FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
BIRUTĖ ZDANYTĖ
ANTIHISTAMININIŲ VAISTŲ (KLEMASTINO FUMARATO, LORATADINO,
DESLORATADINO) MIŠINIO IŠSKYRIMAS IŠ KRAUJO PLAZMOS IR
IDENTIFIKAVIMAS EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS
METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. Palma Nenortienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
ANTIHISTAMININIŲ VAISTŲ (KLEMASTINO FUMARATO, LORATADINO, DESLORATADINO) MIŠINIO IŠSKYRIMAS IŠ KRAUJO PLAZMOS IR
IDENTIFIKAVIMAS EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas
Data
Darbo vadovas
Doc. Palma Nenortienė Data Darbą atliko Magistrantė Birutė Zdanytė Data KAUNAS, 2014
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Histaminas, jo reikšmė žmogaus organizmui, histamininiai receptoriai ... 10
1.2. Antihistamininiai vaistai ... 11
1.2.1. Istorija ... 11
1.2.2. Klasifikacija, pirmos ir antros kartos antihistamininių vaistų palyginimas ... 12
1.2.3. Veikimo mechanizmas ... 13
1.2.4. Farmakokinetika ... 14
1.2.5. Indikacijos ... 14
1.2.7. Nepageidaujami poveikiai ... 15
1.2.8. Dozavimas ... 16
1.2.10. Klemastino, loratadino ir desloratadino struktūra bei fizikinės savybės ... 17
1.2.11. Ekstrakcijos principai ir antihistamininių vaistų ekstrakcija iš kraujo plazmos ... 18
1.2.12. Klemastino fumarato tapatybės nustatymas ... 19
1.2.13. Loratadino tapatybės nustatymas ... 21
1.2.14. Desloratadino tapatybės nustatymas ... 23
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1. Tyrimo planavimas ... 24
2.2. Tyrimo objektas ... 24
2.3. Tyrimo metodai ... 24
2.3.1. Skysčių – skysčių ekstrakcijos metodika ... 24
2.3.2. ESC tyrimo metodika ... 26
2.4. Duomenų analizes metodai ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. ESC metodo optimizavimas ... 28
3.2. ESC metodo validacija ... 29
3.2.1. Specifiškumas ... 29
3.2.2. Rezultatų glaudumas arba preciziškumas ... 31
3.2.2.2. Rezultatų tarpinis preciziškumas ... 32
3.2.3. Ribos ir tiesiškumas ... 33
3.2.4. Aptikimo riba ir nustatymo riba ... 35
3.3. Ekstraktų iš kraujo plazmos tyrimų rezultatai ... 37
3.3.1. Trichlormetaninių ekstraktų rezultatai ... 37
3.3.2. Dichlormetaninių ekstraktų rezultatai ... 38
3.3.3. Dietileterinių ekstraktų rezultatai ... 38
3.3.4. Cikloheksaninių ekstraktų rezultatai ... 39
4. IŠVADOS ... 41
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 43
SANTRAUKA
B. Zdanytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. P. Nenortienė;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Antihistamininių vaistų (klemastino fumarato, loratadino, desloratadino) mišinio išskyrimas iš kraujo plazmos ir identifikavimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Darbo tikslas: optimizuoti metodiką, kuria būtų galima atlikti antihistamininių vaistų mišinio, sudaryto iš klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino, ekstrakciją iš kraujo plazmos ir kokybinį nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Darbo uždaviniai: Atlikti mokslinės literatūros analizę siekiant įvertinti antihistamininių vaistų savybes ir pasirinktų junginių ekstrakcijos iš kraujo plazmos ir tapatybės nusatymo metodikas. Optimizuoti ir validuoti ESC metodiką kokybiniam pasirinktų preparatų mišinio nustatymui iš kraujo plazmos. Parinkti klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino skysčių – skysčių ekstrakcijos iš kraujo plazmos sąlygas. Apibendrinti gautus ekstrakcijos ir ESC rezultatus.
Metodai: skysčių – skysčių ekstrakcija ir ESC.
Tyrimo objektas: kraujo plazma, į kurią įterpti antihistamininiai vaistai klemastino fumaratas, loratadinas, desloratadinas ir jų mišinys.
Rezultatai: tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikai: desloratatadino apie – 5,9 min, loratadino – apie 11,4 min, klemastino fumarato – apie 13,2 min. Validuota ESC atlikimo metodika. Atliekant ekstrakciją su trichlormetanu neišsiekstrahavo nei vienas tiriamasis junginys, su dichlormetanu – loratadinas, su dietileteriu ir cikloheksanu – visi trys tiriamieji junginiai.
Išvados: 1. Atlikta mokslinės literatūros analizė, apžvelgiant antihistamininių vaistų savybes, ekstrakcijos iš kraujo plazmos būdus bei identifikavimo metodus, didžiausią dėmesį skiriant efektyviajai skysčių chromatografijai; 2. Optimizuota ir validuota ESC metodika klemastino fumarato, loratadino, desloratadino mišinio išskirstymui ir junginių identifikavimui; 3. Ekstrahentai, tinkami klemastino fumarato, loratadino, desloratadino ir jų mišinio skysčių – skysčių ekstrakcijai iš kraujo plazmos, yra dietileteris ir cikloheksanas. Ekstrakciją reikia atlikti šarminėje terpėje; 4. Įvertinus validacijos metu gautus rezultatus galima teigti, kad ESC atlikimo metodika yra tinkama klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino mišinio, gauto atlikus junginių ekstrakciją iš kraujo plazmos, išskirstymui ir junginių identifikavimui.
Raktiniai žodžiai: antihistamininiai, klemastinas, loratadinas, desloratadinas, ekstrakcija, efektyvioji skysčių chromatografija, validacija.
SUMMARY
B. Zdanytė Master‘s Thesis/Supervisordoc. P. Nenortienė;Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Department of analytical and toxicological chemistry. – Kaunas.
Antihistamines (clemastine fumarate, loratadine, desloratadine) extraction from human plasma and identification using high performance liquid chromatography
Aim: to optimise a method, by which mixture of antihistamines containing clemastine fumarate, loratadine and desloratadine could be extracted from human plasma and qualitative determination using high performance liquid chromatogrophy could be made.
Tasks: to carry out analysis of scientific literature and evaluate characteristics of antihistamines and methods of chosen compounds extraction from human plasma and identity determination. Optimise and validate HPLC method for qualitative determination of chosen medicines. Select conditions suitable for chosen antihistamines liquid – liquid extraction from human plasma. Carry out qualitative determination of clemastine fumarate, loratadine and desloratadine in human plasma using validated HPLC method. Summarize results of extraction and HPLC.
Methods: liquid – liquid extraction and HPLC.
Object: human plasma with embedded antihistamines: clemastine fumarate, loratadine, deloratadine and their mixture.
Results: retention times of test substances: desloratadine – 5,9 min, loratadine – 11,4 min, clemastine fumarate – 13,2 min. HPLC method was validated. None of the compounds were extracted using trichlormethan. Only loratadine was extracted using dichlormethan. All three compounds were extracted using diethyl ether and cyclohexane.
Conclusions: 1. Analysis of scientific literature was caried out, characteristics of antihistamines, methods of extraction from human plasma and identity determination of chosen compounds were overviewed; 2. HPLC method for identity determination of clemastine fumarate, loratadine and desloratadine was optimised and validated; 3. Diethyl ether and cyclohexane are suitable for fluid – fluid extraction of clemastine fumarate, loratadine and desloratadine from human plasma. The extraction must be performed under alkaline conditions; 4.Results of HPLC method validation prooved that HPLC method is suitable for identity determination of mixture of clemastine fumarate, loratadine, desloratadine.
Key words: antihistamines, clemastine, loratadine, desloratadine, extraction, high performance liquid chromatography, validation.
SANTRUMPOS
C – koncentracijaDC – dujų chromatografija
DMD – diodų matricos detektorius
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija ESI – elektropurkštuvinė jonizacija
HPLC – efektyvioji skysčių chromatografija i.d. – vidinis skersmuo
ICH – Tarptautinė harmonizavimo konferencija IR – infraraudonieji spinduliai
k – sulaikymo koeficientas LOD – aptikimo riba LOQ – nustatymo riba
Mr – santykinė molekulinė masė
MS – masių spektrometrija
PC – plonasluoksnė chromatografija R2 – koreliacijos koeficientas Rf – sulaikymo rodiklis
RI – sulaikymo indeksas
S/N – signalo ir bazinės linijos triukšmo santykis SSN – santykinis standartinis nuokrypis
UV – ultravioletiniai spinduliai λ – bangos ilgis
ĮVADAS
Žmogaus organizmą veikia įvairūs žalingi veiksniai: padidėjęs cheminių medžiagų kiekis aplinkoje ir buityje, socialinis ir psichologinis stresas, padidėjęs radiacinis fonas, alergizuojantys maisto produktai, atmosferos užterštumas. Šie faktoriai skatina sergamumą alerginėmis ligomis. Antihistamininiai vaistai yra pirmojo pasirinkimo vaistai gydant alergines reakcijas. Greta šių indikacijų šie vaistai vartojami CNS ir vestibulinio aparato sutrikimų (pvz.: nemiga, pykinimas, galvos svaigimas) gydymui. Histamino receptoriai skirstomi į H1, H2, H3, H4, tačiau naudojant terminą
„antihistamininiai vaistai“, dažniausiai kalbama apie H1 antihistamininius preparatus.
Vieni iš dažniausiai vartojamų antihistamininių preparatų yra klemastinas, loratadinas ir desloratadinas. Loratadinas ir desloratadinas yra antros kartos antihistamininiai vaistai, kurie yra selektyvesni H1 receptoriams ir sukelia mažiau nepageidaujamų poveikių nei pirmos kartos preparatai.
Klemastinas – pirmos kartos antihistamininis vaistas, sukeliantis nepageidaujamą sedacinį poveikį. Nepaisant to, jis gana dažnai vartojamas, nes esant staigioms, ūmioms alerginėms reakcijoms pasižymi efektyvesniu antihistamininiu veikimu nei antros kartos preparatai.
Moksliniuose šaltiniuose gausu informacijos apie atskirų antihistamininių preparatų tyrimus, nustatymą kraujo plazmoje, tačiau duomenų apie jų mišinių tyrimus trūksta. Antihistamininių vaistų mišinio tyrimas yra aktuali tema, nes pasitaiko atvejų, kai gydymas dubliuojamas, vartojamas daugiau nei vienas vaistas tos pačios indikacijos gydymui. Kai kurie pacientai pasižymi polinkiu vartoti vaistus, vaistinius preparatus vartoja per didelėmis dozėmis ar neteisingu dažniu. Galimi apsinuodijimai, toksinis poveikis. Ūmių apsinuodijimų atvejais reikalingi greiti, specifiški, tikslūs medžiagų nustatymo kraujo plazmoje metodai.
Antihistamininių vaistų mišinio tyrimui pasirinkta efektyviosioji skysčių chromatografija. Tai jautrus, efektyvus ir šiuolaikiškas metodas. Metodika sukurta remiantis preparatų fizikinėmis ir cheminėmis savybės bei jau atliktais moksliniais tyrimais.
Darbo tikslas yra optimizuoti metodiką, kuria būtų galima atlikti antihistamininių vaistų mišinio, sudaryto iš klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino, ekstrakciją iš kraujo plazmos ir kokybinį nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: optimizuoti metodiką, kuria būtų galima atlikti antihistamininių vaistų mišinio, sudaryto iš klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino, ekstrakciją iš kraujo plazmos ir kokybinį nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti mokslinės literatūros analizę siekiant įvertinti antihistamininių vaistų savybes ir pasirinktų junginių ekstrakcijos iš kraujo plazmos ir tapatybės nustatymo metodikas.
2. Optimizuoti ir validuoti ESC metodiką kokybiniam pasirinktų preparatų mišinio nustatymui iš kraujo plazmos.
3. Parinkti klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino skysčių – skysčių ekstrakcijos iš kraujo plazmos sąlygas.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Histaminas, jo reikšmė žmogaus organizmui, histamininiai receptoriai
Histaminas – vienas iš svarbiausių mediatorių, dalyvaujančių alerginių reakcijų patofiziologiniuose procesuose [1]. Tai nedidelės molekulinės masės aminas, natūraliai sintetinamas organizme iš L-histidino, veikiant fermentui histidino dekarboksilazei [27]. Histaminas aptinkamas putliųjų ląstelių ir bazofilų granulėse. Jo išsiskyrimą skatina alergeno prisijungimas prie ląstelės membranos paviršiuje esančio specifinio IgE. Histaminas taip pat sintetinamas skrandžio gleivinės ląstelėse, iš kurių jo išsiskyrimą skatina gastrinas ir acetilcholinas [1].
Histaminas skatina lygiųjų raumenų susitraukimą, skrandžio rūgšties sekreciją, didina kraujagyslių pralaidumą. Jis veikia kaip neurotransmiteris ir turi didelės įtakos imunomoduliacijos, uždegimo, hematopoezės, ląstelių dalijimosi procesams. Tai vienas iš pagrindinių mediatorių, dalyvaujančių alerginio uždegimo patogenezėje [19]. Histamino poveikis pasireiškia jam sąveikaujant su histamininiais receptoriais.
Histaminas veikia sąveikaudamas su keturių tipų receptoriais: H1, H2, H3 ir H4. Jie skiriasi
savo pasiskirstymu organizme, signalo perdavimu bei funkcijomis [27]. Alerginių reakcijų mechanizmai susiję su H1 receptorių stimuliavimu. H1 receptoriai pasiskirstę visame organizme.
Dirginant šiuos receptorius sukeliamas niežulys, skausmas, kraujagyslių išsiplėtimas, hipotenzija, raudonis, galvos skausmas, tachikardija, bronchų spazmas, padidėja kraujagyslių pralaidumas, stimuliuojami kvėpavimo takų vegetacinių aferentinių nervų ir kosulio receptoriai, sumažėja atrioventrikulinio (AV) mazgo laidumas [1].
Histamino receptoriai yra su G baltymu susiję transmembraniniai baltymai, kurių molekulė sudaryta iš septynių klosčių [27]. Jie gali būti dviejų konformacijų – aktyvios ir neaktyvios. Ramybės būsenos metu tarp šių konformacijų vyrauja pusiausvyra. Taip pat receptoriai pasižymi sudėtiniu aktyvumu, kuris apibūdinamas kaip galimybė pakeisti konformaciją iš neaktyvios į aktyvią net neprisijungus ligandui. Remiantis šiuo dviejų būsenų modeliu histamino receptorių ligandai skirstomi į agonistus, tikrus antagonistus ir inversinius agonistus [20].
Histaminas veikia kaip agonistas, pasižymi giminingumu aktyvios būsenos receptoriams, todėl jam išsiskyrus pusiausvyra pasislenka į aktyviųjų receptorių pusę. Inversiniai agonistai, priešingai, pasižymi didesniu giminingumu neaktyvios būsenos receptoriams, stabilizuoja pasyvią jų konformaciją ir pusiausvyra pasislenka link pasyvios būsenos receporių [27]. Tikri antagonistai jungiasi ir prie aktyvių, ir prie neaktyvių receptorių, neleidžia prisijungti agonistams, tačiau nepakeičia pusiausvyros tarp aktyvių ir pasyvių receptorių [20].
1 pav. Antihistamininiai receptoriai ramybės būsenoje (a), prisijungus agonistui (b), inversiniam agonistui (c) ir tikram antagonistui (d). R – neaktyvi receptoriaus būsena, R* – aktyvi receptoriaus
būsena [20]
1.2. Antihistamininiai vaistai
1.2.1. Istorija
Apie histaminą ir jo sintezę žinoma daugiau kaip 100 metų. 1907 m. atrasta, jog histaminas susidaro dekarboksilinant histidiną. Fiziologinė ir patologinė jo reikšmė nustatyta 1910 – 1911 m. [29]. Pirmasis antihistamininis vaistas (timoetildietilaminas) buvo susintetintas 1937 m., tačiau dėl silpno aktyvumo bei didelio toksiškumo klinikinėje praktikoje junginys nebuvo vartojamas. 1940 – 1950 m. buvo susintetinti pirmieji antihistamininiai vaistai, tinkami naudoti klinikinėje praktikoje (fenbenzaminas, pirilaminas, difenhidraminas, chlorfeniraminas) [20, 29]. 1943 m. nustatytas nepageidaujamas pirmos kartos antihistamininių vaistų poveikis CNS. 1955 m. apibūdintas antialerginis antihistamininių vaistų veikimas [29].
1981 m. klinikinėje praktikoje pradėti vartoti antros kartos antihistamininiai vaistai, o jų kardiotoksinis poveikis pastebėtas 1986 m. [29].
1.2.2. Klasifikacija, pirmos ir antros kartos antihistamininių vaistų palyginimas
Antihistamininiai vaistai klasifikuojami pagal chemines ir funkcines savybes. Pagal struktūrą jie skirstomi į šešias grupes: alkilaminai, piperazinai, piperidinai, etanolaminai, fenotiazinai [1]. Ši klasifikacija neatspindi antihistamininių vaistų ryšio su jų farmakologinėmis savybėmis.Funkcines antihistamininių vaistų savybes atspindi skirstymas į pirmos ir antros kartos vaistus. Pirmos ir antros kartos antihistaminiai vaistai skiriasi tarpusavyje farmakokinetinėmis savybėmis ir selektyvumu. Antihistamininių vaistų klasifikacija pagal cheminę struktūrą ir funkcines savybes pateikiama 1 lentelėje.
1 lentelė. Antihistamininių vaistų klasifikacija [1, 27]
Cheminė klasė Funkcinė klasė
Pirmos kartos Antros kartos
Alkilaminai Bromfeniraminas Chlorfenilaminas Dimetindenas Feniraminas Triprolidinas Akrivastinas (nėra Lietuvoje) Piperazinai Buklizinas Ciklizinas Hidroksizinas Meklizinas Oksatomidas Cetirizinas Levocetirizinas Piperidinai Azatadinas Ciprohepatdinas Difenilpiralinas Ketotifenas Desloradatinas Ebastinas Feksofenadinas Levokabastinas Loratadinas Olopatadinas Etanolaminai Karbinoksaminas Klemastinas Dimenhidrinatas Difenhidraminas Doksilaminas Feniltoloksaminas - Fenotiazinai Metdilazinas Prometazinas -
Kiti Doksepinas Azelastinas
Emedastinas Epinastinas
Pirmos kartos antihistamininiai vaistai pasižymi silpnu selektyvumu histamino receptoriams. Jie veikia ir muskarininius cholino, α – adrenerginius, 5 – hidroksitriptaminerginius receptorius. Pirmos kartos antihistamininiai vaistai pasižymi lipofilinėmis savybėmis, yra sąlyginai nedidelės
molekulinės masės, juos prastai atpažįsta ir nepašalina P-glikoproteininis siurblys, todėl jie geba pereiti kraujo – smegenų barjerą ir sukelti sedacinį poveikį. Pirmos kartos antihistamininiai vaistai gali būti vartojami ne tik alerginių sutrikimų gydymui, bet ir kaip raminamieji, antiemetiniai vaistai bei vestibulinio aparato ligų gydymui [20].
Antros kartos preparatai pasižymi priešingomis savybėmis – yra selektyvūs H1 receptoriams,
hidrofiliniai, santykinai didelės molekulinės masės, pasižymi giminingumu P-glikoproteininiui siurbliui, pasižymi didesniu giminingumu periferinės, nei centrinės nervų sistemos receptoriams, todėl nepatenka į CNS, arba patenka tik nedidelė dalis (nuo 0 iki 30 procentų) ir vartojami terapinėmis dozėmis nesukelia sedacijos [25, 20]. Dauguma antros kartos antihistamininių vaistų pasižymi ilgesniu veikimu, nes vaisto – H1 receptoriaus kompleksas disocijuoja lėtai, taip pat susidaro aktyvūs
metabolitai, pasižymintys panašiu veikimu [25, 21].
Pagrindiniai skirtumai tarp pirmos ir antros kartos antihistamininių vaistų yra selektyvumas H1 receptoriams, gebėjimas pereiti kraujo – smegenų barjerą ir paveikti H1 receptorius CNS, bei
veikimo trukmė.
Terminai „trečios kartos“ arba „naujos kartos“ antihistamininiai vaistai yra naudojami, kai norima įvardinti antros kartos antihistamininių vaistų naujus selektyvius izomerus arba aktyvius metabolitus (pvz.: levocetirizinas). Tačiau kol kas nėra bendro sutarimo dėl tokios terminologijos ir naujieji junginiai priskiriami antros kartos ahtihistamininiams vaistams [20].
1.2.3. Veikimo mechanizmas
Kaip minėta ankstesniame skyriuje, histamino receptoriai gali būti aktyvios ir neaktyvios būsenos. Antihistamininiai vaistai veikia kaip inversiniai agonistai, o ne kaip tikri antagonistai. Jie prisijungia prie receptorių ir stabilizuoja neaktyvią jų būseną bei sumažina aktyvumą net esant agonistui [20, 29]. Ilgą laiką antihistamininiai vaistai buvo vadinami H1 receptorių antagonistais arba
H1 receptorių blokatoriais, tačiau šie terminai neatspindi tikslaus antihistamininių vaistų veikimo
mechanizmo [29].
Preparatai veikia uždegimo mediatorių išsiskyrimą neleisdami kalcio jonams prasiskverbti per putliųjų ląstelių ar bazofilų membraną arba stabdydami kalcio jonų atsipalaidavimą iš ląstelės. Antihistamininiai vaistai turi įtakos leukotrienų, prostaglandinų, antitrombocitinio aktyvinančio faktoriaus gamybai vėlyvojoje reakcijų fazėje [1].
1.2.4. Farmakokinetika
Farmakokinetika tiria vaisto kokybinius ir kiekybinius kitimus organizme. Antihistamininiai vaistai greitai absorbuojami, didžiausia vaisto koncentracija plazmoje pasiekiama per 1-4 valandas. Pusinis eliminacijos laikas labai įvairus – nuo keleto minučių iki daugiau kaip paros [1].
Klemastino, vieno iš magistro darbe tiriamų junginių, didžiausia koncentracija plazmoje pasiekama po 2-4 val., poveikis trunka 10-12 val., kai kuriais atvejais – net 24 val. Prie plazmos baltymų gali prisijungti net 95 proc. medžiagos. Nepakitusio vaisto šalinama labai nedidelė dalis [41].
Didžiausia loratadino koncentracija plazmoje pasiekiama po 1-3 val., veikimas trunka 18-24 val. Pusinis eliminacijos laikas yra 8-15 val.Su plazmos baltymais jungiasi 97-99 proc. loratadino, 73-76 proc. jo metabolitų. Vaisto dalis, kuri išsiskiria nepakitusi – 20 proc. [1, 21, 41].
Didžiausia desloratadino koncentracija plazmoje pasiekiama po 1-3 val., veikimo trukmė – 24 val. Pusinės eliminacijos laikas – 27 val. Su kraujo plazmos baltymais jungiasi 83-87 proc. desloratadino. Vaisto dalis, kuri išsiskiria nepakitusi – 67 proc. [1, 21, 41].
Antihistamininių vaistų, ypač antros kartos, poveikis gana greitas ir ilgalaikis, dėl to juos pakanka vartoti kartą per parą. Metabolizmas vyksta kepenyse. Dauguma antihistamininių vaistų šalinami per inkstus su šlapimu, dėl to, esant inkstų funkcijos nepakankamumui, reikia keisti preparatų dozę [1].
Klemastino, loratadino ir desloratadino nustatymą kraujo plazmoje rekomenduojama atlikti per 2-3 val. po vaistinių preparatų pavartojimo, kadangi tuo laiko momentu pasiekiamas jų koncentracijos maksimumas kraujo plazmoje. Mokslinės literatūros duomenimis desloratadino nustatymas buvo atliktas praėjus 3 val. po preparato pavartojimo per os [11, 22].
Atliekant preparatų farmakokinetikos tyrimus, vaistinės medžiagos koncentracija kraujo plazmoje nustatoma įvairiais laiko momentais. J. Chen su kolegomis (2004) atliko loratadino farmakokinetikos tyrimą. Šiuo atveju kraujo mėginiai buvo imami prieš preparato pavartojimą ir 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 7, 10, 13, 16, 24 val. po preparato pavartojimo [9].
1.2.5. Indikacijos
Antihistamininiai vaistai yra plačiai naudojami alerginių sutrikimų gydymui. Antros kartos antihistamininiai vaistai yra pirmojo pasirinkimo vaistai gydant alerginį rinokonjunktyvitą, dilgėlinę bei kai kurias kitas alergines ligas [29]. Antihistamininių vaistų veikimas yra efektyvesnis juos vartojant reguliariai, nei pagal poreikį [28].
Alerginis rinokonjunktyvitas. Antihistamininiai vaistai gerina pacientų gyvenimo kokybę, kadangi slopina nosies niežulį, čiaudulį, sekreciją, užburkimą, gomurio, ryklės, ausų niežulį, ašarojimą. Pirmos kartos antihistamininiai vaistai yra efektyvūs, tačiau jų vartojimas alerginio konjunktyvito gydymui yra ribojamas dėl sukeliamų nepageidaujamų anticholinerginių efektų bei sedacinio poveikio [1, 28, 24]. Pirmenybė teikiama antros kartos antihistamininiams vaistams, kurie pasižymi greitesne veikimo pradžia nei pirmos kartos preparatai, yra geriami vieną kartą per parą ir nesukelia anticholinerginių efektų bei poveikio CNS [19, 24]. Antihistamininių vaistų nosies purškalai ir akių lašai veikia greičiau nei geriamieji preparatai, tačiau jų veikimo trukmė trumpesnė, jie turi būti vartojami kelis kartus per parą [1, 29, 28]. Antihistamininiai vaistai pasižymi minimaliu kraujagysles sutraukiančiu efektu, dėl to jie gali būti vartojami deriniuose su dekongestantais, pavyzdžiui pseudoefedrinu [24].
Dilgėlinė. Antihistamininiai vaistai mažina išbėrimų dažnumą, dydį, trukmę, niežulį [1]. Antros kartos antihistamininiai vaistai, nesukeliantys sedacijos, yra pirmojo pasirinkimo vaistai gydant dilgėlinę [4, 23]. Jie pasižymi simptomus kontroliuojančiu poveikiu (slopina putliųjų ląstelių degranuliaciją ir mediatorių išsiskyrimą) bei simptomus šalinančiu poveikiu (gydo putliųjų ląstelių mediatorių sukeltą audinių pažeidimą). Pirmos kartos antihistamininiai vaistai dilgėlinės gydymui skiriami tuo atveju, jei reikia greito sisteminio antihistamininio poveikio arba nėra galimybės skirti geriamuosius vaistinius preparatus [4].
Antihistamininiai preparatai vartojami atopinio dermatito, anafilaksijos, astmos, infekcinių viršunių kvėpavimo takų, vidurinės ausies uždegimo, nosies polipų, CNS ir vestubulinio aparato sutrikimų gydymui, tačiau jie nėra pirmojo pasirinkimo vaistai šių sutrikimų gydymui, gali būti vartojami kaip gretutinio gydymo priemonė, arba yra naudojami gydymui, tačiau tai nėra argumentuota moksliniais tyrimais [6, 29, 28].
1.2.7. Nepageidaujami poveikiai
Pirmos kartos antihistamininiai vaistai pereina kraujo – smegenų barjerą, dėl to gali sukelti sedaciją, slopina atmintį, mokymosi, psichomotorinius procesus, gebėjimą pažinti, mažina budrumą. Veikia muskarininius receptorius, dėl to gali sukelti burnos sausumą, šlapimo susilaikymą, sinusinę tachikardiją. Dėl poveikio serotonino receptoriams gali padidėti apetitas, augti svoris. Pirmos kartos antihistamininiai vaistai veikia α – adrenoreceptorius, dėl to gali sukelti galvos svaigimą, posturalinę hipotenziją. Dėl poveikio jonų kanalams gali padidėti QT intervalas, kilti aritmijos [29].
Antros kartos antihistamininiai vaistai nepereina kraujo – smegenų barjero, neveikia M cholino, α – adrenerginių ir serotonino receptorių, dėl to nesukelelia poveikio CNS, anticholonerginio,
antiadrenerginio, antiserotoninerginio poveikio [3]. Kardiotoksinis poveikis gali pasireikšti vartojant ir pirmos, ir antros kartos antihistamininius vaistus, kadangi jį lemia ne receptorių blokada, o poveikis jonų kanalams [29].
Vietinio poveikio antihistaminiai vaistai gali sukelti nestiprų vietinį nepageidaujamą poveikį, azelastinas gali sukelti kartumo pojūtį [3].
Antihistamininiai vaistai dažnai įsigyjami be recepto, dėl to perdozavimo ir apsinuodijimo tikimybė šiais preparatais padidėja [2]. Pirmos kartos antihistamininių vaistų perdozavimo simptomai yra tachikardija, kraujospūdžio pakitimai, burnos sausumas, ataksija, susijaudinimas, psichozė, traukuliai. Antros kartos antihistamininių vaistų toksiškumas yra mažesnis, tačiau perdozavus jie gali sukelti tachikardiją, galvos svaigimą, virškinamojo trakto sutrikimus ir galvos skausmą. Ir pirmos, ir antros kartos antihistamininių vaitų perdozavimas gali sukelti aritmijas [34].
1.2.8. Dozavimas
Rekomenduojama klemastino dozė suaugusiems ir vaikams, vyresniems kaip 12 metų, yra po 1 mg du kartus per parą. Prireikus galima suvartoti iki 6 mg per parą. Esant ūmiai alerginei reakcijai galima į veną arba į raumenį sušvirkšti 2 – 4 mg per parą. 6 – 12 metų vaikams rekomenduojama vartoti po 0,5 arba 1 mg du kartus per parą. 3 – 6 metų vaikams rekomenduojama vartoti po 0,5 mg du kartus per parą. Vaikams iki 1 metų klemastino vartoti nerekomenduojama [41].
Rekomenduojama loratadino dozė suaugusiems ir vyresniems kaip 12 metų vaikams yra 10 mg 1 kartą per parą. 2 – 12 metų vaikams, sveriantiems daugiau kaip 30 kg, rekomenduojama paros dozė yra 10 mg, o sveriantiems mažiau kaip 30 kg – 5 mg. Jaunesniems kaip 2 metų vaikams loratadino saugumas ir veiksmingumas nėra ištirtas [41].
Rekomenduojama desloratadino dozė suaugusiems ir vyresniems kaip 12 metų vaikams yra 5 mg 1 kartą per parą. 6 – 11 metų vaikams rekomenduojama vartoti 2,5 mg kartą per parą, 1 – 5 metų vaikams – 1,25 mg kartą per parą [41].
Mokslinės literatūros duomenimis, atliekant farmakokinetikos tyrimus loratadinas kraujo plazmoje buvo nustatomas po vienkartinės 40 mg dozės pavartojimo per os [13], 20 mg dozės pavartojimo per os [20]. Klemastino nustatymas kraujo plazmoje buvo atliekamas po vienkartinės 1,34 mg, 0,67 mg dozės pavartojimo per os [34, 35]. Desloratadino nustatymas buvo atliktas po 5 mg dozės pavartojimo per os [22].
1.2.10. Klemastino, loratadino ir desloratadino struktūra bei fizikinės savybės
Antihistamininiai vaistai pagal struktūrą priklauso skirtingoms cheminėms klasėms bei pasižymi įvairiomis fizikinėmis savybėmis. Klemastinas pagal cheminę struktūrą priskiriamas etanolaminų klasei [1, 27]. Jis naudojamas klemastino fumarato druskos forma. Druskos molekulinė formulė – C21H26ClNO · C4H4O4 (2 pav.). Mr = 460,0. Klemastino fumaratas – balti arba beveik baltikristaliniai milteliai. Jis labai gerai tirpsta vandenyje, iš dalies tirpsta 70 proc. etanolyje, gerai tirpsta 50 proc. etanolyje ir metanolyje [12], šiek tiek tirpsta praskiestoje acto rūgštyje [22].
Loratadinas (3 pav.) pagal cheminę struktūrą priskiriamas piperidinų klasei. Tai balti arba beveik balti kristaliniai milteliai. Loratadinas beveik netirpsta vadenyje, gerai tirpsta acetone ir metanolyje. Mr = 382,9. Molekulinė formulė – C22H23ClN2O2 [12].
Desloratadinas (4 pav.) – loratadino darinys. Pagal cheminę struktūrą jis taip pat priskiriamas piperidinų klasei. Desloratadinas – kristalai, kurie šiek tiek tirpsta vandenyje, labai gerai tirpsta metanolyje, etanolyje, propilenglikolyje. Mr = 310,8. Molekulinė formulė – C19H19ClN2 [22].
2 pav. Klemastino fumaratas [22]
3 pav. Loratadinas [22] 4 pav. Desloratadinas [22]
Tiriamųjų medžiagų savybių išmanymas padeda parinkti tinkamas jų ekstrakcijos bei fizikocheminės analizės metodikas.
1.2.11. Ekstrakcijos principai ir antihistamininių vaistų ekstrakcija iš kraujo
plazmos
Ekstrakcija – tai mėginio paruošimo metodas, kurio metu junginiai yra išskiriami iš sudėtingos, jų analizei netinkamos matricos ir perkeliami į aplinką, tinkamesnę analizei. Išskyrus junginius iš pirminės terpės, galima juos sukoncentruoti ir taip palengvinti aptikimo, identifikavimo ir kiekybinio nustatymo procesą [15].
Atliekant ekstrakciją iš biolognių objektų susiduriama su keletu sunkumų. Kraujas, šlapimas, seilės ir kiti biologiniai skysčiai savo sudėtyje turi baltymų, druskų, rūgščių ir kitų organinių junginių, kurie savo struktūra, savybėmis gali būti panašūs į analitę, bei gali kliudyti tiksliam analitės nustatymui. Kitas veiksnys, apsunkinantis ekstrakcijos procesą, yra tai, kad vaistinės medžiagos pasižymi įvairiomis rūgštinėmis – bazinėmis savybėmis bei struktūroje turi įvairias funkcines grupes. Tai turi įtakos medžiagų tirpumui bei giminingumui ekstrahentui, sorbentui [30].
Norint išgauti analitę iš biologinių skysčių reikėtų atlikti kompleksinę, sudėtingą ekstrakciją, kuri garantuotų metodo selektyvumą. Taip pat galima rinktis paprastą ekstrakciją ir po jos atlikti išekstrahuotų junginių atskyrimą pasirinktu skirstymo metodu, pavyzdžiui ESC.
Vienas iš klasikinių ekstrakcijos metodų yra skysčių – skysčių ekstrakcija. Jos metu naudojami du vienas su kitu nesimaišantys tirpikliai. Dažniausiai viena fazė yra vanduo, o kita – organinis tirpiklis. Parenkant ekstrahentą reikia atsižvelgti į medžiagų maišymąsi, tirpumą, tankį. Kad susidarytų dvi atskiros fazės, tirpikliai turi nesimaišyti tarpusavyje. Taip pat, nors tirpikliai nėra maišūs, jie gali sudaryti vieno tirpiklio tirpalą, prisotintą kitu, dėl to reikia atsižvelgti ir į tirpumus. Tirpiklių tankiai lemia, kurį sluoksnį jie sudaro – viršutinį ar apatinį [5].
Ekstrakcijos metu tirpalai yra lėtai vartomi dalomajame piltuve, paliekami fazių atsiskyrimui. Fazės atskiriamos viena nuo kitos, tirpiklis nugarinamas, analitė sukoncentruojama. Ekstrakcijos metu gali susidaryti putos ar emulsija. To išvengti galima šaldant, centrifuguojant ekstraktą arba pridedant druskų [5].
Antihistamininių vaistų skysčių – skysčių ekstrakcija iš kraujo plazmos vykdoma naudojant įvairius organinius tirpiklius ir jų sistemas. Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą galima teigti, kad tyrimų metu klemastino fumarato ekstrakcijai buvo naudotas etilo acetatas [36], sistema, sudaryta iš n-heksano, dichlormetano, dimetilkarbinolio (30:20:1 V/V/V) [40], metiltertbutileteris [31].
Chen J. su kolegomis (2004) atliko loratadino nustatymą kraujo plazmoje ESC-ESI-MS metodu su vidiniu standartu [9]. Tyrimui naudoti kraujo plazmos mėginiai, gauti iš sveikų vyriškos giminės savanorių po vienkatinės 40 mg loratadino dozės pavartojimo per os. Į 0,5 ml kraujo plazmos buvo pridėta 50 μl vidinio standarto tirpalo, 0,5 μl 1 mol/l NaOH, 3 ml heksano – metiltretbutileterio (50:50 V/V). Mišinys buvo 3 min maišomas, 10 min centrifuguojamas. Organinis sluoksnis buvo
atskirtas ir išgarintas iki sauso likučio naudojant azoto dujas 60 °C temperatūroje. Sausas likutis buvo tirpinamas 100 μl judrios fazės ir chromatografuojamas [9]. Šios metodikos privalumas yra nedidelis kraujo plazmos kiekis, reikalingas tyrimui. Daugumai tyrimų reikia 1 – 2 ml kraujo plazmos, o šiuo atveju jos panaudoti tik 0,5 ml. Tai ypač svarbu, kai atliekamas loratadino nustatymas pediatrinėje populiacijoje [9].
Kitų tyrimų metu loratadino ekstrakcija iš kraujo plazmos buvo atlikta naudojant n-butil-alkoholio ir n-heksano mišinį (2:98 V/V) šarminėje terpėje [7], etilacetatą šarminėje terpėje, į kraujo plazmą pridedant 0,1 mol/l NaOH [38], dietileterį taip pat šarminėje terpėje [30], tolueną [16].
Wena J. su kolegomis (2009) atliko desloratadino nustatymą kraujo plazmoje. Tyrimo metu ekstrakcija buvo atlikta naudojant metiltertbutileterio ir n-heksano mišinį (50:50 V/V), kaip ir anksčiau aprašytame loratadino nustatymo metode [35]. Kito desloratadino nustatymo metu kaip ekstrahentas buvo naudotas etilo eteris [37].
Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą galima teigti, jog klemastino fumarato, loratadino, desloratadino ekstrakcija dažniausiai atliekama šarminėje terpėje. Atlikus vaistinių medžiagų ekstrakciją iš kraujo plazmos, galima atlikti jų tapatybės nustatymą.
1.2.12. Klemastino fumarato tapatybės nustatymas
Klemastino fumaratas yra aprašytas Europos Farmakopėjoje. Pagal Europos Farmakopėjos straipsnį 01/2008:1190 klemastino fumarato tapatybės nustatymo metodai yra optinio sukimo kampo nustatymas, IR spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija (PC). Atliekama plonasluoksnė chromatografija, kuri taikoma klemastino priemaišų nustatymui, bei plonasluoksnė chromatografija fumaro rūgščiai nustatyti [12].
Klemastino fumarato tapatybė gali būti nustatoma atliekant šias spalvines reakcijos: reakciją su Lybermano reagentu (ruda spalva), reakciją su Mandelino reagentu (geltonai ruda spalva), reakciją su Marky reagentu (geltona spalva, žalias žiedas), reakciją su sulfato rūgštimi (geltona spalva, žalias žiedas) [22].
Klemastino fumarato tapatybės nustatymui gali būti naudojamos šios PC tirpiklių sistemos: 25 proc. metanolis, amoniakas (100:1,5 V/V) – sulaikymo rodiklis (Rf) 0,46; cikloheksanas, toluenas,
dietilaminas (15:3:2 V/V/V) – Rf 0,49; trichlormetanas, metanolis (9:1 V/V) – Rf 0,24; etilacetatas, 25
proc. metanolis, amoniakas (17:2:1 V/V/V) – Rf 0,58; metanolis, n – butanolis (3:2 V/V) – Rf 0,49;
acetonas – Rf 0,09; metanolis – Rf 0,88 [22].
1. Kolonėlė: Silica Spherisorb S5W (125 x 4,9 mm i.d., 5 μm); judri fazė: 1,175 g/l (0,01 mol/l) amonio perchlorato tirpalas metanolyje. Pastovus pH palaikomas pridėjus 1 ml 0,1 mol/l natrio hidroksido tirpalo metanolyje (pH 6,7); k = 3,7 [22].
2. Kolonėlė: Lichrospher 60 RP-Select B (125 x 4,0 mm i.d., 5 μm) su prieškolonėle Lichrospher 60 RP-Select B (4 x 4,0 mm i.d., 5 μm); judri fazė: 25 mmol/l triamonio fostato buferis, kurio pH 3,0 (eliuentas A) – acetonitrilas (eliuentas B); eliuacijos gradientinis kitimas pateikiamas 2 lentelėje. Prieš kitą injekciją – 10 min trukmės ekvilibriumas; tėkmės greitis: 1 ml/min; detekcija: DMD; standartai: nitro-n-alkanai nuo C1 iki C12 acetonitrile (10 μl/10 ml); RI = 501 [22].
2 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties priklausomybė nuo laiko [22]
Laikas, min Eliuentas A, proc. Eliuentas B, proc.
0 – 30 100→30 0→70
30 – 40 30 70
40 – 43 30→100 70→0
3. Kolonėlė: C18 LiChrosphere 100 RP-18e (125 x 4,0 mm i.d., 5 μm) su prieškolonėle LiChrocart
124-4; judri fazė gauta 146 μl trietilamino ir 750 μl fosforo rūgšies pridėjus į 530 ml vandens. Pastovus pH 3,3 palaikomas naudojant 10 proc. kalio hidroksido tirpalą ir pridedant 470 ml acetonitrilo; tėkmės greitis: 0,6 ml/min; detekcija: DMD; sulaikymo laikas: 14,0 min [22].
Mokslinėje literatūroje aprašomi įvairūs klemastino fumarato tapatybės nustatymo metodai. De-sheng L. su kolegomis (2011) atliko klemastino fumarato, jo priemaišų bei skilimo produktų nustatymą tabletėse. Tyrimas atlikas ESC metodu. Naudota ODS-3 C18 kolonėlė (250 x 4,6 mm i.d.,5 μm). Judri fazė: acetonitrilas – natrio oktansulfato tirpalas (50:50). Tėkmės greitis: 1 ml/min. Kolonėlės temperatūra: 35 ° C. UV detekcija: λ = 210 nm [10].
Jinlong W. su kolegomis (2007) atliko klemastino fumarato tablečių tirpimo tyrimą. Klemastino fumarato kiekis nustatytas ESC metodu. Naudota C18 kolonėlė (150 x 4,6 mm i.d., 5 μm). Judri fazė: metanolis – 0,01 mol/l koncentracijos kalio divandenilio fostatas – trietilaminas (70:29:1). Pastovus pH 5,0 palaikytas naudojant fosforo rūgštį. UV detekcija: λ = 220 nm [17].
Minėtos atliktų tyrimų metodikos buvo naudotos klemastino fumarato tablečių kokybės vertinimui, tačiau jas galima pritaikymi ir preparato nustatymui kraujo plazmoje.
Hesegawa su kolegomis (2006) atliko dešimties antihistamininių vaistų, tarp jų ir klemastino fumarato, mišinio ekstrakciją iš žmogaus kraujo plazmos kietafazės ekstrakcijos metodu bei jų nustatymą DC – MS metodu [13]. Atlikus ekstrakciją eliuatas buvo injekuotas į dujų chromatografą, jo prieš tai neišgarinus. Naudota DB – 1MS kolonėlė (30 m × 0,32 mm i.d., sorbento sluoksnio storis 0,25 µm). Detekcija atlikta masių spektrometru su elektronų smūgio jonizacija [13].
Farmakopėjiniai klemastino fumarato tapatybės nustatymo metodai yra optinio sukimo kampo nustatymas, IR spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija. PC yra metodas, nepasižymintis dideliu jautrumu ir tikslumu. Taip pat, sudėtinga atlikti kiekybinį nustatymą.
Apžvelgus atliktus mokslinius tyrimus galima teigti, kad klemastino fumarato identifikavimui plačiai taikomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, nustatant optimalias analizės sąlygas medžiagų išskirstymui ir identifikavimui (eliuentą, gradientinį kitimą, analizės trukmę, kolonėlę).
1.2.13. Loratadino tapatybės nustatymas
Loratadinas aprašytas Europos Farmakopėjoje. Pagal Europos Farmakopėjos straipsnį 01/2010:2124 loratadino tapatybė nustatoma IR spektrofotometrijos metodu. Lyginama su loratadino etaloniniu tirpalu. Jei spektras, gautas tiriant kietos būsenos medžiagą, nesutampa, tiriamoji ir lyginamoji medžiaga tirpinama acetone R, išgarinama ir sausas likutis naudojamas naujo spektro užrašymui.
Loratadino tapatybės nustatymui gali būti naudojamos šios PC tirpiklių sistemos: cikloheksanas, toluenas, dietilaminas (15:3:2 V/V/V) – Rf 0,2; etilacetatas, 25 proc. metanolis,
amoniakas (17:2:1 V/V/V) – Rf 0,78; metanolis – Rf 0,86; etilacetatas – Rf 0,29 [22].
ESC metodikos, tinkamos loratadino tapatybės nustatymui:
1. Kolonėlė: Lichrospher 60 RP-Select B (125 x 4,0 mm i.d., 5 μm) su prieškolonėle Lichrospher 60 RP-Select B (4 x 4,0 mm i.d., 5 μm); judri fazė: 25 mmol/l triamonio fostato buferis, kurio pH 3,0 (eliuentas A) – acetonitrilas (eliuentas B); eliuacijos gradientinis kitimas pateikiamas 3 lentelėje. Prieš kitą injekciją – 10 min trukmės ekvilibriumas; tėkmės greitis: 1 ml/min; detekcija: DMD; standartai: nitro-n-alkanai nuo C1 iki C12 acetonitrile (10 μl/10 ml); RI = 523 [22].
3 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties priklausomybė nuo laiko [22]
Laikas, min Eliuentas A, proc. Eliuentas B, proc.
0 – 30 100→30 0→70
30 – 40 30 70
40 – 43 30→100 70→0
3. Kolonėlė: C8 Symmetry (250 x 4,6 mm i.d., 5μm) su prieškolonėle Symmetry C18 (20 mm);
kolonėlės temperatūra: 30 °C; judri fazė: fosfatinis buferis (pH 3,8) – acetonitrilas; eliuacijos programa pateikta 4 lentelėje. Detekcija: DMD; sulaikymo laikas: 22,9 min [22].
4 lentelė. Eliuentų kiekybės sudėties priklausomybė nuo laiko [22]
Laikas, min Eliuentas A, proc. Eliuentas B, proc.
0 – 6,5 85 15
6,5 – 25 65 35
25 – 28 20 80
28 – 35 20→85 80→15
4. Kolonėlė: LC-18-DB (250 x 4,6 mm i.d., 5 μm); judri fazė: acetonitrilas – vanduo – 0,5 M kalio divandenilio fostatas – ortofosforo rūgštis (440:480:80:1), pH 3,0; tėkmės greitis:1,8 ml/min; vidinis standartas: diazepamas; UV detekcija: λ=200; loratadino sulaikymo laikas: 4,1 min; vidinio standarto sulaikymo laikas: 4,7 min [22].
Mokslinėje literatūroje aprašomi įvairūs loratadino nustatymo metodai. Chen J su kolegomis (2004) atliko loratadino nustatymą žmogaus kraujo plazmoje validuotu ESC-ESI-MS metodu, bei įvertino jo farmakokinetines savybes [9]. Chromatografijos metu naudota kolonėlė: Inertsil ODS-3 (150 mm x 2,1 mm, 5,1 μm); vidinis standartas: SCH 37370; judri fazė: acetonitrilas ir vanduo; pastoviam pH palaikyti naudota 0,02 M skruzdžių rūgštis (pH 4,0); tėkmės greitis: 0,2 ml/min. Analizės laikas: 13 min. Kitas mėginys injekuojamas po 5 min trukmės ekvilibriumo [9]. Loratadino nustatymas ESC-ESI-MS metodu yra jautrus, tikslus, atrankus, tinkamas loratadino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui, farmakokinetinių savybių įvertinimui.
Xuedong B. Su kolegomis (2008) atliko loratadino nustatymą granulėse ESC metodu. Tyrimo metu naudota Agilent XDB-C18 kolonėlė. Judri fazė: acetonitrilas – 0,05 mol/l amonio divandenilio fostato tirpalas (1:1). Pastovus pH 2,5 buvo palaikomas naudojant fosforo rūgštį. UV detekcija atlikta prie 245 nm bangos ilgio [39].
Amini H. su kolegomis (2004) atliko loratadino nustatymą kraujo plazmoje ESC su fluorescenciniu detektoriumi metodu. Buvo naudojamas vidinis standartas – diazepamas. Chromatografija atlika izokratinėmis sąlygomis, naudojant C8 (250 x 4,6 mm, 5 μm) kolonėlę. Judri
fazė: acetonitrilas – 20 mM natrio divandenilio fosfatas – trietilaminas (43:57:0,02), pH 2,4. Tėkmės greitis 1,0 ml/min [7]. Kito loratadino nustatymo ESC su fluorescenciniu detektoriumi metu kaip judri fazė buvo naudotas acetonitrilas – vanduo – ledinė acto rūgštis – trietilaminas (90:100:6:0,15) [38].
Song M. (2004) atliko loratadino tablečių biopraeinamumo tyrimą ESC – MS metodu. Chromatografijai naudota Zorbax – Ext – ODS (150 x 4,6 mm, 5 μm) kolonėlė. Judri fazė: metanolis – acetonitrilas – 2 proc. acto rūgšties tirpalas (62:10:28). Naudotas vidinis standartas – diazepamas [32].
Farmakopėjinis loratadino tapatybės nustatymo metodas yra IR spektrofotometrija. Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą galima matyti, kad loratadino nustatymui dažnai taikomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas.
1.2.14. Desloratadino tapatybės nustatymas
Desloratadinas nėra aprašytas Europos Farmakopėjoje.
ESC metodika, tinkama desloratadino nustatymui: Diamonsil BDS C18 kolonėlė, kurios ilgis
150 mm, vidinis skersmuo 5 mm, porų dydis 5 μm; judri fazė sudaryta iš metanolio, 0,03 mol/l natrio 1-heptansulfonato, ledinės acto rūgšties (70:30:4 V/V/V); tėkmės greitis 1 ml/min; UV detekcija (λ = 247 nm). Desloratadino sulaikymo laikas – 5,4 min [22].
El-Enany N. su kolegomis (2007) atliko desloratadino nustatymą dozuotose vaisto formose ir žmogaus kraujo plazmoje spektrofotometriniu, spektrofluorimetriniu bei ESC metodu [11]. Chromatografavimo sąlygos: cianopropilo kolonėlė (250 x 4,6 mm i.d., 5μm); judri fazė: acetonitrilas – vanduo (60:40 V/V); temperatūra: 25 °C; tėkmės greitis: 1 ml/min; UV detekcija 375 nm. Desloratadino sulaikymo trukmė buvo mažesnė nei 5 min [11]. Šis metodas yra tikslus, efektyvus. Trumpas tiriamosios medžiagos sulaikymo laikas – dar vienas metodo privalumas.
Razib M. su kolegomis (2006) atliko desloratadino nustatymą tabletėse ir sirupe atvirkštinių fazių ESC metodu [26]. Naudota kolonėlė C18 (250 x 3,3 mm i.d., 5μm). Judri fazė buvo sudaryta iš
acetonitrilo ir natrio 1-pentansulfonato monohidrato (60:40 V/V), pastovus pH 3,0 palaikytas naudojant fosforo rūgštį. Tėkmės greitis buvo 1 ml/min, UV detekcija atlikta 254 nm bangos ilgyje. Chromatografija atlikta izoktratinės eliucijos sąlygomis, kambario temperatūroje. Gautas desloratadino sulaikymo laikas buvo 7,46 ± 0,91 min [26]. Metodika buvo naudota desloratadino nustatymui vaisto formose, tačiau ją galima pritaikyti ir preparato nustatymui kraujo plazmoje.
Kitų tyrimų metu atliekant desloratadino nustatymą ESC metodu, kaip judri fazė buvo naudotas metanolis – acetonitrilas – 0,01 mol/l fosfatinis buferis, kurio pH 5,5 (35:35:30 V/V/V/) [18], 0,5 mM vandeninis amonio formiatas – metanolis – acetonitrilas (50:30:20 V/V/V) [37], 10 mM orto-fosforo rūgštis – acetonitrilas (77:23) [8].
Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino mišinio išskirstymui ir junginių tapatybės nustatymui buvo pasirinkta ESC. Tai jautrus, efektyvus, šiuolaikiškas metodas.
Analizuojant mokslinę literatūrą nepavyko rasti metodikos, pagal kurią būtų atliekamas klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino mišinio išskirstymas ir tapatybės nustatymas ESC metodu, tačiau gausu tyrimų, kurių metu atliekamas šių junginių nustatymas atskirai, ne mišinyje. Remiantis išanalizuota literatūra buvo kuriama ir optimizuojama magistro darbo tyrimo metodika.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo planavimas
Atlikus mokslinės literatūros apžvalgą, parenkamos ir analizuojamos klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino ekstrakcijos iš kraujo plazmos ir atskyrimo bei tapatybės nustatymo ESC metodu metodikos.
Nustatomos skysčių – skysčių ekstrakcijos sąlygos ir atliekama pasirinktų preparatų ir jų mišinio ekstrakcija iš kraujo plazmos.
Vaistinių medžiagų mišinio atskyrimui ir identifikavimui eksperimentiniu būdu nustatoma ESC metodika (parenkama kolonėlė, eliuentai, gradientinis kitimas bei kitos sąlygos). Metodika optimizuojama ir validuojama.
Klemastino fumarato, loratadino, desloratadino ir jų mišinio ekstraktai iš kraujo plazmos chromatografuojami, naudojant optimizuotą ir validuotą ESC metodiką.
Apibendrinami gauti rezultatai, įvertinamas metodikos tinkamumas pasirinktų preparatų ekstrakcijai iš kraujo plazmos bei atskyrimui ir tapatybės nustatymui .
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – kraujo plazma, į kurią įterpti antihistamininiai vaistai klemastino fumaratas, loratadinas, desloratadinas bei jų mišinys. Tyrimui naudoti iš Kauno klinikų Kraujo centro gauti kraujo mėginiai, likę po atliktų tyrimų. Leidimo tyrimui iš Bioetikos centro kopija pridedama prieduose (1 priedas).
2.3. Tyrimo metodai
2.3.1. Skysčių – skysčių ekstrakcijos metodika
Reagentai: Trichlormetanas (Sigma – Aldrich, Vokietija) Dichlormetanas (Sigma – Aldrich, Vokietija) Dietileteris (Sigma – Aldrich, Vokietija) Cikloheksanas (Sigma – Aldrich, Vokietija)
10 % amonio hidroksidas (Sigma – Aldrich, Vokietija)
Klemastino fumaratas (Sigma – Aldrich, Vokietija. Grynumas ne mažiau kaip 98 proc.) Loratadinas (Sigma – Aldrich, Vokietija. Grynumas ne mažiau kaip 98 proc.)
Desloratadinas (Sigma – Aldrich, Vokietija. Grynumas nemažiau kaip 98 proc.)
Heparino natrio druska (Heparin Sodium Panpharma 5000 TV/ml injekcijoms, Panpharma, Prancūzija)
Įranga, priemonės. Centrifūga (Mechanika precyzyjna MPW – 310, Varšuva), dalomasis piltuvas, pipetės, cheminės stiklinės, universalus indikatorius.
Ekstrakcija. Į kraujo mėginius pridedama heparino natrio druskos. Kraujo mėginiai 5 min centrifuguojami. Centrifūgos sukimose greitis – 3000 apsisukimų per minutę. Kraujo plazma atskiriama nuo kraujo ląstelių. Ruošiamas kraujo plazmos matricos mėginys (į kraujo plazmą neįterpus tiriamųjų medžiagų). Į 3 ml kraujo plazmos pridedamas 1 ml ESC judrios fazės tirpalo, kadangi jis naudojamas kaip tiriamųjų medžiagų tirpiklis. Rūgštinama 10 proc. oksalo rūgšties tirpalu iki pH 2, pH tikrinant universalaus indikatoriaus popierėliu. Mišinys perkeliamas į dalomąjį piltuvą, pridedami 5 ml ekstrahento. Ekstrahuojama lėtai vartant dalomąjį piltuvą, paliekama 10 min fazių atsiskyrimui. Organinis ekstrahento sluoksnis nupilamas. Vėl pilami 5 ml ekstrahento ir procedūra kartojama dar vieną kartą. Gaunama rūgštinė kraujo plazmos matricos ištrauka, kuri išgarinama iki sauso likučio ne aukštesnėje nei 40 °C temperatūroje.
Likusi terpė šarminama 10 proc. amonio hidroksidu iki pH 8, pH tikrinant universaliaus indikatoriaus popierėliu. Pridedami 5 ml ektrahento. Ektrahuojama lėtai vartant dalomąjį piltuvą, paliekama 10 min fazių atsiskyrimui. Organinis ekstrahento sluoksnis nupilamas. Vėl pilami 5 ml ekstrahento ir procedūra kartojama dar vieną kartą. Gaunama šarminė kraujo plazmos matricos ištrauka. Ji išgarinama iki sauso likučio ne aukštesnėje nei 40 °C temperatūroje.
Tokiu pačiu principu ruošiami kraujo plazmos mėginiai su tiriamosiomis medžiagoms. Į 3 ml plazmos pridedamas 1 ml nustatomosios vaistinės medžiagos 0,1 mg/ml koncentracijos tirpalo judrioje fazėje, naudojamoje atliekant ESC. Rūgštinama 10 proc. oksalo rūgšties tirpalu iki pH 2, pH tikrinant universalaus indikatoriaus popierėliu. Mišinys perkeliamas į dalomąjį piltuvą, pridedami 5 ml ekstrahento. Ekstrahuojama lėtai vartant dalomąjį piltuvą, paliekama 10 min fazių atsiskyrimui. Organinis ekstrahento sluoksnis nupilamas. Vėl pilami 5 ml ekstrahento ir procedūra kartojama dar vieną kartą. Gaunama rūgštinė ištrauka, kuri išgarinama iki sauso likučio ne aukštesnėje nei 40 °C temperatūroje.
Likusi terpė šarminama 10 proc. amonio hidroksidu iki pH 8, pH tikrinant universaliaus indikatoriaus popierėliu. Pridedami 5 ml ektrahento. Ektrahuojama lėtai vartant dalomąjį piltuvą, paliekama 10 min fazių atsiskyrimui. Organinis ekstrahento sluoksnis nupilamas. Vėl pilami 5 ml
ekstrahento ir procedūra kartojama dar vieną kartą. Gaunama šarminė ištrauka. Ji išgarinama iki sauso likučio ne aukštesnėje nei 40 °C temperatūroje.
Procedūra atliekama analogiškai su klemastino fumaratu, loratadinu, desloratadinu bei šių vaistinių medžiagų mišiniu. Ekstrakcija atliekama ekstrahentais naudojant trichlormetaną, dichlormetaną, dietileterį, cikloheksaną.
2.3.2. ESC tyrimo metodika
Reagentai:
Klemastino fumaratas (Sigma – Aldrich, Vokietija. Grynumas ne mažiau kaip 98 proc.) Loratadinas (Sigma – Aldrich, Vokietija. Grynumas ne mažiau kaip 98 proc.)
Desloratadinas (Sigma – Aldrich, Vokietija. Grynumas ne mažiau kaip 98 proc.) Acetonitrilas (Sigma – Aldrich, Vokietija)
Trifluoracto rūgštis (Sigma – Aldrich, Vokietija)
Dejonizuotas vanduo, ruošiamas naudojant išgryninto vandens paruošimo sistemą Millipore. Įranga. Eksperimentui naudojama chromatografinė sistema, sudaryta iš Waters Alliance 2695 chromatografo ir fotodiodų matricos detektoriaus Waters 996, kolonėlė Xterra RP 18 (150 mm x 3,0 mm x 3,5 μm), išorinis termostatas (kolonėlės laikymo temperatūra 25 °C).
Analizė. Optimizuoto chromatografinio metodo judri fazė sudaryta iš 0,1 proc. trifluoracto rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Eliuentų tėkmės greitis – 0,5 ml/min, injekcijos tūris – 10,00 μl., kolonėlės temperatūra – 25 °C. Analizės laikas – 31 min. Junginių detekcija atliekama prie 250 nm bangos ilgio. Eliuacijos gradientinis kitimas pateikiamas 5 lentelėje.
5 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties kitimo priklausomybė nuo laiko
Laikas, min Eliuentas A, proc. Eliuentas B, proc.
0 85,0 15,0
25,0 5,0 95,0
26,0 10,0 90,0
30,0 10,0 90,0
Etaloninių tirpalų ruošimas. Paruošiami 0,1 mg/ml koncentracijos klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino tirpalai, bei jų mišinys iš lygių dalių. Tirpiklis – judri fazė, naudojama chromatografuojant (0,1 proc. trifluoracto rūgštis – acetonitrilas 1:1). Gauti 0,1 mg/ml koncentracijos tirpalai prieš chromatografuojant yra filtruojami pro 0,22 μm porų dydžio PVDF filtrą (Rotilabo, Vokietija).
Tiriamojo tirpalo ruošimas. Ekstrakcijos metu gautos ištraukos išgarinamos iki sauso likučio ne aukštesnėje kaip 40 °C temperatūroje. Sausi likučiai tirpinami 1 ml judrios fazės (0,1 proc. trifluoracto rūgštis – acetonitrilas 1:1). Prieš suleidžiant į chromatografinę kolonėlę mėginiai filtruojami pro 0,22 μm porų dydžio PVDF filtrą (Rotilabo, Vokietija).
Kokybinis nustatymas. Vaistinių medžiagų tapatybė nustatoma pagal jų sulaikymo laiką, lyginant jį su etalonų sulaikymo laiku, ir pagal UV spektrą.
2.4. Duomenų analizes metodai
Duomenys rinkti ir analizuoti naudojant programinę įrangą Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. ESC metodo optimizavimas
ESC metodika antihistamininių vaistų mišinio atskyrimui buvo pasirinkta atlikus mokslinės literatūros analizę. Eksperimentų metu parinkta ESC metodika, tinkama klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino išskirstymui ir identifikavimui, esant jų mišiniui kraujo plazmoje.
Parinkti eliuentai, eliuacijos gradientinis kitimas, analizės trukmė, eliuentų tėkmės greitis, injekcijos tūris, chromatografinė kolonėlė. Junginių aptikimas atliktas prie 250 nm bangos ilgio. Bandymai atlikti naudojant dvi kolonėles – ACE C18 (250 mm x 4,6 mm x 5μm) ir Xterra RP 18 (150 mm x 3,0 mm x 3,5 μm). Junginių optimalus išskirstymas pasiektas naudojant kolonėlę Xterra RP 18 (150 mm x 3,0 mm x 3,5 μm). Vaistinių medžiagų mišinio chromatograma pateikta 5 pav. Gauti šie tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikai: desloratatadino – apie 5,9 min, loratadino – apie 11,4 min, klemastino fumarato apie – 13,2 min.
5 pav. Klemastino fumarato, loratadino, desloratadino mišinio chromatograma (juginių aptikimas atliktas prie 250 nm bangos ilgio), tiriamųjų medžiagų UV spektrai
Optimizuotos metodikos tinkamumui įrodyti buvo atliktas validacinis procesas, nustatant šiuos validacinius parametrus: specifiškumą, glaudumą, ribas ir tiesiškumą, bei aptikimo ir nustatymo ribą.
3.2. ESC metodo validacija
Analitinių procedūrų validacija įrodo jų tinkamumą tyrimui [14]. Validacija buvo atlikta remiantis ICH gairėmis „Validation of analytical procedures: text and methodology“ (Q2(R1)).
Validacijos metu nustatyti šie parametrai: 1. Specifiškumas
2. Rezultatų glaudumas
a. Rezultatų pakartojamumas b. Rezultatų tarpinis preciziškumas 3. Ribos ir tiesiškumas
4. Aptikimo riba 5. Nustatymo riba
3.2.1. Specifiškumas
ICH gairėse Q2(R1) teigiama, kad metodikos specifiškumas yra galimybė vienareikšmiškai įvertinti analitę, net esant kitiems junginiams, kurių galima tikėtis tyrimo metu (pvz.: priemaišoms, skilimo produktams) [14]. Norint įvertinti pasirinktos metodikos specifiškumą buvo chromatografuojamas tiriamųjų medžiagų tirpiklio mėginys (šiuo atveju – eliuentas), kraujo plazmos matricos mėginys (ekstraktas iš kraujo plazmos be tiriamųjų medžiagų), standartinio palyginamojo tirpalo mėginys (tiriamųjų medžiagų mišinys), tiriamasis mėginys (tiriamųjų medžiagų mišinio ekstraktas iš kraujo plazmos). Taip pat įvertinami tiriamųjų medžiagų smailių UV absorbcijos spektrai.
6 pav. 1 - tirpiklio (eliuento) chromatograma, 2 - standartinio palyginamojo tirpalo mėginio chromatograma, 3 - tiriamojo tirpalo mėginio chromatograma, 4 - kraujo plazmos matricos mėginio
chromatograma (junginių aptikimas atliktas prie 250 nm bangos ilgio)
Tiriamojo tirpalo junginių smailės, junginių sulaikymo laikai sutampa su standartinių tirpalų smailėmis. Iš kraujo plazmos neišsiekstrahuoja pašalinės balastinės medžiagos arba jos nesukėlė atsako chromatogramoje. Chromatografuojant tirpiklio mėginį nebuvo nustatytos chromatografinės smailės.
Užregistravus ir įvertinus UV absorbcijos spektrus, tiek standartinių medžiagų, tiek tiriamųjų medžiagų spektrai sutapo. Dėl to galima teigti, kad viena chromatogramos smailė atitinka vieną analitę. Gauti UV spektrai pateikiami 7 – 9 pav. Klemastino fumarato absorbcijos maksimumas pasiekiamas prie 219,9 nm bangos ilgio, loratadino – prie 269,1 nm, desloratadino – prie 281,1 nm.
9 pav. Klemastino fumarato UV spektras
Įvertinus standartinių ir tiriamųjų medžiagų sulaikymo laikus bei UV spektrus galima teigti, kad pasirinktas metodas yra specifiškas ir tinkamas tyrimui.
3.2.2. Rezultatų glaudumas arba preciziškumas
ICH gairėse Q2(R1) teigiama, kad rezultatų glaudumas parodo artumą tarp pakartotinių to paties mėginio matavimų nustatytomis sąlygomis. Jis nustatomas atlikus mažiausiai 6 analizės pakartojimus. Glaudumą apibūdinatys parametrai yra dispersija, standartinis nuokrypis, variacijos koeficientas.
Santykinis standartinis nuokrypis SSN (relative standard deviation RSD) – standartinio nuokrypio ir jo vidurkio reikšmės santykis, išreiškiamas procentais. SSN gali būti apskaičiuojamas pagal sulaikymo laiko ir smailės ploto vidurkius.
Glaudumas įvertintas nustačius rezultatų pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą [14].
3.2.2.1. Rezultatų pakartojamumas
ICH gairėse Q2(R1) teigiama, kad rezultatų pakartojamumas išreiškia glaudumą tomis pačiomis tyrimo sąlygomis per trumpą laiko tarpą. Jis skaičiuojamas pagal tą pačią dieną vienas po kito atliktus matavimus. Variacijos koeficientas neturėtų viršyti 5 proc. [14].
Eksperimento metu apskaičiuotas pakartojamumas sulaikymo laikui ir smailės plotui iš 6 analizės pakartojimų tą pačią dieną, naudojant mišinį, sudarytą iš 0,1 mg/ml loratadino, 0,1 mg/ml desloratadino ir 0,1 mg/ml klemastino fumarato tirpalų judrioje fazėje, sumaišytų lygiomis dalimis. Gauti rezultatai pateikiami 6 lentelėje.
6 lentelė. Tiriamųjų preparatų tirpalų pakartojamumo SSN proc. sulaikymo laikui ir smailės plotui Junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc.
Sulaikymo laikui Smailės plotui
Desloratadinas 0,1 0,8
Loratadinas 0,1 0,2
Klemastino fumaratas 0,1 0,7
Apibendrinant rezultatus galima teigti, kad rezultatų pakartojamumas atitinka keliamus reikalavimus, kadangi SSN sulaikymo laikui ir smailės plotui procentinė išraiška neviršija normos ribų (5 proc.). Remiantis šiuo kriterijumi metodas yra tinkamas pasirinktų vaistinių medžiagų nustatymui.
3.2.2.2. Rezultatų tarpinis preciziškumas
Rezultatų tarpinis preciziškumas išreiškia tyrimo rezultatų įvairavimą, matavimus atlikus skirtingomis dienomis, skirtingų analitikų arba naudojant skirtingą techniką. Tiriant vaistinius preparatus SSN neturėtų viršyti 10 proc. [14].
Apskaičiuotas tarpinis preciziškumas sulaikymo laikui ir smailės plotui. Atlikta 10 to paties mėginio injecijų per 3 dienas. Tyrimui naudotas mišinys, sudarytas iš 0,1 mg/ml loratadino, 0,1 mg/ml desloratadino ir 0,1 mg/ml klemastino fumarato tirpalų judrioje fazėje, sumaišytų lygiomis dalimis. Gauti rezultatai pateikiami 7 lentelėje.
7 lentelė. Tiriamųjų preparatų tirpalų tarpinio preciziškumo SSN proc. sulaikymo laikui ir smailės plotui
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc. Sulaikymo laikui Smailės plotui
Desloratadinas 0,1 0,6
Loratadinas 0,1 0,2
Apibendrinus rezultatus galima teigti, kad tarpinis preciziškumas atitinka keliamus reikalavimus, kadangi SSN sulaikymo laikui ir smailės plotui neviršija normos ribų (10 proc.). Remiantis šiuo kriterijumi metodas yra tinkamas pasirinktų vaistinių medžiagų nustatymui.
3.2.3. Ribos ir tiesiškumas
ICH gairėse Q2(R1) teigiama, kad ribos – tai intervalas tarp viršutinės ir apatinės analitės koncentracijos, kuriame buvo atlikta metodo validacija, įrodytas analitės nustatymo glaudumas, tiesiškumas ir teisingumas. Tai analitės koncentracijos intervalas, tinkamas metodo taikymui [14].
Nustatomas koreliacijos koeficientas R2, kurio reikšmė turi būti ne mažesnė kaip 0,98.
Tirti penkių skirtingų koncentracijų klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino tirpalai judrioje fazėje. Tirpalų koncentracijos: 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,00625 mg/ml. Taigi ribos yra nuo 0,00625 mg/ml iki 0,1 mg/ml. Gautos kalibracinės kreivės pateikiamos 10 – 12 pav.
10 pav. Klemastino fumarato kalibracinis grafikas
Gautas kalibracinis klemastino fumarato grafikas rodo, kad chromatografinės smailės ploto priklausomybė nuo medžiagos koncentracijos yra tiesiška tirtų koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficientas R2 = 0,9997. Jo reikšmė didesnė už 0,98, atitinka keliamus reikalavimus.
11 pav. Loratadino kalibracinis grafikas
Gautas kalibracinis loratadino grafikas rodo, kad chromatografinės smailės ploto priklausomybė nuo medžiagos koncentracijos yra tiesiška tirtų koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficientas R2 = 0,9997. Jo reikšmė didesnė už 0,98, atitinka keliamus reikalavimus.
12 pav. Desloratadino kalibracinis grafikas
Gautas kalibracinis desloratadino grafikas rodo, kad chromatografinės smailės ploto priklausomybė nuo medžiagos koncentracijos yra tiesiška tirtų koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficientas R2 = 0,9997. Jo reikšmė didesnė už 0,98, atitinka keliamus reikalavimus.
Apibendrinus gautus rezultatus galima teigti, kad chromatografinės smailės ploto priklausomybė nuo tirtų koncentracijų yra tiesiška visiems trims junginiams. Koreliacijos koeficiento reikšmės didesnės už 0,98. Tiesiškumas atitinka keliamus reikalavimus. Pagal šį parametrą metodas yra tinkamas kiekybiniam pasirinktų vaistinių medžiagų tyrimui.
3.2.4. Aptikimo riba ir nustatymo riba
ICH gairėse Q2(R1) teigiama, kad aptikimo riba – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, bet nebūtinai tiksliai nustatomas kiekybiškai.
Nustatymo riba – tai mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti kiekybiškai įvertinamas tiksliai ir teisingai.
Nustatant šiuos parametrus atliekami matavimai esant labai nedidelei vaistinės medžiagos koncentracijai mėginyje. Vienas iš galimų aptikimo ir nustatymo ribų apskaičiavimo metodų yra aptikimo ir nustatymo ribų nustatymas naudojant signalo ir bazinės linijos triukšmo santykį S/N (angl. signal to noise ratio). Šis būdas gali būti taikomas analitinėms procedūroms, kurių metu pasireiškia bazinės linijos triukšmas [14].
Nustatomos mažiausios vaistinių medžiagų koncentracijos mėginyje, kurioms esant aptinkama vaistinė medžiaga. Apskaičiuojami S/N. Rezultatai pateikiami 8 lentelėje.
8 lentelė. Desloratadino, loratadino ir klemastino fumarato mažiausios koncentracijos, kurioms esant dar aptinkama vaistinė medžiaga, signalo ir bazinės linijos triukšmo santykiai Vaistinė medžiaga Vaistinės medžiagos
koncentracija (c) mėginyje, μg/ml
Signalo ir bazinės linijos triukšmo santykis (S/N)
Desloratadinas 1,56 1,77
Loratadinas 1,56 6,38
Klemastinas 6,25 4,69
ICH gairėse Q2(R1) nurodyta, kad tuo atveju, kai aptikimo riba yra nustatoma naudojant signalo ir bazinės linijos triukšmo santykį (S/N), turėtų būti pateiktos tai įrodančios mėginių chromatogramos, esant mažiausiai aptinkamai vaistinės medžiagos koncentracijai (13 – 15 pav.).
13 pav. 1,56 μg/ml koncentracijos desloratadino mėginio chromatograma, junginių aptikimą atlikus prie 250 nm bangos ilgio
14 pav. 1,56 μg/ml koncentracijos loratadino mėginio chromatograma, junginių aptikimą atlikus prie 250 nm bangos ilgio
15 pav. 6,25 μg/ml koncentracijos klemastino fumarato mėginio chromatograma, junginių aptikimą atlikus prie 250 nm bangos ilgio
Žinant vaistinių medžiagų koncentracijas bei signalo ir bazinės linijos triukšmo santykius, apskaičiuojamos aptikimo ir nustatymo ribos. Skaičiuojant aptikimo ribą priimtinas S/N yra 3:1, o skaičiuojant nustatymo ribą – 10:1. Rezultatai pateikiami 9 lentelėje.
9 lentelė. Desloratadino, loratadino ir klemastino fumarato aptikimo ir nustatymo ribos Vaistinė medžiaga Aptikimo riba (LOD),
μg/ml Nustatymo riba (LOQ), μg/ml Desloratadinas 2,647 8,8235 Loratadinas 0,7337 2,446 Klemastino fumaratas 4,00 13,36
Gauti rezultatai parodė, kad tirtų junginių aptikimo ir nustatymo ribos ženkliai varijuoja. Mažiausios aptikimo ir nustatymo ribos yra loratadino, o didžiausios – klemastino fumarato.
Atlikus metodo validaciją ir nustačius pagrindines analizės metodo charakteristikas galima daryti išvadą, kad optimizuotas ESC metodas tinkamas mišinio, sudaryto iš klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino išskirstymui. Metodas tinkamas junginių identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui.
3.3. Ekstraktų iš kraujo plazmos tyrimų rezultatai
Tyrimui iš Kauno klinikų Kraujo centro gauti kraujo mėginiai, o ne gryna kraujo plazma, todėl pirmiausiai į kraujo mėginius buvo dedamas heparinas, po to centrifugavimo būdu kraujo plazma buvo atskirta nuo kraujo ląstelių. Prieš atliekant tiriamųjų medžiagų ekstrakciją iš kraujo plazmos buvo paruoštas kraujo plazmos matricos mėginys (į kraujo plazmą neįterpus tiriamųjų medžiagų). Jis buvo reikalingas vertinant ESC metodikos specifiškumą, padėjo išsiaiškinti, ar iš kraujo plazmos neišekstrahuojamos medžiagos, kurios trukdytų tiriamųjų medžiagų nustatymui.
Atlikta kiekvienos tiriamosios medžiagos (klemastino fumarato, loratadino, desloratadino) ekstrakcija iš kraujo plazmos atskirai ir jų mišinio ekstrakcija. Ekstrahentais buvo naudojami organiniai tirpikliai trichlormetanas, dichlormetanas, dietileteris ir cikloheksanas. Ekstrakcija buvo atliekama rūgštinėje ir šarminėje terpėje. Ekstraktų kokybinis tyrimas atliktas naudojant optimizuotą ir validuotą ESC metodiką. Analizės metu išsiaiškinta, kurie organiniai tirpikliai yra tinkami tiriamųjų medžiagų mišinio ekstrakcijai.
3.3.1. Trichlormetaninių ekstraktų rezultatai
Atlikus klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino ekstrakciją iš kraujo plazmos su trichlormetanu rūgštinėje ir šarminėje terpėje, neišsiekstrahavo nei viena tiriamoji medžiaga. Chromatogramose negautas atsakas ties 5,920 min, 11,412 min, 13,243 min. Remiantis tokiais rezultatais galima teigti, kad trichlormatenas yra netinkamas ekstrahentas klemastino fumarato, loratadino ir desloratadino ekstrakcijai iš kraujo plazmos.
