką kraujo krešėjimo sistemą veikiančių vaistų efektyvumui. Naujausių tyrimų duomenimis, didelę įtaką tinkamo vaisto ir jo dozes parinkimui daro ligonio genai.
Klinikinėje praktikoje antikoaguliantų – varfarino efektyvumas vertinamas atsižvelgiant į tarptautinį normalizuotą santykį (TNS, angl. INR). Priklausomai nuo operacijos pobūdžio, gretutinių ligų, TNS gali įvairuoti nuo 2 iki 4, 5. Mūsų tirtų ligonių vidutinis TNS buvo: 2, 01±0, 95. Detaliau išnagrinėję mūsų tiriamuosius, t.y. ištyrę jų PAI-1 genotipą, nustatėme, kad TNS statistiškai reikšmingai priklausė nuo PAI-1 genotipo. Atsižvelgiant į PAI-1 4G/5G genotipą, mūsų tirtų ligonių, po širdies vožtuvų operacijų, TNS buvo aukštesnis bent TNS=1 tiems ligoniams, kurie turėjo 5G/5G variantą, nei turintiems bent vieną 4G alelį. Turinčių 5G/5G variantą buvo ketvirtis visos tirtų ligonių imties. Tai sudaro reikšmingą populiacijos dalį.
Antiagregantų efektyvumas vertinamas atsižvelgiant į trombocitų agregacijos rodiklius. Trombocitų funkcija vertinama atsižvelgiant į trombocitų agregaciją paveikus agregacijos induktoriais: ADF - adenozindifosfatas, ADR – adrenalinas, ARA – arachidono rūgštis. ADR rodiklis nurodo bendrą trombocitų agregaciją ir dalinį aspirino antiagregacinį poveikį, o ADF – klopidogrelio, tikagreloro, prasugrelio antiagregacinį efektyvumą. ARA – tik aspirino antiagregacinį efektyvumą. Atsižvelgiant į PAI-1 4G/5G genotipą, ADF, ADR ir ARA rodikliai mūsų tirtiems ligoniams nesiskyrė.
Lietuvoje jau anksčiau buvo atlikti tyrimai, kurių tikslas buvo nustatyti kaip nuo PAI-1 genotipo, o tuo pačiu ir šio fermento aktyvumo priklauso vainikinių kraujagyslių okliuzijos laipsnis [39]. Nustatyta, kad 1,6 karto dažniau vainikinių arterijų okliuziją turėjo tie ligoniai, kurie turėjo PAI-1 4G/5G genotipą.
Kumar ir bendraautorių [39] atlikto tyrimo metu nustatytas PAI-1 4G/5G genotipo dažnis lietuvių populiacijos ligonių, kurie patyrė miokardo infarktą imtyje. Tirtų lietuvių ligonių imties PAI-1 4G/5G genotipo dažnis buvo panašus į kitų pasaulio šalių miokardo infarktu sergančių ligonių PAI-1 genotipo dažnį. Palyginus šio tyrimo metu tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo dažnį, akivaizdu, kad 4G/4G ligonių, kuriems atliktos širdies vožtuvų operacijos buvo mažiau, o 5G/5G turinčių ligonių buvo daugiau, nei miokardo infarktu sergančių ligonių imtyje, kuri tirta Kumar ir bendraautorių [39].
Palyginus PAI-1 4G/5G genotipo dažnį kitose populiacijose, šiaurės Afrikoje 4G/4G turinčių asmenų buvo daugiau (42 %) nei Lietuvoje (32 %) (13 lentelė). Tuo tarpu, 4G/5G turinčių ligonių dažnis buvo panašus (47,4 % ir 49,5%). 5G/5G turinčių asmenų Lietuvoje buvo daugiau (14% vs 18%), bet pietų Afrikoje 5G/5G variantas dažniau, nei Lietuvoje (34% vs 18%). Pietų Amerikoje 4G/4G alelį turinčių asmenų buvo ženkliai mažiau nei Lietuvoje (13,3% vs 32,4%) (13 lentelė). 4G/5G turinčių ligonių buvo netgi 2 kartus daugiau Lietuvoje, tačiau 5G/5G buvo dažnesnis Pietų Amerikoje (56,7% vs 18,1%). Palyginus lietuvių populiacijos ligonius su azijiečiais, 4G/4G ir 4G/5G turinčių žmonių santykis buvo panašus, tačiau 5G/5G Azijoje buvo dažnesnis netgi 1,7 karto, nei Lietuvoje.
13 Lentelė. PAI-1 4G-675 5G genotipo pasiskirstymo dažnis skirtingose populiacijose tarp sveikų žmonių ir Lietuvoje tirtų asmenų.
Regionas N (Iš viso) 4G/4G N % 4G/5G N % 5G/5G N % Šiaurės Afrika [35] 198 83 41,9 94 47,4 28 14,1 Pietų Afrika[36] 300 65 21,6 132 44,0 103 34,3 Pietų Amerika [37] 127 17 13,3 38 29,9 72 56,7 Azija [38] 344 97 28,2 142 41,2 105 30,5 Lietuva [39] 376 122 32,4 186 49,5 68 18,1 Pietų Europa [40-41] 481 105 21,8 214 44,5 162 33,7
7.
IŠVADOS1. Tyrimų rezultatai parodė, kad PAI-1 genotipas nedarė reikšmingos įtakos trombocitų agregacijos rodikliams paveikus ADP ir ADR. PAI-1 4G darė įtaką TNS rodikliams. Aukštesnius TNS rodiklius turėjo 5G/5G ligoniai, nei 4G/5G ar 4G/4G turintys ligoniai.
2. Greta vartojamas aspirinas šio tyrimo metu nedarė reikšmingos įtakos kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui. 3. Tirtas PAI-1 4G/5G genotipo dažnis vyrams ir moterims reikšmingai nesiskyrė.
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1.1Barker DJP. Fetal origins coronary heart dicease.Br Med J 1995; 311: 171-4.
1.3 Droppa M, Tschernow D, Karin A. L. Müller et al. Evaluation of Clinical Risk Factors to PredictHigh On-Treatment Platelet Reactivity andOutcome in Patients with Stable CoronaryArtery Disease (PREDICT-STABLE). PLoS ONE. 2015; 10(3): e0121620.
1.4. Wurtz M, Lordkipanidz M, Grove L. Pharmacogenomics in cardiovascular disease: focus on aspirin and ADP receptor antagonists. J Thromb Haemost, 2013;11:1627 – 1639.
1. Y. Aso, “Plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 in vascular inflammation and thrombosis,” Frontiers in Bioscience, vol. 12, no. 8, pp. 2957–2966, 2007
2. Pannenkoek, H.; Veerman, H.; Lambers, H.; Diergaarde, P.; Verweij, C. L.; van Zonneveld, A. J.; van Mourik, J. A. Embo. J. 1986, 5, 2539-2544.
3. Michaels L. Aetiology of coronary artery disease: an historical approach. Br Heart J 1966; 28:258-64 4. Kruithof EKO. Plasminogen activator inhibitors — a review. Enzyme 1988; 40:113-21.
5. Gelehrter TD, Sznycer-Laszuk R. Thrombin induction of plasminogen activator-inhibitor in cultured human endothelial cells. J Clin Invest 1986; 77:165-9.
6. . Gardell, S. J.; Krueger, J. A.; Antrilli, T. A.; Elokdah, H.; Mayer, S.; Orcutt, S.J.; Crandall, D. L.; Vlasuk, G. P. Mol. Pharmacol. 2007, 72, 897-906.
7. Y. Aso, “Plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 in vascular inflammation and thrombosis,” Frontiers in Bioscience, vol. 12, no. 8, pp. 2957–2966, 2007
8. S. Hazra, V. Stepps, A. D. Bhatwadekar et al., “Enhancing the function of CD34+ cells by targeting plasminogen activator inhibitor-1,” PLoS ONE, vol. 8, no. 11, Article ID e79067, 2013.
9. Wiman B, Ljungberg B, Chmielewska J, Urden G, Blomback M,Johnsson H. The role of the fibrinolytic system in deep vein thrombosis.J Lab Clin Med 1985;105:265-70.
10. . Auwerx J, Bouillon R, Collen D, Geboers J. Tissue-type plasminogen activator antigen and plasminogen activator inhibitor in diabetes mellitus. Arteriosclerosis 1988;8:68-72.
11. Margaglione M, Di Minno G, Grandone E, et al. Abnormally high circulation levels of tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in patients with a history of ischemic stroke. Arterioscler Thromb 1994;14:1741-5.
plasminogen activator: role of fibrin. J Biol Chem 1982; 257:2912-9.
13. . Levi M, Biemond BJ, van Zonneveld A-J, ten Cate JW, Pannekoek H. Inhibition of plasminogen activator inhibitor-1 activity results in promotion of endogenous thrombolysis and inhibition of thrombus extension in models of experimental thrombosis. Circulation 1992; 85:305-12
14. Wagner OF, de Vries C, Hohmann C, Veerman H, Pannekoek H. Interaction between plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) bound to fibrin and either tissue-type plasminogen activator (t-PA) or urokinase-type plasminogen activator (u-PA): binding of t-PA/PAI-1 complexes to fibrin mediated by both the finger and the kringle-2 domain of t-PA. J Clin Invest 1989;84:647-55.
15. Strandberg L, Lawrence D, Ny T. The organization of the humanplasminogen-activator-inhibitor-1 gene: implications on the evolution of the serine-protease inhibitor family. Eur J Biochem 1988; 176:609-7. Ranellou K, Paraskeva A, Kyriazopoulos P, Batistatou A, Evangelou A, El-Aly M, et al. Polymorphisms in prothrombotic genes in young stroke patients in Greece: a case-controlled study. Blood coagulation & fibrinolysis: an international journal in haemostasis and thrombosis. 2015;26(4):430-5.
16. Sirgo G, Morales P, Rello J. PAI-1 gene: pharmacogenetic association of 4G/4G genotype with bleeding after cardiac surgery--pilot study. European journal of anaesthesiology. 2009;26(5):404-11.
17. Akhter MS, Biswas A, Ranjan R, Meena A, Yadav BK, Sharma A, et al. Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) gene 4G/5G promoter polymorphism is seen in higher frequency in the Indian patients with deep vein thrombosis. Clinical and applied thrombosis/hemostasis: official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 2010;16(2):184-8.
18. Kohler HP, Grant PJ. Plasminogen-activator inhibitor type 1 and coronary artery disease. The New England journal of medicine. 2000;342(24):1792-801.
19. Dawson S, Hamsten A, Wiman B, Henney A, Humphries S. Genetic variation at the plasminogen activator inhibitor-1 locus is associated with altered levels of plasma plasminogen activator inhibitor-1 activity. Arteriosclerosis and thrombosis: a journal of vascular biology / American Heart Association. 1991;11(1):183-90.
20. Pannenkoek, H.; Veerman, H.; Lambers, H.; Diergaarde, P.; Verweij, C. L.; van Zonneveld, A. J.; van Mourik, J. A. Embo. J. 1986, 5, 2539-2544.
21. . I. Mertens, A. Verrijken, J. J. Michiels, M. Van der Planken, J. B. Ruige, and L. F. Van Gaal, “Among inflammation and coagulation markers, PAI-1 is a true component of the metabolic syndrome,” International Journal of Obesity, vol. 30, no. 8, pp. 1308–1314, 2006.
22. Rūta Babarskienė, (2009). Išeminė širdies liga. Petras Zabiela, Širdies ligos (19;24), Kaunas: UAB “Kardiologijos projektai”
23. Bhagavan N.V., Ha C.E. Essentials of medical biochemistry: with clinical cases. Amsterdam, Boston et al.: Elsevier;2011. p. 275 – 279,282.
24. Weinberg, Robert A. (Robert Allan), 2013 "The biology of cancer". 2nd edition, Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC ISBN 978-0-8153-4219-9.
25. Dahm R. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early yearsof nucleic acid research. Human Genetics. 2008; 122: 565–581. doi:10.1007/s00439-007-0433-0
26. Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesyan MD, Kushnirov VV. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. Journal of Biological Chemistry. 2003; 278 (49): 49636–43. doi:10.1074/jbc.M307996200. PMID 14507919.
27. Thermo Fisher Scientific. Horizontal Systems Models B1A, B1, B2 and B3: Operating and Maintenance Manual 7007309 Rev. 0. 2012; 2-1 – 4-1
28. Applied biosystems, life technologies. Real-time PCR handbook. 2014. p. 2 – 3.
29. http://www.thermofisher.com/lt/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/qpcr-vs-digital-pcr-vs-traditional-pcr.html#2
30. LukasikM. and Owecki MK. Efficacy of Antiplatelet Treatment in Stroke Prevention:Past, Present, and Future. Drug developmentresearch. 2013; 74: 428–439.
31. Becattini C., Agnelli G. Aspirin for prevention and treatment of venous thromboembolism. Blood Reviews. 2014; 28: 103–108.
32. Berger JS, Lala A, Krantz MJ, Baker GS, Hiatt WR. Aspirin for the prevention of cardiovascular eventsin patients without clinical cardiovascular disease: a meta-analysis of randomized trials. Am Heart J. 2011; 162(1):115–24.e2. doi: 10.1016/j.ahj.2011.04.006 PMID: 21742097.
33. Morange P. E., Saut N., Alessi M. C., et al. Association of plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 (SERPINE1) SNPs with myocardial infarction, plasma PAI-1, and metabolic parameters: the HIFMECH study. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2007;27(10):2250–2257. doi: 10.1161/atvbaha.107.149468.
34. Ahmed W., Malik M., Saeed I., et al. Role of tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor polymorphism in myocardial infarction. Molecular Biology Reports. 2011;38(4):2541–2548. doi: 10.1007/s11033-010-0392-8
polymorphisms and changes in PAI-1/Tissue plasminogen activator levels in myocardial infarction: a case-control study. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 2010;14(1):23–27. doi: 10.1089/gtmb.2009.0039.
36. Pegoraro R. J., Ranjith N. Plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) and platelet glycoprotein IIIa (PGIIIa) polymorphisms in young Asian Indians with acute myocardial infarction. Cardiovascular Journal of South Africa. 2005;16(5):266–270.
37. Isordia-Salas I., Leaños-Miranda A., Sainz I. M., Reyes-Maldonado E., Borrayo-Sánchez G. Association of the plasminogen activator inhibitor-1 gene 4G/5G polymorphism with ST elevation acute myocardial infarction in young patients. Revista Espanola de Cardiologia. 2009;62(4):365– 372. doi: 10.1016/s0300-8932(09)70893-0
38. Ahmed W., Malik M., Saeed I., et al. Role of tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor polymorphism in myocardial infarction. Molecular Biology Reports. 2011; 38(4):2541–2548. doi: 10.1007/s11033-010-0392-8
39. T.K.Parpugga, V.Tatarunas, V.Skipskis, N.Kupstyte. D.Zaliaduonyte-Peksiene and V.Lesauskaite. The Effect of PAI-1 4G/5G Polymorphism and Clinical Factors on Coronary Artery Occlusion in Myocardial Infarction. Dis Markers. 2015; 2015: 260101
40. Ardissino D., Mannucci P. M., Merlini P. A., et al. Prothrombotic genetic risk factors in young survivors of myocardial infarction. Blood. 1999; 94(1):46–51.
41. Onalan O., Balta G., Oto A., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 4G4G genotype is associated with myocardial infarction but not with stable coronary artery disease. Journal of Thrombosis and
Thrombolysis.2008; 26(3):211–217. doi: 10.1007/s11239-007-0083-z.
