VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
VILTĖ RADZEVIČIŪTĖ
SALDŽIALAPĖS KULKŠNĖS (ASTRAGALUS GLYCYPHYLLOS L.) ŽALIAVŲ
TYRIMAS IR PERSPEKTYVŲ ŠIRDIES - KRAUJAGYSLIŲ SISTEMOS LIGŲ
PROFILAKTIKAI IR PAGALBINEI TERAPIJAI PROGNOZĖ
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovė: Doc. Dr. Audronė Dagilytė
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA TVIRTINU
Farmacijos fakulteto dekanas
(vardas, pavardė, parašas) Vitalis Briedis
SALDŽIALAPĖS KULKŠNĖS (ASTRAGALUS GLYCYPHYLLOS L.) ŽALIAVŲ
TYRIMAS IR PERSPEKTYVŲ ŠIRDIES - KRAUJAGYSLIŲ SISTEMOS LIGŲ
PROFILAKTIKAI IR PAGALBINEI TERAPIJAI PROGNOZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: Doc. Dr. Audronė Dagilytė
Recenzentas: Darbą atliko:
Doc. Dr. Lina Raudonė Magistrantė Viltė Radzevičiūtė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1. SANTRUMPOS ... 7
2. ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
3.1. Kulkšnių (Astragalus) gentis ir saldžialapės kulkšnės (A.glycyphyllos) morfologiniai požymiai ... 10
3.2. Saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) cheminė sudėtis ... 11
3.3. Kulkšnių (Astragalus) genties augalų reikšmė medicinoje ... 12
3.4. Antioksidantai ... 13
3.5. Fenoliniai junginiai ... 14
3.6. Flavonoidų struktūra ir klasifikacija ... 16
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 20
4.1. Tyrimo objektas ... 20
4.2 Reagentai ir tirpikliai ... 21
4.3 Naudota aparatūra ... 22
4.4 Astragalus glycyphyllos L. tyrimų metodikos ... 22
4.5. Saldžialapės kulkšnės ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 23
4.5.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 23
4.5.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas ... 24
4.5.3. Fotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas ... 24
4.5.4. Fotometrinis Fe2+ jonų surišimo metodas ... 25
4.6. Duomenų statistinis įvertinimas ... 25
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
5.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 26
5.2. Suminio fenolinių junginių kiekio saldžialapės kulkšnės žaliavoje nustatymas ... 28
5.3. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas ... 31
5.4. Fotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas ... 32
5.6. Rezultatų apibendrinimas ... 37
6. IŠVADOS ... 38
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40
SANTRAUKA
V. Radzevičiūtė. Magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas Doc. Dr. A. Dagilytė; Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. Kaunas.
Darbo pavadinimas: Saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) žaliavų tyrimas ir perspektyvų širdies - kraujagyslių sistemos ligų profilaktikai ir pagalbinei terapijai prognozė.
Darbo tikslas: Nustatyti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidantinį ir chelatinį aktyvumą saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) augalinėse žaliavose ir prognozuoti žaliavos pritaikymo galimybes.
Darbo uždaviniai: Nustatyti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) skirtingais būdais ruoštų augalinių žaliavų mėginiuose. Ištirti žaliavų antioksidantines savybes. Įvertinti augalinių žaliavų chelatines savybes. Remiantis gautais biologiškai aktyvių junginių analizės rezultatais prognozuoti terapines pritaikymo širdies ir kraujagyslių sistemos susirgimams perspektyvas.
Tyrimo objektai ir metodai: Astragalus glycyphyllos L. žaliava, rinkta Kėdainiuose, Lietuvoje. Bendras fenolinių junginių kiekis - pagal Galo rūgšties kalibracinę kreivę; antioksidantinis aktyvumas - nustatant DPPH laisvojo radikalo inaktyvinimą; bendras flavonoidų kiekis - nustatomas spektrofotometriniu metodu pagal rutiną; pereinamųjų jonų surišimo geba - nustatant Fe2+ jonų surišimą.
Išvados: Spektrofotometriniu metodu ištyrus fenolinių junginių kiekį saldžialapės kulkšnės žaliavose, nustatyta, kad didžiausią šių veikliųjų medžiagų kiekį kaupia žiedynai (21,6±0,49 mg/g) ir lapai (25,22±0,59 mg/g), o mažiausiu fenolinių junginių kiekiu pasižymi stiebai (6,12±0,46 mg/g). Nustačius flavonoidų kiekį žaliavose pastebėta, kad daugiausia flavonoidų kaupiama lapuose (20,38±0,31 mg/g) ir šie junginiai sudaro didžiausią fenolinių junginių dalį. Atlikus antioksidantinio aktyvumo tyrimą DPPH metodu pastebėta, kad didžiausiu aktyvumu pasižymi žiedynai (13,26±0,66%). Atlikus antioksidantinio aktyvumo tyrimą fotometriniu Fe2+ jonų surišimo metodu, nustatyta, kad didžiausia jonų surišimo geba pasižymi žiedynai (91,97±1,26%), mažiausia - stiebai (61±1,53%). Antioksidantinis aktyvumas stipriai koreliuoja su fenoliniais junginiais ir flavonoidais. Statistiškai palyginus krūmijimosi metu rinktų augalinių žaliavų džiovinimo būdo įtaką, nustatyta, kad didesnė fenolinių junginių išeiga gaunama iš liofilizacijos būdu paruoštos augalinės žaliavos negu kad iš įprastai džiovintos augalinės žaliavos.
SUMMARY
Thesis Title: Research of Astragalus glycyphyllos L. materials and prospects for prevention of cardiovascular diseases and adjunctive therapy.
Aim: to evaluate the total amount of phenolic compounds and flavonoids and also to analyse antioxidant activity and iron chelating activity of Astragalus glycyphyllos L. dried materials and to predict possible use of analysed plant.
The objectives of the research: to evaluate the total amount of flavonoids and total amount of phenolic combinations in the samples A. Glycyphyllos; to analyse the antioxidant activity of the herbal materials; to analyse iron chelating activity of the herbal materials; according to the biologically active compounds predict therapeutic applications for cardiovascular diseases.
Objects and methods of the assay: the object of this assay is Astragalus glycyphyllos L. material collected in Kėdainiai, Lithuania. Phenolic compounds evaluated according to calibration curve of galic acid, antioxidant activity free DPPH radical inhibition. Iron chelating properties - photometric determination of binded iron.
Conclusions: In spectrophotometric analysis, the highest amount of phenolic compounds were determined in Astragalus glycyphyllos leaves (25,22±0,59 mg/g) and flowers (21,6±0,49 mg/g), lowest - in stems. The highest amount of flavonoids were determined in leaves (20,38±0,31 mg/g), lowest in stems (6,12±0,46 mg/g). Flavonoids are the largest group of phenolic compounds in Astragalus glycyphyllos materials. The strongest antioxidant activity was observed in flowers (13,26±0,66%), and the highest antioxidant activity by iron binding properties was determined in flowers (91,97±1,26%), lowest antioxidant activity was observed in stems (61±1,53%). Antioxidant activity of materials are well correlated with phenolic compounds and flavonoids. While comparing the influence of drying method on yield of phenolics, it was determined that liophylization was better than drying usual way.
1. SANTRUMPOS
DPPH - 2,2 – difenil–1–pikrilhidrazilas FC – Folin-Ciocalteu metodas
GAE – galo rūgšties ekvivalentai ROS – reaktyviosios deguonies formos UV-B – ultravioletiniai B spinduliai
2. ĮVADAS
Saldžialapė kulkšnė (Astragalus glycyphyllos L.) - Azijoje ir Europoje paplitęs Pupinių šeimos Astragalus genties augalas. Dauguma Astragalus genties augalų yra tiriami dėl sudėtyje esančių flavonoidų, saponinų, alkaloidų, sterolių. Dėl veikliųjų medžiagų antioksidantinio poveikio Astragalus genties augalai taikomi širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimų pagalbinei terapijai, imuniteto stiprinimui, adaptacijai [1].
Astragalus kardioprotekcinis poveikis pasireiškia dėl antioksidantinių šių augalų savybių. Tai yra siejama su augalų sudėtyje esančiais fenoliniais junginiais. Kaip stiprūs antioksidantai, šie junginiai mažina oksidacinio streso sukeltą kraujagyslių pažaidą, endotelio disfunkciją, padidėjusį kontraktiliškumą, kraujagyslių lygiųjų raumenų proliferaciją, uždegimą [2,3]. Pritaikant šių junginių savybes, jau yra sukurti bei naudojami maisto papildai bei arbatos su Astragalus membranaceus žaliava. Pagrindinės jų indikacijos - imuniteto stiprinimas, streso mažinimas, kardioprotekcija [4,5].
Saldžialapės kulkšnės augalas taip pat kaupia antioksidantiniu veikimu pasižyminčias veikliąsias medžiagas. Naujausio tyrimo, atlikto 2015 metais, duomenimis, saldžialapė kulkšnė pasižymėjo hepatoprotekciniu poveikiu dėl sudėtyje esančių veikliųjų medžiagų savybių [6].
Taigi yra naudinga šio augalo žaliavose nustatyti fenolinių junginių kiekį bei antioksidantinį aktyvumą, kad būtų galima spręsti apie šio augalo terapinį naudingumą ir širdies - kraujagyslių ligoms.
Temos aktualumas ir naujumas
Kulkšnių šeimos augalo, saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.), kaupiami fenoliniai junginiai ir flavonoidai gali pasižymėti antioksidantiniu ir chelatiniu poveikiu ir tai gali būti pritaikyta mažinant kraujagyslių pažeidimus ir disfunkciją. Taigi saldžialapė kulkšnė galėtų būti vartojama kaip žaliava pagalbinei terapijai sergant širdies ir kraujagyslių ligomis. Astragalus glycyphyllos L.tyrimo duomenys papildo trūkstamas mokslines žinias apie šio augalo cheminę sudėtį.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Nustatyti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidantinį ir chelatinį aktyvumą saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) augalinėse žaliavose ir prognozuoti žaliavos pritaikymo galimybes.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti suminį fenolinių junginių kiekį saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) augalinėse žaliavose.
2. Nustatyti flavonoidų kiekį augalinėse žaliavose. 3. Įvertinti augalinių žaliavų antiradikalinį aktyvumą.
4. Įvertinti augalinių žaliavų gebą surišti pereinamuosius metalų jonus.
5. Remiantis gautais biologiškai aktyvių junginių analizės rezultatais prognozuoti terapines pritaikymo širdies ir kraujagyslių sistemos susirgimams perspektyvas.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Kulkšnių (Astragalus) gentis ir saldžialapės kulkšnės (A.glycyphyllos)
morfologiniai požymiai
Kulkšnių (Astragalus) gentis priklauso Pupinių (Fabaceae) šeimai, Faboideae pošeimiui. Kulkšnių gentis yra didžiausia Pupinių šeimai priklausanti gentis, kurioje yra apie 2500 rūšių, iš kurių 113 auga Europoje [1,7].
Šiai genčiai priklausanti saldžialapė kulkšnė - tai daugiametis, 30-100 cm augalas, turintis storą, pliką arba plaukeliais apaugusį stiebą. Stiebas gulsčias arba kylantis, storas, vagotas, išsišakojęs, ties bambliais raudonai dėmėtas. Šaknis trumpa, stora, šakota. Lapai 10-20 cm ilgio, neporomis plunksniški, sudaryti iš 15-40 mm lapelių. Kulkšnių lapeliai pailgai kiaušiniški arba elipsiški, buka viršūne. Jų viršutinė pusė plika, žalia, apatinė - šviesesnė, pilkai žalia, padengta retais plaukeliais. Prielapiai laisvi, 15-20 mm. Žiedai 7-8, 11-15 mm, gelsvi arba žalsvai-pilko atspalvio, įstriži, gulsti, kartais nulinkę, susitelkę daugiažiedėse, kiaušiniškose ar pailgai kiaušiniškose kekėse. Ankštis 30-40mm, pjautuviškai išsilenkusi, nusmailėjusi, su 14-20 sėklų, sudaryta iš dviejų geldelių su išilgine pertvara. Sėklos 2-3 mm skersmens, netaisyklingai širdiškos ar inkstiškos, suplotos, lygios, šiek tiek blizgančios, žalsvai gelsvos arba rusvos. Dauginasi sėklomis. Augalas žydi birželį - rugpjūtį, sėklos sunoksta liepą - spalį. Šis augalas yra hemikriptofitas - augalo atsinaujinimo pumpurai yra žemės paviršiuje ir žiemos metu apsaugomi mirusių augalo dalių arba paviršinio žemės sluoksnio [8,9].
Saldžialapė kulkšnė auga pievose, ganyklose ir grioviuose. Šis augalas paplitęs Azijoje, Europos šalyse (Albanijoj, Austrijoj, Danijoj, Bulgarijoj, Turkijoj, Lenkijoj, Baltijos šalyse), Rusijos europinės dalies vakarų, vidurio ir pietų rajonuose, Kaukaze, Vakarų Sirijoje. Lietuvoje šis augalas randamas miškuose, šlaituose, smėlio karjeruose [9].
1 pav. Saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) rūšies augalas, jo žiedai, antžeminė dalis [10]
3.2. Saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) cheminė sudėtis
Saldžialapės kulkšnės žaliavoje yra flavonoidų, terpenoidų, steroidų, aminorūgščių ir peptidų. Pagrindiniai komponentai saldžialapės kulkšnės sudėtyje - saponinai ir flavonoidai. Augalo cheminė sudėtis įvairuoja skirtingais vegetacijos periodais [11].
Saldžialapės kulkšnės žaliavoje veikliųjų medžiagų dalį sudaro flavonoidai - izomukronulatolis ir 3-gliukopiranosiloksi-4',5,7-trihidroksi-3-metoksiflavonas [12].
2 pav. Izomukronulatolis [13]
Fenoliniai junginiai - veikliųjų medžiagų grupė, kuri lemia antioksidantines saldžialapės kulkšnės savybes. Augalo žaliavoje nustatyti kumarinai, flavonoliai, katechinai, taninai. Vegetacijos pradžioje saldžialapės kulkšnės lapai kaupia didžiausią flavonolių ir katechinų kiekį, o šaknys - didžiausią kumarinų ir taninų kiekį. Augalo žydėjimo laikotarpiu lapuose nerandama kumarinų, o didžiausias jų kiekis aptiktas stiebuose ir šaknyse. Žiedai pasižymi kaip daugiausia flavonolių kaupianti žaliava, o šaknyse daugiausia aptikta katechinų ir taninų. Cheminė augalo sudėtis kinta prasidėjus vaisių vedimo laikotarpiui. Tuo metu didžiausią flavonolių kiekį kaupia lapai. Ši žaliava išlieka kaip daugiausia flavonolių kaupianti žaliava ir vaisių vedimo laikotarpio pabaigoje. Tuo laikotarpiu daugiausia taninų kaupianti žaliava - šaknys [14].
Astragalus genties tirtuose augaluose nustatytas alkoholių, aldehidų, rūgščių, esterių, eterių, amidų, halogenintų junginių, aromatinių junginių, hidrokarbonatų ir terpenų kiekis skirtingais augalo vegetacijos laikotarpiais. Lapų vystymosi laikotarpiu, pagrindiniai komponentai saldžialapės kulkšnės žaliavoje - hidrokarbonatai. Jų tarpe vyrauja nonakozanas bei skvalenas. Mažesnę dalį sudaro terpenai, iš kurių didžiausias fitolio kiekis. Tirtoje lapų žaliavoje nustatyti alkoholiai 3-heksen-olis, 1-heksanolis, 1-okten-3-olis, 3-etil-4-metilpentan-1-olis, benzilo alkoholis bei 2-metoksi-4-vinil fenolis. Nustatyti ir aldehidai nonanalis ir dekanolis bei ketonai. Lapų vystymosi metu taip pat aptikta ir rūgščių, esterių, aromatinių hidrokarbonatų.
Žydėjimo laikotarpiu didžiausią dalį cheminių junginių sudaro terpenai ir hidrokarbonatai. Terpenų tarpe vyrauja fitolis, o hidrokarbonatų - pentakozanas ir heptakozanas. Mažesnė dalis - esteriai, aldehidai ir aminai.
Vaisių vedimo laikotarpiu didžiausią dalį cheminių junginių sudaro halogeninti junginiai - heksachloretanas ir hidrokarbonatai - heksakozanas. Šioje žaliavoje taip pat nustatyti alkoholiai, esteriai, iš kurių didžiausias dalis - acto rūgšties etilmetil esteris, aromatiniai junginiai. Nedidelę dalį sudaro aldehidai, rūgštys ir amidai [11].
Saldžialapė kulkšnė kaupia ir triterpenoidus sojasapogenolį B, cikloastragenolį, astragenolį, steroidus ir sterolius [12, 15].
3 pav. Triterpenoidai astragenolis ir cikloastragenolis [16,17]
3.3. Kulkšnių (Astragalus) genties augalų reikšmė medicinoje
Astragalus genties augalai dažniausiai naudojami tradicinėje medicinoje. Šios genties augalai pasižymi hepatoprotekciniu, priešvirusiniu, imuninę sistemą stimuliuojančiu veikimu. Džiovintos Astragalus genties augalų šaknys vartojamos kaip antiperspirantai, diuretikai ir taikomos gydyti tokioms ligoms kaip nefritas, cukrinis diabetas, hipertenzija. Azijoje augančios Astragalus genties augalų rūšys yra naudojamos dėl jų išskiriamos gumos - tragakanto, kuris įvairių medikamentų gamyboje naudojamas kaip emulsiklis, stabilizatorius ir klampumą reguliuojanti medžiaga [1]. Astragalus membranaceus kinų medicinoje naudojamas jau daugiau nei tūkstantį metų. Šis augalas vadinamas adaptogenu, kadangi padeda organizmui prisitaikyti prie streso. Antioksidantinės savybės padeda pagerinti širdies funkciją, palengvinti širdies ligų simptomus bei mažinti cholesterolio kiekį kraujyje [18].
Saldžialapė kulkšnė daugiau vartojama liaudies medicinoje. Tradicinėje Bulgarijos medicinoje Astragalus glycyphyllos L. vartojamas kaip antihipertenzinis, diuretinis ir antiuždegiminis augalas. Šis augalas vartojamas kaip nuoviras gydant nervinius susirgimus, taip pat kaip svorio mažinimo priemonė, dermatito gydymui, venerinėms ligoms, dizenterijai, virškinimo ligų sutrikimams. A. glycyphyllos pasižymi hipotenziniu ir antikoaguliaciniu veikimu [19,20].
2015 metais atliktame tyrime su žiurkėmis buvo vertinamas saldžialapės kulkšnės antioksidantinis ir hepatoprotekcinis poveikis, siekiant sumažinti anglies tetrachlorido sukeltą kepenų pažeidą. Padarytos išvados, kad saldžialapės kulkšnės ekstraktas pasižymi panašiomis apsaugančiomis savybėmis kaip ir silimarinas dėl sudėtyje esančių flavonoidų, saponinų ir polisacharidų [6].
3.4. Antioksidantai
Antioksidantai - tai natūralūs arba sintetiniai junginiai, stabdantys oksidacijos procesą. Natūralios medžiagos yra randamos vaisiuose, daržovėse, arbatose [22]. Antioksidantai naudojami ir konservuojant maistą, tačiau viena iš svarbiausių jų naudojimo sričių - apsaugoti žmogaus organizmą nuo ROS padarytos žalos. Natūralūs antioksidantai yra skirstomi į dvi grupes:
Fermentai (superoksido bismutazė, katalazė ir kt.). Jų veikimo mechanizmas paremtas ROS ir aktyvių azoto rūšių pavertimu į stabilius junginius. Superoksido bismutazė naikina superoksido radikalą, katalazė katalizuoja vandenilio peroksido suirimą į vandenį ir deguonį.
Mažos molekulinės masės antioksidantai - skirstomi pagal tirpumą į lipofilinius ir vandenyje tirpius antioksidantus. Hidrofiliniai antioksidantai reaguoja su oksidantais ląstelės citoplazmoje ir kraujo plazmoje (pvz. askorbo rūgštis). Hidrofobiniai antioksidantai apsaugo ląstelės membranas nuo lipidų peroksidacijos ( pvz. karotenai, α-tokoferolis).
Antioksidantai gali veikti keliais mechanizmais:
dalyvaujant grandinės nutraukimo reakcijoje;
surišant pereinamųjų metalų jonus;
stabdant ROS formavimąsi;
šalinant ROS;
Antioksidantų poveikis žmogaus organizmui svarbus tuo, kad veikdami laisvuosius radikalus jie stabdo senėjimo procesus, mažina lėtinių ligų progresavimą, turi adaptinę ir apsauginę funkcijas. Sumažėjus antioksidantų ir ROS pusiausvyrai organizme, padidėja vėžio, nervinių sutrikimų, širdies - kraujagyslių ligų atsiradimo rizika [22, 23, 24].
Kadangi sintetiniai antioksidantai yra vengiami vartoti dėl toksinio poveikio žmogaus organizmui, dažniausiai ieškoma vis naujų augalinių antioksidantų šaltinių. Augaluose jie kaupiami dėl augalo augimo, vystymosi ir apsaugos nuo žalingų faktorių. Žaliavose galima rasti tokių antioksidantų kaip fenoliniai junginiai, azoto junginiai, vitaminai [25].
3.5. Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai - tai grupė cheminių junginių, pasižyminčių antioksidantinėmis savybėmis, plačiai paplitusių gamtoje. Kompleksiniai junginiai randami šaknyse, lapuose, žievėje. Jų galima rasti ir į maisto racioną įeinančiuose produktuose - alyvuogėse, šokolade, grūduose, arbatoje, kavoje, vyne. Augaluose fenoliniai junginiai atlieka apsauginę funkciją, sumažinant UV radiacijos, patogenų, parazitų ir plėšrūnų žalą [2].
Fenolinių junginių struktūra varijuoja nuo paprastų fenolių iki polimerizuotų junginių, tokių kaip kondensuoti taninai. Yra žinoma daug fenolinių junginių klasifikacijų. Priklausomai nuo anglies grandinės ilgio, fenoliniai junginiai skirstomi į 16 klasių [26]. Pagrindinės fenolinių junginių klasės yra fenolinės rūgštys, stilbenai, lignanai ir flavonoidai (1 lentelė) [3].
Pagal pasiskirstymą gamtoje, fenoliniai junginiai gali būti skirstomi į tris klases: mažai paplitę (paprasti fenoliai), plačiai paplitę (flavonoidai, fenolinės rūgštys) ir polimerai (taninas ir ligninas) [26, 27].
Fenolinių junginių ekstrakcija - tai pirminis žingsnis siekiant išskirti šiuos junginius, panaudojant juos vaistų, maisto papildų, kosmetikos produktų gamyboje. Ekstrakcija gali būti atliekama tiek iš džiovintos, tiek iš šviežios ar šaldytos žaliavos. Dažnai naudojamas etanolis, kuris, ne taip kaip metanolis, yra saugus vartoti. Ekstraktų ruošimui gali būti naudojama ekstrakcija ultragarsu, kadangi tai pigus ir paprastas metodas, nereikalaujantis sudėtingų įrenginių. Literatūros duomenimis, atlikta palyginamoji studija ruošiant braškių ekstraktus tarp ultragarsinės ekstrakcijos ir mikrobangų ekstrakcijos bei ekstrakcijos suslėgtu karštu vandeniu parodė, kad naudojant ultragarsinę ekstrakciją sukeliama mažesnė fenolinių junginių degradacija [2].
1 lentelė. Pagrindinės fenolinių junginių klasės ir struktūros.
Fenolinių junginių klasė Struktūra
Stilbenai
Lignanai
Flavonoidai
Fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas lemia jų svarbą žmogaus organizmui. Veikdami kaip antioksidantai, jie apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso [3]. Apsauginiai mechanizmai pasireiškia jų gebėjimu surišti laisvuosius radikalus, atiduoti vandenilio atomą ar elektroną [28]. Antioksidantinės savybės priklauso nuo junginių struktūros. Plačiausiai žinomi fenoliniai junginiai, turintys šių savybių yra flavonoidai, taninai, chalkonai, kumarinai ir fenolinės rūgštys [26].
Fenolinių junginių vartojimas yra susijęs su poveikiu širdies ir kraujagyslių sistemai. Tyrimų duomenimis, produktų, turinčių fenolinių junginių, vartojimas gali padėti užkirsti kelią koronarinės širdies ligos atsiradimui. Šie junginiai taip pat turi įtakos ir aterosklerozės formavimuisi. Kadangi fenoliniai junginiai yra MTL oksidacijos inhibitoriai, jie stabdo aterosklerozės atsiradimą. Širdies - kraujagyslių ligų stabdymui ir prevencijai fenoliniai junginiai vartojami ir kaip turintys priešuždegiminį, antitrombinį poveikį dėl DTL didinimo ir endotelio funkcijos gerinimo [3].
3.6. Flavonoidų struktūra ir klasifikacija
Flavonoidai (lot. flavus - geltonas) - tai mažos molekulinės masės bioaktyvūs junginiai, priklausantys polifenolių grupei. Pagrindinis flavonoidų struktūros bruožas - 2-fenil-benzo- γ-pirono žiedas (flavanas) su dviem benzeno žiedais, nukreiptais link heterociklinio pirano žiedo [29]. Yra identifikuota daugiau negu 4000 flavonoidų variacijų [3].
4 pav. Flavonoidų struktūra [30]
Flavonoidai aptinkami daržovėse, vaisiuose, žieduose, sėklose. Jie plačiai pasiskirstę visoje augalų karalystėje [29].
Pagrindinės flavonoidų klasės - flavanoliai, flavonoliai, flavonai, izoflavonai, antocianidinai, antocianinai ir flavanonai (5 pav.). Atskiri junginiai kiekvienoje šių grupių gali skirtis hidroksilo grupės padėtimi ir skaičiumi ir jų alkilinimo ir/arba glikozilinimo laipsniu [3]. Flavonoidai gali būti konjuguoti su monosacharidais ir disacharidais bei būti kompleksuose su oligosacharidais, lipidais, aminais [26].
Izoflavonai
Flavonoliai
Flavanonai Flavanoliai Flavonai Antocianinai
5 pav. Flavonoidų klasės ir bendrosios struktūros.
Reikšmingiausia flavonoidų savybė, nulemianti jų svarbą šių dienų medicinoje - antioksidantinis poveikis. Šie junginiai antioksidantiniu aktyvumu pasižymi stipriau negu vitaminai C ir E. Flavonoidų antioksidantinis aktyvumas pasireiškia keliais mechanizmais: laisvųjų radikalų gamyboje dalyvaujančių fermentų, tokių kaip glutationo S-transferazė, NADH oksidazė slopinimu, ROS surišimu bei antioksidantinių fermentų aktyvacija.
Flavonoidų antioksidantinio aktyvumo mechanizmas priklauso nuo hidroksilo grupių išsidėstymo ir kiekio, konfigūracijos, pakaitų [29].
Dėl savo antioksidacinio aktyvumo, flavonoidai turi didelę įtaką širdies ir kraujagyslių sistemai. Deguonies radikalai oksiduoja MTL, kuris pažeidžia endotelį ir vystosi aterosklerozė. Flavonoidai mažina MTL oksidaciją, didina DTL koncentraciją, slopina širdies putliųjų lastelių mediatorių išsiskyrimą [30]. Japonų tyrimo metu pastebėta atvirkštinė koreliacija tarp suvartoto flavonoidų kiekio ir cholesterolio koncentracijos kraujo plazmoje. Flavonoidai, surišdami laisvuosius
radikalus, sukelia ir antitrombinį poveikį, kadangi palaikoma endotelio prostaciklino ir NO koncentracija [29].
Flavonoidai atlieka svarbų vaidmenį ir hipertenzijos kontrolėje. Jie veikia kaip vazodilatatoriai, inhibuoja NADPH oksidazę bei, slopindami superoksido gamybą, palaiko NO kiekį. Tyrimų duomenimis, ilgalaikis flavonoidų vartojimas gali sumažinti širdies - kraujagyslių ligų atsiradimo riziką ir jų pasekmes [31].
3.7. Antioksidantinio tyrimo metodai
Populiarus metodas antioksidantinio aktyvumo nustatymui - DPPH radikalų surišimo galios matavimas. Pirmiausia šį metodą pateikė Brand-Williams 1995 metais. Nuo tada tai plačiai naudojamas antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas. Jo metu naudojamas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas (DPPH) - tai tamsiai violetinės spalvos kristalai, sudaryti iš stabilių laisvųjų radikalų bei tirpstantys organiniuose tirpikliuose. DPPH radikalų prieš naudojimą nereikia aktyvinti, pakanka ištirpinti reikiamą jų kiekį. Kai vandenilio atomas yra atiduodamas molekulei, DPPH radikalai yra redukuojami, susidaro stabili ne radikalinė DPPH forma ir violetinės spalva pereinaį blankiai geltoną hidraziną [32].
6 pav. DPPH reakcija su antioksidantu [33]
DPPH radikalų surišimo galia organinėje terpėje vertinama matuojant absorbcijos sumažėjimą esant 515–528 nm bangos ilgiui, kai absorbcija tampa stabili [34]. Šis antioksidantinio aktyvumo tyrimo metodas yra paprastas ir greitas, naudojamas tik UV spektrofotometras, todėl jis plačiai naudojamas antioksidantinio aktyvumo nustatymui [32].
Kitas metodas, siekiant nustatyti antioksidantinį aktyvumą, tai fotometrinis Fe2+ jonų surišimo metodas. Šio tyrimo esmė ta, kad ferozinas gali chelatuoti su Fe2+ ir sudaryti raudonos spalvos kompleksą. Ši reakcija gali būti ribojama dėl chelatinių agentų, kas sąlygoja raudonos spalvos išblukimą. Spalvos sumažėjimo matavimas nustato tiriamosios medžiagos chelatuojantį aktyvumą ir
gebėjimą konkuruoti su ferozinu dėl geležies jonų. Geležies jonų chelatinis aktyvumas gali būti matuojamas absorbcijos sumažėjimu esant 562nm bangos ilgiui [35].
3.8. Oksidacinis stresas ir širdies-kraujagyslių ligos
Širdies ir kraujagyslių ligų eiga susijusi su oksidaciniu stresu, vykstančiu žmogaus organizme. Dėl padidėjusios aplinkos taršos, rūkymo, streso, alkoholio vartojimo, ultravioletinės spinduliuotės organizme susidaro laisvieji radikalai. Tai - nestabilios molekulės, turinčios neporinį elektroną. Padidėjęs laisvųjų radikalų kiekis organizme gali sąlygoti cukrinio diabeto, neurodegeneracinių ligų, vėžio atsiradimą, taip pat turi neigiamą įtaką kraujagyslėms [36, 37].
Šios laisvaradikalinės reakcijos prasideda dėl įvairių reaktyvių deguonies junginių per didelio susikaupimo ląstelėje: superoksido radikalo (O2•-), hidroksilo radikalo (•OH), azoto monoksido (NO•), peroksilo radikalo (ROO•), vandenilio peroksido (H2O2), hipochlorinės rūgšties (HOCl), singletinio
deguonies (1O2) [37].
Radikalų kaupimais sąlygoja endotelio difunkciją, kurios metu homeostatinės endotelio funkcijos yra sutrikdomos. Viso to eigoje formuojasi vazospazmai, trombozės, intimos augimas, uždegimas, plokštelių susidarymas ir jų įtrūkimai. Dėl visų šių disfunkcijos padarinių formuojasi tokios ligos kaip audinių išeimija, aterotrombozė ir infarktas. Sutrikdyta endotelio funkcija pasireiškia tuomet, kai patologiniai procesai užkerta kelią endotelio ląstelių išskirto azoto monoksido bioaktyvumui. NO yra išskiriamas endotelio ląstelių ir taip reguliuoja kraujagyslių tonusą veikdamas kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles, sukeldamas kraujagyslių vazodilataciją. Kitos NO funkcijos susijusios su plokštelių formavimąsi, leukocitų adheziją stabdančiu poveikiu. Sumažėjusi NO sintezė ar jo inaktyvacija - pagrindinė priežastis formuotis širdies ir kraujagyslių ligų rizikos faktoriams [38].
Pagrindinis sutrikusio NO bioprieinamumo mechanizmas yra susijęs su superoksido anijonu. Prie vienos deguonies molekulės prisijungus vienam elektronui susiformuoja superoksido radikalas (O2•).:
O2+ e-→O2•- [39].
Šis laisvasis radikalas tiesiogiai reaguoja su NO ir mažina jo biologinį aktyvumą,susiformuojant peroksinitritui. Vystosi endotelio disfunkcija ir tai gali sąlygoti tokias ligas kaip hipertenzija ir aterosklerozė [40].
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
4.1. Tyrimo objektas
Buvo tirtos išdžiovintos saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) augalo dalys - stiebai, lapai, žiedynai, sėklos. Taip pat buvo tiriama visa augalo biomasė, rinkta 2013 metais ir 2014 metais bei visa augalo biomasė, rinkta augalo krūmijimosi laikotarpiu, džiovinta skirtingais būdais - įprastu džiovinimu ir naudojant liofilizaciją.
Augalo kilmė. Laukinis ekotipas, surinktas natūralioje pievoje Latvijoje.
Kolekcijos įrengimas. Augalų kolekcija buvo įrengta 2012 metais Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centre, Dotnuvos instituto bandymų laukuose, giliau karbonatiniame sekliau glėjiškame vidutinio sunkumo priemolio rudžemyje. Kolekcija pasėta birželio mėnesį. Tos pačios veislės ir selekcinė medžiaga pasėta 4 pakartojimais, 2,5 m2 laukeliais: po 2 eilutes, kurių ilgis – 5 metrai,
atstumas tarp numerio eilučių – 0,5 metro, atstumas tarp skirtingų numerių – 0,5 metro. Auginimui nebuvo naudojami herbicidai.
Augalo dalių rinkimas. Augalo mėginiai buvo surinkti žydėjimo laikotarpiu 2013 ir 2014 metais bei krūmijimosi tarpsniu 2014 metais. Antžeminė augalo dalis, rinkta 2014 metais, buvo suskirstyta į dvi atskiras dalis. Viena dalis buvo palikta kaip visa augalo biomasė, o kita dalis išskirstyta į morfologines augalo dalis - stiebus, lapus ir žiedynus. Sėklos buvo surinktos 2013 metais.
Mėginių paruošimas. Visi mėginiai buvo nuplauti vandentiekio vandeniu, perplauti distiliuotu vandeniu ir palikti išdžiūti and filtro popieriaus. Tuomet buvo supjaustyti, paruošti kaitinant 15 minučių 105C temperatūroje, išdžiovinti krosnyje 651C temperatūroje ir susmulkinti iki 1 mm. Pusė augalo mėginių, rinktų krūmijimosi tarpsniu, buvo paruošti liofilizacijos būdu. Mėginiai buvo paruošti jų rinkimo dieną.
2 lentelė. 2013 metų orų sąlygos Kėdainiuose.
Mėnesis Vidutinė temperatūra, C Krituliai, mm
Balandis 4,8 46,2 Gegužė 16 49,6 Birželis 18,6 46,4 Liepa 18,5 104,3 Rugpjūtis ND* ND ND* - nėra duomenų.
3 lentelė. 2014 metų orų sąlygos Kėdainiuose.
Mėnesis Vidutinė temperatūra, C Krituliai, mm
Balandis 8,9 27,1 Gegužė 13 75,8 Birželis 14,4 65,8 Liepa 20 69,1 Rugpjūtis 17,6 111,2
4.2 Reagentai ir tirpikliai
Tirpikliai:1. Distiliuotas vanduo (Lietuvos Sveikatos Mokslų laboratorija, ruošiamas vandens distiliavimo sistema „Millipore");
2. C2H5OH - etanolis, 96% (UAB „Stumbras", Lietuva);
3. CH3COOH - acto rūgštis (ledinė) (100%); (Carl Roth GmbH + Co., Vokietija).
1. Folin - Ciocalteu tirpalas (Sigma-Aldrich, Šveicarija);
2. Na2CO3 - natrio karbonatas, bevandenis (99,5-100,5%) (Sigma-Aldrich, Prancūzija);
3. AlCl3x6H2O (≥95%); (Carl Roth GmbH + Co., Vokietija);
4. Heksametilentetraminas; (≥99,5%); (Sigma-Aldrich, Rusija);
5. DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) (95%); (Alfa-Aesar, Vokietija); 6. Ferozinas (≥97%); (Sigma-Aldrich, JAV);
7. FeCl2x4H2O (99,5%); (Alfa-Aesar, Vokietija).
Medžiagos standartams:
1. Galo rūgšties monohidratas (≥98%); (Sigma-Aldrich, Kinija); 2. Rutino hidratas (≥94%); (Sigma-Aldrich, Vokietija).
4.3 Naudota aparatūra
Augalinių žaliavų bei reagentų svėrimui naudotos elektroninės analitinės svarstyklės (ABT 100-5M, Kern & Sohn GmbH, Vokietija).
Mėginių ekstrakcija buvo vykdyta ultragarso vonelėje (Elmasonic S 40 (H), Elma - Hans Schmidbauer GmbH & Co.,Vokietija).
Bendrajam fenolinių junginių, flavonoidų kiekiui nustatyti ir laisvųjų radikalų surišimo bei Fe2+ jonų surišimo įvertinimui nustatyti naudotas spektrofotometras (GENESYS-2, Thermo-Scientific, JAV).
4.4 Astragalus glycyphyllos L. tyrimų metodikos
Tiriamojo ekstrakto gamyba. Išdžiovinta susmulkinta augalinė žaliava ektrahuojama ultragarsinės ekstrakcijos būdu. Šis ekstrakcijos būdas yra greitas, paprastas, patogus ir pigus lyginant
su kitais augalinės žaliavos paruošimo metodais. Ultragarsinė ekstrakcija dažnai naudojama išgauti fenolinius junginius [43]. Kiekvienos susmulkintos augalo dalies atsverta po 0,1 g, suberiama į tamsaus stiklo buteliuką (tikslus svėrinys) ir užpilta 30 ml 70% etanoliu. Ekstrahuojama 15 minučių 40°C temperatūroje. Filtruojama pro popierinį filtrą.
4.5. Saldžialapės kulkšnės ekstraktų spektrofotometrinė analizė
4.5.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas
Suminis fenolinių junginių kiekis etanoliniuose ekstraktuose nustatytas matuojant absorbciją spektrofotometru, taikant Folin – Ciocalteu kolorimetrinį metodą. 1 ml tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 5 ml darbinio Folin – Ciocalteu fenolinio reagento ir įpilama 4 ml natrio karbonato 7,5% vandeninio tirpalo. Gautas mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Absorbcija matuota spektrofotometru po 1 val. esant 765 nm bangos ilgiui. Gauti duomenys palyginti su standartinių galo rūgšties tirpalų kreive ir išreikšti miligramais, ekvivalentiškais galo rūgščiai, gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
GAE = c×V/m, mg/g
c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);
m –tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
4.5.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas
Suminis flavonoidų kiekis nustatomas tiriamąjį ekstraktą veikiant aliuminio chlorido ir heksametilentetramino tirpalais, acto rūgštimi parūgštintoje terpėje. Duomenys įvertinami gautą absorbcijos koeficiento dydį lyginant su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpilant 1 ml etanolinio ekstrakto, 10 ml 96% etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5% heksametilentetramino tirpalo; kolbutės turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės, sumaišoma. Praėjus 30 min matuojamas absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant bangos ilgiui 407 nm.
Palyginamasis tirpalas paruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpilant 1 ml etanolinio ekstrakto, 10 ml 96% etanolio, 0,5ml 33% acto rūgšties tirpalo ir kolbutės turinį praskiedus išgrynintuoju vandeniu iki žymės.
Etaloninio tiriamojo ir palyginamojo rutino tirpalo paruošimas vykdomas vietoje 1 ml ekstrakto pilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo. Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,05 g tirpinant etanolyje 100 ml talpos matavimo kolbutėje.
Flavonoidų suminis kiekis perskaičiuotas rutinu ir išreikštas mg/g: X=mR× A × V/m × AR×VR× 1000
mR - rutino masė g, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti; A - augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V - augalinio ekstrakto tūris, ml;
m - augalio bandinio masė g, sunaudota ekstraktui paruošti; AR - etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
VR- etaloninio rutino tirpalo tūris, ml.
4.5.3. Fotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas
Kiekvieną dieną buvo ruošiamas šviežias 6×10-5 M DPPH tirpalas ir laikomas apsaugant nuo
6x10-5 M DPPH tirpalo (96% (v/v) etanolyje. Tirpalas gerai sumaišomas. Tuščias bandinys paruošiamas su 50 µl 70% etanolio. Spektrofotometru išmatuojamas mėginių absorbcijos dydžio sumažėjimas 515 nm bangos ilgyje po 30 min.
Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais: DPPH surišimas = [(Ab - Aa)/Ab] × 100%
Ab - tuščio bandinio absorbcijos dydis (t=0 min.);
Aa - bandinio su tiriamuoju ekstraktu abdorbcijos dydis (po 30 min.).
4.5.4. Fotometrinis Fe
2+jonų surišimo metodas
Chelatinės ekstraktų savybės buvo įvertinamos matuojant Fe(II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimą esant 562 nm bangos ilgiui. Į 1 ml tiriamojo tirpalo ekstrakto įdedama 50 µl 2mM FeCl2 tirpalo, gerai sumaišoma. Reakcija inicijuojama įdėjus 0,2 ml 5 mM ferozino tirpalo. Gerai
sumaišoma, paliekama 10 min. kambario temperatūroje. Po to spektrofotometru matuojamas reakcijos mišinio absorbcijos dydis esant 562 nm bangos ilgiui.
Tuščias bandinys paruošiamas į 1 ml 70% etanolio įdedant tokį patį kiekį FeCl2 ir ferozino
tirpalų. Fe2+ jonų surišimas išreiškiamas procentais:
Fe2+ surišimas= [(Ab - Aa)/Ab] × 100% Ab - tuščio bandinio absorbcijos dydis;
Aa - bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis.
4.6. Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenys statistiškai įvertinti naudojantis „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa bei ,,SPSS Statistics 20" (IBM, JAV) statistiniu paketu. Duomenys statistiškai vertinti apskaičiavus tyrimų duomenų matematinį vidurkį ir standartinę paklaidą. Koreliaciniam ryšiui nustatyti taikytas Pirsono koreliacijos koeficientas.
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
5.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Saldžialapės kulkšnės ekstrahavimo sąlygų optimizavimui buvo atlikti tyrimai su visa augalo biomase (2013m.) naudojant skirtingas etanolio koncentracijas, skirtingais laiko intervalais bei esant skirtingai temperatūrai.
Tirpiklio koncentracijos įtakos tyrimas. Siekiant ištirti skirtingų tirpiklių koncentracijų įtaką ekstrakcijos efektyvumui, buvo pasirinkti 60%, 70% ir 80 % etanolis. Augalinė žaliava (0,1 g) ekstrahuojama su 30 ml etanoliu 30°C temperatūroje 15 minučių.
8 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis saldžialapės kulkšnės žaliavoje ekstrakciją vykdant su skirtingos koncentracijos etanoliu
Nustatyta didžiausia fenolinių junginių išeiga su 70% etanoliu, o tiek su mažesnės, tiek su didesnės koncentracijos etanoliu fenolinių junginių išeiga mažesnė. Remiantis šiais rezultatais galima daryti išvadą, kad fenolinių junginių ekstrakcijai iš saldžialapės kulkšnės žaliavos nepakanka 60% etanolio ir naudojant šios koncentracijos tirpiklį, ekstrakcijos išeiga yra mažesnė. Netinkamas yra ir 80% etanolis, taigi galima daryti prielaidą, kad esant didesnei nei 70% etanolio koncentracijai vyksta fenolinių junginių degradacija ir gaunama mažesnė šių junginių išeiga. Rasti literatūros duomenys parodė, kad atliekant perkoliaciją su saldžialapės kulkšnės žaliava taip pat naudotas 70% etanolis [44].
Literatūroje minimų tyrimų metu tokia pati tirpiklio koncentracija naudota ir atliekant maceraciją su saldžialapės kulkšnės genties augalu Astragalus hamosus [45].
Ekstrakcijos trukmės įtaka fenolinių junginių išsiskyrimui. Augalinė žaliava (0,1 g) ekstrahuojama su 30 ml 70% etanoliu. Ekstrakcija buvo atliekama ultragarso vonelėje esant 30°C. Ekstrakcija buvo vykdoma skirtingais laiko intervalais: 10, 15, 20 min.
9 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis saldžialapės kulkšnės žaliavoje ekstrakciją vykdant skirtingais laiko intervalais
Didžiausia fenolinių junginių išeiga nustatyta atliekant ekstrakciją 15 minučių, o didinant ekstrakcijos trukmę fenolinių junginių kiekis mažėja. Dauguma fenolinių junginių lengvai hidrolizuojasi ir oksiduojasi. Ypač esant ilgam ekstrakcijos laikui fenoliniai junginiai gali oksiduotis ir taip sumažėti jų išeiga ekstrakte [2]. Taigi, remiantis atliktu tyrimu galima teigti, kad optimaliausias laikas saldžialapės kulkšnės ekstrahavimui - 15 minučių.
Ekstrakcijos temperatūros įtaka fenolinių junginių išsiskyrimui. Buvo tiriama temperatūros įtaka fenolinių junginių išsiskyrimui iš augalinės žaliavos. Ekstrakcija vykdoma atsveriant augalinę žaliavą (0,1 g) ir užpilant ekstrahento - 70% etanolio. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 15 min.
10 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis saldžialapės kulkšnės žaliavoje esant skirtingai temperatūrai
Didinant temperatūrą nuo 30°C iki 40°C fenolinių junginių kiekis didėja, bet toliau didinant temperatūrą, fenolinių junginių kiekis pradeda mažėti. Taigi, optimaliausia temperatūra - 40°C. Tai galima paaiškinti tuo, kad aukštai pasireiškia fenolinių junginių oksidacija ir didėjant temperatūrai jų išeiga mažėja [2].
Ekstrakcijos sąlygų parinkimo aptarimas. Ekstrakcijos sąlygos parinktos pagal gautą didžiausią fenolinių junginių išeigą: tirpiklis 70% etanolis, ekstrakcijos trukmė - 15 minučių, temperatūra - 40°C.
5.2. Suminio fenolinių junginių kiekio saldžialapės kulkšnės žaliavoje nustatymas
Atliktas žydėjimo laikotarpiu rinktų augalo dalių bei sėklų ekstraktų suminis fenolinių junginių tyrimas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. Rezultatai pateikti 11 paveiksle.11 pav. Fenolinių junginių kiekis saldžialapės kulkšnės žaliavose, rinktose žydėjimo laikotarpiu bei sėklose
Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas saldžialapės kulkšnės lapų žaliavoje (25,22±0,59 mg/g). Panašus kiekis yra sukauptas žiedynų žaliavoje (21,6±0,49 mg/g). Palyginti mažesnis kiekis nustatytas sėklose (13,84±0,63 mg/g). Mažiausias fenolinių junginių kiekis yra Astragalus glycyphyllos L. stiebuose (6,12±0,46 mg/g).
Gauti rezultatai sutampa su literatūroje rastais duomenimis. Tos pačios genties augalo, Astragalus compactus, ekstrakte nustatytas fenolinių junginių kiekis buvo didesnis lapų žaliavos ekstrakte palyginus su žiedynų žaliavos ekstraktu [46]. Didesnis fenolinių junginių kaupimasis saldžialapės kulkšnės lapuose gali būti paaiškinamas kaip lapų audinių apsauga nuo UV šviesos. Augalai, apšvietus juos UV-B šviesa, pradeda gaminti fenolinius junginius, antioksidantinius fermentus, kurie apsaugo lapo audinius nuo fotooksidacinės pažaidos [47,48].
Lyginant fenolinių junginių kiekį visoje augalo biomasėje skirtingais rinkimo metais, pastebėta, kad 2013 metais rinkta žaliava yra sukaupusi didesnį fenolinių junginių kiekį (18,68±0,45 mg/g) negu žaliava, rinkta 2014 metais (15,85±0,16 mg/g) [49]. Pagal literatūros šaltinių duomenis, nustatytas fenolinių junginių kiekis saldžialapės kulkšnės antžeminėje dalyje (15,93±0,47 mg/g) yra panašus kaip ištirtoje 2014 metų derliaus žaliavoje (15,85±0,16 mg/g). Kitame tos pačios genties augale, Astragalus squarrosus nustatytas šiek tiek didesnis fenolinių junginių kiekis antžeminėje augalo dalyje (23,3 mg/g) [50].
Galima daryti prielaidą, kad skirtingos oro sąlygos augalo vystymosi laikotarpiu turi įtakos veikliųjų medžiagų kiekio svyravimui tose pačiose žaliavose. 2014 metų gegužę, prasidėjus lapų vystymosi laikotarpiui, vidutinė mėnesio temperatūra buvo trimis laipsniais žemesnė negu 2013 metų gegužę. Apžvelgiant augalo žydėjimo pradžią - birželį, pastebėta, kad 2014 metais birželio temperatūra
buvo keturiais laipsniais žemesnė negu 2013 metų birželį. Apžvelgiant kritulių kiekį pastebėta, kad tiek gegužę, tiek birželio mėnesį didesnis kritulių kiekis buvo 2014 metais. Taigi galima daryti prielaidą, kad aukštesnė temperatūra turėjo įtakos didesniam fenolinių junginių kiekiui augalo žaliavoje ir mažesnis kritulių kiekis lėmė, jog saldžialapės kulkšnės visoje augalo biomasėje, rinktoje 2013 metais kaupiasi didesnis fenolinių junginių kiekis.
Atliktas krūmijimosi tarpsniu rinktų Astragalus glycyphyllos L. visos augalo biomasės suminis fenolinių junginių tyrimas siekiant palyginti džiovinimo būdo įtaką veikliųjų medžiagų išekstrahavimui.
12 pav. Fenolinių junginių kiekis saldžialapės kulkšnės žaliavose, ruoštose skirtingais džiovinimo būdais
Krūmijimosi tarpsniu surinktoje visos augalo biomasės žaliavoje, ruoštoje liofilizacijos būdu, nustatyta daugiau fenolinių junginių (16,28±0,87 mg/g) negu džiovintoje įprastai. Siekiant geresnių ekstrahavimo rezultatų ir didesnio veikliųjų medžiagų kiekio, galima naudoti liofilizacijos metodą paruošiant saldžialapės kulkšnės žaliavas. Apžvelgiant skirtingais metais rinktų žaliavų rezultatus, pastebėta, kad 2014 metų rudenį rinkta visa augalo biomasė nepasižymėjo didesniu fenolinių junginių kiekiu negu 2013 metais rinkta visa augalo biomasė žydėjimo laikotarpiu. Nustatyta, kad krūmijimosi tarpsniu rinkta visos augalo biomasės žaliava, džiovinta įprastu būdu kaupia mažiau fenolinių junginių (11,4±1,16 mg/g) negu žydėjimo metu rinkta žaliava. Tačiau palyginus fenolinių junginių kiekį visoje augalo biomasėje, rinktoje 2014 metais žydėjimo laikotarpiu ir visoje augalo biomasėje, rinktoje 2014 metais krūmijimosi laikotarpiu, ruoštoje liofilizacijos būdu, pastebėta, kad didesnis fenolinių junginių kiekis išgautas iš krūmijimosi tarpsniu rinktos ir liofilizuotos žaliavos. Taigi tai patvirtina liofilizacijos naudą siekiant išgauti kuo daugiau veikliųjų medžiagų.
5.3. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas
Nustatytas bendras flavonoidų kiekis saldžialapės kulkšnės sėklų ir žaliavų, rinktų žydėjimo laikotarpiu, ektraktuose. Rezultatai pateikti 13 paveiksle.
13 pav. Flavonoidų kiekis saldžialapės kulkšnės augalo dalyse, rinktose žydėjimo laikotarpiu bei sėklose
Bendras flavonoidų kiekis saldžialapės kulkšnės žaliavose svyravo nuo 0,96 mg/g iki 20,38 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas lapų žaliavoje (20,38±0,31 mg/g). Šiek tiek mažesnis kiekis nustatytas žiedynuose (15,23±0,16 mg/g). Sėklose nustatytas flavonoidų kiekis - 5,88±0,11 mg/g. Palyginus 2013 ir 2014 metų derliaus visą augalo biomasę pastebėta, kad didesnį flavonoidų kiekį kaupia 2013 metų žaliava (12,61±0,32 mg/g) negu 2014 metų žaliava (10,71±0,06 mg/g). Šio tyrimo metu pastebėta, kad, kaip ir fenolinių junginių tyrimo atveju, didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas lapų žaliavoje. Lyginant flavonoidų ir fenolinių junginių kiekį, pastebėta, kad flavonoidų kiekis yra pakankamai panašus į fenolinių junginių ir gauti rezultatai stipriai koreliuoja (r=0,986, p<0,05). Flavonoidai sudaro didžiausią fenolinių junginių dalį saldžialapės kulkšnės žaliavose. Tai patvirtina literatūros šaltiniuose pateiktą informaciją, kad flavonoidai yra pagrindinė fenolinių junginių dalis Astragalus genties augaluose [11].
Nagrinėjant orų salygų įtaką skirtingų metų žaliavose esančiui flavonoidų kiekiui, nustatyta, kad kaip ir fenolinių junginių atveju,daugiau flavonoidų kaupiama esant mažesniam kritulių kiekiui ir aukštesnei temperatūrai.
Atliktas bendras flavonoidų kiekio nustatymas krūmijimosi tarpsiu rinktoje, skirtingu būdu ruoštoje žaliavoje. Rezultatai pateikti 14 paveiksle.
14 pav. Flavonoidų kiekis saldžialapės kulkšnės žaliavose, ruoštose skirtingais džiovinimo būdais
Nustačius bendrą flavonoidų kiekį krūmijimosi tarpsniu rinktose žaliavose, nustatytas didesnis flavonoidų kiekis liofilizuotos žaliavos ekstrakte (12,18±0,08 mg/g). Mažesnis kiekis nustatytas įprastai džiovintos žaliavos ekstrakte (9,98±0,19 mg/g). Lyginant 2014 metų žaliavas, pastebėta, kad iš liofilizuotos, krūmijimosi metu rinktos visos augalo biomasės išekstrahuotas didesnis fenolinių junginių kiekis negu 2014 metų žydėjimo metu rinktos visos augalo biomasės (10,71±0,06 mg/g). Flavonoidų nustatymo metu pastebėta, kad gauti duomenys yra panašūs kaip ir nustatant fenolinius junginius - liofilizuojant saldžialapės kulkšnės žaliavą gaunama didesnė flavonoidų išeiga.
5.4. Fotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas
Žydėjimo laikotarpiu rinktų žaliavų bei sėklų antioksidantinis aktyvumas nustatytas DPPH radikalų surišimo metodu. Rezultatai pateikti 15 paveiksle.
15 pav. Laisvųjų radikalų surišimo geba saldžialapės kulkšnės augalo dalyse, rinktose žydėjimo laikotarpiu bei sėklose
Antiradikalinis aktyvumas svyravo nuo 3,01% iki 13,26%. Didžiausias laisvųjų radikalų surišimas - antioksidantinis aktyvumas nustatytas žiedynų žaliavoje (13,26±0,66%), šiek tiek mažesnis - lapuose (13,04±0,65%). Beveik perpus mažesnis antiradikalinis aktyvumas nustatytas sėklose (6,42±0,32%). Mažiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas stiebuose (3,01±0,15%). Antioksidantinis aktyvumas buvo palygintas tarp skirtingų metų derliaus žaliavos. Didesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo visa augalo biomasė, rinkta 2013 metais (8,65±0,42%) negu visa augalo biomasė, rinkta 2014 metais (6,52±0,35%).
Matuotas antiradikalinis aktyvumas krūmijimosi metu rinktoje skirtingu būdu ruoštoje žaliavoje.
16 pav. Laisvųjų radikalų surišimo geba saldžialapės kulkšnės augalo žaliavose, ruoštose skirtingais džiovinimo būdais
Didesne radikalų surišimo geba pasižymėjo liofilizuotos visos augalo biomasės žaliavos ekstraktas (7,35±0,36%) negu įprastai džiovintos žaliavos (4,97±0,25%). Taigi galima daryti prielaidą, kad iš liofilizavimo būdu paruoštos žaliavos išsiekstrahuoja daugiau fenolinių junginių, kurie suteikia antioksidantinį aktyvumą ir šis žaliavos paruošimo būdas yra tinkamas ruošiant saldžialapės kulkšnės ekstraktus.
Tarp fenolinių junginių ir antiradikalinio aktyvumo nustatyta stipri koreliacija (r=0,955, p<0,05). Taigi galima teigti, kad didėjant fenolinių junginių kiekiui, didėja ir antioksidantinis aktyvumas. Tačiau pastebėta, kad didžiausiu fenolinių junginių kiekiu pasižyminti žaliava - lapai, pasižymi mažesniu antioksidantiniu aktyvumu negu žiedynai, kurie kaupia šiek tiek mažiau fenolinių junginių. Gauti rezultatai sutampa su literatūros duomenimis - tos pačios genties augalo Astragalus compactus žiedynų žaliava pasižymėjo didesniu antioksidantiniu aktyvumu negu lapai, nors juose buvo rastas didesnis fenolinių junginių kiekis [46]. Saldžialapės kulkšnės didesnis žiedynų antioksidantinis aktyvumas gali būti paaiškintas tuo, kad augalo žaliava rinkta žydėjimo tarpsniu, o tuo metu žiedynai kaupia didesnį kiekį saponinų, kurie suteikia žaliavai antioksidantinio aktyvumo. Literatūros duomenimis, žydėjimo laikotarpiu tirtoje augalo žiedynų žaliavoje nustatyta 6,75% saponinų, pagal visą augalo masę, o tuo tarpu lapų žaliavoje nustatyta 5% [14].
Didesnis žiedynų antioksidantinis aktyvumas gali būti paaiškintas ir tuo, kad Astragalus genties augalai kaupia didelius kiekius kvercetino, izoramnetino ir kemferolio darinių. Šie junginiai randami ir laisvi, ir kondensuotų junginių pavidalu. Pavyzdžiui, Astragalus hamosus kaupia tokius flavonolius kaip rutinas, astragalinas, izoramnetin-3-O-gliukozidas. Kitame tos pačios genties augale Astragalus missouriensis rastas kvercitrinas ir izokvercitrinas [51, 52]. Šie flavonoliai, suteikiantys augalams gelsvą spalvą, pasižymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis veikdami prieš tokius oksidatorius kaip superoksido radikalas, hipochlorinė rūgštis. Kadangi saldžialapės kulkšnės žiedai yra gelsvos spalvos, galima iškelti hipotezę, kad ji savo žieduose kaupia flavonolius, kurie ir suteikia šiai žaliavai stipresnes antioksidantines savybes [53].
Literatūros duomenimis, žydėjimo laikotarpiu saldžialapės kulkšnės žaliavoje randama terpenų, kurių tarpe vyrauja fitolis. Fitolis - tai natūralus antioksidantas, randamas augaluose [54]. Pagal literatūros duomenis, lapų vystymosi laikotarpiu šio terpeno randama mažiau negu žydėjimo laikotarpiu, taigi galima daryti prielaidą, kad žydėjimo metu rasti didžiausi fitolio kiekiai randami saldžialapės kulkšnės žiedynų žaliavoje ir tai jiems suteikia didesnį antioksidantinį aktyvumą [11].
Nustatyta stipri koreliacija tarp antioksidantinio aktyvumo ir flavonoidų kiekio (r=0,886, p<0,05). Taigi, galima teigti, kad antioksidantinis aktyvumas yra stipriai susijęs su flavonoidų kiekiu žaliavoje. Palyginus ryšį tarp didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčių žaliavų ir jų sudėtyje
esančių flavonoidų kiekio, nustatyta, kad, kaip ir fenolinių junginių atveju, žiedynai pasižymi stipresniu antioksidantiniu aktyvumu negu lapai, nors lapų žaliavoje nustatytas didesnis flavonoidų kiekis.
5.5. Fotometrinis Fe
2+jonų surišimo metodas
Atliktas fotometrinis Fe2+ jonų surišimo metodas siekiant nustatyti tiriamųjų ekstraktų
pereinamųjų metalų surišimo gebą. Pereinamieji metalai, tokie kaip geležis ar varis, gali dalyvauti ROS susidaryme, ko pasekoje formuojasi širdies - kraujagyslių ligos. Antioksidantams surišant pereinamuosius metalus sumažinamas deguonies toksiškumas, laisvųjų radikalų susidarymas [55].
17 pav. Pereinamųjų metalų surišimo geba saldžialapės kulkšnės augalo dalyse, rinktose žydėjimo laikotarpiu bei sėklose
Atlikus fotometrinį Fe2+ jonų surišimo metodą pastebėta, kad didžiausiu antioksidantiniu
aktyvumu pasižymi saldžialapės kulkšnės žiedynų žaliava (91,97±1,26%). Šiek tiek mažesnis antioksidantinis aktyvumas nustatytas lapų žaliavoje (89,53±1,57%). Panašia pereinamųjų metalų surišimo geba pasižymi sėklų (64,84±1,32%) ir 2013 metų derliaus visos augalo biomasės žaliavos (68,94±0,68%). Mažiausias pereinamųjų metalų surišimas nustatytas stiebuose (61±1,53%).
Kadangi manoma, kad chelatinis aktyvumas yra susijęs su veikliųjų medžiagų kiekiu žaliavose, nustatyta koreliacija (r=0,682, p<0,05) tarp pereinamųjų metalų surišimo gebos ir bendrojo fenolinių junginių kiekio. Vidutinio stiprumo ryšys parodė, kad chelatinės žaliavų savybės iš dalies priklauso nuo fenolinių junginių kiekio. Tačiau nustačius koreliaciją tarp pereinamųjų metalų surišimo
ir flavonoidų kiekio nustatytas stipresnis ryšys (r=0,792, p<0,05). Galima teigti, kad saldžialapės kulkšnės žaliavoje esantys flavonoidai chelatinėmis savybėmis pasižymi labiau negu kiti fenoliniai junginiai.
Fe2+ jonų surišimo metodas buvo taikytas ir krūmijimosi tarpsniu rinktai saldžialapės kulkšnės žaliavai.
18 pav. Pereinamųjų metalų surišimo geba saldžialapės kulkšnės žaliavose, ruoštose skirtingais džiovinimo būdais
Liofilizuota visos augalo biomasės žaliava pasižymėjo didesne pereinamųjų metalų surišimo geba (87,53±0,63%) negu įprastai džiovinta visa augalo biomasė (80,04±1,31%). Tai dar kartą įrodė, kad liofilizacijos metodas yra veiksmingesnis siekiant išekstrahuoti didesnį veikliųjų medžiagų kiekį ir tuo pačiu išgauti didesnį antioksidantinį aktyvumą. Statistiškai palyginus 2014 metų krūmijimosi ir žydėjimo metu rinktų visų augalo biomasių antioksidantinį aktyvumą pastebėta, kad stipresnėmis chelatinėmis savybėmis pasižymėjo rudenį rinkta liofilizuota žaliava, o ne rinkta žydėjimo metu (65,86±1,26%). Statistiškai lyginant laisvųjų radikalų surišimą ir chelatines medžiagų savybes pastebėta vidutinio stiprumo koreliacija tarp rezultatų, taikant abu šiuos metodus (r=0,741, p<0,05). Taigi atsižvelgiant į rezultatus, galima teigti, kad tirtų žaliavų laisvųjų radikalų surišimo savybės tik iš dalies susijusios su pereinamųjų metalų surišimo geba.
5.6. Rezultatų apibendrinimas
Spektrofotometrijos būdu atlikus ekstrahavimo sąlygų optimizavimą nustatyta, kad tinkamiausias tirpiklis ruošiant saldžialapės kulkšnės ekstraktus yra 70% etanolis. Ekstrakcijos trukmė - 15 minučių, temperatūra - 40°C.
Tiriant saldžialapės kulkšnės žaliavas spektrofotometriniu Folin - Ciocalteu metodu nustatyta, kad didžiausią fenolinių junginių kiekį kaupia lapų žaliava, šiek tiek mažesnį - žiedynų žaliava. Panašios ir flavonoidų kaupimosi tendencijos šio augalo žaliavose. Apžvelgus klimato sąlygas augalų vegetacijos fazių metu, nustatyta, kad didesniam veikliųjų medžiagų kaupimuisi įtakos turi mažesnis kritulių kiekis ir aukštesnė temperatūra - tokiomis sąlygomis sukaupiama daugiau fenolinių junginių. Šie duomenys patvirtina literatūros šaltiniuose esančią informaciją, kad fenolinių junginių kaupimasis priklauso ne tik nuo augalo vegetacinės fazės, bet ir nuo oro sąlgų [46].
Nustačius veikliųjų medžiagų kiekį tose pačiose, bet skirtingu būdu ruoštose žaliavose, pastebėta, kad liofilizacija yra veiksmingesnis žaliavų džiovinimo metodas siekiant išekstrahuoti didesnį veikliųjų medžiagų kiekį. Gauti rezultatai sutampa su literatūros duomenimis, kad liofilizacija yra efektyvesnis būdas didesnei ekstrahavimo išeigai išgauti [56].
Siekiant nustatyti galimą saldžialapės kulkšnės naudojimą širdies - kraujagyslių ligų pagalbinei terapijai, gauti rezultatai palyginti su kitų augalų tyrimų duomenimis. Veikliųjų medžiagų apžvalgai buvo pasirinkti širdies - kraujagyslių ligoms vartojami ar potencialų terapinį poveikį turintys augalai. Tyrimų duomenimis, mažesni negu saldžialapės kulkšnės stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčių žaliavų fenolinių junginių kiekiai buvo nustatyti miškinės gudobelės (Crataegus oxyacantha) etanoliniame ekstrakte (2,12 mg/g) [57], tačiau Astragalus glycyphyllos veikliųjų junginių kiekis žiedynuose ir lapuose buvo mažesnis negu paprastojo erškėčio (Rosa canina) (96 mg/g) [58], miškinės gudobelės metanolinio/vandeninio (1:1) ekstrakto (30,63 mg/g) [57], kininės rožės (Rosa chinensis) (38,06 mg/g) [59], vienapiestės gudobelės (Crataegus monogyna) vaisių (28,30 mg/g) sudėtyse [60]. Atliktame tyrime su uogomis, grūdais, sėklomis, vaisiais, daržovėmis, iš viso 92 fenoliniais ekstraktais, buvo nustatytas didelis (>20 mg/g) fenolinių junginių kiekis uogose, ypač aronijoje ir varnauogėje, o mažiausias kiekis nustatyas grūduose (0,2-1,3 mg/g). palyginti dideli kiekiai nustatyti tiriamųjų augalų ekstraktuose (9,1-23,1 mg/g) [61].
Apžvelgus literatūros šaltiniuose esančius tyrimus galima teigti, kad saldžialapė kulkšnė kaupia pakankamai didelį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį ir šios veikliosios medžiagos pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, taigi stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižyminti šio augalo dalis - žiedynai, galėtų būti pritaikyti širdies - kraujagyslių ligų pagalbinei terapijai.
6. IŠVADOS
1. Saldžialapės kulkšnės (A. Glycyphyllos L.) skirtingų augalo dalių žaliavose didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas lapuose (25,22±0,59 mg/g) ir žiedynuose (21,6±0,49 mg/g), mažiausias - stiebuose (6,12±0,46 mg/g).
2. Nustatyta, kad flavonoidų kiekis A. Glycyphyllos L. įvairavo nuo 0,96 mg/g iki 20,38 mg/g. Daugiausia šių junginių sukaupė lapų žaliava, mažiausiai - stiebų žaliava.
3. Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymi kulkšnės žiedynai (13,26±0,66%), mažiausiu - stiebai (3,01±0,15%). Pastebima stipri koreliacija tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo (r=0,955, p<0,05) bei tarp flavonoidų kiekio ir antioksidantinio aktyvumo (r=0,886, p<0,05).
4. Stipriausiomis chelatinėmis savybėmis pasižymi žiedynų žaliava (91,97±1,26%), silpniausiomis - stiebai (61±1,53%). Nustatyta stipri koreliacija tarp flavonoidų ir chelatinio aktyvumo (r=0,792, p<0,05); tarp fenolinių junginių ir chelatinių savybių pastebėta vidutinio stiprumo koreliacija (r=0,682, p<0,05).
5. Saldžialapės kulkšnės žaliavoje nustatyti fenoliniai junginiai ir flavonoidai pasižymi antioksidantiniu aktyvumu ir gali būti naudojami širdies-kraujagyslių ligų profilaktikai ir pagalbinei terapijai.
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Būtų tikslinga atlikti tolimesnius saldžialapės kulkšnės (Astragalus glycyphyllos L.) augalo dalių tyrimus, nustatant individualių veikliųjų medžiagų kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei atlikti tolimesnius antioksidantinio aktyvumo tyrimus.
Šio tyrimo metu nustatytas antioksidantinis saldžialapės kulkšnės žaliavų aktyvumas gali būti pritaikomas širdies - kraujagyslių ligų pagalbinei terapijai dėl sudėtyje esančių veikliųjų medžiagų antioksidantinio poveikio. Šis augalas galėtų būti vartojamas profilaktikai ir pagalbinei terapijai kartu su kitais antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčiais Astragalus genties augalais, pavyzdžiui, Astragalus membranaceus, sudėtinėse arbatose. Šį augalą reikėtų rinkti žydėjimo fazės metu, kadangi žiedynai pasižymi stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu. Tačiau reikalingi išsamesni tyrimai pagrindžiant saldžialapės kulkšnės potencialų poveikį širdies - kraujagyslių sistemos negalavimams lengvinti.
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Lysiuk R. Plants of the genus Astragalus used for medicinal purposes. ResearchGate [interaktyvus]. 2014 [žiūrėta 2014-12-04]. Prieiga per internetą:
http://www.researchgate.net/publication/259182657_Plants_of_the_genus_Astragalus_used_for_medi cinal_purposes;
2. Dai J, Mumper RJ. Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules [interaktyvus] 2010 [žiūrėta 2015-03-15] 15(10):7325-7326. Prieiga per internetą: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20966876;
3. Pandey KB, Rizvi SI. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxid Med Cell Longev [interaktyvus] 2009 [žiūrėta 2015-03-24] 2(5):270-278. Prieiga per internetą: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835915/;
4. Nacionalinis vėžio instituto internetinis puslapis [žiūrėta 2015-02-15]. Prieiga per internetą: http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756038;
5. East Tao vaistinės internetinis puslapis [žiūrėta 2015-04-26]. Prieiga per internetą: http://www.easttao.com/catalog/Heaven_Age_Tea.htm;
6. Shkondrov A, Smeonova R, Kondeva - Burdina M, Vitcheva V, Krasteva I. Study to Evaluate the Antioxidant Activity of Astragalus glycyphyllos Extract in Carbon Tetrachloride-Induced Oxidative Stress in Rats. European Journal of Medicinal Plants [interaktyvus] 2015 [žiūrėta 2015-04-29] 7(2): 59-66. Prieiga per internetą: http://www.sciencedomain.org/abstract.php?iid=1018&id=13&aid=8249; 7. JAV žemės ūkio departamento (USDA) internetinis puslapis. [žiūrėta 2015-01-25]. Prieiga per internetą: http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?5792;
8. Clapham AR, Tutin TG, Moore DM. Flora of the British Isles [interaktyvus]. Cambridge University Press; 1990, p. 187 [žiūrėta 2014-12-21]. Prieiga per internetą:
http://books.google.lt/books/about/Flora_of_the_British_Isles.html?id=GVs4AAAAIAAJ&redir_esc= y;
9. Ragažinskienė O, Rimkienė S, Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas: Lututė; 2005. p. 191.;
10. JAV nacionalinio mokslo fondo (NSF) projekto „Go Botany" internetinis puslapis [žiūrėta 2015-01-14]. Prieiga per internetą: https://gobotany.newenglandwild.org/species/astragalus/glycyphyllos/; 11. Platikanov S, Nikolov S, Pavlova D, Evstatieva L, Popov S. Volatiles from Four Astragalus Species: Phenological Changes and their chemotaxonomical Application. Z Naturforsch C. [interaktyvus]. 2005 [žiūrėta 2015-02-04] 60(7-8):591-599. Prieiga per internetą:
12. Bisby F. Phytochemical Dictionary of the Leguminosae [interaktyvus]. CRC Press; 1994, p. 97 [žiūrėta 2014-12-14]. Prieiga per internetą:
http://books.google.lt/books/about/Phytochemical_Dictionary_of_the_Legumino.html?id=pqOcEBcw ySkC&redir_esc=y;
13. Topcu G, Kusman T. Lamiaceae Family Plants as a Potencial Anticholinesterase Source in the Treatment of Alzheimer's Disease. Bezmialem Science [interaktyvus] 2014 [žiūrėta 2015-02-18] 1:10. Prieiga per internetą: http://www.bezmialemscience.org/sayilar/4/buyuk/1-25.pdf;
14. Lobanova IE. Phytochеmical description of Astragalus glycyphyllos (fabaceae). Pастительный мир азиатской россии [interaktyvus]. 2011 [žiūrėta 2014-11-12] 2:87-90. Prieiga per internetą: http://www.izdatgeo.ru/pdf/rast/2011-1/87.pdf;
15. Ionkova I, Shkondrov A, Krasteva I, Ionkov T. Recent progress in phytochemistry, pharmacology and biotechnology of Astragalus saponins. Phytochemistry Reviews [interaktyvus]. 2014 [žiūrėta 2015-05-04] 13(2):366. Prieiga per internetą: http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11101-014-9347-3#page-1
16. Harley CB, Chin AC, Akama T, Yuk-yu Ip N, Wong Y, Miller-Martini DM. Compositions and methods for increasing telomerase activity. US7846904 B2 (Patentas), 2004;
17. Ip FC, Ng YP, An HJ, Dai Y, Pang HH, Hu YQ, Chin AC, Harley CB, Wong YH, Ip NY. Cycloastragenol is a potent telomerase activator in neuronal cells: implications for depression
management. Neurosignals [interaktyvus]. 2014 [žiūrėta 2015-04-27] 22(1):54. Prieiga per internetą: http://www.karger.com/Article/Pdf/365290;
18. Merilendo universiteto Medicinos centro internetinis puslapis [žiūrėta 2015-03-15]. Prieiga per internetą: http://umm.edu/health/medical/altmed/herb/astragalus;
19. Tonev S, Kanev K, Dishovsky C. Medical Management of Chemical and Biological Casualties JMedCBR [interaktyvus]. 2009 [žiūrėta 2015-01-25] 8:240. Prieiga per internetą:
http://www.jmedcbr.org/issue_0801/Dishovsky/Medical_Mgt_of_CB_Casualties.pdf;
20. Ionkova I, Shkondrov A, Krasteva I, Ionkov T. Recent progress in phytochemistry, pharmacology and biotechnology of Astragalus saponins Phytochem Rev [interaktyvus]. 2014 [žiūrėta 2015-03-05] 13:366. Prieiga per internetą: http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11101-014-9347-3#page-1; 21. Godevac D, Zdunić G, Savikin K, Vajs V, Menković N. Antioxidant activity of nine Fabaceae species growing in Serbia and Montenegro. Fitoterapia [interaktyvus] 2008 [žiūrėta 2015-03-15] 79(3):185-187. Prieiga per internetą: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18166277;
22. Kumar S. Free Radicals and Antioxidants: Human and Food System. Advances in Applied Science Research [interaktyvus] 2011 [žiūrėta 2014-12-28] 2(1):129-135. Prieiga per internetą:
