1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS
VIENTISŲJŲ MEDICINOS STUDIJŲ PROGRAMA
TRAIL GENO POLIMORFIZMŲ ĮTAKA KRŪTIES VĖŽIO KLINIKINĖMS IR MORFOLOGINĖMS
SAVYBĖMS BEI KRŪTIES VĖŽIU SERGANČIŲ PACIENČIŲ LIGOS EIGAI
Magistro baigiamasis darbas
Padalinys: LSMU MA MF Onkologijos institutas Darbą atliko: Ieva Čiučiulkaitė Darbo vadovas: Gyd. Erika Korobeinikova Darbo konsultantas: Doc. dr. Rasa Ugenskienė
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 5 2. SUMMARY ... 6 3. PADĖKA ... 7 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 75. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 7
6. SANTRUMPOS ... 8
7. SĄVOKOS ... 10
8. ĮVADAS ... 11
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
9.1 Darbo tikslas ... 12
9.2 Darbo uždaviniai ... 12
10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
10.1 Krūties vėžio problema... 13
10.2 Krūties vėžio prognozės ir predikcijos veiksniai... 14
10.2.1 Metastazės sritiniuose limfmazgiuose ... 15
10.2.2 Pirminio naviko dydis ... 15
10.2.3 Stadija ... 16
10.2.4 Diferenciacijos laipsnis ... 16
10.2.5 Morfologinis naviko tipas ... 17
10.2.6 Invazija į kraujagysles bei limfagysles ... 17
10.2.7 Ki67 indeksas ... 18
10.2.8 Estrogenų ir progesterono receptorių būklė ... 18
10.2.9 HER2 lygis ... 19
3
10.2.11 Multigeniniai testai ... 20
10.2.12 Vieno nukleotido polimorfizmai ... 21
10.3 TRAIL geno ir jo koduojamo baltymo funkcija ... 23
10.4 TRAIL geno vieno nukleotido polimorfizmai ... 25
11. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 28
11.1 Tyrimo planavimas ... 28
11.2 Tyrimo objektas ... 28
11.3 Tiriamųjų atranka ... 28
11.4 Tyrimo metodai ... 29
11.4.1 DNR išskyrimas iš kraujo ... 29
11.4.2 TRAIL geno 1595 C>T ir -716 C>T polimorfizmų nustatymas ... 30
11.4.2.1 Polimerazės grandininė reakcija ... 30
11.4.2.2 PGR-RFIP metodas TRAIL 1595 C>T polimorfizmui nustatyti ... 31
11.4.2.3 PGR-RFIP metodas TRAIL -716 C>T polimorfizmui nustatyti... 32
11.4.3 DNR elektroforezė ... 32
11.4.4. Klinikiniai ir patomorfologiniai naviko duomenys ... 33
11.4.5 Duomenų analizės metodai. SPSS programa ... 33
12. REZULTATAI ... 35
12.1 Klinikinių ir morfologinių krūties naviko savybių, TRAIL -716C>T ir TRAILC>T 1595 genų polimorfizmų bei išgyvenamumo pasiskirstymas tiriamųjų grupėje ... 35
12.2 TRAIL geno TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis ... 36
12.3 TRAIL geno TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų ryšys su jaunų, ankstyvu krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eiga ... 41
13. REZULTATŲ APTARIMAS... 44
14. IŠVADOS ... 47
5
1. SANTRAUKA
Autorius: Ieva Čiučiulkaitė
Darbo pavadinimas: TRAIL geno polimorfizmų įtaka krūties vėžio klinikinėms ir morfologinėms savybėms bei krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eigai.
Tikslas: Nustatyti TRAIL geno polimorfizmų įtaką krūties vėžio klinikinėms ir morfologinėms savybėms bei krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eigai.
Uždaviniai: 1. Nustatyti TRAIL geno TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų pasiskirstymą jaunų, ankstyvu krūties vėžiu sergančių tiriamųjų kohortoje; 2. Išanalizuoti šių polimorfizmų sąsajas su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis; 3. Nustatyti šių polimorfizmų ryšį su jaunų, ankstyu krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eiga.
Tyrimo dalyviai: Tyrime dalyvavo 100 krūties vėžiu sergančių pacienčių. Tyrime dalyvavo pilnametės moterys, sergančios ankstyvu I arba II stadijos (T1, N0, T2 N0, T3 N0, T1 N1, T2 N1) krūties vėžiu, kurių amžius ligos nustatymo metu buvo ≤50 metų, ir kurioms liga prasidėjo iki menopauzės.
Metodika: Tiriamoji DNR buvo išskirta iš periferinio kraujo leukocitų silikagelio kolonėlių metodu. Polimorfizmai TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T buvo tiriami polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo (RFIP) metodu. Fragmentų vizualizavimas buvo atliekamas elektroforezės būdu agarozės gelyje. Rezultatai buvo analizuojami SPSS 23.0 programa.
Tyrimo rezultatai: TRAIL -716C>T CC genotipą turėjo 70% tiriamųjų, CT genotipą – 28% bei TT genotipą – 2%. Alelį C turėjo 84 % tiriamųjų, o alelį T 16% tiriamųjų. TRAIL 1595 C<T CC genotipą turėjo 37% tiriamųjų, CT genotipą – 52% bei TT genotipą – 11%. C alelis pasireiškė 63%, o T alelis 37% tiriamųjų. Tarp TRAIL -716C<T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų genotipų bei alelių ir KV morfologinių bei klinikinių savybių nebuvo nustatyta jokių sąsajų (p>0,05). Taip pat nebuvo rasta reikšmingų bendro išgyvenamumo, laiko iki ligos progreso bei laiko be tolimųjų metastazių skirtumų tarp skirtingų TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų genotipų bei alelių nešiotojų (p>0,05).
6
2. SUMMARY
Author: Ieva Čiučiulkaitė
Title: The influence of TRAIL gene polymorphisms on the clinical and morphological characteristics of breast cancer and on the survival of patients with breast cancer.
Purpose: To determine the influence of TRAIL gene polymorphisms on the clinical and morphological characteristics of breast cancer and on the survival of patients with breast cancer.
Objectives: 1. To determine the distribution of TRAIL -716C>T and TRAIL 1595C>T polymorphisms among young, early-stage breast cancer patients; 2. To analyze the relation between these polymorphisms and the clinical and morphological characteristics of the tumor; 3. To determine the relation between these polymorphisms and survival in young, early-stage breast cancer patients.
Participants: Study sample consisted of 100 women with stage I - II breast cancer (T1, N0, T2 N0, T3 N0, T1 N1, T2 N1) ≤50 years old in premenopausal status at the time of the diagnosis.
Methodology: DNA was isolated from white blood cells using Silica Spin Column Isolation Technology (SSCI). Polymorphisms of TRAIL-716C>T and TRAIL 1595C>T were investigated using Polymerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) method. DNA fragments visualization was done by electrophoresis. Results were analyzed using SPSS 23.0 program.
Results: TRAIL -716C>T CC genotype had 70% patients, CT genotype - 28% and TT genotype - 2%. Allele C had 84% cases and T allele 16% cases. TRAIL 1595 C <T CC genotype had 37% patients, CT genotype - 52% and TT genotype - 11%. Allele C had 63% cases of the cases and allele T 37% cases. There were no correlations between TRAIL-716C <T and TRAIL 1595C>T polymorphism genotypes and alleles and KV morphological and clinical features (p> 0.05). Also, TRAIL-716C>T and TRAIL 1595C>T polymorphisms did not significantly influence overall survival, disease free survival and metastasis free survival (p> 0.05).
7
3. PADĖKA
Esu labai dėkinga darbo mokslinei vadovei gyd. Erikai Korobeinikovai bei darbo konsultantei doc. dr. Rasai Ugenskienei už patarimus ir pagalbą rašant baigiamąjį magistro darbą. Taip pat labai dėkoju LSMU MA MF Onkologijos instituto Onkologijos mokslo laboratorijos darbuotojai Aistei Savukaitytei už pagalbą atliekant genetinius tyrimus.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Interesų konflikto nebuvo.
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Etikos komiteto pavadinimas: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto bioetikos centras Leidimo numeris: BEC-MF-443
8
6. SANTRUMPOS
AJCC – Amerikos jungtinis vėžio komitetas (angl. The American Joint Committee on Cancer) APAF-1 – apoptozės proteazę aktyvuojantis faktorius 1 (angl. Apoptotic protease activating factor 1) CCND1 – cyklinas D
DD – mirties domenas (angl. Death domain)
DISC – mirtį sukeliančio signalo kompleksas (angl. Death-inducing signaling complex) DNR – deoksiribonukleorūgštis
ER – estrogeno receptorius
FADD – su Fas susijęs mirties domenas (angl. Fas-associated death domain) FasL – Fas ligandas
G – naviko diferenciacijos laipsnis (angl. Grade)
HER2 - žmogaus epidermio augimo faktoriaus 2-ojo tipo receptorius (angl. Human epidermal growth factor receptor 2)
IL 10 – interleukinas 10 KV – krūties vėžys
LSMU KK - Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kauno Klinikos
LSMU MA MF – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Medicinos fakultetas M – metastazės (angl. Metastasis)
N – limfmazgiai (angl. Nodes)
PGR – polimerazės grandininė reakcija PR – progesterono receptorius
9 TNF – Tumoro nekrozės faktorius (angl. Tumor necrosis factor)
TNFα – Tumoro nekrozės faktorius alfa (angl. Tumor necrosis factor alpha)
TRAIL – su tumoro nekroze susijęs apoptozę indukuojantis ligandas (angl. Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)
10
7. SĄVOKOS
Kaspazės – proteazių šeima, dalyvaujanti programuotoje ląstelės žūtyje bei uždegimo procesuose. Mirties domenas – mirties receptoriaus regionas, dalyvaujantis perduodant citotoksinį signalą.
Mirties receptariai – TNF šeimos nariai, receptoriai, kurie, prisijungus ligandui, inicijuoja citotoksinį signalą ir įvyksta ląstelės apoptozė.
Nulinis alelis – terminas, apibūdinantis alelio praradimą/nebuvimą, kurio pasekoje genas pakinta ir praranda savo funkciją.
Retasis alelis – antras pagal dažnį pasireiškiantis alelis.
TNM klasifikacija – tarptautinė onkologinių ligų klasifikacijos sistema, skirta nustatyti piktybinio naviko stadiją ir išplitimą. T apibūdina pirminio naviko dydį, N – naviko išplitimą į limfmazgius, M – tolimąsias metastazes, G – diferenciacijos laipsnį, R – operacijos radikalumą, kur R0 – operacija radikali, R1 nurodo mikroskopinį neradikalumą, R2 – makroskopinį neradikalumą.
11
8. ĮVADAS
Lietuvos vėžio registro duomenimis, krūties vėžys (KV) yra antra pagal sergamumą moterų onkologinė liga. Išskirtinai svarbu pastebėti, jog jaunų, 30-54 m. amžiaus, moterų grupėje KV yra dažniausias onkologinis susirgimas ir vyraujanti mirties nuo vėžio priežastis. Dėl labai aukštų sergamumo ir mirtingumo rodiklių, ankstyvas KV jauno amžiaus moterų populiacijoje yra labai aktuali šių dienų medicinos problema. Nepaisant modernaus ankstyvo KV gydymo, parinkto pagal esamus prognostinius bei predikcinius faktorius, dažnai ligos eiga būna agresyvesnė nei tikėtasi ir gydymas nepakankamai efektyvus. Siekiant individualizuoti ir optimizuoti KV gydymą vis daugiau pastangų dedama naujų prognozės žymenų paieškai.
Šiame tyrime kaip potencialius prognozės veiksnius būtent jaunų, ankstyvu KV sergančių moterų grupėje pasirinkta analizuoti su tumoro nekroze susijusio apoptozę indukuojančio ligando (TRAIL) (angl. Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) geno vieno nukleotido polimorfizmus (VNP). TRAIL genas pasirinktas dėl jo anksčiau įrodytos reikšmės navikų augimo reguliavime. Šio geno koduojamas baltymas sukelia programuotą ląstelės žūtį, veikdamas per mirties receptorius. Svarbu tai, jog TRAIL baltymas apoptozę indukuoja išskirtinai vėžinėse ląstelėse, tuo tarpu normalias organizmo ląsteles paveikia retai. Yra nustatyta, kad TRAIL geno -716C>T ir 1595C>T pozicijose esantys polimorfizmai keičia TRAIL baltymo produkciją, todėl turi potencialą modifikuoti vėžinių ląstelių žūties procesus. Literatūroje skelbiamos tik pavienės mažos apimties studijos, nagrinėjusios TRAIL geno polimorfizmus kaip KV prognozės veiksnius, kurių rezultatai prieštaringi. Mūsų tyrimas išskirtinis tuo, jog pirmą kartą šių polimorfizmų dažnis, įtaka KV prognozei ir jų sąsaja su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis vertinama homogeniškoje jaunų, ankstyvu KV sergančių moterų grupėje. Tikimasi, jog mūsų rezultatai prisidės prie KV progonzavimo gerinimo.
12
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
9.1 Darbo tikslas:
Nustatyti TRAIL geno polimorfizmų įtaką krūties vėžio klinikinėms ir morfologinėms savybėms bei krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eigai.
9.2 Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti TRAIL geno TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų pasiskirstymą jaunų, ankstyvu krūties vėžiu sergančių tiriamųjų kohortoje;
13
10. LITERATŪROS APŽVALGA
10.1 Krūties vėžio problema
Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, krūties vėžys (KV) yra dažniausia moterų onkologinė liga ir antra pagal dažnį mirties nuo vėžio priežastis. 2012 m. buvo nustayta 1,67 mln. naujų KV atvejų, ir 522 tūkstančiai mirčių buvo sąlygotos KV [1]. Lietuvoje, vėžio registro duomenimis, KV yra antra pagal sergamumą moterų onkologinė liga, tačiau, svarbu pastebėti, jog jaunų, 30-54 m. amžiaus moterų grupėje, KV yra dažniausias onkologinis susirgimas ir 2012 m. sudarė net 27% visų šios amžiaus grupės vėžio atvejų. 30-50 m. moterų tarpe KV taip pat yra ir vyraujanti mirties nuo vėžio priežastis, 2012 m. lėmusi 24% visų onkologinių ligų sąlygotų mirčių [2].
Jaunų moterų populiacijoje KV pasižymi agresyvesne eiga ir blogesniu išgyvenamumu [3]. Manoma, jog tai sąlygoja besiskiriančios nuo vyrensių moterų navikų biologinės savybės [4]. Labai svarbu tai, kad jaunas pacienčių amžius yra nepriklausomas ankstyvo, I-os – II-os stadijos, krūties vėžio prognozinis veiksnys. Anders su kolegomis, lyginusi žinomus klinikinius ir patologinius prognozinius veiksnius tarp jaunų ir vyresnio amžiaus pacienčių, nustatė, jog jaunesnės nei 40 m. moterys turėjo 39% didesnę riziką numirti nuo KV nei vyresnės pacientės, net jei liga nustatyta I-oje ar II-oje stadijoje [5].
14 10.2 Krūties vėžio prognozės ir predikcijos veiksniai
Krūties vėžys yra heterogeniška liga, pasižyminti daug skirtingų biologinių profilių bei skirtinga prognozinių ir predikcinių požymių raiška tarp individų. Pacientų prognozė priklauso nuo daugelio veiksnių ir gali stipriai skirtis net ir esant panašiam ligos išplitimui. Prognoziniai veiksniai, idealiu atveju, parodo atkryčio, progreso ar mirties nuo vėžio tikimybę. Tuo tarpu predikciniai veiksniai turėtų atskleisti tikėtiną atsaką į planuojamą skirti gydymą. Šiuo metu siekiamybė krūties vėžio gydyme yra individualizuota terapija, kurios esmė - kiekvienai KV pacientei parinkti individualų gydymo planą, pagal objektyviai apskaičiuotą vėžio prognozę, nustatytus predikcijos žymenis, įvertintą gydymo riziką ir naudą, galimus šalutinius poveikius ir asmeninius paciento prioritetus [6]. Per pastaruosius kelis dešimtmečius buvo pasiūlyta daug potencialių biomarkerių, tačiau tik maža dalis yra aktyviai naudojami [7]. To priežastis gali būti ta, kad idealiu atveju biomarkeriai turi atitikti tam tikrus standartus, kuriuos ne visada lengva pasiekti. Norint panaudoti biomarkerį klinikinėje praktikoje, jis turi suteikti reikšmingą ir nepriklausomą prognostinę vertę, jo naudojimas turi būti paprastas, plačiai prieinamas, o rezultatai lengvai interpretuojami klinikinėje praktikoje, tačiau tuo pačiu išlaikant kokybės ir tikslumo standartus [8]. Todėl, nepaisant medicinos progreso ir atsirandančių naujų molekulinių prognostinių testų, kaip Oncotype DX, Mamma Print ir kt., pažeistų regioninių limfmazgių skaičius, naviko dydis bei naviko diferenciacijos laipsnis vis dar išlieka pagrindiniais ir privalomais faktoriais, prognozuojat ligos eigą bei parenkant gydymo metodą naujai diagnozuotam KV [9].
15 10.2.1 Metastazės sritiniuose limfmazgiuose
Naviko išplitimas į regioninius limfmazgius ir pažeistų limfmazgių skaičius yra pagrindinis KV prognostinis faktorius [9]. Lokalus, regioninis ir tolimasis ligos progresas prikauso nuo regioninių limfmazgių būklės [10], o tolimųjų metastazių rizika yra tiesiogiai proporcinga pažeistų regioninių limfmazgių skaičiui [11]. Esant mažam pirminiam navikui, regioninės metastazės gali lemti blogesnę ligos eigą. 5 metų išgyvenamumas tarp moterų, kurioms buvo nustatytas lokalus mažas navikas (T1-2), siekia iki 99%, o tarp moterų, kurioms buvo nustatytas išplitimas į regioninius limfmazgius, nepaisant mažo naviko dydžio – tik iki 85% [12]. Neatsižvelgiant į pirminio naviko dydį, pagal pažeistų limfmazgių skaičių galima prognozuoti 5 metų išgyvenamumą, kuris, esant lokaliai ligai (T1-T4), siekia 82,2%, esant pažeistiems 1-3 limfmazgiams – 73%, 4-12 limfmazgių – 45,7% bei 28,4%, kuomet pažeista daugiau nei 12 limfmazgių. Šis faktorius dažniausiai naudojamas esant ankstyvam KV, sprendžiant dėl adjuvantinės chemoterapijos ar radioterapijos skyrimo [11]. Taigi, naviko išplitimas į regioninius limfmazgius yra stiprus, nepriklausomas ir neigiamą reikšmę turintis prognostinis faktorius.
10.2.2 Pirminio naviko dydis
16 gydymo būdų, naviko dydis išlieka mažai kintantis prognostinis faktorius. Taigi, naviko matmenys yra kitas tikslus, nepriklausomas prognostinis faktorius.
10.2.3 Stadija
Kitas nemažiau svarbus prognozinis veiksnys yra naviko stadija. Šiuo metu krūties naviko stadija yra nustatoma naudojant TNM klinikinę klasifikaciją. Tarptautinės vėžio kontrolės organizacijos (UICC) (angl. The Union for International Cancer Control) bei Amerikos jungtinio vėžio komiteto (AJCC) (angl. The American Joint Committee on Cancer) sukurta ir kartu tobulinama TNM anatominės ligos išplitimo klasifikacija yra visuotinai pripažinta klasifikacija, skirta vėžio stadijai nustatyti. Raidžių derinys TNM reiškia vietinį naviko augimą (T), plitimą į regioninius limfmazgius (N) ir tolimąsias metastazes (M). Naviko priskyrimas tam tikrai stadijai yra paremtas šiomis trimis kategorijomis, o pati stadija apibrėžia paciento prognozę [15,16]. Šios klasifikacijos tikslai yra palengvinti gydymo planavimą, gydymo rezultatų vertinimą bei informacijos mainus tarp skirtingų gydymo centrų, padėti prognozuojant ligos eigą, bei prisidėti prie tolimesnių piktybinių ligų tyrimų [17]. Taigi TNM klasifikacija yra universali, lengvai interpretuojama ir tarptautiniu mastu pritaikoma sistema, kuri sujungia kelis prognostinius faktorius.
10.2.4 Diferenciacijos laipsnis
17 laipsnis yra nepriklausomas prognostinis veiksnys [18]. Taigi, naviko diferenciacijos laipsnis yra reikšmingas prognostinis faktorius.
10.2.5 Morfologinis naviko tipas
Dažniausiai (apie 70 proc.) nustatomas krūties vėžio morfologinis tipas yra invazinė duktalinė karcinoma. Antras pagal dažnį tipas yra invazinė lobulinė karcinoma, nustatomas iki 10%. Retesni tipai apima mucininį, papilinį, komedoninį, tubulinį, medulinį, papilinį ir kt. morfologinius tipus. Lyginant lobulinę ir duktalinę karcinomas su kitais retais KV tipais, lobulinė ir duktalinė karcinomos dažniau pasireiškia III-os ar IV-os stadijos, navikas būna didesnis, dažniau randamas išplitimas į regioninius limfmazgius, todėl dauguma retų morfologinių tipų, kaip mucininis, tubulinis ar papilinis, laikomi geresnės prognozės navikais [19]. Kalbant apie pagrindinių morfologinių tipų, duktalinės ir lobulinės karcinomos, prognozę, labai svarbus faktorius yra laikas. Pestalozzi ir kolegų atliktame tyrime buvo nustatyta, kad per pirmus 6 metus invazine lobuline karcinoma sirgusioms pacientėms tikimybė išgyventi be ligos atkryčio buvo 16% mažesnė nei pacientėms, kurioms buvo diagnozuota invazinė duktalinė karcinoma. Tarp pacienčių, išgyvenusių be atkryčio ilgiau nei 6 metus, net 54% didesnę tikimybę išgyventi be ligos atkryčio turėjo pacientės, kurioms buvo diagnozuota invazinė lobulinė karcinoma lyginant su invazine duktaline karcinoma [20]. Taigi, remiantis naviko morfologiniu tipu, galima numatyti geresnės ar blogesnės eigos ligą.
10.2.6 Invazija į kraujagysles bei limfagysles
18 10.2.7 Ki67 indeksas
Ki67 indeksas yra vienas plačiausiai naudojamų prognostinių biomarkerių. Ki67 yra branduolio baltymas, susijęs su ląstelių proliferacija. Imunohistocheminio krūties vėžinio audinio tyrimo metu žymint šį baltymą galima įvertinti vėžinių ląstelių augimo frakciją. Iki šiol nėra patvirtintos standartizuotos šio biomarkerio vertinimo ir interpretavimo metodikos [22]. Europos navikinių markerių grupė (angl. The European Group on Tumor Markers) sutinka, kad šis biomarkeris gali būti vertinimas prognozuojant krūties vėžio eigą, tačiau jis turėtų būti vertinimas tik kartu su kitais prognostiniais faktoriais. Taip pat į jį vertėtų labiau atsižvelgti tik tada, kuomet jo reikšmė yra <10% (gera prognozė) arba >25% (bloga prognozė). Yra nustatyta, jog Ki67 indeksas yra nepriklausomas prognostinis veiksnys prognozuojant laiką iki ligos atkryčio ir bendrą išgyvenamumą [9, 22].
10.2.8 Estrogenų ir progesterono receptorių būklė
Estrogeno receptoriai yra laikomi KV predikciniais faktoriais. Tai yra intraceliuliniai receptoriai, jie, sąveikaudami su estrogenu, veikia kaip branduolio transkripcijos faktoriai, kurie reguliuoja tam tikrų genų ekspresiją [23]. KV atveju, šie receptoriai skatina ląstelių augimą, skatindami genų MYC ir cyklino D (CCND1) transkripciją. Apie apie 70% KV atvejų yra nustatomi išreikšti ER. Taip pat dažniau šie receptoriai būna išreikšti tarp vyresnio amžiaus moterų [25,36]. ER svarbu įvertinti sprendžiant dėl hormonų terapijos skyrimo [9]. Esant išreikštiems ER ir skiriant hormoninę terapiją (pvz. selektyvius estrogenų receptorių moduliatorius, aromatazės inhibitorius ir kt. medikamentus ar chirurgines priemones – ovarektomiją), dažniau pasiekiama klinikinė vėžio remisija bei pagerėja pacienčių išgyvenamumas be ligos bei bendras išgyvenamumas [24].
19 10.2.9 HER2 lygis
Žmogaus epidermio augimo faktoriaus 2-ojo tipo receptorius dalyvauja normaliuose krūties augimo ir vystymosi procesuose. KV atveju, esant padidėjusiai HER2 geno ekspresijai ir didesniam HER2 baltymo kiekiui ant ląstelės membranos, padidėja receptoriaus aktyvavimosi rizika, dėl ko skatinama ląstelės proliferacija, judrumas bei angiogenezės procesas [23]. HER2 padidėjusi ekspresija yra siejama su agresyvesne ligos eiga, didesne ligos progreso ir mirties tikimybe [11]. Šiuo metu svarbiausias šio predikcinio faktoriaus vaidmuo yra atrenkant pacientes, kurioms reikia skirti taikinių terapiją. Kol kas yra 4 vaistai, kurie gali būti skiriami, esant išreikštiems HER2. Plačiausiai naudojamas ir ištirtas vaistas yra trastuzumabas. Jis gali būti naudojamas tiek kaip neoadjuvantinė, tiek kaip adjuvantinė terapija, taip pat juo gydomos ir pacientės, esant pažengusiai ligai. Buvo nustatyta, kad, skiriant kartu neoadjuvantinę chemoterapiją ir trastuzumabą, pacientėms su išreikštais HER2, 26-65% gydytų pacienčių buvo nustatytas pilnas atsakas į gydymą, tuo tarpu skiriant tik neoadjuvantinę chemoterapiją pilną atsaką į gydymą pasiekė 19-27% tiriamųjų [26]. Taigi, nors ir HER2 yra siejamas su agresyvesne liga bei prastesne prognoze, taikant taikinių terapiją galima tikėtis geresnio atsako į gydymą bei geresnės ligos prognozės.
10.2.10 Pacienčių amžius
20 10.2.11 Multigeniniai testai
Šiandien vis labiau plėtojama idėja apie individualizuotą terapiją gydant KV. Šiam tikslui neužtenka vien tik anksčiau minėtų tradicinių prognostinių faktorių, todėl vis plačiau taikomi molekulinių biomarkerių testai. Šie tyrimai padeda geriau nustatyti naviko savybes ir taip parinkti tinkamiausią gydymą. Tai ypač aktualu vertinant individualią pacientės riziką ir sprendžiant apie chemoterapijos poreikį [23]. Molekuliniai biomarkerių testai dažniausiai yra genetiniai tyrimai, kurių metu tiriama mikro RNR (mRNR). Be to, juos taikant, vienu metu yra tiriamos kelios analitės, todėl šie testai dar vadinami multigenetiniais testais. Plačiausiai naudojami ir labiausiai pripažinti prognostiniai testai yra Oncotype DX, MammaPrint, uPA/PAI-1 [9]. Taip pat naudojami ir tokie testai kaip Breast cancer index, PAM50 ROR, EndoPredict [23]. Visi testai, išskyrus MammaPrint, tinka prognozuoti tiek vėlyvą, tiek ankstyvą ligos atkrytį, tačiau MammaPrint yra vienintelis testas, tinkamas naudoti esant išreikštiems HER2 receptoriams. Taip pat Oncotype DX, MammaPrint ir uPA ir PAI-1 gali būti naudojami sprendžiant dėl adjuvantinės chemoterapijos [9,23].
Oncotype DX – vienas plačiausiai naudojamų, labiausiai pripažintų ir validizuotų testų, kuris naudojamas tiek prognozei tiek predikcijai esant krūties vėžiui. Jo metu yra tiriamas 21 genas mRNR lygmenyje. 16 tiriamų genų yra asocijuoti su vėžiu ir 5 yra kontroliniai genai. Remiantis šių genų tyrimais yra suskaičiuojami atkryčio balai. Pagal gautą balų skaičių pacientė yra priskiriama didelės, vidutinės ar mažos atkryčio rizikos grupei. Taip pat šio testo pagalba galima įvertinti adjuvantinės chemoterapijos poreikį. Labiausiai šis testas yra tinkamas esant teigiamiems ER receptoriams, bei esant tik lokaliai ligai [9].
MammaPrint pirmasis sukurtas genetinis prognostinis testas, kuris tiria 70 genų. Tiriami genai yra atsakingi už apoptozę, augimo skatinimo ir slopinimo signalus, replikaciją, invaziją, metastazes ir angiogenezę. Remiantis šių genų ekpresijos kiekiu, pacientės skirstomos į aukštos ir žemos atkryčio per ateinančius 5 metus rizikos grupes [23].
21 Breast cancer index yra 5 genus tiriantis molekulinis testas. Šis tyrimas gali padėti įvertinti artimo ir tolimo atkryčio riziką, tolimųjų metastazių išsivystymo riziką ir atrinkti pacientes, kurioms reiktų taikyti testinę / prailgintą hormonų terapiją [23].
PAM50 ROR 50 vėžio genų ir 8 kontrolinius genus tiriantis testas. Pirmiausia šie 50 genų buvo pasiūlyti tirti ir nustatyti krūties vėžio potipius: luminalinį A, luminalinį B ir trigubai neigiamą. Dabar galima apskaičiuoti ir atkryčio riziką. Skaičiuojant šią riziką, gauta informacija apie krūties vėžio potipį yra konvertuojama į kliniškai reikšmingą prognostinį balą, kurio reikšmės yra nuo 1 iki 100. Skaičiuojant PAM50 ROR papildomai naudojamas naviko proliferacijos įvertis ir naviko dydis. Šiuo metu šį testą rekomenduojama naudoti tik apskaičiuoti atkryčio rizikai pacientėms postmenopauzėje, esant teigiamiems hormonų receptoriams ir lokaliai ar regioniškai išplitusiai ligai [23].
EndoPredict yra 11 genų tiriantis testas. 8 genai yra vėžio ir 3 kontroliniai genai. Pridėjus limfmazgių būklę ir naviko dydį galima apskaičiuoti klinikinį rizikos balą. Šiuo metu testas yra naudojamas tik Eupropoje bei pacientėms postmenopauzėje [23].
10.2.12 Vieno nukleotido polimorfizmai
22 lokalizuotas TNFSF10 gene (rs113532), o kitas PTGS2 gene (rs5275) [34]. Khan su bendraautoriais atliktos studijos metu buvo vertinama dviejų polimorfizmų įtaka KV, esant išreikštiems ER, gydymo išeitims. Buvo identifikuotas rs992531 polimorfizmas, kurio retasis alelis lėmė prastesnį išgyvenamumą tarp pacienčių, su išreikštais ER. rs992531 yra siejamas su mažesne RHOBTB2 ekspresija. RHOBTB2 yra naviko supresijos genas, todėl sumažėjus šio geno ekspresijai navikas labiau proliferuoja. Kitas šio tyrimo metu rastas polimorfizmas buvo rs7701292 ir jo retasis alelis, turėję įtakos blogesniam pacienčių, gydomų hormonų terapija, išgyvenamumui. Šio polimorfizmo retasis alelis buvo atsakingas už sumažėjusią RAB9P1 geno ekspresiją. Šis genas labai panašus į RAB9A geną, kuris yra atsakingas už naviko progresavimą ir atsparumo vaistams vystymąsi. Sumažėjus RAB9P1 geno ekspresijai, didėja RAB9A geno ekspresija, todėl vystosi atsparumas vaistams [35].
23 genotipas didino išplitimo į regioninius limfmazgius šansus. Tarp likusių dviejų genų ir klinikinių bei morfologinių KV savybių tyrėjai nerado jokių sąsajų [38].
Šie tyrimai įrodė VNP potencialą prognozuojant KV pacienčių naviko savybes bei ligos eigą. Nors VNP dar nėra naudojami klinikinėje praktikoje, įvertinus pastaruoju metu nuolat didėjantį publikacijų šia tema skaičių, galima teigti, jog tai yra potenciali prognostinių KV markerių tyrimų sritis. Svarbu pažymėti, kad skelbiami skirtingų tyrėjų gauti rezultatai neretai skiriasi. Rezultatų nesutapimai tarp tyrimų galėtų būti paaiškinami metodologiniais skirtumais, skirtingų etninių grupių dalyvių įtraukimu į vieną tyrimą bei kai kurių tyrimų mažomis imtimis. Todėl yra didelis poreikis toliau plėtoti kokybiškus (paremtus vieningomis tarptautinėmis biomarkerių tyrimų metodologijos rekomendacijomis) VNP prognozinės reikšmės tyrimus įtraukiant kuo daugiau skirtingos kilmės tiriamųjų [30].
10.3 TRAIL geno ir jo koduojamo baltymo funkcija
TRAIL genas (taip pat žinomas kaip ApoL2) yra Tumoro nekrozės faktoriaus (TNF) (angl. Tumor necrosis factor) genų šeimos narys, kuris buvo atrastas 1995 metais, remiantis jo panašumu į APO1/Fas ligandą (FasL), bei kitus TNF šeimos narius [39]. TRAIL yra lokalizuotas 3 chromosomos ilgajame petyje 3q26 lokuse ir sudarytas iš 5 egzonų bei koduoja 281 amino rūgšties baltymą [38]. Kaip ir daugelis TNF genų šeimos narių, TRAIL genas dalyvauja imuninio atsako reguliacijoje ir programuotos ląstelės mirties procesuose [40-42].
TRAIL geno ekspresija vyksta įvairiuose organuose. Daugiausiai TRAIL baltymo sintetinama plaučiuose, žarnose, šlapimo pūslėje, placentoje, tačiau mažesniais kiekiais šis baltymas randamas daugelyje organų. Taip pat su membrana susijęs TRAIL baltymas gaminamas ir imuninėse ląstelėse: monocituose, B limfocituose, dendritinėse ląstelėse, natūraliuosiuose žudikuose , makrofaguose [43-46].
TRAIL yra II tipo transmembraninis glikoproteinas, membranos paviršiuje formuojantis homotrimerą, kurio kiekvieną monomerą sudaro dvi antiparalelinės β klostės. Šio baltymo ekstraceliulinis ilgasis C (karboksi)-galas yra homologiškas kitiems TNF šeimos citokinams, o trumpesnis intraceliulinis N (amino)-galas skiriasi nuo kitų TNF šeimos narių. Baltymo ekstraceliulinė dalis, atsiskyrusi tampa tirpia aktyvia forma, kuri dalyvauja ląsteliniuose procesuose [39, 47].
24 paviršiuje. Yra nustatyti 5 TRAIL receptoriai, 4 homologiški receptoriai- DR5, DR4, DcR1 DcR2, bei penktasis OPG receptorius, kuris nėra toks artimas likusiems keturiems receptoriams. Tik du, DR5 ir DR4, iš šių receptorių turi veiklų intraceliulinį mirties domeną (DD) (angl. Death domain), gali perduoti signalą ląstelei, aktyvuoti tolimesnę kaskadą bei sukelti apoptozę. Likę trys receptoriai gali prisijungti TRAIL, tačiau jie nesukelia apoptozės. DcR1 ir DcR2 receptoriai ekstraceliuline dalimi yra homologiški DR5 ir DR4 receptoriams, tačiau DcR2 turi nefunkcionuojantį, sutrumpėjusį mirties domeną, DcR1 receptorius turi tik ekstraceliulinę dalį, o su ląstelės membrana jį jungia glikofosfolipidinė jungtis. OPG receptoriaus afinitetas TRAIL fiziologinėje temperatūroje yra labai žemas, tačiau ligandui prisijungus prie šio receptoriaus apoptozė taip pat nevyksta. Manoma, kad DcR1, DcR2 bei OPG receptoriai gali veikti kaip apoptozės slopintojai dėl savo sugebėjimo prisijungti TRAIL ir tokiu būdu sumažinti ligando kiekį, tačiau nesukelti apoptozės [47].
TRAIL prisijungus prie DR4 ar DR5 receptoriaus, ligando ir receptoriaus sąveika sąlygoja su FAS susijusio mirties domeno (FADD) (angl. Fas-associated death domain) prisijungimą. Toliau prie FADD prisijungia prokaspazė-8 arba prokaspazė-10. Susidaręs kompleksas vadinamas mirtį indukuojančio signalo kompleksas (DISC) (angl. Death-inducing signaling complex). Prisijungus kaspazėms prie FADD jos aktyvuojamos. Aktyvi kaspazė 8/10 toliau suskaldo ir taip aktyvuoja efektorines 3/6/7 kaspazes, kurios sukelia apoptozę [48]. Toks apoptozės kelias vyksta 1 tipo ląstelėse, kur kaspazės 8/10 yra pakankamai aktyvios, kad galėtų aktyvuoti efektorines kaspazes, kurios sukelia apoptozę. 2 tipo ląstelėse kaspazė 8/10 nėra tokia aktyvi, todėl DISC signalas turi būti sustiprintas [49]. Šio proceso metu dalyvauja mitochondrijos bei baltymas vadinamas Bid. Vykstant šiam apoptozės keliui, aktyvi kaspazė 8/10 suskaldo Bid ir atskilusi baltymo dalis tBid prisijungia prie išorinės mitochondrijos membranos. Mitochondrijose tBid prisijungia ir aktyvuoja Bcl-2 šeimos baltymus Bax ir Bak. Dėl šio proceso iš mitochondrijos išsiskiria citochromas C bei kitos proapoptotiškai veikiančios medžiagos. Citoplazmoje citochromas c jungiasi su apoptozės proteazę aktyvuojančiu faktoriumi 1 (APAF-1) (angl. Apoptotic protease activating factor 1) ir suformuoja apoptosomą. Ši apoptosoma aktyvuoja kaspazę 9, o aktyvi kaspazė 9 toliau aktyvuoja efektorines kaspazes 3/6/7 ir prasideda ląstelės apoptozė [47].
25 hormonaliai teigiamose (esant išreikštiems ER arba PR) KV ląstelių linijose TRAIL efektas ženkliai mažesnis. Taip pat pastebėta, kad jautresni trigubai neigiami navikai, turintys mezenchiminių savybių. Tiriant TRAIL receptorius buvo nustatyta, kad KV ląstelės sintetina tiek DR4 (taip pat žinomas kaip TRAIL-R1), tiek DR5 (taip pat žinomas kaip TRAIL-R2) receptorius, ir jie abu gali sukelti apoptozę, tačiau dominuojantis apoptozės mediatorius yra DR5. Tiriant receptorių ekspresiją buvos rasta, kad abiejų receptorių ekspresija tiek esant jautriems, tiek nejautriems TRAIL sukeltai apoptozei navikams išlieka panaši. Tiriant apoptozę slopinančių receptorių ekspresiją, nebuvo nustatyta jos skirtumų tarp TRAIL jautrių ir nejautrių KV ląstelių. Nebuvo nustatyta ir tai, kad DR4 bei DR5 mutacijos bei sekos variacijos turėtų įtakos TRAIL sukeltos apoptozės jautrumui. Taip pat buvo nagrinėta ir TRAIL sukeltos apoptozės kaskadoje dalyvaujančių komponentų įtaka TRAIL sukeltos apoptozės jautrumui, tačiau nebuvo nustatyta, kad šių komponentų aktyvumo ar kiekio pokyčiai būtų tiesiogiai susiję su jautrumu TRAIL [50]. Taigi, nors TRAIL gali sukelti apoptozę bei visos KV ląstelės sintetina TRAIL receptorius, fenototipiškai skirtingos KV ląstelės yra nevienodai jautrios TRAIL.
Išskirtinė TRAIL baltymo savybė sukelti apoptozę išskirtinai vėžinėse ląstelėse paskatino ir jo, kaip terapinio preparato tyrimus. Tačiau nustatyta, jog krūties vėžio ląstelės ilgainiui įgyja atsparumą TRAIL preparatams, todėl vis dar ieškoma būdų, kaip išvengti įgyto vėžinių ląstelių atsparumo ir galimo TRAIL pritaikymo KV vėžio gydymui [51]
Įvertinus TRAIL geno rolę, programuotos ląstelių žūties mechanizmuose, TRAIL baltymo poveikį krūties vėžio ląstelių linijose, tampa įdomu įvertinti šio geno ekspresiją reguliuojančių vieno nukleotido polimorfizmų įtaką KV eigai.
10.4 TRAIL geno vieno nukleotido polimorfizmai
26 Gana plačiai yra ištirtas TRAIL geno polimorfizmas, esantis 1595 pozicijoje, kurio įtaka KV yra nagrinėjama ir šio tyrimo metu. Atliekant tyrimus pacientams, sergantiems suriebėjusių kepenų liga bei opiniu kolitu, buvo nustatyta, kad šis polimorfizmas yra funkcinis, t.y. nuo jo priklauso susintetinamo TRAIL baltymo kiekis. [52-54]. Tiriant opniniu kolitu sergančius pacientus buvo nustatyta didesnė TRAIL baltymo koncentracija tarp turinčiųjų CC bei CT genotipus [53]. Tiriant pacientus, sergančius suriebėjusių kepenų liga, buvo rasta mažiausia TRAIL baltymo koncentracija tarp turinčiųjų TT genotipą [54].
Kelios mokslininkų grupės tyrė TRAIL 1595C>T polimorfizmo įtaką vėžinėms bei ne vėžinėms ligoms. Verim ir kiti tyrė TRAIL 1595C>T polimorfizmą tarp pacientų, sergančių plokščialąsteliniu gerklų vėžiu, tačiau nenustatė statistiškai reikšmingos šio polimorfizmo genotipų bei alelių įtakos ligos eigai [55]. Kita studija buvo atlikta su prostatos vėžiu. Jos metu buvo nustatyta, kad TRAIL 1595 C>T CTgenotipas dažniau pasireiškė tarp sergančiųjų prostatos vėžiu [56]. Taip pat buvo atlikta dar viena studija su skrandžio vėžiu. Wang ir kiti nustatė, kad T alelis pasireiškė rečiau tarp sergančiųjų skrandžio vėžiu nei tarp sveikų žmonių. Be to, T alelio nešiotojai, segantys skrandžio vėžiu, rečiau turėjo prastos diferenciacijos skrandžio adenokarcinomą [57]. Kalbant apie ne vėžinius susirgimus, tiriant TRAIL 1595C>T polimorfizmo genotipų ir alelių įtaką išsėtinės sklerozės išsivystymui, buvo nustatytas didesnis CC genotipo bei C alelio dažnis tarp sergančiųjų nei tarp kontrolinės sveikų tiriamųjų grupės narių. Įrodyta, kad CC genotipas yra nepriklausomas išsėtinės sklerozės rizikos faktorius [58]. Dažnesnis TRAIL 1595C>T CC genotipas bei C alelis buvo nustatytas ir tarp sergančiųjų 2 tipo cukriniu diabetu nei tarp sveikų kontrolinės grupės narių. Taip pat šio tyrimo metu CC genotipo nešiotojams buvo nustatytas didesnis trigliceridų ir kreatinino kiekis kraujo serume nei TT genotipo nešiotojams bei mažesnis gliukozės kiekis kraujyje nei CT genotipo turėtojams [59]. Dar viena studija tyrė TRAIL 1595C>T polimorfizmo įtaką suriebėjusių kepenų ligai. TT genotipas buvo susijęs su mažesne šios ligos rizika bei mažesniu kepenų suriebėjimu esant nealkoholinei suriebėjusių kepenų ligai [54].
27 skirtumų šios studijos metu nebuvo gauta [60]. Kita studija tyrinėjo šio polimorfizmo sąsajas su įvairiais limfomų tipais. Tyrimo metu rasta, kad alelis A dažniau pasireiškė tarp sergančiųjų limfomomis nei tarp sveikų kontrolinės grupės narių. Ši sąsaja išliko ir vertinant polimorfizmo įtaką atkirai moterims bei vyrams [62].
Abu šie funkciniai polimorfizmai buvo tirti ir KV sergančių pacienčių tarpe. Buvo nagrinėjama šių polimorfizmų įtaka krūties vėžio išsivystymui, taip pat įtaka klinikinėms ir morfologinėms KV savybėms. Lyginant KV sergančias ir sveikas moteris nebuvo nustatyta jokių statistiškai reikšmingų skirtumų tarp TRAIL 1595C>T polimorfizmo genotipų variantų. Vertinant TRAIL -716C>T polimorfizmo genotipus buvo rasta, kad CC genotipas bei C alelis dažniau pasireiškė tarp sergančiųjų KV nei tarp sveikų moterų. Taip pat buvo rasta abiejų polimorfizmų įtaka KV klinikinėms ir morfologinėms savybėms [61, 63, 64].
28
11. TYRIMO METODIKA IR METODAI
11.1 Tyrimo planavimas
Darbas buvo pradėtas nuo literatūros paieškos ir analizės. Duomenų bazėse buvo renkami straipsniai apie KV problemą, prognostinius bei predikcinius KV veiksnius, TRAIL geną, šio geno VNP įtaką KV savybėms ir vėliau atliekama surinktų straipsnių analizė. Šio etapo metu buvo patebėta, kad tyrimų, nagrinėjančių šią temą, yra vos keli, informacijos šia tema yra labai mažai ir kol kas nėra vienareikšmiško atsakymo apie TRAIL geno polimorfizmų įtaką KV. Aptarus literatūros analizės rezultatus su mokslinio darbo vadove bei konsultante, buvo nuspręsta atlikti tyrimą, kurio metu buvo tikrinama TRAIL geno 1595 C>T ir -716 C>T polimorfizmų įtaka krūties vėžio klinikinėms ir morfologinėms savybėms bei pacienčių išgyvenamumui. Baigiamojo magistro darbo laboratoriniai tyrimai buvo atliekami LSMU MA MF Onkologijos instituto Onkologijos mokslo laboratorijoje.
11.2 Tyrimo objektas
TRAIL geno 1595 C>T ir -716 C>T polimorfizmai ankstyvu KV sergančių moterų kraujyje bei šių polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis ir morfologinėmis krūties vėžio savybėmis bei pacienčių išgyvenamumu.
11.3 Tiriamųjų atranka
29 11.4 Tyrimo metodai
11.4.1 DNR išskyrimas iš kraujo
Tiriamajai DNR iš periferinio kraujo leukocitų išskirti buvo taikomas silikagelio kolonėlių metodas Tyrimų metu buvo naudojamas „PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen)“ DNR išskyrimo rinkinys. DNR išskyrimo procedūrą sudarė du etapai: ląstelių lizavimas bei DNR išvalymas ir eliucija. 1. Ląstelių lizavimas
− 200 μl kraujo, 20 μl proteinazės K ir 20 μl RNazės A pilama į sterilų centrifūginį mėgintuvėlį. Gautas mišinys sumaišomas, supurtomas ir paliekamas 2 minutėms kambario temperatūroje.
− Tada pilama 200 μl lizės buferio (PureLink®Genomic Lysis/Binding Buffer) ir vėl viskas sumaišoma ir supurtoma.
− Atliekama inkubacija 55 ◦C temperatūroje 10 minučių.
− Pilama 200 μl 96–100 % etanolio. Gautas mišinys sumaišomas ir supurtomas. 2. DNR išvalymas ir eliucija
− Ląstelių lizavimo metu gautas mišinys perkeliamas ant PureLink® Spin Column išvalymo kolonėlės. − Kolonėlė įstatoma į skysčių surinkimo mėgintuvėlį.
− Atliekamas centrifūgavimas 10 000 xg per minutę greičiu. Po procedūros skysčių surinkimo mėgintuvėlis pakeičiamas nauju.
− Tada 500 μl DNR plovimo buferio 1 (DNA Wash Buffer 1) pilama ant DNR išvalymo kolonėlės. − Dar kartą centrifūguojama 10 000 xg per minutę greičiu.
− Skystis išpilamas iš surinkimo mėgintuvėlio ir vėl įstatoma DNR išvalymo kolonėlė, ant kurios pilama 500 μl DNR plovimo buferio 2 (DNA Wash Buffer 2).
30 11.4.2 TRAIL geno 1595 C>T ir -716 C>T polimorfizmų nustatymas
11.4.2.1 Polimerazės grandininė reakcija
TRAIL geno 1595C>T ir -716C>T polimorfizmų tyrimo metu, pirmiausia buvo amplifikuoti DNR fragmentai naudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR). Naudotų PGR mišinių sudėtis pateikta 1 ir 2 lentelėse. Atliekant kiekvieną PGR reakciją buvo naudota 2 μl DNR tirpalo ir 23 μl PGR reakcijos mišinio. Abiems polimorfizmams, remianatis studijomis, buvo parinkti atitinkami pradmenys, kurie pateikti 3 ir 4 lentelėse [59,65]. PGR reakcijų, taikytų TRAIL 1595 C>T ir -716 C>T polimorfizmų tyrimams, atlikimo sąlygos ir eiga nurodytos 5 bei 6 lentelėse.
1 lentelė. PGR mišinio sudėtis naudota tiriant TRAIL geno 1595 C>T polimorfizmą
Medžiaga Medžiagos kiekis 1 mėginiui (μl)
H2O 19,275
10xDreamTaq buferis 2,5
dNTP (10mM) 0,5
Pradmuo F (20pmol/µl) 0,3 Pradmuo R (20pmol/µl) 0,3 DreamTaq polimerazė (5u/µl) 0,125
2 lentelė. PGR mišinio sudėtis naudota tiriant TRAIL geno -716 C>T polimorfizmą
Medžiaga Medžiagos kiekis 1 mėginiui (μl)
H2O 18,275 10xDreamTaq buferis 2,5 dNTP (10mM) 0,5 Pradmuo F (20pmol/µl) 0,3 Pradmuo R (20pmol/µl) 0,3 DMSO 1
DreamTaq polimerazė (5u/µl) 0,125
3 lentelė. Pradmenų sekos TRAIL geno 1595 C>T polimorfizmo nustatytmui
Pradmuo Pradmens seka
Tiesioginis 5’-aacatcttctgtctttataatc -3’
31 4 lentelė. Pradmenų sekos TRAIL geno -716 C>T polimorfizmo nustatytmui
Pradmuo Pradmens seka
Tiesioginis 5’-cctgtgtgttaggctggcca-3’
Atvirkštinis 5-‘tctgatagtggggagatttgg-3’
5 lentelė. PGR programa TRAIL geno 1595 C>T polimorfizmo nustatytmui
Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
95ºC 5 min - 95ºC 45 s 35 48ºC 45 s 72ºC 45 s 72ºC 7 min -
6 lentelė. PGR programa TRAIL geno -716 C>T polimorfizmo nustatytmui
Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
95ºC 5 min - 95ºC 30 s 35 52ºC 30 s 72ºC 30 s 72ºC 7 min -
11.4.2.2 PGR-RFIP metodas TRAIL 1595 C>T polimorfizmui nustatyti
TRAIL 1595C>T polimorfizmui nustatyti buvo taikomas restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (RFIP) metodas. Šio metodo metu buvo naudojama HinfI restrikcijos endonukleazė. Esant C aleliui, fermentas PGR reakcijos metu pagausintą 483 bp produktą kerpa į du 353 bp ir 130 bp fragmentus. Esant T aleliui, pagausintas DNR fragmentas lieka nesukarpytas. Atliekant karpymą PGR-RFIP metodu buvo naudojama 10μl PGR produkto ir 5,5μl mišinio, kurio sudėtis pateikta 7 lentelėje. Reakcija vyko 37 °C temperatūroje, 1-16val.
7 lentelė. RFIP mišinio sudėtis TRAIL 1595 C>T polimorfizmui nustatyti
Medžiaga Medžiagos kiekis 1 mėginiui (μl)
Restikcijos endonukleazė HinfI(10u/µl)
0,75μl
10xbuferis R 1 μl
32 11.4.2.3 PGR-RFIP metodas TRAIL -716 C>T polimorfizmui nustatyti
TRAIL -716 C>T polimorfizmui nustatyti taip pat buvo taikomas RFIP metodas. Atliekant reakciją buvo naudojama MvaI restrikcijos endonukleazė. Esant C aleliui, endonukleazė 201 bp produktą kerpa į du 181 bp ir 20 bp fragmentus. Esant T aleliui, pagausintas DNR fragmentas lieka nesukarpytas. Atliekant karpymą PGR-RFIP metodu buvo naudojama 10μl PGR produkto ir 5,5μl mišinio, kurio sudėtis pateikta 8 lentelėje. Reakcija vyko 37 °C temperatūroje, 1-16val.
8 lentelė. RFIP mišinio sudėtis TRAIL -716 C>T polimorfizmui nustatyti Medžiaga Medžiagos kiekis 1 mėginiui (μl) Restikcijos endonukleazė MvaI
(10u/µl)
0,75μl
10xbuferis R 1 μl
H2O 3,75 μl
11.4.3 DNR elektroforezė
PGR-RFIP metodu gauti produktai buvo frakcionuojami elektroforezės būdu. Elektroforezė buvo atlikta horizontalioje vonelėje, naudojant 2% agarozės gelį. Pirmiausia buvo pagamintas 1xTBE buferis (50 ml 1xTBE buferio atskiesta su 450 ml distiliuoto vandens). Tada buvo gaminamas gelis iš 1g agarozės ir 50 ml 1xTBE buferio.Sumaišius, gautas mišinys buvo kaitinamas iki kol ištirpo agarozė, ir mišinys tapo skaidrus. Tada į mišinį buvo įlašinta 5 μl etidžio bromido ir viskas išmaišyta iki tolygaus pasiskirstymo. Gautas mišinys buvo supiltas į rėmelį ir paliktas stingti. Sustingus geliui, rėmelis buvo įdėtas į elektroforezės vonelę, užpildytą 1xTBE buferiu.
Elektroforezės eiga:
33 − Elektroforezė buvo atliekama esant 5 V/cm įtampai. Tiriant 1595 C>T polimorfizmą elektroforezė truko
40 min., o tiriant –716 C>T polimorfizmą – 50 min.
− Elektroforezės rezultatai buvo vizualizuojami transiliuminatoriuje UV šviesoje (gelių dokumentavimo sistema ClearView UV transiluminator, CleaverScientific Ltd., Jungtinė karalystė).
11.4.4. Klinikiniai ir patomorfologiniai naviko duomenys
Tyrime naudoti klinikiniai bei naviko patomorfologiniai duomenys buvo renkami iš medicininės pacienčių dokumentacijos. Renkant patomorfologinius naviko duomenis buvo remiamasi LSMU KK pataloginės anatomijos klinikos pateiktais naviko histologinio tyrimo atsakymais. Naviko receptorių raiška buvo tirta imunohistochemiškai. Remiantis receptorių raiška navikai buvo suskirstyti į Luminalinį A, Luminalinį B, HER2 ir trigubai neigiamą subtipus.
Pacienčių stebėjimo laikotarpis truko nuo 2005 m. iki 2018 m. sausio 1d., kurio metu buvo sekama pacienčių ligos eiga. Tiek vietinis, tiek sisteminis ligos išplitimas buvo laikomas ligos progresu. Atskaitos taškas išgyvenamumo analizėje buvo pirminės biopsijos (KV diagnozės nustatytmo) data. Laikas iki ligos atkryčio buvo apibūdintas kaip laikas nuo pirminės biopsijos iki lokalaus arba tolimojo ligos progreso arba mirties dėl bet kurios priežasties. Laikas be tolimųjų metastazių buvo apibūdintas kaip laikas nuo pirminės biopsijos iki tolimujų metastazių išsivystymo arba mirties dėl bet kokios priežasties. Bendras išgyvenamumas vertintas kaip laikas nuo pirminės biopsijos iki mirties dėl bet kurios priežasties.
11.4.5 Duomenų analizės metodai. SPSS programa
35
12. REZULTATAI
12.1 Klinikinių ir morfologinių krūties naviko savybių, TRAIL -716C>T ir TRAILC>T 1595 genų polimorfizmų bei išgyvenamumo pasiskirstymas tiriamųjų grupėje
Tyrime dalyvavo 100 ankstyvu krūties vėžiu sirgusių pacienčių, kurių dauguma buvo vyresnės nei 40 metų (66%.). Vertinant naviko dydį, 66% tirtų moterų, remiantis TNM klasifikacija, buvo nustatytas pT1 navikas ir 34% – pT2. Vertinant limfmazgius bei remiantis ta pačia klasifikacija, 55% tiriamųjų nustatytas pN0 ir 45% – pN1. 71% tiriamųjų navikai buvo gerai arba vidutiniškai diferencijuoti (naviko diferenciacijos laipsnis atitinakami G1 arba G2) ir 29% – blogai diferencijuoti (G3). ER ekspresija buvo nustatyta 57% tirtų navikų, PR – 48% bei HER2 – 22%. Luminalinis A arba B subtipai buvo nustatyti 64% tirtų pacienčių, HER2 subtipą turėjo 9% tiriamųjų bei 27% pacienčių buvo nustatytas trigubai neigiamas subtipas.
Bendro išgyvenamumo stebėjimo laiko mediana cenzūravimo metu buvo 105,5 mėnesio (intervalas 28 – 200). Cenzūravimo metu 15% tirtų moterų buvo mirusios (visos dėl krūties vėžio progreso), 25% iki cenzūravimo datos buvo pasireiškęs lokalus ir/ar tolimasis ligos progresas, 22 % buvo nustatytos tolimosios metastazės.
Tiriamųjų TRAIL -716C>T ir 1595C>T polimorfizmų genotipų ir alelių pasiskirstymas pateiktas 9 lentelėje. Abiejų polimorfizmų genotipų dažnis tirtoje populiacijoje atitiko Hardžio-Veinbergo dėsnį.
9 lentelė. TRAIL geno -716C>T ir 1595C>T polimorfizmų alelių ir genotipų pasiskirstymas tiriamojoje grupėje
TRAIL geno polimorfizmas
Alelių ir genotipų pasiskirstymas (N; dažnis)
C T CC CT TT
-716 C>T 84 16 70 28 2
0.84 0.16 0.7 0.28 0.02
1595 C>T 63 37 37 52 11
36 12.2 TRAIL geno TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis bei morfologinėmis naviko savybėmis
Tiriant TRAIL -716C>T genotipų CC, CT ir TT įtaką naviko morfologinėms ir klinikinėms savybėms, nebuvo rasta statistiškai reikšmingų sąsajų tarp šių genų ir krūties naviko dydžio, išplitimo į limfmazgius, diferenciacijos laipsnio, receptorių (ER, PR, HER2) ekspresijos bei krūties vėžio subtipų. Taip pat nebuvo nustatyta statistiškai reikšmingo ryšio tarp TRAIL -716C>T genotipų ir pacienčių mirties nuo ligos ar progreso išsivystymo (10 lentelė).
10 lentelė. TRAIL geno -716 C>T polimorfizmo genotipų ryšio su krūties vėžio klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis statistinė analizė
Klinikinės ir morfologinės naviko
savybės
37 Yra 18 (25,7%) 7 (25,0%) 0 (0,0%) Nėra 52 (74,3%) 21 (75,0%) 2 (100,0%) Mirties faktas 0,822 Yra 11 (15,7%) 4 (14,3%) 0 (0,0%) Nėra 59 (84,3%) 24 (85,7%) 2 (100,0%)
Tiriant TRAIL 1595C>T genotipų CC, CT ir TT įtaką naviko morfologinėms ir klinikinėms savybėms nebuvo rasta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šių genų ir krūties naviko dydžio, išplitimo į limfmazgius, diferenciacijos laipsnio, receptorių (ER, PR, HER2) ekspresijos bei krūties vėžio subtipų. Taip pat šie genotipai neturėjo įtakos pacienčių mirties nuo ligos ar progreso išsivystymo dažniui (11 lentelė).
11 lentelė. TRAIL geno 1595C>T polimorfizmo genotipų ryšio su krūties vėžio klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis statistinė analizė
Klinikinės ir morfologinės naviko
savybės
38 Progreso faktas 0,838 Yra 10 (27,0%) 13 (25,0%) 2 (18,2%) Nėra 27 (73,0%) 39 (75,0%) 9 (81,8%) Mirties faktas 0,333 Yra 6 (16,2%) 9 (17,3%) 0 (0,0%) Nėra 31 (83,8%) 43 (82,7%) 11 (100,0%)
Tyrimo metu nebuvo nustatyta statiškai reikšmingų skirtumų tarp TRAIL -716C>T alelių C ir T bei naviko morfologinių ir klinikinių savybių, bei pacienčių mirties nuo ligos ar progreso išsivystymo dažnio (12 ir 13 lentelės).
12 lentelė. TRAIL geno -716C>T polimorfizmo alelio C ryšio su krūties vėžio klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis statistinė analizė
Klinikinės ir morfologinės naviko
savybės
39 Yra 25 (25,5%) 0 (0,0%) Nėra 73 (74,5%) 2 (100,0%) Mirties faktas 0,548 Yra 15 (15,3%) 0 (0,0%) Nėra 83 (84,7%) 2 (100,0%)
13 lentelė. TRAIL geno -716 C>T polimorfizmo alelio T ryšio su krūties vėžio klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis statistinė analizė
Klinikinės ir morfologinės naviko
savybės
40 Tiriant TRAIL 1595C>T alelių C ir T įtaką naviko morfologinėms ir klinikinėms savybėms bei pacienčių išgyvenamumui, taip pat nebuvo gauta jokių statistiškai reikšmingų skirtumų (14 ir 15 lentelės).
14 lentelė. TRAIL geno 1595 C>T polimorfizmo alelio C ryšio su krūties vėžio klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis statistinė analizė
Klinikinės ir morfologinės naviko
savybės
TRAIL 1595C>T polimorfizmas P reikšmė CC ir CT N (%) TT N (%) Amžiaus grupės 0,861 ≤ 40 metų 30 (33,7%) 4 (36,4%) > 40 metų 59 (66,3%) 7 (63,6%) Naviko dydis (pT) 0,861 pT1 59 (66,3%) 7 (63,6%) pT2 30 (33,7%) 4 (36,4%) Limfmazgių būklė (pN) 0,500 pN0 50 (56,2%) 5 (45,5%) pN1 39 (43,8%) 6 (54,5%) Naviko diferenciacijos laipsnis 0,402 G1 arba G2 62 (69,7%) 9 (81,8%) G3 27 (30,3%) 2 (18,2%) Estrogenų receptoriai Teigiami 48 (53,9%) 9 (81,8%) 0,078 Neigiami 41 (46,1%) 2 (18,2%) Progesterono receptoriai 0,082 Teigiami 40 (44,9%) 8 (72,7%) Neigiami 49 (55,1%) 3 (27,3%) HER2 0,273 Teigiami 21 (23,6%) 1 (9,1%) Neigiami 68 (76,4%) 10 (90,9%) Molekulinis subtipas 0,353 Luminalinis A arba B 55 (61,8%) 9 (81,8%) HER2 9 (10,1%) 0 (0,0%) Trigubai neigiamas 25 (28,1%) 2 (18,2%) Progreso faktas 0,580 Yra 23 (25,8%) 2 (18,2%) Nėra 66 (74,2%) 9 (81,8%) Mirties faktas 0,140 Yra 15 (16,9%) 0 (0,0%) Nėra 74 (83,1%) 11 (100,0%)
15 lentelė. TRAIL geno 1595 C>T polimorfizmo alelio T ryšio su krūties vėžio klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis statistinė analizė
Klinikinės ir morfologinės naviko
savybės
TRAIL 1595C>T polimorfizmas P reikšmė CC
N (%)
41 Amžiaus grupės 0,135 ≤ 40 metų 16 (43,2%) 18 (28,6%) > 40 metų 21 (56,8%) 45 (71,4%) Naviko dydis (pT) 0,535 pT1 23 (62,2%) 43 (68,3%) pT2 14 (37,8%) 20 (31,7%) Limfmazgių būklė (pN) 0,884 pN0 20 (54,1%) 35 (55,6%) pN1 17 (45,9%) 28 (44,4%) Naviko diferenciacijos laipsnis 0,739 G1 arba G2 27 (73,0%) 44 (69,8%) G3 10 (27,0%) 19 (30,2%) Estrogenų receptoriai 0,970 Teigiami 21 (56,8%) 36 (57,1%) Neigiami 16 (43,2%) 27 (42,9%) Progesterono receptoriai 0,466 Teigiami 16 (43,2%) 32 (50,8%) Neigiami 21 (56,8%) 31 (49,2%) HER2 0,667 Teigiami 9 (24,3%) 13 (20,6%) Neigiami 28 (75,7%) 50 (79,4%) Molekulinis subtipas 0,828 Luminalinis A arba B 24 (64,9%) 40 (63,5%) HER2 4 (10,8%) 5 (7,9%) Trigubai neigiamas 9 (24,3%) 18 (28,6%) Progreso faktas 0,720 Yra 10 (27,0%) 15 (23,8%) Nėra 27 (73,0%) 48 (76,2%) Mirties faktas 0,794 Yra 6 (16,2%) 9 (14,3%) Nėra 31 (83,8%) 54 (85,7%)
12.3 TRAIL geno TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų ryšys su jaunų, ankstyvu krūties vėžiu sergančių pacienčių ligos eiga
42 Atliekant Kokso proporcingų rizikų regresinę analizę ir lyginant bendrą išgyvenamumą, laiką iki progreso bei laiką be tolimųjų metastazių tarp TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T genotipų bei alelių grupių taip pat nebuvo gauta jokių statistiškai reikšmingų skirtumų (16 ir 17 lentelės).
16 lentelė. TRAIL -716C>T Kokso proporcingų rizikų regresinės analizės rezultatų lentelė TRAIL -716 C>T
Modelis Genotipas/ Aleliai
n Bendras išgyvenamumas Laikas be tolimųjų metastazių
Laikas iki progreso Santykinė rizika (PI) P reikšmė Santykinė rizika (PI) P reikšmė Santykinė rizika (PI) P reikšmė Genotipinis CC 70 1 0,981 1 0,976 1 0,979 CT 28 0,892 (0,284-2,802) 0,844 0,901 (0,352-2,302) 0,827 1,024 (0,381-2,186) 0,838
TT 2 n.a. n.a. n.a.
Alelinis Turintys C 98 1 1 1 Neturintys C 2 20,760 (<0,001;>1000) 0,704 20,782 (<0,001;>1 000) 0,638 20,815 (<0,001;> 1000) 0,609 Turintys T 30 1 1 1 Neturintys T 70 0,829 (0,264-2,605) 0,748 0,836 (0,327-2,137) 0,709 0,846 (0,353-2,026) 0,707
n.a. – nėra atvejų
17 lentelė. TRAIL 1595C>T Kokso proporcingų rizikų regresinės analizės rezultatų lentelė TRAIL 1595 C>T Modelis Genotipas/ Aleliai n Bendras išgyvenamumas Laikas be tolimųjų metastazių
43 Turintys T 63 1 1 1 Neturintys T 37 0,885 (0,315-2,488) 0,817 1,125 (0,471-2,684) 0,791 0,958 (0,430-2,136) 0,916
44
13. REZULTATŲ APTARIMAS
TRAIL baltymui skiriamas vis didesnis dėmesys dėl jo unikalios savybės sukelti apoptozę tik vėžinėse ląstelėse, išsaugant sveikas organizmo ląsteles [42], o dėl TRAIL gene esančių polimorfizmų įtakos šio baltymo ekspresijai, polimorfizmai vis plačiau nagrinėjami kaip galimi onkologinių ligų rizikos ir prognozės veiksniai [34, 55-57, 60-62,63,64]. Vis dėlto, iki šiandien TRAIL polimorfizmų reikšmė nei KV, nei kitų navikinių susirgimų vystymuisi ir eigai nėra iki galo ištirta. Mūsų tyrimas naujas tuo, jog pirmą kartą ištirtas TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų genotipų ir alelių pasiskirstymas Lietuvos KV pacienčių grupėje, taip pat pirmą kartą šių polimorfizmų ryšys su klinikinėmis ir morfologinėmis KV savybėmis bei ligos eiga įvertintas homogeniškoje jaunų, ankstyvu KV sergančių moterų grupėje.
Mūsų tyrimo duomenimis, iš TRAIL 1595C>T polimorfizmų tarp jaunų, ankstyvu krūties vėžiu sergančių Lietuvos moterų dažniausiai (52%) pasireiškė CT genotipas, rečiau (37%) CC genotipas, o rečiausiai (11%) TT genotipas. C alelis pasireiškė dažniau nei T alelis (63 % ir 37% atitinkamai). Palyginimui, Turkijoje atliktame tyrime KV pacienčių grupėje, panašiai kaip ir mūsų tyrime, TRAIL 1595 C>T polimorfizmo C alelis stebėtas 68,9%, o T alelis 31,1%. Panašus buvo ir genotipų pasiskirstymas. Yildiz ir kitų tyrime nežymiai daugiau stebėta CC genotipų – 49,1%, CT genotipas stebėtas rečiau – 39,6%, o TT genotipas nustatytas 11,3% tiriamųjų, taip pat kaip ir mūsų tyrimo metu [63]. Pakistano populiacijoje KV sergančių pacienčių genotipų pasiskirstymas buvo panašus į Turkijos rezultatus (CC – 46,3%, CT- 41,6%, TT – 12,1%) [64]. Taigi tarp mūsų tiriamųjų TRAIL 1595C>T polimorfizmo alelių ir genotipų pasiskirstymas buvo panašus į kitų tyrėjų.
45 neįtraukėme pažengusiu KV sergančių pacienčių. TRAIL 1595C>T polimorfizmo įtakos kitoms KV savybėms Yildiz su kolegomis, kaip ir mes, nenustatė [63].
Mūsų tyrmo metu nustatyta, jog TRAIL 1595C>T polimorfizmas neturėjo įtakos tiriamų pacienčių išgyvenamumo rodikliams. Viso genomo sekoskaitos tyrimuose, kuriuose vertinta VNP įtaka KV pacienčių išgyvenamumui, TRAIL 1595C>T polimorfizmas taip pat nebuvo įvertintas kaip reikšmingas rizikos veiksnys [68,69]. Svarbu pastebėti, jog dėl metodologinių viso genomo sekoskaitos tyrimų ypatumų, polimorfizmai, turintys mažą, tačiau reikšmingą įtaką, gali būti nenustatomi [70], todėl išlieka individualių polimorfizmų koreliacijų tyrimų poreikis, ypač kuomet polimorfizmas turi nustatytą funkcinę reikšmę, kaip mūsų tirti VNP. Anksčiau atliktų studijų, skirtų TRAIL 1595C>T polimorfizmo sąsajoms su KV išgyvenamumu, literatūroje neradome.
Kalbant apie TRAIL -716C>T polimorfizmą, šioje studijoje nustatytas TRAIL -716 C>T polimorfizmo alelių pasiskirstymas skyrėsi nuo anksčiau atliktų tyrimų. Retasis T alelis ir jį turintys genotipai mūsų populiacijoje nustatyti rečiau nei, pavyzdžiui, Indijos KV sergančioms pacientėms [61]. Šiame tyrime T alelio pasireiškimas siekė 16 %, o tiriant Indijos KV sergančias moteris T alelis buvo nustatytas iki 26 %. Alelių ir genotipų pasiskirstymo netolygumai tarp tyrimų galėtų būti paaiškinti rasiniais skirtumais.
46 Kaip ir TRAIL 1595C>T polimorfizmo atveju, anksčiau nebuvo atlikta kandidatų genų tyrimų, kurie vertintų specifiškai TRAIL -716C>T polimorfizmo įtaką KV sergančių pacienčių išgyvenamumui, tačiau viso genomo sekvenavimo tyrimuose, kaip ir mūsų tyrime, ryšio tarp šio polimorfizmo ir KV pacienčių išgyvenamumo nebuvo nustatyta [68,69].
47
14. IŠVADOS
1. Tiriant TRAIL -716C>T tarp jaunų, ankstyvu krūties vėžiu sergančių moterų dažniausiai pasireiškė CC genotipas, o rečiausiai TT genotipas. CC genotipą turėjo 70% tiriamųjų, CT genotipas – 28% bei TT genotipą – 2%. C alelis pasireiškė dažniau nei T alelis (84 % ir 16% atitinkamai). Tiriant TRAIL 1595 C>T, dažniausiai pasireiškė CT genotipas, rečiausiai buvo nustatytas TT genotipas. CC genotipą turėjo 37% tiriamųjų, CT genotipą– 52% bei TT genotipą – 11%. C alelis, kaip ir TRAIL -716C>T, pasireiškė dažniau nei T alelis (63% ir 37% atitinkamai).
2. TRAIL geno TRAIL -716C>T ir TRAIL 1595C>T polimorfizmų sąsajų su klinikinėmis bei morfologinėmis krūties vėžio savybėmis nebuvo nustatyta.
48
15. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
49
16. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2014;136(5):E359-E386.
2. Smailytė G, Aleknavičienė B, Kačėnienė A, Krilavičiūtė A, Lapašinskaitė I, Meiluvienė J ir kiti. Vėžys Lietuvoje 2012 metais. Nacionalinis vėžio institutas, 2012. Prieiga per internetą: http://www.nvi.lt/uploads/pdf/Vezio%20registras/Vezys_lietuvoje_2012.pdf
3. Anders C, Fan C, Parker J, Carey L, Blackwell K, Klauber-DeMore N et al. Breast Carcinomas Arising at a Young Age: Unique Biology or a Surrogate for Aggressive Intrinsic Subtypes?. J Clin Oncol. 2011;29(1):e18-e20.
4. Azim H, Partridge A. Biology of breast cancer in young women. Breast Cancer Res. 2014;16(4). 5. Anders C, Johnson R, Litton J, Phillips M, Bleyer A. Breast Cancer Before Age 40 Years. Semin
Oncol. 2009;36(3):237-249.
6. Harbeck N, Wuerstlein R. Mammakarzinom. Internist (Berl). 2013;54(2):194-200.
7. Van Poznak C, Harris L, Somerfield M. Use of Biomarkers to Guide Decisions on Systemic Therapy for Women With Metastatic Breast Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline. J Oncol Pract. 2015;11(6):514-516.
8. Treatment of Early-Stage Breast Cancer. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 1991;265(3):391.
9. Nicolini A, Ferrari P, Duffy M. Prognostic and predictive biomarkers in breast cancer: Past, present and future. Semin Cancer Biol. 2017;.
10. Fung F, Cornacchi S, Vanniyasingam T, Dao D, Thabane L, Simunovic M et al. Predictors of 5-year local, regional, and distant recurrent events in a population-based cohort of breast cancer patients. Am J Surg. 2017;213(2):418-425.
11. Cianfrocca M. Prognostic and Predictive Factors in Early-Stage Breast Cancer. Oncologist. 2004;9(6):606-616.
12. Siegel R, Miller K, Jemal A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2018;68(1):7-30.
50 14. Carter C, Allen C, Henson D. Relation of tumor size, lymph node status, and survival in 24,740
breast cancer cases. Cancer. 1989;63(1):181-187.
15. Webber C, Gospodarowicz M, Sobin L, Wittekind C, Greene F, Mason M et al. Improving the TNM classification: Findings from a 10-year continuous literature review. Int J Cancer. 2014;135(2):371-378.
16. American Joint Committee on Cancer. AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer; 2010.
17. Gospodarowicz M, Miller D, Groome P, Greene F, Logan P, Sobin L. The process for continuous improvement of the TNM classification. Cancer. 2003;100(1):1-5.
18. Rakha E, El-Sayed M, Lee A, Elston C, Grainge M, Hodi Z et al. Prognostic Significance of Nottingham Histologic Grade in Invasive Breast Carcinoma. J Clin Oncol. 2008;26(19):3153-3158. 19. Li C, Uribe D, Daling J. Clinical characteristics of different histologic types of breast cancer. Br J
Cancer. 2005;93(9):1046-1052.
20. Pestalozzi B, Zahrieh D, Mallon E, Gusterson B, Price K, Gelber R et al. Distinct Clinical and Prognostic Features of Infiltrating Lobular Carcinoma of the Breast: Combined Results of 15 International Breast Cancer Study Group Clinical Trials. J Clin Oncol. 2008;26(18):3006-3014. 21. Song Y, Shin S, Cho J, Park M, Yoon J, Jegal Y. The Role of Lymphovascular Invasion as a
Prognostic Factor in Patients with Lymph Node-Positive Operable Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 2011;14(3):198.
22. Inwald E, Klinkhammer-Schalke M, Hofstädter F, Zeman F, Koller M, Gerstenhauer M et al. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Res Treat. 2013;139(2):539-552.
23. Turner B, Hicks D. Pathologic diagnosis of breast cancer patients: evolution of the traditional clinical-pathologic paradigm toward “precision” cancer therapy. Biotech Histochem. 2017;92(3):175-200.
24. Banin Hirata B, Oda J, Losi Guembarovski R, Ariza C, Oliveira C, Watanabe M. Molecular Markers for Breast Cancer: Prediction on Tumor Behavior. Dis Markers. 2014;2014:1-12.
25. Mohammed H, Russell I, Stark R, Rueda O, Hickey T, Tarulli G et al. Progesterone receptor modulates ERα action in breast cancer. Nature. 2015;523(7560):313-317.
51 27. Assi H, Khoury K, Dbouk H, Khalil L, Mouhieddine T, El Saghir N. Epidemiology and prognosis
of breast cancer in young women. J Thorac Dis. 2013;5(Suppl 1):S2.
28. Axelrod D, Smith J, Kornreich D, Grinstead E, Singh B, Cangiarella J et al. Breast Cancer in Young Women. J Am Coll Surg. 2008;206(6):1193-1203.
29. Duffy M, McGowan P, Harbeck N, Thomssen C, Schmitt M. uPA and PAI-1 as biomarkers in breast cancer: validated for clinical use in level-of-evidence-1 studies. Breast Cancer Research. 2014;16(4). 30. Brookes A. Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Encyclopedia of Life Sciences. 2007;.
31. Pirie A, Guo Q, Kraft P, Canisius S, Eccles D, Rahman N et al. Common germline polymorphisms associated with breast cancer-specific survival. Breast Cancer Res. 2015;17(1).
32. Michailidou K, Hall P, Gonzalez-Neira A, Ghoussaini M, Dennis J, Milne R et al. Large-scale genotyping identifies 41 new loci associated with breast cancer risk. Nat Genet. 2013;45(4):353-361.
33. Michailidou K, Beesley J, Lindstrom S, Canisius S, Dennis J, Lush M et al. Genome-wide association analysis of more than 120,000 individuals identifies 15 new susceptibility loci for breast cancer. Nat Genet. 2015;47(4):373-380.
34. Jung J, Chae Y, Moon J, Kang B, Kim J, Sohn S et al. TNF superfamily gene polymorphism as prognostic factor in early breast cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 2009;136(5):685-694.
35. Khan S, Fagerholm R, Kadalayil L, Tapper W, Aittomäki K, Liu J et al. Meta-analysis of three genome-wide association studies identifies two loci that predict survival and treatment outcome in breast cancer. Oncotarget. 2017;9(3).
36. Korobeinikova E, Myrzaliyeva D, Ugenskiene R, Raulinaityte D, Gedminaite J, Smigelskas K et al. The prognostic value of IL10 and TNF alpha functional polymorphisms in premenopausal early-stage breast cancer patients. BMC Genet. 2015;16(1).
37. Ugenskienė R, Myrzaliyeva D, Jankauskaitė R, Gedminaitė J, Jančiauskienė R, Šepetauskienė E et al. The contribution of SIPA1andRRP1Bgermline polymorphisms to breast cancer phenotype, lymph node status and survival in a group of Lithuanian young breast cancer patients. Biomarkers. 2016;21(4):363-370.
38. Savukaitytė A, Ugenskienė R, Jankauskaitė R, Čereškevičius D, Šepetauskienė E, Juozaitytė E. Investigation of prognostic value of polymorphisms within estrogen metabolizing genes in Lithuanian breast cancer patients. BMC Med Genet. 2015;16(1).
