MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
EVELINA STANKŪNAITĖ
LIETUVOJE AUGANČIOS PAPRASTOSIOS BITKRĖSLĖS
(TANACETUM VULGARE L.) ETERINIŲ ALIEJŲ CHEMINĖS
SUDĖTIES ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Lekt. Dr. Daiva Kazlauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
LIETUVOJE AUGANČIOS PAPRASTOSIOS BITKRĖSLĖS
(TANACETUM VULGARE L.) ETERINIŲ ALIEJŲ CHEMINĖS
SUDĖTIES ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbasRecenzentas Darbo vadovas:
Doc. dr. Inga Stanevičienė Lekt. Dr. Daiva Kazlauskienė
Darbą atliko: Magistrantė Evelina Stankūnaitė KAUNAS, 2017
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Tanacetum vulgare L. botaninė charakteristika ... 12
1.2 Cheminė Tanacetum vulgare L. charakteristika ... 13
1.2.1 Eteriniai aliejai ... 14
1.2.2 Paprastosios bitkrėslės (T. Vulgare L.) cheminė eterinių aliejų sudėtis ... 15
1.3 Eterinių aliejų panaudojimas kaip pesticidų ... 17
1.3.1 T. vulgare eteriniai aliejai, pasižymintys pesticidiniu aktyvumu ... 18
1.4 Eterinių aliejų ekstrakcijos metodai ... 19
1.4.1 Ekstrakcija superkritiniais skysčiais ... 20
1.4.2 Distiliacija vandens garais ... 21
1.4.3 Ekstrakcija organiniais tirpikliais; ... 22
1.4.4 Mechaninis metodas (šalto spaudimo ekstrakcija) ... 23
1.4.5 Kietafazė mikroekstrakcija. ... 23
1.5 Dujų chromatografija-masių spektrometrija ... 25
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODIKA ... 26
2.1 Tyrimų objektas ... 26
2.2 Reagentai ... 26
2.4 Tyrimų metodai ... 27
2.4.1 Tiriamojo pavyzdžio ruošimas ... 27
2.4.1.1 Ekstrakcija metanoliu. ... 27
2.4.1.2 Distiliacija vandens garais ... 27
2.4.2 Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu ... 28
2.4.3 Statistinė duomenų analizė ... 28
3. REZULTATAI I.R JŲ APTARIMAS ... 29
3.1 Eterinių aliejų sudėties identifikavimas ... 29
3.2 Rezultatų aptarimas ... 37
IŠVADOS ... 39
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41
SANTRAUKA
Evelinos Stankūnaitės magistro baigiamasis darbas, pavadinimas: Lietuvoje augančios paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) eterinių aliejų cheminės sudėties analizė/ mokslinis vadovas: lekt. dr. Daiva Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas - išanalizuoti Lietuvoje augančios paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) žiedų eterinių aliejų cheminę sudėtį. Darbo uždaviniai – remiantis literatūros šaltinių analizės metu sukaiptais duomenimis parinkti optimalias sąlygas eterinių aliejų iš surinktos Tanacetum vulgare L. žaliavos išskyrimui; ištirti Tanacetum vulgare L. žieduose ir lapuose esančių eterinių aliejų sudėtį, palyginti ir statistiškai įvertinti eterinių aliejų sudėtį Tanacetum vulgare L. žiedų ir lapų ekstraktuose; pateikti rekomendacijas paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų vartojimui kaip pesticidines priemones. Tyrime naudoti metodai – dujų chromatografija-masių spektrometrija (DC-MS) eterinių aliejų komponentams identifikuoti.
Tyrimo rezultatai: paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų cheminė sudėtis buvo tiriama DC-MS metodu. Ekstraktai gauti hidrodistiliacijos metodu. DC-MS metodu įvertinus eterinių aliejų sudėtį buvo nustatyti pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai: kamparas, 1,8-cineolis, terpinen-4-olis,-terpineolis, krisantenonas, cis-krisantenolis,tujonas. Nustatyta, jog eterinių aliejų komponentų sudėtis skiriasi skirtinguose Lietuvos regionuose rinktoje augalinėje žaliavoje. Taip pat palyginus skirtinguose augalo organuose (žiedynuose ir lapuose) kaupiamo eterinio aliejaus sudėtį, buvo nustatyta, jog skirtingų T. vulgare L. dalių eterinio aliejaus dominuojantys komponentai skiriasi. Žiedai kaupia daugiau kamparo, krisantenono, cis-krisantenolio,tujono, lapai kaupia daugiau 1,8-cineolio.
SUMMARY
Master thesis by Evelina Stankūnaitė, „Analysis of essential oils in tansy Tanacetum vulgare L. growing in Lithuania“. Scientific supervisor: lect. dr. Daiva Kazlauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of analytical and toxicological chemistry.- Kaunas.
The aim of the study – to analyse the chemical essential oil composition in Tanacetum vulgare floretes. Main go als of the study –to analize and chose optimal method of extraction of essential oils from Tanacetum vulgare florettes, to perform analysis of essential oil compounds in leaves and florettes, to compare and statistically evaluate compositions in florettes and leaves, to make recommendations on Tanacetum vulgare L. essential oils usage as pesticdes.
Methods – gaschromatography – massspectrometry to identify and evaluate composition of essential oils.
Results. The method uset was gaschromatography – massspectrometry. Extracts were preparedusing hydrodistillation. GC-MS methods howed main compounds in essential oils – 1,8- cineol, terpinen-4-ol, -terpineol, chrisatenon, cys-christantenol, tujon. It has been found that in different regions of Lithuania composition of essential oils in Tanacetum vulgare was different. Also after analising leaves and florettes was found that in different parts ofthe plant the composition differs. In florettes were more camphor, chrisantenon, cys-christantenol, tujon, and in leaves were more 1,8-cyneol.
PADĖKA
Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems rengiant magistro baigiamąjį darbą. Dėkoju magistro baigiamojo darbo vadovei lekt. dr. Daivai Kazlauskienei už patarimus ir konsultacijas. Taip pat dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros doktorantui Mindaugui Marksai už pagalbą dirbant analitinėje laboratorijoje.
SANTRUMPOS
DC-MS – dujų chromatografija-masių spektrometrija; DEET - N,N-dietil-m-toluamidas;
KFME – kietafazė mikroekstracija;
ESS – ekstrakcija superkritiniais skysčiais; O2 – deguonis;
GASR – aminosviesto rūgštis; CO2 – anglies dioksidas.
ĮVADAS
Fitoterapinis augalų panaudojimas medicinoje vis tampa svarbesnis įvairių ligų profilaktikoje bei jų gydyme.
Daug lėšų kasmet skiriama naujų augalinių preparatų kūrimui, naujų augalų tyrinėjimams – analizuojama jų cheminė sudėtis, tiriamas farmakologinis ir toksikologinis veikimas, įvairių augalų sąveika su kitais vaistais bei jų sąveika žmogaus organizme [1]. Įvairių patentų, susijusių su augaliniais vaistiniais preparatais ar augalų panaudojimu medicinoje, skaičiaus augimas byloja apie fitocheminių vaistų aktualumą bei pramoninių įmonių susidomėjimą vaistiniais augalais [2].
Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, medicinoje naudojama 35 – 75 tūkstančiai augalų rūšių, o tai sudaro 14 – 28 % visų augalų rūšių, tačiau tik 1% šių augalų panaudojimo yra patvirtintas tyrimais [1].
Paprastoji bitkrėslė (Tanacetum vulgare L.) yra astrinių šeimos daugiametis žolinis augalas. Nuo senų laikų yra žinomos paprastosios bitkrėslės gydomosios savybės. Šios savybės yra pagrįstos plačia augalo komponentų sudėtimi, į kurią įeina daugybė bioaktyvių medžiagų, kaip eteriniai aliejai, kartumynai, galo rūgštis, chlorogenas, tanaceto rūgštys, raugai, dervos, oksikumarinai. Taip pat augalo sudėtyje randama karotinoidų, askorbo rūgšties [3].
Tanacetum vulgare L. nuo seno naudojamas kaip virškinamojo trakto liaukų veiklą skatinanti,
kaip tulžies išsiskyrimą skatinanti priemonė, stimuliuojanti apetitą, pasižyminti antihelmintiniu veikimu, mažinanti pilvo pūtimą [4]. Į Jungtinių Amerikos valstijų farmakopėją šis augalas įtrauktas kaip priemonė, peršalimui, karščiavimui gydyti.
Dėl aptinkamo didelio kiekio eterinių aliejų – seskviterpenų bei monoterpenų, naujausi tyrimai parodė, kad paprastosios bitkrėslės eteriniai aliejai ar ekstraktai taip pat pasižymi priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešgrybeliniu, priešvirusiniu poveikiu, neuroprotektiniu poveikiu [5; 6; 7].
Eteriniai aliejai, esantys augalo sudėtyje, pasižymi ir repelentinėmis savybėmis. Neseniai atlikti tyrimai rodo, jog dėl didelio kiekio tam tikrų eterinių aliejų, tokių kaip 1,8-cineolis, terpinen-4-olis ir kt., paprastoji bitkrėslė gali pasižymėti šiomis savybėmis. Darbe bus tiriama Lietuvoje augančios paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų sudėtis bei pateikiamos rekomendacijos jų v vartojimui kaip pesticidines priemones.
Darbo aktualumas: Didėjant vabzdžių atsparumui sintetiniams pesticidams, buvo pradėta galvoti apie alternatyvius metodus. Eteriniai aliejai gali būti alternatyva sintetiniams pesticidams. Be to jie yra ekologiški, nėra tokie kenksmingi gamtai bei žmonėms, kaip sintetiniai pesticidai.
Darbo tikslas: išanalizuoti Lietuvoje augančios paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) žiedų eterinių aliejų cheminę sudėtį.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:Išanalizuoti Lietuvoje augančios paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) žiedų eterinių aliejų cheminę sudėtį.
Darbo uždaviniai:
1. Remiantis sukauptais duomenimis, parinkti optimalias sąlygas eterinių aliejų iš surinktos Tanacetum vulgare L. žaliavos išskyrimui.
2. Ištirti Tanacetum vulgare L. žieduose ir lapuose esančių eterinių aliejų sudėtį dujų
chromatografijos – masių spektrometrijos metodu (DC-MS).
3. Palyginti ir statistiškai įvertinti eterinių aliejų sudėtį ir kiekį Tanacetum vulgare L. žiedų ir lapų ekstraktuose.
4. Pateikti praktines rekomendacijas paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) eterinių aliejų vartojimui kaip pesticidines priemones.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Tanacetum vulgare L. botaninė charakteristika
Paprastoji bitkrėslė (Tanacetum vulgare L.) yra astrinių (Asteraceae) šeimos daugiametis žolinis augalas.
Paprastoji bitkrėslė – status, galintis užaugti 30-150 cm aukščio, aštraus kvapo augalas. Šakniastiebis šliaužiantis, storas. Stiebas šiek tiek briaunotas, viršūnėje šakotas. Lapai dideli, iki 20cm ilgio, 7-10cm pločio, pražanginiai, 1-2 kartus plunksniškai suskaidyti, pliki arba apaugę retais plaukeliais. Viršutinė lapo pusė taškuota. Lapai turi pjūkliškai dantytus kraštus, apatiniai kotuoti, viršutiniai bekočiai. Žiedynas – tanki skydiška šluotelė, kurioje susitelkę iki 80 graižų. Graižai pusrutuliški, plokščiomis viršūnėmis. Žiedai vamzdiški, geltoni, kraštiniai su 3-4, viduriniai su 5 danteliais stiebo viršūnėje [3].
Augalas žydi liepos-rugsėjo mėnesiais.
Paprastoji bitkrėslė auga vidutinio klimato zonoje Europoje, Kaukaze, Mažojoje ir Vidurinėje Azijoje, Vakarų ir Rytų Sibire, Tolimosiuose Rytuose, Šiaurės Kinijoje, Korėjoje bei Japonijoje. Ji buvo įvesta į kitas pasaulio dalis ir tam tikrose srityse tapo invazinė, pavyzdžiui, Šiaurės Amerikoje [8].
Paprastoji bitkrėslė mėgsta lengvesnes dirvas, bet auga ir priemolyje, saulėtoje vietoje. Auga pievose, panamėse, pakelėse, palaukėse, upių krantuose, sausuose ir saulėtuose šlaituose. Paplitusi visoje Lietuvoje, tačiau šiaurinėje dalyje sutinkama rečiau [9].
Pirmieji istoriniai įrašai apie paprastąją bitkrėslę yra senovės graikų, kurie šį augalą naudodavo įvairiems negalavimams gydyti. Aštuntame amžiuje Šveicarijos Benediktai šį augalą reumato, karštligės ir virškinimo sutrikimams gydyti. Dažniausias paprastosios bitkrėslės panaudojimas - dėl didelės eterinių aliejų koncentracijos, žarnyno kirminams šalinti. Vėliau paprastoji bitkrėslė buvo įtraukta į Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėją, naudojama peršalimo ir karščiavimo gydymui. Taip pat nuo pat viduramžių šis augalas buvo naudojamas kaip repelentinė priemonė [10].
Dabar šis augalas laikomas kenksmingu sveikatai daugelyje vietų ir yra kontroliuojamas. Tradiciškai jis naudojamas maisto, kosmetikos, dažų, konservantų bei vaistų gamyboje daugelyje šalių, įskaitant ir Lietuvą [1]. Taip pat T. vulgare L. naudojama įvairių insekticidų, akaricidų gamyboje [11].
Paprastoji bitkrėslė naudojama ir migrenai, neuralginiams skausmams, reumatui gydyti. Naujausi tyrimai taip pat parodė, kad paprastosios bitkrėslės eteriniai aliejai ar ekstraktai taip pat pasižymi priešuždegiminiu, antibakteriniu ir priešgrybeliniu poveikiu, kartu su kitais biologiniais poveikiais priklausomai nuo cheminės sudėties [12]. Taip pat buvo nustatyta ir šio augalo antioksidacinis, priešvirusinis, neuroprotektinis poveikiai [5; 6].
Paprastoji bitkrėslė žadina apetitą, skatina virškinamojo trakto liaukų darbą. Taip pat didina tulžies, prakaito liaukų aktyvumą. Tinka kirmėlėms (askaridėms, spalinukėms) iš virškinamojo trakto šalinti [4].
Paprastosios bitkrėslės antihelmintinis aktyvumas, remiantis atliktų tyrimų duomenis, pasireiškia manoma dėl kaupiamo didelio kiekio -tujono. Šis eterinio aliejaus komponentas veikia GASRA receptorių, panašiai kaip ir antihelmintiniai vaistai, pavyzdžiui, ivermektinas [4].
1.2 Cheminė Tanacetum vulgare L. charakteristika
Paprastoji bitkrėslė kaupia daug įvairių medžiagų, kaip eteriniai aliejai, kartumynai, galo r., chlorogenas, tanaceto rūgštys, raugai, dervos, oksikumarinai. Taip pat augalo sudėtyje randama karotinoidų, askorbo rūgšties [9].
Didelę ir svarbią dalį cheminėje paprastosios bitkrėslės sudėtyje užima karčiosios medžiagos. Svarbiausi ir naudojami medicinoje - seksviterpeninis laktonas tanacetinas bei flavanoidai (apigeninas, liuteolinas, akacetinas, kvercetino dariniai: flavanoliniai glikozidai – iki 0,47%). Iš
bitkrėslės žaliavos, turinčios nemažus kiekius flavanoidų ir fenolkarboninių rūgščių, gaminami tulžies išsiskyrimą skatinantys vaistai.
Didžiausia dalis veikliųjų medžiagų, randamų paprastojoje bitkrėslėje, – eteriniai aliejai (žolėje – 0,2-0,6%, žiedynuose – iki 1,5%).
Eteriniai aliejai randami T. vulgare L. žiedynuose įvairuoja. Iš viso literatūros duomenimis randama apie 40 skirtingų komponentų [12].
1.2.1 Eteriniai aliejai
Augalai kaupia dviejų rūšių aliejus – tai riebaliniai aliejai ir eteriniai aliejai. Riebaliniai aliejai susideda iš glicerolio esterių, riebalų rūgščių (trigliceridų ar triacilglicerolių), tuo tarpu eteriniai aliejai yra mišinys įvairios cheminės prigimties lakiųjų, organinių junginių: angliavandenilių, alkoholių, ketonų, rūgščių, esterių, eterių bei kitų junginių. Dažniausiai eterinius aliejus sudaro 85-99 % lakiųjų ir 1-15 % nelakiųjų junginių [13; 14]. Į vieno augalo sudėtį gali įeiti nuo kelių iki keliasdešimt komponentų. Didžiausią dalį eterinių aliejų sudėties sudaro terpenai, kurie yra klasifikuojami pagal struktūroje esančių izopreno (C5H8) fragmentų skaičių: 1 izopreno molekulė – pusiauterpenai, 2 - monoterpenai, 3 – seskviterpenai, 4 - diterpenai, 6 - triterpenai, 8 – tetraterpenai, 100 - 5000 – politerpenai, tačiau dažniausiai aptinkami monoterpenai (timolis, mentolis, kamparas, 1,8- cineolis) ir seskviterpenai (serinas) [15].
Eteriniai aliejai yra viena labiausiai paplitusių vaistinių medžiagų grupių. Augalai, kurie kaupia eterinius aliejus yra įvairių botaninių rūšių ir aptinkami visame pasaulyje. Manoma, kad pasaulyje yra daugiau kaip 350 000 augalų rūšių ir tik 5% šių (17 500 rūšių) yra aromatingi [13]. Augalai eterinius aliejus kaupia specialiose augalo dalyse, vadinamose eterinių aliejų talpyklose (sekreciniuose audiniuose): egzogeninėse (liaukiniai plaukeliai) ir endogeninėse (sekrecinės ląstelės) talpose. Šių sekrecinių ląstelių augale daugiausiai yra lapuose ir žolėje, taip pat vaisiuose, žieduose, šaknyse, šakniastiebiuose, medienoje.
Eteriniai aliejai – skaidrūs, bespalviai, rečiau spalvoti skysčiai. Jie yra riebalingi, turi būdingą kvapą, lakūs. Jie lengvesni už vandenį, tankis didėja, didėjant O2 atomų kiekiui. Eteriniai aliejai yra netirpūs vandenyje, tačiau gerai tirpsta organiniuose tirpikliuose – eteryje, alkoholiuose, acetone, chloroforme, taip pat tirpūs riebaliniuose aliejuose [16]. Eteriniai aliejai, skirtingai nei riebaliniai, išgaruodami nepalieka riebalingos dėmės.
1.2.2 Paprastosios bitkrėslės (T. Vulgare L.) cheminė eterinių aliejų sudėtis
Paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų sudėtis skirtinguose moksliniuose šaltiniuose pateikiama skirtinga. Daug faktorių turi įtakos aliejų sudėčiai: augalo audinio dalis, kuri buvo ekstrahuojama, augalo ontogenezė, sezoniniai pokyčiai bei ekstrakcijos metodas gali sukelti lakiųjų aliejų sudėties variacijas [17].
T. vulgare yra chemiškai labai įvairi rūšis. Žinoma, kad į eterinių aliejų sudėtį įeina dideli
kiekiai mono- ir seskviterpenų, kurie leidžia skirstyti į atskirus chemotipus. Iki šiol yra nustatyta daugiau nei 30 skirtingų paprastosios bitkrėslės eterinio aliejaus chemotipų pagal dominuojantį komponentą skirtinguose pasaulio regionuose. Net 26 skirtingi chemotipai buvo aptikti ir apibūdinti Vengrijoje, 10 skirtingų chemotipų Suomijoje. Kitose šalyse buvo aptikta nuo keturių iki septynių chemotipų. Labiausiai paplitę – β-tujono chemotipas, rastas devyniose pasaulio šalyse, kamparo – septyniose, trans-krisantenilio acetato chemotipas – penkiose šalyse, 1,8-cineolio ir artemisia ketono– trijose. Kiti T. Vulgare chemotipai buvo rasti tik vienoje arba dviejose pasaulio šalyse [17]. Taigi dominuojantis chemotipas yra β-tujono.
Lietuvoje Tanacetum vulgare yra plačiai paplitusi visoje šalyje, tačiau šiaurinėje dalyje aptinkama rečiau. Natūralioje aplinkoje rastos dvi augalo variacijos – tai var. Vulgare ir var. Crispum. Atlikus tyrimus yra nustatyta 4 skirtingi paprastosios bitkrėslės chemotipai: kamparo, trans-tujono, 1,8-cineolio, artemisia ketono [12].
Kamparas – specifinio kvapo bespalvių kristalų pavidalo medžiaga, įeinanti į daugelio eterinių aliejų sudėtį, naudojamas medicinoje kaip antiseptinė, tonizuojanti, nervų spazmus malšinanti priemonė. Kamparo chemotipas Lietuvoje dažniau randamas rytinėje Lietuvos dalyje. Tai labiausiai Lietuvoje paplitęs Tanacetum vulgare L. chemotipas. Kamparo koncentracija paprastojoje bitkrėslėje svyruoja 19 – 60 % [18].
1,8-cineolis (eukaliptolis) – specifinio, eukalipto kvapo eterinių aliejų komponentas, pasižymintis antiseptiniu, skausmą malšinančiu poveikiu, atsikosėjimą lengvinančiu poveikiu.
Tanacetum vulgare L. chemotipas, kuriame dominuoja 1,8-cineolis, dažniausiai aptinkamas centrinėje
Lietuvos dalyje. 1,8-cineolio koncentracija svyruoja nuo 14 % iki 24 %. Šio eterinio aliejaus komponento didesnė koncentracija aptinkama lapuose nei žieduose.
Trans-tujonas – ketonas, monoterpenas, įeinantis į daugelio eterinių aliejų sudėtį. Gali būti dviejų formų - α-tujonas ir β-tujonas. Tujonas yra GASR receptorių antagonistas, gali sukelti raumenų spazmus ir traukulius. Tujonas taip pat yra 5–HT3 receptorių antagonistas, sumažina jo aktyvumą. [19; 20]. Trans-tujono chemotipas aptinkamas vakarinėje Lietuvos dalyje, tačiau rečiau nei ankščiau minėti chemotipai. Tujono koncentracija augalo eteriniame aliejuje svyruoja 35-78 % [18].
Paprastosios bitkrėslės eteriniuose aliejuose randama net 40 skirtingų komponentų. Tai sudaro 89-99,6 % visos aliejaus sudėties. Eteriniuose aliejuose dominuoja oksiduoti monoterpenai, apytiksliai 55-91 % [12].
1 lentelė Dažniausiai aptinkami eteriniai aliejau T. vulgare
Eterinio aliejaus komponentas Formulė
Mirtenolis C20H22O 1,8-cineolis C10H18O2 Kamparas C10H16O Krisantenolis C10H16O Trans-tujonas C10H16O Borneolis C10H18O Terpinen-4-olis C10H18O
Pastebėti eterinio aliejaus, randamo skirtingose augalo dalyse, sudėties skirtumai. Žiedynai daugiau kaupia tujoną, krisantenoną ir terpinen-4-olį, nei lapai, toje pačioje natūralioje aplinkoje. Tuo tarpu 1,8-cineolio didesnis kiekis randamas aliejuje išskirtame iš augalo lapų [12].
1.3 Eterinių aliejų panaudojimas kaip pesticidų
Eteriniai aliejai plačiai naudojami kaip antimikrobinės, priešvirusinės, priešgrybelinės medžiagos, tačiau vis daugiau atliekama mokslinių tyrimų, siekiant panaudoti eterinius aliejus kaip insekticidines, repelentines priemones. Nors sintetiniai junginiai išlieka kaip daugiausiai vartojami įvairių repelentų ir insekticidų kūrime, tačiau vis didėjant vabzdžių atsparumui sintetiniams pesticidams, dažniau atsižvelgiant į aplinkos taršą, pradėta galvoti apie alternatyvius metodus, kontroliuojant kenkėjų paplitimą [21].
Vieni iš siūlomų metodų - eterinių aliejų panaudojimas. Atliekama vis daugiau tyrimų, nustatant įvairių augalų eterinių aliejų pagrindinius komponentus, veikliąsias medžiagas veikiančias vabzdžių gyvybingumą, vystymosi stadijas [21].
Moksliniais tyrimais siekiama pagrįsti eterinių aliejų naudojimą kaip pesticidines medžiagas žemės ūkyje prieš augalų kenkėjus. Siekiant sumažinti kenkėjų daromą žalą augalams, pastaruosius 50 metų buvo naudojami sintetiniai insekticidai. Tačiau sintetiniai insekticidai yra toksiški ir nepalankiai veikia aplinką: teršia dirvožemį, vandenį ir orą. Dėl plataus šių medžiagų vartojimo išsivystė kai kurių kenkėjų rūšių atsparumas. Atlikti tyrimai leido daryti išvadą, jog insekticidiniu aktyvumu pasižymėju 30 augalų šeimų. Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo Laminaceae šeimos augalai, kurių net 22 rūšys pasižymi insekticidiniu aktyvumu, Asteraceae šeimos – 17 rūšių augalų, Myrtaceae šeimos – 10 augalų rūšių, kitų 26 šeimų augalų mažiau nei 7 rūšys [22].
Tyrimais yra pagrįsta augalų, kaupiančių tam tikrus eterinius aliejus, naudojimas prieš augalų kenkėjus. Tam naudojami yra anyžiai (Pimpinella anisum L.), šalavijas (Salvia officinalis L.), pipirinė mėta (Menth apiperita L.), čiobrelis (Thymus vulgaris L.), rozmarinas (Rosmarinus officinales L.), eukaliptas (Eucalyptus globus L.) ir kt.[21]. Buvo įrodyta, kad šie augalai sumažina tam tikrų vabzdžių padėtų kiaušinėlių skaičių. Taip pat buvo įrodyta ir paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų aktyvumas prieš kopūstų kenkėjus bei Kolorado vabalus [23; 24].
Augalų eterinių aliejų, kurie pasižymi insekticidiniu aktyvumu, pagrindinis komponentas aptinkamas 1,8-cineolis, kiti taip pat dažnai randami komponentai – α-pinenas, β-pinenas, kamparas. Šie keturių junginių aktyvumas prieš vabzdžius buvo tirtas ir visi jie parodė aktyvumą prieš kenkėjus [25; 26; 27; 28].
Eteriniai aliejai plačiai naudojami ir veterinarijoje. Jie gali būti naudojami gyvūnams atbaidyti ir pritraukti. Taip pat veterinariniams vaistams, kaip alternatyva antibiotikams, po to kai 2006 metais Europos Sąjungoje buvo uždrausta antibiotikus naudoti gyvūnų pašaruose [23].
Keletas eterinių aliejų naudojami kaip repelentai arba kaip insekticidai ir panašiais tikslais. Pavyzdžiui, pipirinės mėtos (Mentha piperita L.) eterinis aliejus pasižymi repelentinėmis savybėmis, galinčiomis atbaidyti peles [29].
Iki šiol veiksmingiausiai ir plačiausiai naudojama apsauga nuo uodų ir mašalų yra DEET (N,N-dietil-m-toluamidas). Nepaisant dešimtmečius vykdomų mokslinių tyrimų, deja, veiksmingesnės alternatyvos šiam sintetiniam junginiui nėra atrasta. Tačiau šis junginys pasižymi daug pašalinių poveikių - kaip encefalopatijos vaikams, dilgėlinės sindromas, anafilaksija, hipotenzija ir sumažėjęs širdies susitraukimų dažnis [30].
Eteriniai aliejai vis plačiau naudojami ir kaip repelentai siekiant atbaidyti kraujasiurbius vabzdžius. Manoma, jog iš augalų išskirtos biologiškai veiklios medžiagos yra mažiau kenksmingos žmonių sveikatai nei sintetiniai junginiai. Šiuo metu žinoma daugiau nei 2000 augalų rūšių, pasižyminčių insekticidinėmis, repelentinėmis savybėmis. Šie augalai yra veiksmingos kovos su kenkėjais priemonės dėl didelio selektyvumo, neturi neigiamo poveikio netiksliniams organizmams, pasižymi mažu toksiškumu, ekologiški [31].
1.3.1 T. vulgare eteriniai aliejai, pasižymintys pesticidiniu aktyvumu
Didėjant vabzdžių atsparumui sintetiniams pesticidams, siekiama ištirti kuo įvairesnių augalų rūšių, galimai pasižyminčių insekticidinėmis savybėmis ir rasti alternatyvą sintetiniams repelentams [32].
Eterinių aliejų komponentai, pasak atliktų tyrimų, pasižymintys pesticidiniu aktyvumu, yra įvairūs. Dažniausiai naudojami ir aptinkami augaluose – 1,8-cineolis, kurio daugiausia aptinkama rosmarine, mentolis, timolis, eugenolis, kurio daugiausia randama kvapniajame gvazdikmedyje (Syzygium aromaticum), β-tujonas, terpinen-4-olis.
Tradiciškai buvo manoma, jog paprastoji bitkrėslė dėl savo stipraus aromato, pasižymi insekticidinėmis, antimikrobinėmis savybėmis. Atlikti tyrimai parodė, jog augalas kaupia eterinius aliejus, kurie pasižymi stipriu repelentiniu poveikiu. Stipriausiai ektoparazitus veikiantys eterinių aliejų komponentai, randami T. vulgare– 4-terpineolis, 1,8-cineolis, tujonas, bei 1-α-terpineolis [33].
2 lentelė T. Vulgare L. eteriniai aliejai, pasižymintys repelentiniu aktyvumu [33]
Eterinio aliejaus komponentas Repelentinis poveikis %
4-terpineolis 71,5
1-α-terpineolis 69,2
Mišinys (piperitonas, izoborneolis, borneolis,
trans-verbenolis,cis-jazmonas 1:1:1:1:1 ištirpintas n-heksane) 68,8 Borneolis 64,3 1,8-cineolis 70,4 Tujonas 70,0 Verbenolis 68,6 1-verbenonas 65,4
Atliktas mokslinis tyrimas, kurio metu buvo tiriama T. vulgare L. eterinių aliejų sudėtis ir aktyvumas prieš erkes, parodė, jog didžiausiu aktyvumu pasižymėjo 4-terpineolis ir 1,8-cineolis. Stipriu repelentiniu aktyvumu pasižymėjo tujonas, 1-α-terpineolis [33].
Atlikto tyrimo duomenimis, kuriame buvo tiriama Tanacetum vulgare L. eterinių aliejų cheminė sudėtis ir insekticidinis aktyvumas prieš A. diaperinus lervas, buvo nustatyta didelė koncentracija β-tujono, kamparo bei trans-krisantenolio. Šis tyrimas parodė T.vulgare L. lervacidinį poveikį [34].
1.4 Eterinių aliejų ekstrakcijos metodai
Egzistuoja įvairių ektrakcijos būdų. Klasikiniai ekstrakcijos metodai yra skysčių – skysčių ekstrakcija ir kietafazė ekstrakcija, taip pat mechaninė ekstrakcija tirpikliais, Soksleto ekstrakcija, ekstrakcija ultragarsu. Tai paprasti metodai, kuriems nereikalinga sudėtinga aparatūra, tačiau jie užima daug laiko bei reikalingi dideli tirpiklių tūria [16].
Pastaruoju metu ekstrakcijos metodai patobulinti, sukurta naujų metodų – ekstrakcija mikrobangų pagalba, ekstrakcija superkritiniais skysčiais bei pagreitinta ekstrakcija tirpikliais. Šiems metodams naudojama mažesni tirpiklių kiekiai. Šie išskyrimo metodai yra ir žymiai greitesni.
Naudojami eterinių aliejų ekstrakcijos metodai: Superkritinių skysčių ekstrakcija; Distiliacija vandens garais; Ekstrakcija organiniais tirpikliais;
Mechaninis metodas (šalto spaudimo ekstrakcija); Kietafazė mikroekstrakcija;
Ekstrakcijos metodo pasirinkimas priklauso nuo augalinės žaliavos morfologinių- anatominių ypatumų, eterinio aliejaus kiekio ir sudėties bei panaudojimo.
Išskyrus citrusinius vaisius, kurių eteriniai aliejai yra išgaunami šaltojo spaudimo metodu, visi kiti eteriniai aliejai gali būti išgaunami distiliuojant, superkritinių skysčių ekstrakcijos būdu ar ekstrakcijos organiniais tirpikliais metodu [35].
1.4.1 Ekstrakcija superkritiniais skysčiais
Analizės tikslams superkritiniai skysčiai pirmąkart buvo panaudoti 1981 m., o po keleto metų ekstrakcija superkritiniais skysčiais (ESS) buvo komercializuota. Šiuo metodu ekstrahuojama iš kietų matricų [36].
ESS ekstrahuojanti medžiaga yra savo superkritinėje būsenoje. Superkritiniai skysčiai turi unikalias savybes — tarpinę būseną tarp dujų ir skysčių, tai priklauso nuo slėgio, temperatūros ir skysčio sudėties. Skystis yra superkritiniame būvyje, kai tiek jo temperatūra, tiek slėgis yra virš jų kritinio taško [37; 38]. Virš kritinio taško esant vienam iš parametrų skystis yra subkritiniame būvyje. Kai temperatūra yra aukštesnė už kritinę, didinant slėgį dujos nebeskystėja, bet suspaudžiamos į superkritinį skystį. Kritinis taškas kiekvienai konkrečiai medžiagai yra specifinis [37].
ESS dažniausiai naudojamas anglies dioksidas (CO2) superkritiniame būvyje. CO2 chemiškai inertiškas, pigus, netoksiškas, nedegus ir turi lengvai pasiekiamą kritinį tašką. Žema kritinė temperatūra leidžia atlikti ekstrakciją švelniomis sąlygomis. Be to, CO2 atmosferos slėgyje išgaruoja, todėl netrukdo tolimesnei analizei. Dėl šių priežasčių CO2 yra įprastinis ESS tirpiklis.
Pagrindinės ESS sistemos dalys: siurblys, ištraukimo kamera, kurioje bandinys yra veikiamas tam tikru slėgiu ir temperatūra, surinkimo gaudyklė, rezervuaro — šerdis, surinkimo rezervuarai.
2 pav. Ekstakcinės sistemos superkritiniais skysčiais principinė schema [39].
Ekstrakcijai naudojamos dujos, kurios aukštu spaudimu ir slėgiu paduodamos į siurblį, sukuriant superkritinį skystį. Skirstymui skirta žaliava talpinama į rezervuarą, kuris kontaktuoja su superkritiniu skysčiu. Komponentai, gerai tirpstantys pasirinktame tirpiklyje, yra perkeliami į surinkimo gaudyklę, ten jie kondensuojasi, mažėja tirpiklio tankis. Toks tankis yra pasiekiamas, keliant temperatūrą, esant pastoviam slėgiui arba mažinant slėgį, esant pastoviai temperatūrai.
ESS privalumai - procesas vykdomas švelniomis sąlygomis, bet greitas, galima išekstrahuoti medžiagas, jautrias aukštai temperatūrai. Tačiau šiam metodui reikalinga speciali sudėtinga technologija, brangi įranga [38].
1.4.2 Distiliacija vandens garais
Distiliacija vandens garais arba hidrodistiliacija – tai vienas iš seniausių ekstrakcijos metodų, tačiau ir vienas iš efektyviausių, siekiant išgauti eterinį aliejų. Tai labiausiai paplitęs eterinių aliejų išskyrimo būdas. Hidrodistiliacija naudojama tuomet, kai žaliavoje yra didelis eterinių aliejų kiekis ir jis nekeičia savo savybių bei sudėties, veikiant temperatūrai [40].
Hidrodistiliacijos privalumas yra tai, kad naudojamas pigus tirpiklis – vanduo. Šiam ekstrakcijos būdui naudojami paprasti įrenginiai. Svarbiausias privalumas yra tas, kad gaunamas švarus eterinis aliejus [40].
Kaip jau minėta, distiliacijos vandens garais aparatūra nėra sudėtinga, jis sudaryta iš keleto dalių. Tai yra apvaliadugnės (500-1000 ml), ilgakaklės kolbos, šaldytuvo (kondensatoriaus), rinktuvo bei jungiamųjų vamzdelių ir žarnelių [40].
3 pav. Distiliacijos vandens garais aparatūra
Distiliuojant vandens garais, augalinė žaliava sudedama į apvaliadugnę kolbą, įpilamas tam tikras tūris distiliuoto vandens bei prijungiamas šaldymo įrenginys. Tuomet mišinys kolboje yra šildomas ir, jį sudarantys junginiai, paeiliui, virimo temperatūros didėjimo tvarka, iš skysčio pereina į garus, kurie, patekę į kondensatorių, vėl virsta skysčiu, o jis surenkamas į rinktuvą.
Distiliacija vandens garais nėra sudėtinga, tačiau užima daug laiko.
1.4.3 Ekstrakcija organiniais tirpikliais;
Kai kurių augalų lakiųjų medžiagų kiekiai yra labai maži arba labai nestabilūs, veikiant karščiui. Dėl šių priežasčių šių augalų eterinių aliejų išgavimui netinka hidroditiliacijos metodas. Tokiu atveju dažniausiai naudojamas eterinių aliejų ekstrahavimo metodas – ekstrakcija organiniais tirpikliais.
Tai plačiai naudojama technologija, kuri yra paprasta, efektyvi ir plačiai pritaikoma. Paprastai naudojami tirpikliai: metanolis, etanolis, heksanas, benzenas ar toluenas.
Atliekant ekstrakciją organiniais tirpikliais, medžiaga susmulkinama ir sumaišoma su tirpikliu. Tirpiklio pasirinkimas priklauso nuo ekstrahuojamų medžiagų charakteristikų, tirpiklio kainos. Tirpiklis su jame ištirpusia ekstrahuojama medžiaga vadinamas micele.
Skiriama keletas metodikų, kaip atlikti ekstrakcijas organiniais tirpikliais: maceracija, perkoliacija, reperkoliacija, priešsrovinė ekstrakcija. Maceracijos metu žaliava išmirkoma tirpiklyje nuolat maišant ir tada tirpiklis nugarinamas. Likusi micelė iš augalinės žaliavos pašalinama, panaudojant centrifugavimą. Atliekant perkoliaciją, augalinė žaliava sudrėkinama tirpikliu, išbrinkinama, perkeliama į perkoliacijos kamerą. Žaliava pakartotinai plaunama tirpikliu, kol pašalinamos visos veikliosios medžiagos. Priešsrovinė ekstrakcija — efektyvus ekstrakcijos procesas, kur tirpiklis kitaip nei maceracijos ar perkoliacijos metodu teka kryptimi, priešinga augalinei žaliavai.
1.4.4 Mechaninis metodas (šalto spaudimo ekstrakcija)
Ekstraktai mechaniniu metodu išgaunami iš augalų, kaupiančių didelį kiekį eterinių aliejų. Dažniausiai šis metodas naudojamas citrusinių vaisių eterinių aliejų gamyboje. Metodas atliekamas nulupus vaisiaus žievę, ji susmulkinama ir sumaišoma su nedideliu kiekiu vandens ir gauta masė spaudžiama. Svarbiausia sąlyga tam, kad ekstrahuotųsi kokybiškas eterinis aliejus – žema temperatūra. Esant aukštai temperatūrai lakieji junginiai gali pradėti irti [16].
1.4.5 Kietafazė mikroekstrakcija.
Kietafazė mikroekstrakcija (KFME) – ganėtinai naujas ir perspektyvus metodas. Šio metodo privalumai - nereikalinga sudėtinga aparatūra bei tirpikliai. KFME plačiai taikoma dujų chromatografinėje analizėje [41].
KFME paremta analičių pasiskirstymu tarp mėginio ir ekstrakcinės sistemos dangos. Po ekstrakcijos mėginys desorbuojamas ir pasirinktu metodu analizuojamas.Ekstrakcijai yra naudojamas specialus prietaisas, kurį sudaro kvarcinis strypelis, padengtas polimeriniu sorbentu, stūmoklis, įtaisytas nerūdijančio plieno adatoje, kuri tvirtinama prie prietaiso korpuso [41].
1.4.6 Eterinių aliejų ekstrakcijos metodų palyginimas
Išanalizavus mokslinius straipsnius, kuriuose buvo tirta paprastosios bitkrėslės (T. Vulgare L.) eterinių aliejų cheminė sudėtis, galima daryti išvadą, jog eterinių aliejų komponentų sudėčiai gali turėti ekstrakcijos metodas. Dažniausiai pasirinktas metodas – hidrodistiliacija. Ekstrahuojant hidrodistiliacijos metodu pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai – kamparas, tujonas, borneolis,
trans-krisantenilio acetatas.
Paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų ekstrakcijai taip pat taikomas metodai – ekstrakcija organiniais tirpikliais (metanoliu, n-heksano). Taip pat atliekama ekstrakcija superkritiniais skysčiais.
3 lentelė T. vulgare L. eterinio aliejaus cheminės sudėties analizės, taikant skirtingus ekstrakcijos metodus Straipsnio Nr. Pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai Eterinio aliejaus komponento koncentracija (%) Ektrakcijos
metodas Analizės metodas
[42] Tujen-2-onas 13,66 Hidrodistiliacija DC-MS Krisantenilio acetatas 13,18 Artemisia ketonas 6,66 Kamparas 4,75 -tujonas 3,07 [18] kamparas 36,38 Hidrodistiliacija 2,5 val. DC-MS 1,8-cineolis 18,42 Borneolis 7,21 Krisantenilio acetatas 6,08 [43] Trans-karvyl acetatas 21,85 Ekstrakcija n-heksanu DC-IO -tujonas 19,7 Kamparas 22,95 [44] kamparas 16,25 Hidrodistiliacija DC-IO -tujonas 14,63 borneolis 9,02 [45] Mirtenolis 17,7 Ekstrakcija superkritiniais skysčiais DC-MS Borneolis 16,4 1.8-cineolis 9,3 [45] 1,8-cineolis 18,2 Hidrodistiliacija DC-MS Mirtenolis 10,3 trans-tujonas 9,0 [46] Kamparas 69,4 Ekstrakcija metanoliu DC-MS 1,8-cineolis 8,07 -tujonas 9,53 Artemisia ketonas 6,24
Atliktas mokslinis tyrimas, kuriame buvo lyginta toje pačioje aplinkoje augančios paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų komponentų sudėtis, naudojant skirtingus ekstrakcijos metodus – ekstrakciją superkritiniais skysčiais bei hidrodistiliaciją. Tyrimo metu buvo nustatyta, jog eterinio
aliejaus komponentai, juos išgaunant skirtingais ekstrakcijos metodais, skiriasi. ESS ekstraktuose pagrindiniai komponentai - mirtenolis, borneolis bei 1,8-cineolis, hidrodistiliacijos metodu išgautuose eteriniuose aliejuose dominuoja – 1,8-cineolis, mirtenolis bei trans-tujonas bei didesnė koncentracija aptikta kamparo ir cis-krisantenolio [45].
1.5 Dujų chromatografija-masių spektrometrija
Dujų chromatorafija – chromatografinis fizikocheminės analizės būdas, kurį taikant naudojama judančioji fazė yra dujos. Dujų chromatografija pagrįsta skirtinga dujų ar garų mišinio sudedamųjų dalių adsorbcija pasirinkto adsorbento paviršiuje. Dujų chromatografija plačiai taikoma fitochemijoje [42].
Atliekant dujų chromatografiją kolonėlė, pripildyta kieta nejudančia faze, nuolat praplaunama inertinėmis dujomis. Tai vadinamos nešančiosios dujos. Po to nedidelis kiekis analizuojamojo dujų mišinio, susidedančio iš kelių ar keliolikos komponentų, įleidžiamas į nešančiųjų dujų srautą kolonėlės pradžioje. Dėl adsorbcijos ir desorbcijos vyksmų kolonėlėje analizuojamas mišinys atskiriamas į sudedamąsias dalis. Adsorbcijos pobūdis ir adsorbuotos medžiagos kiekis labai priklauso nuo adsorbuojamos medžiagos kilmės ir koncentracijos, adsorbento pirminio paruošimo, jo aktyvaus paviršiaus ploto ir sandaros. Liečiantis dujoms (garams) ir adsorbentui, nusistovi dinaminė adsorbcinė pusiausvyra, kurią lemia molekulių sorbcijos ir desorbcijos sparta. Kolonėlėje medžiagos pasiskirsto zonomis. Pasiskirstymo pobūdis rodo mišinio komponentų reliatyvų išsidėstymą pagal gebėjimą adsorbuotis [44; 45].
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODIKA
2.1 Tyrimų objektas
Paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) žiedai ir lapai, rinkti 4 skirtinguose Lietuvos regionuose, žydėjimo metu 2015 m. rugpjūčio mėnesį bei 2016 m. rugpjūčio mėnesį.
1. Ringaudų km., Kauno raj. 2. Prūselių km., Šakių raj. 3. Gargždai, Klaipėdos raj. 4. Vytėnų km., Jurbarko raj.
Augalinė žaliava buvo džiovinta gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinta medžiaga buvo laikoma ne aukštesnėje kaip 25oC temperatūroje, sausoje, gerai vėdinamoje vietoje.
2.2 Reagentai
1. Metanolis(≥99,8% Sigma-Aldrich, Izraelis); 2. Petrolato eteris (Sigma-Aldrich, Izraelis); 3. Heksanas (Sigma-Aldrich, Izraelis).
2.3 Įranga
Eterių aliejų komponentams nustatyti buvo naudojamas GCMS-QP2010 Ultra dujų chromatografas su masių spektrometru (Shimadzu, Japonija). Naudotas automatins injektorius AOC-5000 (Shimadzu, Japonija), valdantis švirkštą su pluošteliu.
Vaistinės augalinės žaliavos ekstrakcijai buvo naudojamas Clevenger aparatas. Kaitinimo šaltinis –glicerolio vonia (Heidolph, Vokietija).
Vandens gamybai buvo naudojama MILIPORE (Darmstadt, Vokietija) vandens gryninimo sistemą.
Medžiagų pasvėrimui buvo naudojamos Shimadzu AUW120D analitinės svarstyklės (Bellingen, Vokietija).
Žaliavos malimui buvo naudojamas D-47906 Clatronic (Kempen, Vokietija) laboratorinis malūnėlis.
2.4 Tyrimų metodai
2.4.1 Tiriamojo pavyzdžio ruošimas
Tiriamojo pavyzdžio paruošimas buvo atliekamas dviem būdais. Pirma pasirinktas ekstrakcijos metodas - ekstrakcija metanoliu, antras – distiliacija vandens garais.
2.4.1.1 Ekstrakcija metanoliu.
2 g džiovintų Tanacetum vulgare L. žiedų sutrinami grūstuvėje ir perkeliami į centrifūginius mėgintuvėlius, kuriuose buvo įpilta 5ml metanolio. Plakama 1 valandą, tuomet centrifuguojama, o centrifūgatas perkeliamas į kitą mėgintuvėlį. Taip ekstrahuojama metanoliu 3 kartus. Į metanolinį ekstraktą įpilama apie 1 ± 2 ml sotaus natrio chlorido tirpalo ir 7ml petrolato eterio ir tuomet tirpalas išskiriamas į dvi fazes. Viršutinis sluoksnis, kuriame yra petrolato eterio nupipetuojamas į kolbą ir džiovinamas su bevandeniu natrio sulfatu tamsoje 1-3 dienas. Natrio chlorido ir petrolato eterio pridėjimas bei džiovinimas vykdomas 2 kartus. Išdžiovintas ekstraktas filtruojamas ir garinamas iki 1ml ir laikomas 2ml buteliukuose 4-8oC temperatūroje tamsoje iki analizės.
2.4.1.2 Distiliacija vandens garais
30 g džiovintų Tanacetum vulgare L. žiedų susmulkinama ir supilama į 1l apvaliadugnę kolbą. Užpilama 500ml distiliuoto vandens ir prijungiama prie distiliacijai vandens garais naudojamo Klevengerio aparato. Kolba kaitinama ant glicerolio vonios, palaikant 1000C temperatūrą apie 2-2,5 val., kol išsiskirs eterinis aliejus. Eterinis aliejus surenkamas ir laikomas tamsoje iki analizės.
2.4.2 Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos
metodu
Eterinio aliejaus cheminei analizei pasirinkta distiliacija vandens garais, nes šis metodas yra efektyvesnis, tikslesnis, nei kiti eterinio aliejaus ekstrakcijos metodai, taip pat nereikia naudoti papildomų reagentų.
Eterinių aliejų komponentų analizė buvo atliekama dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu.
Ekstrakcijai atsveriama vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto ir patalpinama į stiklinį buteliuką, kuris turi kamštį su ertme adatai įleisti. Eterinio aliejaus išsiskyrimui bandinys termostatuojamas 50 oC temperatūroje. Terminė desorbcija atliekama 260 oC temperatūroje 2min.
Dujų chromatografijos metodo sąlygos: pradinė kolonėlės temperatūra 50 oC, injektoriaus temperatūra 260 oC, jonų srauto temperatūra 200 oC, sąsajos temperatūra 280 o
C. Injekcija atliekama split 60.0 metodu. Temperatūra keliama palaipsniui nuo 50 oC iki 200 oC 2 oC/min, nuo 200 oC iki 315 o
C 15 oC/min ir palaikoma 1 min. Bendras vieno bandinio analizės laikas 98 min.
Paprastosios bitkrėslės eterinių aliejų komponentų identifikavimas atliktas NIST Massspectral programa analizuojant masių spektrus.
4 lentelė Masių spektrometrijos detektoriaus sąlygos
Jonų srauto temperatūra (0C) Interferencnė temperatūra (0 C) Tirpiklio išėjimo laikas (min) Analizės laikas (min) Skanavimo greitis Pradžia m/z Pabaiga m/z 200 280 2.00 98.00 2500 29.00 500.00
2.4.3 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant MS Excel 2010 (Microsoft, JAV), išvestas matematinis vidurkis ir santykinis standartinis nuokrypis.
3. REZULTATAI I.R JŲ APTARIMAS
3.1 Eterinių aliejų sudėties identifikavimas
Atlikus dujų chromatografijos-masių spektrometrijos analizę, buvo nustatyti paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) eterinio aliejaus komponentai.
Buvo tirta skirtingose augavietėse augančių paprastųjų bitkrėslių žiedai ir lapai. Žaliava rinkta skirtinguose Lietuvos regionuose:
5 lentelė Tyrime naudota T. vulgare L. žaliava, rinkta skirtinguose Lietuvos regionuose
Žiedai Lapai Rinkimo laikas
Ringaudai, Kauno raj. Ž1 L1 2016 rugpjūčio mėn.
Prūselių km., Šakių raj. Ž2 L2 2015 rugpjūčio mėn.
Gargždai, Klaipėdos raj. Ž3 L3 2015 rugpjūčio mėn. Vytėnų km., Jurbarko raj. Ž4 L4 2016 rugpjūčio mėn.
Paveikslėlyje pateikta paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) žiedų chromatogramos pavyzdys. Žaliava rinkta Prūselių km., Šakių raj. 2015 m. rugpjūčio mėnesį. Eteriniai aliejai išgauti hidrodistiliacijos metodu.
4 pav. Paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) rinktos Prūselių km., Šakių raj. eterinių aliejų išgautų hidrodistiliacijos metodu DC-MS chromatograma
Pateiktoje chromatogramoje matyti dominuojantis eterinio aliejaus komponentas (12) – kamparas, kurio koncentracija šiame mėginyje 42,14 %.
6 lentelė Nustatyti eterinio aliejaus komponentai T. vulgare L. mėginiuose
ETERINIS ALIEJUS Ž1 L1 Ž2 L2 Ž3 L3 Ž4 L4 Santolinatrenas + + -pinenas + + + + -pinenas + + + + Yamogi alkoholis + p-cimenas + + + Eukaliptolis + + + + + + + γ-terpinenas + -tujonas + + + + Kamparas + + + + + + cis-krisantenolis + + + + Terpinen-4-olis + + + + -terpineolis + + + Krisantenilio acetatas + + (-)-mirtenolis + + + + -ocimenas + + + N,N'-Bis(2,6-dimethyl-6-nitrosohept-2-en-4-one) + + + Artemisia alkoholis + + Mirtenalis + cis-dihidrokarvonas + + cis-krisantenolio acetatas + + + Bornylio acetatas + + + + + Kamfenas + + + Sabinenas + + -tujonas + + + + Krisantenonas + + + + + + T-Muurololis + + + + δ-kadinenas + + Filifolonas + + Pinokarvonas + 3-karen-5-onas + + γ-amorfenas +
6 lentelėje pateikti pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai, kurių koncentracija pagal bendrą smailių plotą tirtuose bandiniuose buvo didesnė nei 2 % ir kurie buvo nustatyti augalo žieduose bei lapuose rinktuose skirtingose augavietėse.
Eteriniame aliejuje daugiausia nustatyta monoterpenų, mažiau seskviterpenų. Nustatyti dominuojantys eterinio aliejaus komponentai – kamparas,eukaliptolis (1,8-cineolis), krisantenolis, -pinenas, -pinenas, terpinen-4-olis,-terpineolis, -tujonas. Šie komponentai mažesniais ar didesniais kiekiais aptikti visuose bandiniuose.
Palyginus eterinio aliejaus komponentų kiekius žieduose pagal bendrą smailių plotą didžiausiu kiekiu pasižymėjo Gargžduose, Klaipėdos raj. rinkta žaliava.
5 pav. Eterinio aliejaus kiekis T. vulgare L. žieduose pagal bendrą smailių plotą skirtinguose Lietuvos regionuose
Gargžduose Klaipėdos raj. rinktoje žaliavoje iš viso nustatyti 43 junginiai. Bendras smailių plotas 229,27 x 107. Prūselių kaime, Šakių raj., rinktoje žaliavoje žieduose identifikuoti 44 skirtingi junginiai. Bendras smailių plotas 157,65 x 107. Ringauduose, Kauno raj. bei Vytėnuose, Jurbarko raj. rinktos žaliavos žiedų eterinio aliejaus chromatogramų bendri smailių plotai labai skiriasi nuo Gargžduose ir Prūseliuose rinktos žaliavos. Ringauduose, Kauno rajone rinktoje žaliavoje nustatyta 38 junginiai, bendras smailių plotas 76,89 x 107. Mažiausiai eterinio aliejaus komponentų nustatyta Vytėnų km., Jurbarko raj. rinktoje žaliavoje. Iš viso identifikuoti 35 junginiai, bendras smailių plotas 80,36 x 107. 76,89 157,65 229,27 80,36 0 50 100 150 200 250 Ringaudų km., Kauno raj.
Prūselių km., Šakių raj. Gargždai, Klaipėdos raj. Vytėnų km., Jurbarko raj. B e n d ras sm ai lių p lo tas x 10 7
Išanalizavus ir eterinio aliejaus kiekius augalinės žaliavos lapuose pagal bendrą smailių plotą didžiausiu kiekiu pasižymėjo Prūselių kaime, Šakių raj. rinkta žaliava.
6 pav. Eterinio aliejaus kiekis T. vulgare L. lapuose pagal bendrą smailių plotą skirtinguose Lietuvos regionuose
Prūselių km., Šakių raj., rinktoje augalinėje žaliavoje identifikuota 43 junginiai, bendras smailių plotas 122,57 x 107. Gargžduose rinktos augalinės žaliavos eteriniame aliejuje identifikuoti taip pat 43 junginiai, kaip ir Šakių raj. rinktoje žaliavoje, tačiau bendras smailių plotas šiek tiek mažesnis – 101,83 x 107. Mažiau eterinio aliejaus komponentų aptikta Jurbarko raj. Vytėnų km. bei Kauno raj., Ringauduose rinktoje augalinėje žaliavoje. Atitinkamai 33 ir 39 identifikuoti junginiai, bendras smailių plotas 36,06 x 107
ir 54,49 x 107.
Skirtingas nustatytų junginių kiekis priklauso nuo identifikuojamo junginio koncentracijos žaliavoje.
Lyginant eterinių aliejų komponentų kiekį skirtinguose augalo dalyse – žieduose ir lapuose, matome, kad žiedai pasižymi didesniu eterinio aliejaus kiekiu bei žieduose identifikuota daugiau skirtingų junginių. Palyginimui Šakių raj. rinktos augalinės žaliavos žiedų ir lapų chromatogramos
54,49 122,57 101,83 36,05 0 20 40 60 80 100 120 140 Ringaudų km., Kauno raj.
Prūselių km., Šakių raj. Gargždai, Klaipėdos raj. Vytėnų km., Jurbarko raj. B e n d ras sm ai lių p lo tas x 10 7
parodė, jog žieduose esančiame eteriniame aliejuje identifikuota 44 junginiai, bendras smailių plotas 35,49 x 106, tuo tarpu lapuose identifikuota junginių – 43, bendras smailių plotas – 25,95 x 106.
Išanalizavus bandinius, nustatyti vyraujantys komponentai. Pastebėta, jog žieduose ir lapuose eteriniame aliejuje vyraujantys komponentai skiriasi. Žieduose vyraujantys komponentai – kamparas, 1,8-cineolis, krisantenolis, terpinen-4-olis,krisantenonas, T-murololis.
7 pav. T. vulgare L. žieduose vyraujantys eterinio aliejaus komponentai
Palyginus dominuojančius eterinio aliejaus komponentus augalinės žaliavos bandiniuose, kaip matome 7 paveikslėlyje pagrindinis vyraujantis komponentas visuose – kamparas, jo koncentracija svyruoja nuo 13,53% iki 42,14 % visų identifikuotų junginių. Daugiausia šio komponento aptikta Šakių raj. Prūselių km. rinktoje augalinėje žaliavoje – 42,14 % visų komponentų. Mažiausiai kamparo aptikta Ringauduose, Kauno raj. rinktoje žaliavoje. Taip pat nustatyta didelis kiekis cis-krisantenolio, kuris yra vyraujantis eterinio aliejaus komponentas Ringaudų km., Kauno raj., rinktuose paprastosios bitkrėslės žieduose – 25,41%. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ringaudų km., Kauno raj. Prūselių km., Šakių raj. Gargždai, Klaipėdos raj. Vytėnų km., Jurbarko raj.
Išanalizavus paprastosios bitkrėslės lapų chromatogramas nustatyti vyraujantys eterinio aliejaus komponentai skiriasi nuo žieduose vyraujančių komponentų. Tirto augalo lapų eteriniuose aliejuose vyrauja 1,8-cineolis, kamparas, cis-krisantenolis, krisantenonas, mirtenolis, -ocimenas, -tujonas, bornylio acetatas.
8 pav. T. vulgare L. lapuose vyraujantys eternio aliejaus komponentai
Kaip matyti 8 paveikslėlyje lapuose daugiausia nustatyta komponento 1,8-cineolio. Šio eterinio aliejaus komponento koncentracija bandiniuose svyruoja nuo 3,83 % iki 28,56%. Daugiausia šio komponento aptikta Vytėnų km., Jurbarko raj. rinktoje augalinėje žaliavoje. Kaip ir žieduose, taip ir lapuose daug aptikta kamparo, kurio daugiausia nustatyta Gargžduose, Jurbarko raj., rinktoje augalinėje žaliavoje – 20,91%. Ringauduose, Kauno raj. rinktoje žaliavoja daug aptikta -ocimeno bei cis-krisantenolio, atitinkamai 17,74% ir 16,73 %. 0 5 10 15 20 25 30
Ringaudų km., Kauno raj. Prūselių km., Šakių raj. Gargždai, Klaipėdos raj. Vytėnų km., Jurbarko raj.
Išanalizavus pagrindinius komponentus dominuojančius Tanacetum vulgare L. eteriniuose aliejuose ir palyginus jų koncentracijas žieduose ir lapuose, pasitvirtina duomenys atlikto tyrimo A. Judžentienės ir kt. (2003), jog skirtingoses T. vulgare L. augalo dalyse dominuojantys eterinio aliejaus komponentai skiriasi. A. Judžentienė teigia, jog žieduose kaupiama daugiau kamparo, krisantenono, terpinen-4-olio, o lapuose daugiau nustatoma 1,8-cineolio.
9 pav. T. vulgare žieduose ir lapuose dominuojantys eterinio aliejaus komponentai
Kaip matome 9 paveikslėlyje, šiame tyrime nustatyta, jog žieduose didesnė koncentracija aptinkama kamparo 26,54%, kai tuo tarpu lapuose – 8,77%, cis-krisantenolio žieduose – 4,75%, lapuose – 8,01%. Krisantenono ir terpinen-4-olio koncentracijos žieduose ir lapuose šio tyrimo duomenimis panašios, krisantenono žieduose nustatyta 4,46%, lapuose – 4,31%, terpinen-4olio žieduose – 3,35%, lapuose - 2,16%. Lapuose didesnė koncentracija, nei žieduose nustatyta 1,8-cineolio. Atitinkamai 17,26% ir 5,62%. 0 5 10 15 20 25 30 5,62 26,54 14,75 4,46 3,35 17,26 8,77 8,01 4,31 2,16 Žiedai Lapai
Pasak tyrimo, atlikto Estijoje Palsson K. ir kt. (2008), kuriame buvo tirta T. vulgare L. eterinio aliejaus komponentų cheminė analizė ir jų repelentinis aktyvumas prieš erkes, buvo nustatyta, jog repelentiniu aktyvumu labiausiai pasižymėjo terpinen-4-olis, α-terpineolis, borneolis, 1,8-cineolis, tujonas, verbenolis, verbenonas. (2)
Išanalizavus eterinio aliejaus komponentus, kurie nustatyti Lietuvoje augančios T. vulgare L., kaip matome 10 paveikslėlyje, didžiausias kiekis repelentiniu veikimu pasižyminčio T. vulgare L. eterinio aliejaus komponento randama 1,8-cineolio.
10 pav. T. vulgare L. eterinio aliejaus komponentai, pasižymintys didžiausiu repelentiniu aktyvumu
Lietuvoje augančios T. vulgare L. eteriniame aliejuje 1,8-cineolio koncentracija nustatyta 11,44%. Pasak Palsson ir kt. (2008) tyrimo šis komponentas pasižymi 70,4% aktyvumu prieš erkes. Taip pat didelis kiekis nustatyta α-tujono ir β-tujono, α-terpineolio bei terpinen-4-olio.
2,76 3,44 11,44 0,17 2,12 3,71 0,1 0,41 0 2 4 6 8 10 12 14
Palyginus repelentiniu aktyvumu pasižyminčių T. vulgare L. eterinių aliejų komponentų koncentracijas žieduose ir lapuose, matoma, jog repelentiniu aktyvumu pasižyminčių komponentų koncentracijos lapuose didesnės nei žieduose.
11 pav. T. vulgare L. lapuose ir žieduose nustatyti eterinio aliejaus komponentai, pasižymintys didžiausiu repelentiniu aktyvumu
Lyginant T. vulgare L. žiedų ir lapų eterinių aliejų komponentų, pasižyminčių repelentiniu aktyvumu koncentracijas, 11 paveikslėlyje matome, jog 1,8-cineolio augalo lapai kaupia daugiau, attinkamai 17,26% ir 5,62%. Lapai pasižymi ir didesne koncentracija β-tujono, lapuose nustatyta 5,31%, žieduose – 2,1%.
3.2 Rezultatų aptarimas
Šiame tyrime buvo atlikta paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) eterinių aliejų cheminės sudėties analizė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu. Augalinė žaliava buvo rinkta skirtinguose Lietuvos regionuose ir palyginta jų eterinių aliejų sudėtis.
Atlikto tyrimo duomenimis, daugiau eteriniuose aliejuose komponentų nustatyta monoterpenų nei seskviterpenų. Tai patvirtina ir atlikti tyrimai D. Mockutės ir A. Judžentienės (2005) bei Piras A. ir kt. (2014) nustatė, jog monoterpenų T. vulgare L. eteriniuose aliejuose aptinkama 55-94% [45].
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2,83 1,92 5,62 0 2,42 2,1 0,15 0,2 2,68 1,52 17,26 0,34 1,82 5,31 0 0,62 Žiedai Lapai
Atlikto tyrimo metu buvo nustatyta skirtinguose Lietuvos regionuose rinktos augalinės žaliavos eterinio aliejaus komponentai ir palygintas bendras jų kiekis pagal bendrą smailių plotą žieduose ir lapuose. Nustatyta, jog žieduose nustatytas eterinis aliejus pagal bendrą smailių plotą didžiausias buvo Gargžduose, Klaipėdos raj. rinktoje augalinėje žaliavoje – 229,27 x 107
. Nustatyti ir identifikuoti 43 skirtingi junginiai. Lapuose nustatytas eterinio aliejaus kiekis didžiausias Šakių raj. Prūselių km. rinktoje augalinėje žaliavoje. Bendras smailių plotas – 122,57 x 107
. Nustatyta ir identifikuota 43 skirtingi junginiai.
Išanalizavus tyrimo metu gautus duomenis, buvo nustatyti pagrindiniai dominuojantys eterinio aliejaus komponentai T. vulgare L. žieduose – kamparas, 1,8-cineolis, cis-krisantenolis, terpnen-4-olis, krisantenonas bei T-murololis. Daugiausia žieduose nustatyta – kamparo, kurio koncentracija svyruoja nuo 13,53% iki 42,14%. Augalo lapuose vyraujantys eterinio aliejaus komponentai – 1,8-cineolis, kamparas, cis-krisantenolis, krisantenonas, mirtenolis, -ocimenas, -tujonas, bornilio acetatas. Lapuose daugiausiai aptinkama 1,8-cineolio, kurio koncentracija svyruoja nuo 3,83% iki 28,56%.
Lyginant lapų ir žiedų eterinių aliejų kompozicijas,šiame tyrime gauti rezultatai patvirtina, tyrimo atlikto D. Mockutės ir A. Judžentienės, kurio metu buvo tirta Lietuvoje augančios T. vulgare L. žiedų eterinių aliejų cheminė sudėtis ir lyginta su lapuose kaupiamo eterinio aliejaus sudėtimi. Pasak D. Mockutės ir kt. (2005), žiedynai daugiau kaupia kamparą, krisantenoną ir terpinen-4-olį, nei lapai toje pačioje natūralioje aplinkoje. Tuo tarpu 1,8-cineolio didesnis kiekis randamas aliejuje, išskirtame iš augalo lapų.
Kito atlikto tyrimo Lietuvoje Piras A. ir kt (2014), kuriame taip pat nagrinėta Lietuvoje augančios T.vulgare L. eterinių aliejų sudėtis, nustatyta, jog žieduose eterinių aliejų didžiausios koncentracijos aptikta mirtenolio, borneolio, 1,8-cineolio, cis-krisantenolio, epi-α-muurololio, kamparo, tujono.
Išanalizavus tyrimo metu gautus duomenis ir palyginus eterinio aliejaus komponentų, pasižyminčių didžiausiu repelentiniu aktyvumu, nustatyta, jog Lietuvoje auganti T. vulgare L. kaupia didelį kiekį 1,8-cineolio. Šio komponento nustatyta vidutiniškai – 11,44%. Pasak Palsson ir kt. (2008) tyrimo duomenimis šis komponentas pasižymi didžiausiu repelentiniu aktyvumu. Taip pat didelėmis koncentracijomis nustatyta -tujono, -tujono, terpinen-4-olio, 1--terpineolio, mažesniais kiekiais – verbenolio, verbenono, timolio. Palyginus šių eterinių aliejų komponentų koncentracijas T. vulgare L. žieduose ir lapuose, matoma, jog 1,8-cineolio, -tujono, timolio, verbenolio lapuose kaupiama daugiau, tačiau terpinen-4-olio, 1--terpineolio, -tujono bei verbenono didesnės koncentracijos nustatytos augalo žieduose.
IŠVADOS
1. Cheminė eterinių aliejų sudėtis paprastosios bitkrėslės (Tanacetum vulgare L.) augalinėje žaliavoje buvo nustatyta dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu. Eterinio aliejaus ekstraktai gauti vandens garų distiliacijos metodu.
2. Įvertinus eterinių aliejų sudėtį augalinėje žaliavoje, rinktoje skirtinguose Lietuvos regionuose buvo nustatyta, jog daugiausiai eterinių aliejų identifikuota Klaipėdos raj. ir Šakių raj. rinktoje augalinėje žaliavoje.
3. Atlikus analizę nustatyti pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai aptikti ekstraktuose – kamparas, 1,8-cineolis, terpinen-4-olis, -terpineolis, tujonas, krisantenonas. Nustatyta, jog žieduose ir lapuose kaupiamų eterinių aliejų cheminė sudėtis skiriasi. Žiedynai kaupia daugiau kamparo, terpinen-4-olio,krisantenono, lapuose dominuojantis komponentas – 1,8-cineolis.
4. Įvertinus eterinių aliejų komponentų sudėtį skirtinguose Lietuvos regionuose rinktoje augalinėje žaliavoje buvo nustatyta, jog Vytėnuose, Jurbarko raj. rinktoje žaliavoje yra identifikuota daugiausiai eterinių aliejų, kurie pasižymi repelentiniu aktyvumu. Šiame regione rinktoje žaliavoje nustatyta didžiausias kiekis 1,8-cineolio bei didelė koncentracija -tujono.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atlikto tyrimo rezultatais galima teigti, jog paprastosios bitkrėslės (Tanacetum
vulgare L.) žiedų ir lapų eteriniai aliejai gali būti naudojami kaip insekticidai, kadangi juose
identifikuota eterinių aliejų komponentai pasižymintys repelentiniu aktyvumu.
Tikslinga būtų atlikti tolimesnius tyrimus, nustatant T. vulgare L. eterinių aliejų atskirų komponentų įtaką skirtingiems kenkėjams bei atlikti platesnę analizę iš surinktos žaliavos, randamos skirtingose augavietėse.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Kartal, M. Intellectual property protection in the natural product drug discovery, traditional herbal medicine and herbal medicinal products. Phytotherapy Research 2007; 21(2):113–119; 2. Barsteigienė Z., et al. Augalinės kilmės preparatai Lietuvos farmacijos rinkoje. MEDICINA
2003, T.39;
3. Muresan, M.L., Antimicrobial efects of the ethanollic extracts and essential oils of Tanacetum vulgare L. from Romania. Acta Universitatis Cibiniensis, 2015;
4. Godinho, Loyana Silva, et al. Anthelmintic Activity of Crude Extract and Essential Oils of Tanacetum vulgare (Asteraceae) against Adult Worms of Schistosoma mansoni. The Scientific World Journal, 2014;21:4603-4212.
5. Daneshmand, Parvaneh, et al. Neuroprotective Effects of Herbal Extract (Rosa canina, Tanacetum vulgare and Urtica dioica) on Rat Model of Sporadic Alzheimer's Disease. Avicenna Journal of Medical Biotechnology, 2016; 8;
6. Onozato, T., et al., Tanacetum vulgare:antiherpes virus activity of crude extract and the purified compound parthenolide. Phytotherapy Research. 2009; 23(6);
7. Moricz, A., Boszomenyi, H. Tracking and identification of antibacterial components in the essential oil of Tanacetum vulgare L. by the combination of high-performance high-layer chromatography with direct bioautography and mass spectrometry. 2010;
8. Wolf, V.C., et al., Genetic and chemical variation of Tanacetum vulgare in plants of native and invasine origin. Biological Control, 2012.
9. Ragažinskienė O., Rimkienė S., Sasnauskas V., Vaistinių augalų enciklopedija. Litutė, 2005, p. 70-71;
10. LeCain, R., Sheley, R. Common tansy (Tanacetum vulgare). Montana State University, 2014; 11. Chiasson, HeLene, et al. Acaricidal properties of Artemisia absinthium and Tanacetum vulgare
(Asteraceae) essential oils obtained by three methods of extraction. Journal of economic entomology 2001;94:0022-0493.
12. Mockutė D., Judzevičienė A., Volatile compounds of Tanacetum vulgare L. (tansy) growing wild in Central Lithuania. 2013;6:198-202;
13. Tisserand, R., Rodney, Y., Essential oil safety. Second edition [online], 2014. ISBN: 978-0-443-06241-4.
14. Baser, K.H.C., Demirci, H. Chemistry of essential oils. Springer 2007;
15. Sari M., Biondi D.M., Kaâbeche M, Mandalari G, D’Arrigo M, Bisignano G, Saija A, Daquino C, Ruberto G. Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil of several populations of Algerian Origanum glandulosum Desf. Flavour and frarance journal, 2006;21:890-898;
16. Janulis V., Puodžiūnienė G., Malinauskas F. Fitocheminė analizė. KMU, 2008;
17. Kleine, S., Muller, C. Intraspecific plant chemical diversity and it's relation to herbivory. Biological control, 2010;
18. Judzentienė, A., Mockutė, D. The inflorescence and leaf essential oils of Tanacetum vulgare growing wild in Lithuania. Biochemical Systematics and Ecology 2005;
19. Deimi, T., et al. Alpha-thujone reduces 5-HT3 receptor activity by an effect on the agonist-reduced desensitization. Neuropharmacology. 2004;
20. Johnston, Graham A.R., et al. Modulation of Ionotronic GABA receptors by natural products of plant origin. Advances in Pharmacology, 2006;
21. Isman, M. Botanical insecticides, deterrents, and repelents in modern agriculture and an increasingly regulated world. University of British Columbia, 2006;51:0066-4170;
22. Perez, S.G., et al. Activity of essential oils as biorational alternative to control coleopteran insects in stored grains. Journal of Medicinal Plants Research, 2010;4:1996-0875;
23. Husnu, C.B.K., Buchbauer, G. Handbook of essential oils. Science, Technology and Applications. Taylor and Francis Group, 2010;
24. Kumar, V., Tyagi, V. Chemical composition and biological activities of essential oils of genus Tanacetum. Journal of Pharmacognosy and thytochemistry 2013;2:159-163;
25. Khalfi, O., Benyoussef, E., Yahiaoui, N. Extraction, analysis and insecticidal activity of spearmint essential oil from Algeria against Rhyzopertha dominica F. Recents Progres en Genie des Procedes, 2007;2:910239-68-3;
26. Kalinovic, I., et al. Insecticidal activity of some aromatic plants from Croatia against lesser grain borer (Rhyzopertha dominica F.) on stored wheat. Cereal Research Communications, 2007 m; 34:705-708;
27. Kouninki, H., et al. Toxicity of some terpenoids of essential oils of FXylopia aethiopica from Cameroon against Sitophilus zeamais Motschulsky. Journal of Applied Entomology, 2007; 28. Tchoumbougnang, F., et al. Comparative essential oils composition and insecticidal effect of
different tissues of Piper capense L., Piper guineense Schum. et Thonn., Piper nigrum L. and Piper umbellatum L. grown in Cameroon. African Journal of Biotechnology, 2009;8:1684-5315;
29. Pet care pest control – using essenial oils. Scents Sensibility Newsletter, 2001; 30. Peterson, Ch., Coats, J. Insect repellents - past, present and future. 2001;
31. Haider, S.Z., et al. Repellent and Fumigant AAtivities of Tanacetum nubigenum Wallich. ex DC Essential Oils against Tribolium castaneum (Herbst). Journal of Oleo Science 2015; 64:1345-8957;
32. Bakkali F., Averbeck S., Averbeck D., Idaomar M. Biological effects of essential oils-a review. Food and chemical toxicology 2008;46:446-475;
33. Palsson, K., Jaeson T., Baeckstorm P., Borg-Karlson A. Tick repellent substances in the Essential Oil of Tanacetum vulgare. 2008; 45(1):88-93;
34. Szolyga, B., et al. Chemical composition and insecticidal activity of Thuja occidentalis and Tanacetum vulgare essential oils against larvae of the lesser mealworm, Alphitobius diaperinus. African Journal of Biotechnology, 2014;151:1-10;
35. Baser, K.H.C. Analysis and quality assesment of essential oils. UNIDO 1995;
36. Vičkačkaitė, V., Ekstrakciniai mėginio paruošimo dujų chromatografiniai analizei metodai . VU 2008, ISBN 978-9955-33-277-0;
37. Culik, Jiri, et al. Supercritical fluid extraction - new progressive method in brewing analytics. Part I. Academy of Sciences of Czech Republic, 2006.
38. Culik , Jiri, et al. Supercritical fluid extraction - new progressive method in brewing analytics.- Part II. Academy of Sciences of Czech Republic, 2010.
