SĖJAMOJO ESPARCETO (ONOBRYCHIS VICIIFOLIA) ŽALIAVŲ PALYGINAMOJI CHEMINĖ ANALIZĖ IR JŲ PRITAIKYMO KRAUJAGYSLIŲ ENDOTELIO DISFUNKCIJOS PROFILAKTIKAI BEI PAGALBINEI TERAPIJAI PERSPEKTYVŲ APŽVALGA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

AIVARA BERNOTAITĖ

SĖJAMOJO ESPARCETO (ONOBRYCHIS VICIIFOLIA) ŽALIAVŲ

PALYGINAMOJI CHEMINĖ ANALIZĖ IR JŲ PRITAIKYMO

KRAUJAGYSLIŲ ENDOTELIO DISFUNKCIJOS PROFILAKTIKAI

BEI PAGALBINEI TERAPIJAI PERSPEKTYVŲ APŽVALGA

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Doc. Dr. Audronė Dagilytė

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

Data

SĖJAMOJO ESPARCETO (ONOBRYCHIS VICIIFOLIA) ŽALIAVŲ

PALYGINAMOJI CHEMINĖ ANALIZĖ IR JŲ PRITAIKYMO

KRAUJAGYSLIŲ ENDOTELIO DISFUNKCIJOS PROFILAKTIKAI

BEI PAGALBINEI TERAPIJAI PERSPEKTYVŲ APŽVALGA

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas

Data

Darbo vadovas

Doc. Dr. Audronė Dagilytė

Data

Darbą atliko

Magistrantė

Aivara Bernotaitė

Data

KAUNAS, 2015

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

DARBO PRISTATYMAS ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia) ... 10

1.1.1. Sėjamojo esparceto charakteristika ... 10

1.1.2. Sėjamojo esparceto cheminė sudėtis ... 11

1.1.3. Polifenolinių junginių struktūros ir antioksidacinio aktyvumo ryšys ... 12

1.1.4. Polifenolinių junginių poveikis žmogaus organizmui ... 16

1.2. Endotelio disfunkcija ... 18

1.2.1. Endotelio disfunkcijos priežastys ir profilaktika ... 18

1.2.2. Preparatai, vartojami endotelio disfunkcijos gydymui ... 21

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 24

2.1. Tyrimų objektas ... 24

2.2. Meteorologinės sąlygos žaliavų auginimo metu Dotnuvoje ... 24

2.3. Naudotos medžiagos ir reagentai ... 26

2.4. Naudota aparatūra ... 26

2.5. Tyrimų metodai ... 26

2.5.1. Tiriamojo pavyzdžio paruošimas ... 26

2.5.2. Spektrofotometrinis suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 28

2.5.3. Spektrofotometrinis suminio flavonoidų kiekio nustatymas ... 30

2.5.4. Spektrofotometrinis antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu ... 30

2.5.5. Spektrofotometrinis chelatinio aktyvumo nustatymas ... 32

2.5.6. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas ... 32

3. REZULTATAI ... 33

3.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingų sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia) augalo dalių ekstraktuose spektrofotometrinės analizės metodu ... 33

3.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas skirtingų sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia) augalo dalių

ekstraktuose spektrofotometrinės analizės metodu ... 35

3.3. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas skirtingų sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia) augalo dalių ekstraktuose spektrofotometrinės analizės metodu ... 37

3.4. Chelatinio aktyvumo nustatymas skirtingų sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia) augalo dalių ekstraktuose spektrofotometrinės analizės metodu ... 39

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 41

5. IŠVADOS ... 44

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44

SANTRAUKA

A. Bernotaitė. Magistro baigiamasis darbas. Mokslinė vadovė: doc. dr. A. Dagilytė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2015.

Darbo pavadinimas: Sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia) žaliavų palyginamoji cheminė

analizė ir jų pritaikymo kraujagyslių endotelio disfunkcijos profilaktikai bei pagalbinei terapijai perspektyvų apžvalga.

Tyrimo objektas ir metodai: Sėjamojo esparceto augalo antžeminių dalių žaliavų, rinktų

skirtingais vegetacijos tarpsniais, bei skirtingais augimo metais analizė. Flavonoidų bei fenolinių junginių kiekio nustatymas, antiradikalinio aktyvumo įvertinimas DPPH radikalų surišimo metodu, chelatinio aktyvumo įvertinimas geležies (II) jonų surišimo pagalba.

Darbo tikslas: ištirti sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia Scop.) kaupiamų fenolinių

junginių kiekį bei savybes, apžvelgti žaliavų pritaikymo galimybes endotelio disfunkcijos profilaktikai ir gydymui.

Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti fenolinių junginių kiekį skirtingų antžeminių sėjamojo esparceto

augalo dalių žaliavose bei visos augalo biomasės žaliavose rinktose skirtingais vegetacijos tarpsniais ir skirtingais metais. 2. Nustatyti flavonoidų kiekį sėjamojo esparceto augalo žaliavose. 3. Įvertinti antiradikalinį sėjamojo esparceto žaliavų aktyvumą. 4. Nustatyti chelatinį sėjamojo esparceto žaliavų aktyvumą. 5. Remiantis analizės rezultatais ir literatūros šaltiniais prognozuoti žaliavos profilaktines ir terapines galimybes endotelio disfunkcijos atveju.

Išvados: 1. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas augalo lapuose (21,99±0,73 mg/g).

Daugiausiai jų kaupiama krūmijimosi tarpsnyje (38,49±1,80 mg/g), o vertinant pagal augimo metus - antraisiais augalo augimo metais rinktoje augalo žaliavoje (24,19±0,69 mg/g). 2. Daugiausiai flavonoidų kaupiama augalo krūmijimosi tarpsnio metu (38,40±1,90 mg/g). Didžiausias flavonoidų kiekis aptiktas lapuose (18,03±2,45 mg/g). Gausesniu flavonoidų kiekiu pasižymėjo antraisiais augalo augimo metais rinkta žaliava (16,21±1,60 mg/g). 3. Didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi krūmijimosi tarpsnio metu rinkta žaliava (39,23±1,83%). Vertinant skirtingas augalo dalis didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas augalo žiedynuose ( 22,07±2,39 %) bei lapuose (21,34±3,00 %). 4. Daugiausiai chelatinių savybių turi augalo žydėjimo tarpsniu rinkta žaliava (52,52±2,76 %). Iš visų augalo dalių didžiausią chelatinį aktyvumą turi sėjamojo esparceto lapai (65,87±1,55 %). 5. Sėjamojo esparceto žaliavos gali būti panaudotos kaip fenolinių junginių ar flavonoidų šaltinis ir dėl šių medžiagų antioksidacinio, vazoprotekcinio, vazodilatacinio bei antiapoptozinio poveikių tai yra perspektyvus augalas endotelio disfunkcijos pagalbinei terapijai bei profilaktikai.

SUMMARY

A. Bernotaitė. Master thesis. Scientific supervisor: Assoc. Prof. A. Dagilytė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Medicinal Chemistry. Kaunas, 2015.

Title: The comperative chemical analysis of sainfoin (Onobrychis viciifolia) herbal raw and its

perspectives in vascular endothelial dysfunction prophylaxis and additional therapy.

Object and methods: Analysis of sainfoin aerial parts herbal raw, collected at different stages of

vegetation and different growth year. Quantitative analysis of flavonoids and phenolic compounds, evaluation of antiradical activity by DPPH assay and iron-chelating activity.

Aim: to investigate quantitative composition and properties of sainfoin (Onobrychis viciifolia

Scop.) polyphenolic compounds and to review saifoins herbal raws aplications possibilities for prophylaxis and treatment of endothelial dysfunction.

Objective: 1. Evaluate quantitative composition of phenolic compounds in different aerial parts

of sainfoin herbal raw and in whole plant herbal raw collected at different stages of vegetation and different growh year. 2. Evaluate quantitative composoition of flavonoids in sainfoin herbal raw. 3. Assess free radical scavenging activity of sainfoin herbal raw. 4. Assess iron chelating activity of sainfoin herbal raw. 5. Based on the results of the analysis and literature to predict saifoin raw prophylactic and therapeutic possibilities in the case of endothelial dysfunction .

Conclusions: 1. The most phenolic compouds were determined in herbal raw of sainfoin leafs

(21,99±0,73 mg/g) and in raw collected at plants tillering phase (38,49±1,80 mg/g). Evaluating the growth year, the highest amount of phenolic compuonds was found in herbal raw collected in second plants growth year (24,19±0,69 mg/g). 2. The highest amount of flavonoids were determined in raw, collected at plants tillering phase (38,40±1,90 mg/g). As for different plant parts, the most flavonoids were in sainfoin leafs (18,03±2,45 mg/g). Herbal raw, collected in second plants growth year had higher amount of flavonoids (16,21±1,60 mg/g). 3. The highest free radical scavenging activity was determined in sainfoin whole plant herbal raw, collected at plants tillering phase (39,23±1,83%). As for different plant parts, sainfoin leafs ( 22,07±2,39 %) and flowers (21,34±3,00 %) had the best free radical scavenging activity. 4. The best iron chelating activities were determined in sainfoin raw, collected at plants blooming phase (52,52±2,76 %). Plants leafs have the best iron chelating activity(65,87±1,55 %). 5. Sainfoin raw may be used as a source of polyphenols and flavonoids and because of the antioxidant, vasoprotective, vasodilating and antiapoptotic effects of these substances, this is a promising plant for endothelial dysfunction additional therapy and prophylaxis .

SANTRUMPOS

AKF – angiotenziną konvertuojantis faktorius. DNR – deoksiribonukleorūgštis.

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas DTL – didelio tankio lipoproteinai. ED – endotelio disfunkcija.

Fe (II) – dvivalentė geležis. NO – azoto oksidas.

MTL – mažo tankio lipoproteinai.

NADH - fermentas nikotinamid-adenindinukleotido oksidazė. ONOO – peroksinitritas.

ĮVADAS

Labiausiai paplitusi Onobrychis genties rūšis yra sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia Scop.), nors iš viso yra žinoma 130 skirtingų šios genties rūšių. [11] [63] Lietuvoje gali būti auginamos dvi esparcetų rūšys: sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia Scop.) ir smiltyninis esparcetas (Onobrychis arenaria Kit.). Dažniau yra auginamas sėjamasis. [71] Sėjamasis esparcetas yra pupinių šeimos daugiametis augalas, kilęs iš rytų Viduržemio regiono, dažnai auginamas su kitais daugiamečiais augalais dirvos derlingumui gerinti, nes pasižymi azotą fiksuojančiomis savybėmis. [28] [63] Iš kitų pašarinių pupinių augalų sėjamasis esparcetas išsiskiria ankstyva vegetacijos pradžia – pavasarį jis suželia anksčiau už mėlynžiedę liucerną. [40] Jis yra vertinamas kaip maistingas ir sveikas gyvulių pašaras, pasižymintis antihelmintiniu poveikiu bei skirtingai nei kiti pupinių šeimos augalai nesukeliantis vidurių pūtimo ir netgi slopinantis baltymų degradaciją virškinamąjame trakte. [67] [68]

Visi pupinių šeimos augalai yra vertinami dėl kaupiamų baltymų bei polifenolinių junginių. [64] Sėjamojo esparceto žaliavose aptinkama daug polifenolinių junginių, gausiausiai iš jų nustatoma flavonoidų, iš kurių daugiausia yra flavonolių, flavan-3-olių, fenolinių rūgščių bei flavonų. [53] Dominuojantys junginiai augalo sudėtyje yra flavonolis rutinas, paprastasis fenolis arbutinas, bei kondensuotasis raugas katechinas. [51] [64] Flavonoidai ir kiti polifenoliniai junginiai organizme veikia kaip antioksidantai. Jų biologinis poveikis yra pagrįstas keletu mechanizmų: elektronų atidavimu laisviesiems radikalams, chelatų sudarymu su metalų jonais, antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių fermentų aktyvavimu bei fermentų, skatinančių laisvųjų radikalų susidarymą (oksidazių) slopinimu. [27] [70] [24]

Laisvųjų radikalų perprodukcija arba sutrikusi jų neutralizacija sukelia oksidacinį stresą, kuris oksiduoja mažo tankio lipoproteinus, azoto oksidą, pažeidžia endotelio ląsteles ir sukelia endotelio funkcijos sutrikimus, dėl kurių sužadinamas jo paviršius ir šis tampa trombogeniškas ar neįprastai adhezyvus uždegiminėms ląstelėms. [6] [42] Tyrimais įrodyta, kad didelė antioksidantų koncentracija maiste gali užkirsti kelią oksidacinio streso sukeliamai pažaidai bei atkurti normalią endotelio funkciją. [52]

Siekiant apsaugoti ląsteles bei jų organeles nuo laisvųjų radikalų ir jų reaktyviųjų darinių, naudojant antioksidantus funkcinio maisto, maisto papildų ar kitų farmacinių produktų gamyboje, nuolat ieškoma naujų šių medžiagų šaltinių. [27] [43] [25] Pastaruoju metu didėja susidomėjimas ir natūraliais antioksidantų šaltiniais, kurie galėtų pakeisti sintetinius antioksidantus farmacijoje ir netgi maisto ar kosmetikos pramonėje. [25] [12] Puikus augalinės kilmės antioksidacinių medžiagų pavyzdys galėtų būti flavonoidai ir kiti polifenoliniai junginiai, kurie yra gausiausiai išskiriami

antriniai augalų metabolitai, ir turi 10 kartų stipresnį antioksidacinį poveikį negu vitaminas C ir 100 kartų stipresnį nei vitaminas E ar karotenoidai. [61] [13] [55]

Aktualumas: Darbe pasirinkta tirti sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia Scop.)

augalinių žaliavų etanolinius ekstraktus, kaip potencialų antioksidantų šaltinį, kurie gali turėti teigiamos įtakos endotelio disfunkcijos gydymui bei profilaktikai. Buvo nustatyti augalo suminiai polifenolinių junginių bei flavonoidų kiekiai skirtingais laikotarpiais rinktose bei skirtingų augalo dalių žaliavose. Oksidaciniai procesai organizme gali prasidėti skirtingais mechanizmais, todėl buvo svarbu tiriamųjų ekstraktų poveikį charakterizuoti keletu skirtingų tyrimų. [25] Sėjamojo esparceto ekstraktų antioksidaciniam poveikiui ištirti buvo pasirinkti DPPH radikalų surišimo bei chelatinių junginių sudarymo su geležies (II) jonais metodai.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Uždaviniai:

1. Nustatyti fenolinių junginių kiekį skirtingų antžeminių sėjamojo esparceto augalo dalių žaliavose bei viso augalo žaliavose rinktose skirtingais vegetacijos tarpsniais ir skirtingais metais.

2. Nustatyti flavonoidų kiekį sėjamojo esparceto augalo žaliavose. 3. Įvertinti antioksidacinį sėjamojo esparceto žaliavų aktyvumą. 4. Nustatyti chelatinį sėjamojo esparceto žaliavų aktyvumą.

5. Remiantis analizės rezultatais ir literatūros šaltiniais prognozuoti žaliavos profilaktines ir terapines galimybes endotelio disfunkcijos atveju.

DARBO PRISTATYMAS

Darbo tema parengtos tezės pristatytos 5-ojoje tarptautinėje farmacijos mokslų konferencijoje, dedikuotoje 145-osioms profesoriaus Petro Raudonikio metinėms (The 5th international conference on pharmaceutical sciences and pharmacy practice, dedicated to 145th Anniversary of prof. Petras Raudonikis), stendinių pranešimų sekcijoje.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia Scop.) 1.1.1. Sėjamojo esparceto charakteristika

Sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia Scop.) yra 40 – 80 cm aukščio pupinių (Fabaceae) šeimos daugiametis augalas, tuščiaviduriais stačiais ar dalinai stačiais stiebais, augančiais iš bazalinių pumpurų ant išsišakojusios šaknies. [28] Augalo lapai sudėtiniai plunksniški – susidedantys iš 5 – 14 lapelių porų ir vieno galinio lapelio. Augalo prielapiai platūs ir nusmailėjančiu galu. [49] Sėjamojo esparceto žiedynas – raceminė gausiai žydinti kekė, prisitvirtinusi ant pažastinio žiedynkočio. Žiedai – rausvai raudoni, kupini nektaro. Vienoje kekėje gali būti iki 80 bičių apdulkinamų žiedų. Kiekviename esparceto žiede subręsta po vieną 4 – 6 mm inksto formos sėklą, esančią rudos spalvos neatsidarančioje ankštyje. Sėklos spalva gali varijuoti nuo gelsvai žalios iki rudos ar juodos. (1 pav.) [49] Sėjamasis esparcetas yra labai vertinamas bitininkų, nes kaupia daugiausiai nektaro iš visų ankštinių augalų ir žydi gegužės pabaigoje – birželio pradžioje kai mažai kitų žydinčių augalų. [71]

Sėjamasis esparcetas yra adaptuotas prie labai plataus spektro klimatinių sąlygų ir gerai auga įvairaus derlingumo dirvose. Augalas geriausiai auga neutraliuose ar šarminguose dirvožemiuose (pH 6 ir daugiau), sausose ir drėkinamose vietovėse, tačiau prastai pakelia vandens sąstovį dirvoje. Yra duomenų, jog sėjamasis esparcetas yra atsparus daugumai ligų bei kenkėjų, lyginant su kitais pupiniais augalais. [63]

Lietuvoje yra išvestos dvi sėjamojo esparceto veislės: „Meduviai“ bei „Žilvinai“. Esparcetų veislė „Meduviai“ sukurta Lietuvos žemdirbystės instituto Vokės filiale ir pasižymi didesniu derlingumu bei lapuotumu nei „Žilvinai“. [72]

1.1.2. Sėjamojo esparceto cheminė sudėtis

Augalo cheminėje sudėtyje galima aptikti amino rūgščių, alkaloidų, paprastųjų fenolinių rūgščių, hidroksibenzoinių bei hidroksicinamono rūgščių, dihidroflavonolių, flavon-C-glikozidų, flavan-3-olių, flavonolių, antocianinų bei izoflavonų. [50] Iš polifenolinių junginių daugiausiai augalo žaliavose aptinkama flavonolių, flavonų, fenolinių rūgščių bei flavan-3-olių. [53] Gausiausiai aptinkami pavieniai junginiai yra arbutinas (apie 17,67±7,33mg/g lapkočiuose), rutinas (apie 19,94±12,07mg/g lapuose) bei katechinas (apie 3,46±1,15mg/g lapkočiuose). (2 pav.) [51]

2 pav. arbutino, rutino ir katechino cheminė struktūra.

Yra duomenų, jog sėjamasis esparcetas kaupia platų spektrą įvairių mažo molekulinio svorio fenolinių junginių, tokių kaip cinamono rūgšties dariniai, kemferolis, kvercetinas, afzelinas ir flavonoidų glikozidai. [65]

Dominuojantys junginiai sėjamojo esparceto sudėtyje yra flavonoidai. [28] Sėjamojo esparceto sudėtyje iš visų flavonoidų didžiausią dalį sudaro flavonoliai. [53] Gausiausiai aptinkami flavonoliai: rutinas, kvercetinas, izokvercetinas, astragalinas, nikotiflorinas, miricitrinas be įvairūs kemferolio dariniai. Iš dihidroflavonolių sėjamojo esparceto žaliavose randami dihidrokvercetinas,

dihidrokemferolio glikozidas ir dihidrokvercetino glikozidas. Augalo sudėtyje taip pat nustatyti flavonų tipo junginiai: viteksinas, izoviteksinas bei orientinas. [51]

Augalo žaliavose esantys flavan-3-oliai yra identifikuoti kaip kondensuotieji raugai. [49] Tai yra antriniai augalo metabolitai, dažniausiai kaupiami ląstelių vakuolėse. [63] Iš jų, katechinas, epikatechinas, galokatechinas ir epigalokatechinas yra aptinkami augalo žaliavoje visose jo augimo stadijose. [49] Kondensuotieji raugai, randami sėjamojo esparceto žaliavose, nėra būdingi kitų plačiai paplitusių pupinių šeimos augalų sudėčiai. [64] Hidrolizuojami raugai augaluose aptinkami mažais kiekiais. [37] Paprastai rauginės medžiagos aptinkamos augalų šaknyse, žievėje, stiebuose bei augalo audinių išoriniuose sluoksniuose. [48]

Augalo sudėtyje aptinkamos fenolinės rūgštys gali būti: paprastosios (elago rūgštis, 8-β-gliukopiranoziloksicinamono rūgštis), hidroksibenzoinės (4-hidroksibenzoinė rūgštis, protokatechino rūgštis, galo rūgštis) bei hidroksicinamono rūgštys (trans-p-kumaro rūgštys). [51] Hidroksicinamono rūgštys, esančios sėjamojo esparceto sudėtyje yra stiprūs nitrozamino – kancerogeniško junginio, aptinkamo tabako dūmuose bei konservuotame maiste, inhibitoriai. [40]

Sėjamojo esparceto žaliavoje aptinkamos amino rūgštys yra identifikuotos kaip L-triptofanas bei hipaforinas ( α-N,N,N-trimetiltriptofano betainas). [51] Augalo sudėtyje gausu mineralinių medžiagų, nors lyginant su kitais pupiniais augalais jo sudėtyje esančių kalcio bei natrio koncentracijos yra mažesnės. [63]

Cheminė sudėtis skirtinguose augalo organuose gali varijuoti: pavyzdžiui, arbutinas yra vienas pagrindinių junginių randamų augalo lapkočiuose, stiebuose bei žiedynkočiuose, tačiau lapuose ir žieduose jo gali būti iš vis neaptinkama. [51]

1.1.3. Polifenolinių junginių struktūros ir antioksidacinio aktyvumo ryšys

Polifenoliniai junginiai yra cheminiai komponentai, suteikiantys spalvą augalų organams bei vaisiams. Jie gali būti skirstomi į flavonoidus ir neflavonoidinius junginius. Dažniausiai sutinkami neflavonoidiniai junginiai yra stilbenai ir elago rūgštis. [48] Sėjamojo esparceto sudėtyje dažniausiai aptinkami polifenoliniai junginiai yra paprastieji fenoliai, fenolinės rūgštys, flavonoliai bei raugai. [51] Fenoliniai junginiai yra gausiausiai aptinkami antriniai metabolitai augalų sudėtyje. Jų struktūrai būdingas mažiausiai vienas aromatinis žiedas ir viena ar kelios hidroksilo ar karboksilo grupės. Fenoliniai junginiai antioksidaciniu veikimu pasižymi dėl savo savybės sudaryti chelatinius junginius su metalų jonais ir donuoti elektronus laisviesiems radikalams. [61]

Fenolinės rūgštys gali būti skirstomos į dvi klases: benzoinės rūgšties darinius, tokius kaip galo rūgštis bei cinamono rūgšties darinius, tokius kaip kumaro, kavos ar ferulo rūgštys. [13] Fenolinės rūgštys pasižymi savybe eliminuoti Fe (II) jonus juos chelatuojant ar oksiduojant. Toks veikimas priklauso nuo jų struktūros savybių, ypatingai nuo orto- padėtyje esančių hidroksilo grupių. Elago ir chlorogeno rūgštys, turinčios dvi orto- padėtyse esančias hidroksilo grupes ir atitinkamai keturias ir penkias hidroksilo grupes savo struktūroje iš viso, pasižymi dižiausiu chelatiniu aktyvumu, sudarant junginius su Fe (II) jonais, iš visų fenolinių rūgščių. (3 pav.) [21]

3 pav. elago ir chlorogeno rūgščių cheminės stuktūros.

Arbutinas arba 4-hidroksifenil-β-D gliukopiranozidas yra paprastasis fenolinis junginys ir vienas gausiausiai aptinkamų junginių sėjamojo esparceto žaliavose. [51] Organizme arbutinas yra verčiamas į hidrochinoną, kuris pasižymi antimikrobinėmis, sutraukiančiomis ir dezinfekuojančiomis savybėmis. Hidrochinonas organizme gali grįžtamųjų reakcijų metu būti oksiduojamas ir virsti į chinonus. Antioksidacinės junginio savybės priklauso nuo struktūroje esančių hidroksilo grupių. [47]

Sėjamojo esparceto sudėtyje gausiausiai aptinkami polifenoliniai junginiai yra flavonoidai. [28] Flavonoidai yra polifenoliniai junginiai, kurie gali būti tiek laisvos (aglikonai) tiek glikozidų formos. Visi flavonoidai turi bendrą C6-C3-C6 fenil-benzopirano skeletą. (4 pav.)

4 pav. bendras flavonoidų struktūros skeletas.

Flavonoidai pagal savo cheminę struktūrą yra klasifikuojami į flavonus, flavonolius, flavononus, flavononolius, flavan-3-olius, antocianidinus, leukoantocianidinus, chalkonus, izoflavonus, auronus, neoflavonoidus ir biflavonoidus. Dažniausiai sutinkamos flavonoidų klasės yra flavonai, flavonoliai, flavononai, flavan-3-oliai, izoflavonai bei antocianidinai – šios klasės sudaro

80% visų gamtoje sutinkamų flavonoidų. Kvercetinas, kempferolis ir kvercitrinas yra randami beveik 70% augalų. [48]

Flavonoidų savybė prisijungti laisvuosius radikalus priklauso nuo jo cheminės struktūros. Kuo junginyje daugiau hidroksilo radikalų, tuo stipresnis jo antioksidacinis aktyvumas. Dvi hidroksilo grupės B žiede lemia stiprų antioksidacinį poveikį, o vienos iš jų trūkumas lemia reikšmingą šio poveikio sumažėjimą. Struktūroje esančios hidroksilo grupės sudaro sąlygas tarp jų susidaryti tarpmolekuliniams vandeniliniams ryšiams ir taip padidina fenoksilo radikalų stabilumą. [43] Hidroksilo grupės, esančios prie B žiedo gali atiduoti vandenilį ir elektroną hidroksilo, peroksilo ir peroksinitrito radikalams taip juos stabilizuodamos, vykstant reakcijai: [24]

𝐹 − 𝑂𝐻 + R • → F − O • +RH

Visi flavonoidai pasižymi geromis metalus chelatuojančiomis savybėmis. Žmogaus organizme svarbiausi pereinamieji metalai yra geležis bei varis. Šie elementai vaidina svarbų vaidmenį oksidacinių procesų katalizėje, kadangi jie skatina hidroksilo radikalų susidarymą bei vandenilio peroksido skilimą in vivo. [70] [25] Vandenilio peroksidas žmogaus organizme gali reaguoti su dvivalente geležimi (Fe2+_{) arba vienvalenčiu variu (Cu}1+_{) ir taip lemti hidroksilo radikalų susidarymą.} (5 pav.) [70]

5 pav. Hidroksilo radikalų susidarymas veikiant pereinamiesiems metalams.

Šie procesai gali būti pristabdyti organizme esančius pereinamuosius metalus sujungus į chelatinius junginius. [25] Sudarydami kompleksus su geležimi ir variu, flavonoidai prisijungia juos prie katecholio ar hidroksilo grupių, gretimų okso grupėms ir 1-okso-3-hidroksi grupes turinčių liekanų. [48] [65]

Metilo grupės prijungimas orto padėtyje gali mažinti flavonoidų antioksidacinį aktyvumą. [24] Pavyzdžiui, metilo grupės flavonolių ramnetino ir izoramnetino molekulėse mažina junginių gebėjimą neutralizuoti radikalus, esant mažoms šių medžiagų koncentracijoms. Antioksidaciniam aktyvumui taip pat yra reikšminga metilo grupės prisijungimo vieta – ramnetinas, kuris turi metilo grupę A žiede prie C7 atomo turi didesnį antioksidacinį aktyvumą nei izoramnetinas, kurio metilo grupė lokalizuota B žiede prie C4 atomo. (6 pav.) [43]

6 pav. Ramnetino ir izoramnetino cheminės struktūros.

Kaip ir metilinimas O-glikozilinimas taip pat turi įtakos flavonoidų gebėjimui delokalizuoti elektronus. Be to, prie flavonoidų prisijungę cukrūs ne tik užima laisvas hidroksilo grupes, kurios reikalingos laisvųjų radikalų neutralizavimui, bet ir keičia junginio B žiedo išsidėstymą plokštumoje likusios flavonoido molekulės atžvilgiu, didina hidrofiliškumą ir taip mažina junginio galimybę patekti prie lipidų peroksilo ir hidroksilo radikalų ląstelių membranose.Taigi, glikozilintos flavonoidų formos yra laikomos silpnesniais antioksidantais, tačiau glikozidai kartais pasižymi geresniu bioprieinamumu nei aglikonai. [24] Kita vertus, unikalus glikozido pavyzdys yra rutinas. Rutinas - tai flavonolglikozidas, sudarytas iš flavonolio kvercetino ir disacharido rutinozės. [35] Tai yra gausiausiai aptinkamas flavonolis sėjamojo esparceto augalinėje žaliavoje. [51] Nors ir yra glikozidas, rutinas pasižymi tik nežymiai silpnesnėmis antioksidacinėmis savybėmis nei jo aglikonas kvercetinas. Antioksidaciniam aktyvumui reikšmės taip pat turi prijungto angliavandenio rūšis. Pavyzdžiui, kvercetinas glikozilintas ramnoze pasižymi žymiai mažesniu antioksidaciniu aktyvumu nei glikozilintas rutinoze. [24]

Raugai yra polifenolinės struktūros antriniai augalų metabolitai ir gali būti arba galo rūgšties esteriai ar jų dariniai, kuriuose galo rūgšties liekana yra sujungta su poliolio, katechino ar triterpenoidiniais struktūriniais branduoliais (galotaninai, elagotaninai, kompleksiniai taninai), arba oligomerinai ar polimeriniai proantocianidinai, kurie gali turėti skirtingas interflavanines jungtis ir pakaitus (kondensuotieji raugai). [36] Proantocianidinai gali būti sudaryti iš flavan-3-olių vienetų (katechinai) arba flavan-3,4-diolių vienetų (leukoantocianidinai). [15]

Rauginių medžiagų antioksidaciniam aktyvumui įtakos turi jų polimerizacijos laipsnis. Procianidinų dimerai ir trimerai veikia efektyviau prieš superoksido anijoną, tetramerai stipriau veikia prieš peroksinitrito bei superoksido sukeltą oksidaciją nei trimerai, o heptamerai ir heksamerai aktyviau neutralizuoja superoksido radikalus nei trimerai ar tetramerai. Didėjant procianidinų polimerizacijos laipsniui didėja ir jų aktyvumas prieš daugelį laisvųjų radikalų rūšių. [24]

Sėjamojo esparceto sudėtyje randami kondensuotieji raugai yra identifikuojami kaip procianidinų bei prodelfinidinų mišinys. Šios raugų grupės tarpusavyje skiriasi B žiedo hidroksilinimo pobūdžiu – procianidinai sudėtyje turi katecholio pagrindo B žiedą, o prodelfinidinai – pirogalolio pagrindo B žiedą. Prodelfinidinų ir procianidinų santykis sėjamojo esparceto augalo sudėtyje varijuoja

nuo 36:64 iki 93:7. Toks santykių skirtumas gali būti lemtas kultivaro, augalo amžiaus, vegetacijos fazės, dirvos derlingumo, temperatūros bei drėgmės. Prodelfinidinų – procianidinų santykis augale vaidina svarbų vaidmenį antioksidaciniam kondensuotųjų raugų poveikiui – didėjant prodelfinidinų kiekiui, didėja antioksidacinis aktyvumas. Taip yra dėl medžiagos molekulės B žiedo hidroksilinimo – prodelfinidinai turi tris hidroksilo grupes, o procianidinai – tik dvi. [65] Taip pat yra teigiama, jog prodelfinidinai ir jų monomerai pasižymi stipresniu antihelmintiniu poveikiu nei procianidinai bei jų monomerai. [53]

Mažos fenolių molekulės, kurios lengvai oksiduojasi, tokios kaip kvercetinas ar galo rūgštis gali turėti ir prooksidandinį poveikį (skatinti reaktyviųjų molekulių susidarymą), tačiau didelio molekulinio svorio molekulės, tokios kaip hidrolizuojamieji ar kondensuotieji raugai, beveik neturi ar išvis neturi prooksidantinio veikimo. Prooksidantinis veikimas fenoliniams antioksidantams yra būdingas tik esant tam tikroms sąlygoms – rūgštiniam pH bei didelėms pereinamųjų metalų jonų koncentracijoms kai aplinkoje yra ir deguonies molekulių. [13]

1.1.4. Polifenolinių junginių poveikis žmogaus organizmui

Polifenoliniai junginiai yra įprasta augalinės kilmės maisto produktų sudedamoji dalis ir svarbiausias antioksidantų šaltinis žmogaus mityboje. Pagrindiniai polifenolių tipai yra flavonoidai ir fenolinės rūgštys. [55]

Polifenoliniai junginiai pasižymi antioksidaciniu poveikiu dėl savo gebėjimo atiduoti elektronus (vandenilio atomus) iš hidroksilo grupės laisviesiems radikalams. [41] Tačiau naujausi tyrimai leidžia daryti prielaidą, kad toks veikimo mechanizmas nėra vienintelis – pagrindinis polifenolinių junginių poveikis pasiekiamas jiems tiesiogiai reaguojant su receptoriais ar fermentais, kurie dalyvauja oksidacijos-redukcijos reakcijose. [55] Fenoliniai junginiai nutraukia laisvųjų radikalų susidarymo reakcijas ir oksidacijos procesus slopindami tam tikrus fermentus, tokius kaip oksidazės. [43] Polifenoliniai junginiai vaidina svarbų vaidmenį širdies ir kraujagyslių ligų, osteoporozės bei vėžio prevencijoje ir gali prisidėti užkertant kelią neurodegeneracinių ligų bei cukrinio diabeto vystymuisi. [55] Fenolinės rūgštys pasižymi priešuždegiminiu, priešvėžiniu, atimikrobiniu bei antioksidaciniu aktyvumu. [39]

Polifenoliniai junginiai gali pagerinti endotelio būklę esant jo disfunkcijai. Tyrimais su izoliuotomis žiurkių ar triušių aortomis bei moteriškos lyties makakomis nustatyta, jog izoliuoti polifenoliai, tokie kaip antocianinai, izoflavonai, proantocianidinai, resveratrolis ar kvercetinas pasižymi nuo endotelio priklausomu vazorelaksaciniu veikimu. Šis poveikis gali būti sąlygojamas

antioksidacinio polifenolinių junginių aktyvumo, dėl kurio vazorelaksacinis faktorius NO yra apsaugomas nuo oksidacijos. [55]

Flavonoidų terapinis poveikis yra vertinamas dėl jų antioksidacinio, priešuždegiminio, hepatoprotekcinio, kardioprotekcinio, priešvėžinio, antiopinio, priešspazminio, antimutageninio antialerginio bei priešvirusinio poveikių. [48] Epidemiologinėmis studijomis yra nustatytas atvirkštinis koreliacinis ryšys tarp flavonoidų vartojimo ir lėtinių širdies bei kraujagyslių ligų pablogėjimo rizikos. [70] [57] Praturtinus dietą flavonoidais, jie gali sumažinti širdies ir kraujagyslių ligų išsivystymo riziką. [55] Teigiamas maiste esančių flavonoidų poveikis žmogaus organizme pasireiškia iškart virškinamojo trakto spindyje, kur šios medžiagos gali apsaugoti kitus lengvai pasisavinamus antioksidantus nuo suirimo bei virškinamojo trakto epitelio ląstelių membranose, kurias saugo nuo laisvųjų radikalų poveikio. [43]

Iš visų flavonoidų aktyviausiais junginiais yra laikomi flavonoliai. [47] Tyrimų duomenimis nustatyta, jog flavonolglikozidas rutinas gali reikšmingai sumažinti lipidų peroksidaciją bei padidinti antioksidacinių fermentų veikimą – tokiu būdu šis junginys efektyviai veikia prieš oksidacinį stresą. Rutinas taip pat pasižymi antiautofaginiu ir antiapoptoziniu veikimu. [35] Tai taip pat ypatingai svarbu esant padidėjusiai laisvųjų radikalų pažaidos rizikai, nes oksidacinis stresas skatina tiek apoptozę tiek autofagiją. Šie procesai indukuoja ląstelių mirtį esant išemijai. [20] Šalia savo antioksidacinio poveikio, flavonoliai taip pat dalyvauja daugelyje biocheminių signalinių reakcijų. Yra žinoma, jog kvercetinas ir jam giminingi flavonoliai skatina nuo endotelio priklausomų vazodilatatorių veikimą, saugo nuo oksidacinio streso NO molekulę bei endotelį, pasižymi antiagregaciniu poveikiu, slopina MTL oksidaciją bei mažina uždegiminių markerių adheziją prie kraujagyslių sienelių. Kvercetinas pasižymi antihipertenziniu ir antiaterogeniniu poveikiu ir taip pat slopina endotelio disfunkcijos vystymąsi. [47]

Tyrimų in vitro metu yra įrodytas antocianinų poveikis endotelio ląstelėms – nustatyta, jog endotelio ląstelės ne tik geba prisijungti antocianinus, bet taip pat pastebėtas reikšmingas ląstelių rezistentiškumo žalingiems reaktyviųjų deguonies formų poveikiams padidėjimas. [69] Atlikti tyrimai taip pat nustatė, jog flavonoidai, ypač antocianinas delfinidinas ir flavonas chrizinas, gali turėti vazodilatacinį nuo endotelio priklausomą ar NO sukeltą poveikį. [47]

Tiek hidrolizuojamieji, tiek kondensuotieji raugai, randami augalų sudėtyje yra laikomi puikiomis antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčiomis medžiagomis. [37] Kondensuotieji raugai šalia visiems flavonoidams būdingų antioksidacinių bei priešvirusinių poveikių taip pat pasižymi imunomoduliacinėmis, antibakterinėmis bei antihelmintinėmis savybėmis. [32] [37] Nustatyta, jog iš sėjamojo esparceto lapų išskirti kondensuotieji raugai efektyviai veikia prieš Butyrivibrio fibrisolvens bei Streptococcus bovis bakterijas [32] Raugai taip pat didina gliukozės įsisavinimą organizme, o tai gali būti panaudota nuo insulino nepriklausomo cukrinio diabeto gydymui. [37]

Sėjamasis esparcetas šiuo metu yra naudojamas veterinarijoje, žolėdžių gyvulių pašaruose kaip antihelmintinį ir vidurių pūtimą mažinantį poveikį turintis augalas, taip pat teigiama, jog polifenolinių junginių gausa augalo sudėtyje gali pagerinti gyvulių sveikatą bei prailginti jų mėsos galiojimo laiką ir stabilumą dėl lipidų peroksidacijos slopinimo po skerdimo. [40]

1.2. Endotelio disfunkcija

1.2.1. Endotelio disfunkcijos priežastys ir profilaktika

Kraujagyslių endotelis yra daugiafunkcinis audinys. Jis yra svarbus kraujagyslių sienelių homeostazei bei kraujo apytakos funkcijai, nes palaiko pusiausvyrą tarp vazodilatacijos ir vazokonstrikcijos, veikia trombogenezę bei fibrinolizę, slopina ir skatina lygiųjų raumenų ląstelių augimą ir migraciją. [7] [42]

Endotelis išskiria daugybę aktyvių medžiagų (prostacikliną, azoto oksidą, bradikininą, interleukinus, endotelinus, endotelio ląstelių augimo faktorius, plazminogeno inhibitorius, von Willebrando faktorių), kurios palaiko normalų kraujagyslės tonusą, veikia trombocitų ir leukocitų adheziją ir agregaciją, kraujagyslės lygiųjų raumenų proliferaciją, reguliuoja pusiausvyrą tarp trombogenezės ir trombolizės. [18] Prostaciklinas veikia sinergistiškai su NO slopinant trombocitų agregaciją. [7] Bradikininas skatina NO, prostaciklino, endotelio išskiriamo hiperpoliarizuojamojo faktoriaus ir kitų prie trombocitų agregacijos slopinimo prisidedančių vazodilatorių išsiskyrimą. [17]

Endotelio ląstelės yra pagrindinis NO šaltinis. [62] NO endotelio ląstelėse gaminamas iš L-arginino endotelio azoto oksido sintetazės pagalba. [56] NO molekulė turi ne tik vietinį vazodilatacinį poveikį, kurį lemia jo sąveika su guanilatciklaze lygiųjų raumenų ląstelėse, bet ir slopina trombocitų bei leukocitų adheziją prie endotelio ląstelių, trombocitų agregaciją, lygiųjų raumenų lastelių migraciją ir proliferaciją bei uždegimą. [26] NO yra laikoma vazoprotekcine molekule. [56]

Endotelio disfunkcija yra endotelio savybių pasikeitimas, kuris blogina kraujagyslių reaktyvumą arba sužadina endotelio paviršių - šis tampa trombogeniškas ar neįprastai adhezyvus uždegiminėms ląstelėms. Tai lemia trombų formavimosi pradžią, aterosklerozę, hipertenzijos sukeltą kraujagyslių pažeidimą ir kitus sutrikimus. [42] Endotelio pažeidimas yra laikomas pirmuoju aterogenezės požymiu. [62] Tam tikrų endotelio disfunkcijos formų pradžia greita (atsiranda per kelias minutes), jos grįžtamos ir nepriklausomos nuo naujų baltymų sintezės (pvz.: endotelio ląstelių kontrakcija sukelta histamino ir kitų vazoaktyvių mediatorių). Kiti pokyčiai apima pakitimus genų ekspresijoje ir baltymų sintezėje bei gali prireikti ilgo laikotarpio jiems pasireikšti. [42]

Aterosklerozės vystymasis gali būti laikomas oksidacinio streso sukeliamos žalos pavyzdžiu. Dažniausiai didžiausiu aterosklerozės rizikos veiksniu yra laikoma hipercholesterolemija, tačiau pagrindinis žingsnis aterosklerotinės plokštelės susiformavime yra MTL oksidacinės modifikacijos, vykstančios dėl didelės laisvųjų radikalų koncentracijos. [70] Ankstyviausia aterosklerozės stadija – kraujagyslės vidinio sluoksnio, t.y. kraujagyslių endotelio, funkcijos sutrikimas, susijęs su subtiliais biocheminiais pokyčiais kraujagyslės sienelėje, palaipsniui peraugančiais į struktūrinius kraujagyslės sienelės pokyčius – aterosklerozinės plokštelės formavimąsi. Viena pagrindinių aterogenezės teorijų – tai laisvųjų radikalų teorija. Laisvųjų radikalų perprodukcija arba sutrikusi jų neutralizacija sukelia oksidacinį stresą, kuris oksiduoja mažo tankio lipoproteinus, azoto oksidą, pažeidžia endotelio ląsteles ir sukelia endotelio funkcijos sutrikimus. [6] Yra nustatyta, jog viena žmogaus ląstelė kasdien susiduria su 1,5 x 105 _{reaktyvių molekulių sukeltų oksidacinių atakų. [45]}

Hiperlipidemija taip pat stipriai koreliuoja su aterosklerozės progresavimu, tačiau aterogeniški yra tik oksiduoti mažo tankio lipoproteinai (MTL). Reaktyviosios deguonies formos gali stimuliuoti MTL oksidaciją. [9] [45] MTL oksidacija dažniausiai vyksta arterijų sienelėse, kur antioksidantų kiekis, reikalingas laisvųjų radikalų neutralizavimui yra išeikvotas. Oksidacija vyksta keliais mechanizmais: hidroksilo radikalų susidarymo, veikiant pereinamiesiems metalams, reaktyvių deguonies formų susidarymo veikiant mieloperoksidazės bei lopooksigenazės fermentams ir tiesioginės modifikacijos, veikiant reaktyvioms azoto formoms. [70] Subendoteliniame tarpe vyksta oksidacijos reakcija tarp superoksido anijono, peroksinitrito ir MTL, nes superoksido dismutazė nespėja neutralizuoti padidėjusio laisvųjų radikalų kiekio. Susiformuoja aktyvūs oksiduoti MTL, kurie stimuliuoja limfocitų ir monocitų adheziją prie endotelio ląstelių, bei makrofagų migraciją į subendotelinį tarpą (oksiduoti MTL yra nebeatpažįstami MTL receptorių ir gali būti prijungti prie makrofagų receptorių) ir jų transformaciją į putliąsias ląsteles. [60] [9]

Didelės elastingos arterijos (tokios kaip aorta, miego arterija, klubo arterija) bei didelės ar vidutinės raumeninės arterijos (tokios kaip širdies ir pakinkto arterija) yra pagrindiniai aterosklerozės taikiniai. Simptomiškai aterosklerozė dažniausiai apima arterijas tiekiančias kraują širdžiai, smegenims, inkstams ir apatinėms galūnėms. Miokardo infarktas, insultas, aortos aneurizmos ir periferinių kraujagyslių liga (kojų gangrena) yra pagrindinės aterosklerozės pasekmės, kurios priklauso nuo pažeistų arterijų dydžio, santykinio aterosklerotinės plokštelės stabilumo ir vidinės arterijos sienelės pažeidimo laipsnio. Mažesnės kraujagyslės gali užsikimšti, sukeldamos giliųjų audinių perfuzijos pavojų. Atitrūkusios aterosklerotinės plokštelės gali sukelti distaliųjų venų obstrukciją, ar privesti prie sunkios kraujagyslių trombozės. Vidinės kraujagyslės sienelės pažeidimas gali sukelti aneurizmos formavimąsi, lydimą antrinio plyšimo ar trombozės. [42][1]

Endotelio disfunkcija ir pagreitėjusi aterosklerozės eiga taip pat yra pagrindinės mirtingumo ir komplikacijų, susijusių su diabetu, priežastys. Hiperglikemijos sukeltas padidėjęs laisvųjų radikalų

kiekis lemia oksidacinį stresą, kuris vėliau sukelia endotelio disfunkciją bei pagreitėjusį diabeto bei jo komplikacijų vystymąsi. [56]

Oksidacinis stresas yra susijęs ir su nuo endotelio priklausomos vazorelaksacijos sutrikimu, kuris atsiranda dėl NO bioaktyvumo sumažėjimo kraujagyslių sienelėse. Endotelio disfunkcija kartu su padidėjusiais laisvųjų radikalų kiekiais užima svarbią vietą širdies ir kraujagyslių ligų, tokių kaip hipertenzija, aterosklerozė bei širdies nepakankamumas, vystymesi. [16] Padidėjęs laisvųjų radikalų kiekis taip pat geli lemti vėžio, diabeto, uždegiminių ligų vystymąsi bei ankstyvą senėjimą. [45]

Oksidacinis stresas yra apibūdinamas kaip padidėjęs labai reaktyvių molekulių susidarymas ar nepakankamas jų šalinimas. Reaktyvios molekulės gali būti skirstomos į reaktyvias deguonies formas bei reaktyvias azoto formas. Reaktyviosioms deguonies formoms priskiriami: superoksido (•O2-), hidroksilo (•OH),, peroksilo (•RO2), hidroperoksilo (•HRO2-) radikalai, bei neradikalinės molekulės, kaip vandenilio peroksidas (H2O2) bei hipochlorito rūgštis (HOCl). Reaktyviosioms azoto formoms priskiriami: azoto oksidas (•NO), azoto dioksidas (•NO2-) bei neradikalinės molekulės kaip peroksinitritas (ONOO-), nitrito rūgštis (HNO2) bei alkilperoksinitratai (RONOO). [55] [33] NO molekulė, kaip minėta anksčiau, gali būti laikoma vazoprotekcine, tačiau ši jos savybė pasireiškia tik tuo atveju, jei aplinkoje nėra superoksido radikalų – NO lengvai su jais reaguoja, sudarydamas labai reaktyvią peroksinitrito molekulę. [56]

Reaktyvios molekulės organizme gali susidaryti veikiant saulės ar kitokiai radiacijai, dėl maiste esančių medžiagų poveikio, rūkymo, oro užterštumo, ksenobiotikų metabolizmo ar pesticidų. [65] [43]

Tam, kad apsisaugotų nuo nuolatinio oksidacinio streso organizmas turi natūralių antioksidantų, tokių kaip gliutationas, alfa-lipoinė rūgštis, kofermentas Q10, feritinas, šlapimo rūgštis, bilirubinas, metaltioneinas, L-karnitinas, melatoninas, fermentinė superoksido dismutazė, katalzė, glutationo peroksidazės, tioredoksinai bei peroksiredoksinai, kurie reguliuoja intraląstelinius aktyviųjų deguonies formų kiekius. [45]

Esant normalioms sąlygoms, superoksido radikalas iš organizmo yra greitai eliminuojamas, veikiant antioksidacinės gynybos mechanizmams: superoksido radikalas yra verčiamas į peroksido molekulę, veikiant mangano superoksido dismutazei ląstelių mitochondrijose bei vario superoksido dismutazei ląstelių citozolyje. Peroksidas toliau verčiamas į vandenį bei deguonį, veikiant gliutationo peroksidazei mitochondrijose ar gliutationo katalazei lizosomose. Jei aplinkoje yra geležies ar vario jonų. peroksido molekulė gali būti paversta į labai reaktyvius hidroksilo radikalus. [56] Geležies atsipalaidavimas oksidacinio proceso metu yra lemiamas superoksido radikalo. Vėliau laisvas geležies jonas dalyvauja Fentono reakcijoje, sukurdamas labai reaktyvų hidroksilo radikalą. Geležies jonų paskatintas reaktyviųjų deguonies formų susidarymas lemia DNR pažaidas ir todėl turi įtakos vėžio formavimuisi. [45]

Reaktyvios deguonies formos yra atsakingos už įvairių rūšių ląstelių pažaidas, tarp jų – membranos peroksidaciją, DNR pakitimus, fermentų inaktyvaciją, bei baltymų oksidaciją. Nuolatinis balanso tarp reaktyvių deguonies formų susidarymo ir antioksidacinių procesų aktyvumo sutrikimas gali lemti reperfuzinius sutrikimus, aterosklerozę, uždegiminių procesų vystymąsi, karcinogenezę bei ankstyvus senėjimo procesus. [22] [ 70]

1.2.2. Preparatai, vartojami endotelio disfunkcijos gydymui

Laisviesiems radikalams reaguojant su kitomis molekulėmis, gali susidaryti antriniai radikalai, kurie toliau reaguos su kitomis molekulėmis ir taip sudarys dar daugiau laisvųjų radikalų. Tai vadinama grandinine reakcija ir ši reakcija vyks tol, kol sureagavus dviems laisviesiems radikalams susidarys stabilus produktas arba kol radikalus neutralizuos antioksidantas. [70] Tyrimais įrodyta, kad didelė antioksidantų koncentracija maiste gali sumažinti aterogenezės procesus, užkirsdama kelią oksidacinio streso sukeliamai pažaidai bei atkurdama normalią endotelio funkciją. [52] Antioksidaciniu poveikiu gali pasižymėti tiek sintetinės, tiek augalinės kilmės medžiagos.

Endotelio disfunkcijos gydymui yra vartojami vaistiniai preparatai, mažinantys lipidų koncentraciją kraujyje ar mažinantys MTL ir didinantys DTL kiekį, AKF inhibitoriai bei antioksidantai. [7] Antioksidantai sutinkami maiste bei maisto papildų sudėtyje yra vitaminai, mineralai, karotenoidai ir polifenoliniai junginiai. Geriausiai žinomi komponentai yra vitaminai C, E, karotenoidai ir mineralinė medžiaga selenas. [28]

Statinai

Hipercholesterolemijos gydymas statinais (3-hidroksi-3-metilglutaril kofermento A reduktazės inhibitoriais) yra labai efektyvus būdas kardiovaskulinių ligų prevencijai. Tačiau tyrimais įrodyta, jog šios grupės preparatai pasižymi ne tik cholesterolio kiekį kraujo serume mažinančiu poveikiu, bet ir reikšmingu antioksidaciniu veikimu. [22] Statinų antioksidacinis poveikis grindžiamas jų savybe aktyvinti NO sintezę bei S-nitrozilinimo reakcijomis aktyvinti tioredoksino-1 fermentinį veikimą. Tioredoksinas-1 gali tiesiogiai sujungti ir metabolizuoti aktyvias deguonies formas. [23] Nustatytas statinų veikimas tiek prieš peroksilo (aktyviausiai veikia fluvastatinas), tiek hidroksilo (aktyviausiai veikia simvastatinas) laisvuosius radikalus. [22]

AKF inhibitoriai

Viena pagrindinių AKF inhibitorių veikimo vietų yra endotelis. [7] AKF inhibitoriai ED gali mažinti net keletu mechanizmų. Vienas jų – angiotenzino II gamybos slopinimas, dėl kurio susilpnėja NADH oksidazės aktyvinimas ir mažiau pasigamina laisvųjų radikalų, nes superoksido anijono ir vandenilio peroksido gamyba endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelėse vyksta dalyvaujant fermentui

nikotinamid-adenindinukleotido (NADH) oksidazei. [6] Kitas AKF inhibitorių ED mažinimo mechanizmas – tai superdezido dismutazės (SOD) aktyvacija kraujagyslės sienelėje – taip didinama laisvųjų radikalų neutralizacija, dėl kurios mažėja oksidacinis stresas. Be to, AKF inhibitoriai mažina bradikinino skilimą į neaktyvias formas, taigi, gydant AKF inhibitoriais, didėja bradikinino, atpalaiduojančio NO ir prostaglandinus iš endotelio, koncentracija. [6][7]

β adrenoblokatoriai

β adrenoblokatoriai – svarbi vaistų klasė širdies ir kraujagyslių ligoms gydyti. Jie gali būti skirstomi į (a) neselektyviuosius, blokuojančius β1 ir β2 adrenoreceptorius, (b) β1 selektyviuosius, kurių giminingumas stipresnis β1 negu β2 receptoriams. [72]

Karvedilolis yra 10 kartų stipresnis antioksidantas negu vitaminas E. Kai kurie karvedilolio metabolitai turi 30–80 kartų stipresnes antioksidacines savybes negu pats karvedilolis ir 1000 kartų stipresnes negu vitaminas E. Jis apsaugo endotelio ląsteles ir kraujagyslės lygiųjų raumenų ląsteles nuo laisvųjų radikalų pažeidimo, slopina superoksido anijono atsipalaidavimą iš aktyvuotų neutrofilų. Mažina peroksinitrito (ONOO), didina gliutationo ir NO kiekį (tai rasta gyvūnams, turintiems hipercholesterolemiją). [6]

Askorbo rūgštis

Askorbo rūgštis arba vitaminas C yra viena svarbiausių vandenyje tirpių antioksidacinių medžiagų. Su vitaminu C atlikti tyrimai rodo, jog ši medžiaga suriša laisvuosius radikalaus ir taip netiesiogiai didina NO kiekį organizme. Po vitamino C infuzijos nustatytas kraujagyslės spindžio padidėjimas iki 15 proc., o vidutinis kraujotakos greičio padidėjimas iki 41 proc. [19] Ji gali surišti superoksido, vandenilio peroksido, hidroksilo radikalus, hipochloritinę rūgštį, vandeninius peroksilo radikalus bei singletinį deguonį. [70] Be to, askorbo rūgštis geba regeneruoti oksiduotą α-tokoferolį. [58]

Tokoferolis

Lipofiliški antioksidantai sujungia laisvuosius radikalus membranose bei lipoproteininėse organelėse. Šie antioksidantai yra svarbiausi užkertant kelią lipidų peroksidacijos reakcijoms. [70] Vitaminas E gamtoje randamas aštuoniomis skirtingomis formomis, kurios smarkiai skiriasi savo aktyvumu: tokoferoliai α, β, μ bei ir tokotrienoliai α, β, μ bei . Šios medžiagos tarpusavyje skiriasi metilo grupių kiekiu bei jų išsidėstymu prie benzolo žiedo. [70]

Vitaminas E negali užkirsti kelio laisvųjų radikalų susidarymui lipofilinėje aplinkoje, tačiau sumažina antrinių radikalų formavimąsi. α-tokoferolis yra aktyviausias antioksidantas iš tokoferolių – jis greitai reaguoja su peroksilo radikalais ir suformuoja realiatyviai stabilų tokoferoksilo radikalą. [70]

Antioksidantinį poveikį tokoferoliui suteikia jo galimybė grįžtamai konvertuotis iš tokoferolio į α-tokoferilchinoną. [44]

Kofermentas Q-10

Ubichinolis-10 yra redukuota kofermento Q-10 forma ir yra žinomas kaip lipofiliškas antioksidantas. Ši medžiaga organizme randama mažesnėmis koncentracijomis nei α-tokoferolis, tačiau daug efektyviau sujungia peroksilo radikalus, lyginant tiek su α-tokoferoliu, tiek su karotinoidais ir taip pat geba regeneruoti α-tokoferolį iš tokoferilo radikalų. [70]

Selenas

Antioksidacinis seleno molekulių poveikis pasireiškia per laisvųjų radikalų surišimo bei deguonies metabolitų skaidymo mechanizmus. Selenas turi taip pat savybę surišti metalų jonus – tai dar vienas šios medžiagos antioksidacinio poveikio mechanizmas, nes sudarydamas kompleksus su vario jonais žmogaus organizme užkerta kelią laivųjų radikalų susidarymui. [8]

Karotinoidai

Karotinoidai yra grupė riebaluose tirpių antioksidantų, kurių pagrindą sudaro izoprenoidinis anglies skeletas. [70] Gamtoje randama per 600 skirtingų karotinoidų, kurie yra klasifikuojami į karotenus, ksantofilus ir likopenus. Karotinoidai pasižymi antioksidaciniu poveikiu dėl savo įpatingos struktūros, kurioje esantis konjuguotas dvigubasis ryšys gali keisti nesuporuotų elektronų padėtis. Dėl šios savybės karotinoidai puikiai geba nutraukti laivųjų radikalų reakcijas audiniuose ir slopinti singletinio deguonies poveikį. Taip pat šie junginiai reaguoja su pereinamaisiais metalais, tokiais kaip varis ar geležis elektronų perdavimo reakcijose. Kita vertus, tam tikromis sąlygomis, kurios iki galo nėra ištirtos, karotinoidai gali pasižymėti ir prooksidantiniu poveikiu. [31]

Endotelio disfunkcijos profilaktikai taip pat yra svarbu hiperglikemijos kontrolė, tinkamai subalansuota mityba, fizinis aktyvumas ar rūkymo atsisakymas. [7]

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS

2.1. Tyrimų objektas

Tyrimų objektas – lietuviškos Meduvių veislės sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia) žaliavos. Tyrimams naudotos skirtingos augalo dalys: džiovinimo krosnyje džiovinti ir smulkinti sėjamojo esparceto augalo žiedai, lapai, stiebai bei visos antžeminės augalo dalies biomasės žaliava, rinkta 2013 metais, augalų masinio žydėjimo tarpsnyje (birželio 6 – 14 d.); džiovinimo krosnyje džiovinta sėjamojo esparceto visos augalo antžeminės dalies biomasės žaliava, rinkta 2014 metais, augalų masinio žydėjimo tarpsnyje (birželio 6 – 14 d.) bei krūmijimosi tarpsnyje (rugsėjo 2 d.); bei džiovinta liofilizuojant sėjamojo esparceto visos augalo antžeminės dalies biomasės žaliava, rinkta 2014 metais, augalų krūmijimosi tarpsnyje (rugsėjo 2 d.). Visos žaliavos užaugintos Lietuvoje, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centre, Žemdirbystės instituto bandymų laukuose, Dotnuvoje. Kolekcija buvo pasėta 2012 metais birželio mėnesį, jos priežiūrai nebuvo naudota herbicidų.

Surinkti augalo mėginiai prieš tyrimus buvo plaunami vandentiekio vandeniu, skalaujami distiliuotu vandeniu ir nusausinti filtriniu popieriumi. Vėliau žaliavos buvo smulkinamos, 15 minučių laikomos 105°C temperatūroje ir toliau džiovinamos 65 ± 5°C temperatūroje džiovinimo krosnyje. Išdžiovintos žaliavos sumaltos iki dydžio, tinkamo pereiti 1 mm angelių skersmens sietą. Atitinkamos žaliavos buvo džiovinamos liofilizuojant. Visos žaliavos apdorotos rinkimo dieną.

2.2. Meteorologinės sąlygos žaliavų auginimo metu Dotnuvoje

Lietuvoje žolinių augalų vegetacija prasideda balandį, kai penkias dienas iš eilės paros vidutinė temperatūra yra 5°C. [2] Vertinant oro sąlygas, 2013 metais vidutinė oro temperatūra Dotnuvoje buvo didesnė už ilgametį vidurkį (1924 – 2014 metų) gegužės, birželio, liepos bei rugpjūčio mėnesiais. Tų pačių metų balandžio mėnesį vidutinė oro temperatūra buvo mažesnė už 5°C bei ilgametį temperatūrų vidurkį (5,9°C). 2014 metais vidutinė oro temperatūra Dotnuvoje viršijo ilgametį temperatūrų vidurkį visais mėnesiais nuo balandžio iki rugpjūčio, išskyrus birželio mėnesį, kai vidutinė oro temperatūra buvo mažesnė už 1924 – 2014 metų vidurkį 1,3°C. [5] (7 pav.)

7 pav. 2013 ir 2014 metų vidutinės oro temperatūros °C palyginimas su 1924 – 2014 metų oro temperatūros vidurkiu.

Vertinant 2013 metų vidutinį kritulių kiekį Dotnuvoje, galima pastebėti, jog jis buvo mažesnis už 1924 – 2014 metų vidurkį gegužės ir birželio mėnesiais, ilgametį vidurkį viršijo balandžio ir liepos mėnesiais, o rugpjūtį už ilgametį vidurkį buvo didesnis vos 0,2°C. 2014 metais vidutinis kritulių kiekis balandžio bei liepos mėnesiais buvo mažesnis už nustatytą 1924 – 2014 metų vidurkį, o gegužės, birželio ir rugpjūčio mėnesiais viršijo ilgametį vidurkį. 2014 metų rugpjūčio kritulių vidurkis Dotnuvoje išsiskyrė labiausiai – nuo ilgamečio vidurkio skyrėsi 37 mm. [5] (8 pav.)

8 pav. Vidutinio kritulių kiekio 2013 ir 2014 metais palyginimas su 1924 – 2014 metų vidurkiu. 4.8 8.9 5.9 16 13 12.3 18.614.415.7 18.5 20 17.7 18 17.616.7 0 5 10 15 20 25

Balandis Gegužė Birželis Liepa Rugpjūtis

Vi d u tinė o ro te m p e ratū ra °C

2013 metai 2014 metai 1924 - 2014 metai

46.2 49.6 46.4 104.3 74 27.1 75.8 65.8 69.1 111.2 36.9 52.3 62.3 75.5 74.2 0 20 40 60 80 100 120

Balandis Gegužė Birželis Liepa Rugpjūtis

V id u ti n is kri tu lių kiekis mm

2.3. Naudotos medžiagos ir reagentai

Acto rūgštis 100%, Sigma – Aldrich, Vokietija;

Aliuminio chlorido heksahidratas ≥95%, Sigma – Aldrich, Vokietija; 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas 95%, Alfa Aesar, Vokietija;

FeCl2 99,5%, Alfa Aesar, Vokietija;

Ferozinas (ferrozine monosodium salt) ≥97%, Fluka analythical, JAV Folin – Ciocalteau reagentas, Sigma – Aldrich, Šveicarija;

Galo rūgšties monohidratas ≥98,0%, Sigma – Aldrich, Kinija; Heksametileno tetraminas ≥99,5%, Sigma – Aldrich, Rusija;

Natrio karbonatas, bevandenis 99,5 – 100,5%, Sigma – Aldrich, Prancūzija; Maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96%, Lietuva;

Rutino hidratas ≥94%, Sigma –Aldrich, Vokietija.

2.4. Naudota aparatūra

Spektrofotometras Genesys 2, Thermo Spectronic, Spestronic instruments, JAV; Ultragarsinė vonelė Elma S40H (U= 230V, V=40Hz) Elmasonic, Vokietija; Purtyklė IKA KS 130 Basic, IKA-WERKE, Vokietija.

2.5. Tyrimų metodai

2.5.1. Tiriamojo pavyzdžio paruošimas

Optimalios sėjamojo esparceto žaliavų ekstrakcijos sąlygos buvo nustatytos eksperimentiškai. Sėjamojo esparceto žaliavų ekstraktai buvo ruošiami atsveriant 0,1g augalo žaliavos ir ją užpilant 40ml 70% V/V etanoliu. Ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje, keičiant ekstrakcijos laiką (10 min; 15min), ekstrahento koncentraciją (50%, 60%, 70% ir 80% V/V etanolis) ir temperatūrą (kambario temperatūra (18°C); 30°C; 60°C) buvo vertinamas ekstrahuotų fenolinių junginių kiekis. Taip pat buvo vertinama laiko, praėjusio nuo reagentų ir ekstrakto sumaišymo, įtaka fenolinių junginių nustatymo kokybei. (Pasirinkta vertinti ekstraktus po 30, 60 ir 90 minučių).

Optimali ekstrahento – etanolio koncentracija ekstraktų gamybai buvo nustatyta eksperimentiškai. Įvertinta, jog tinkamiausia etanolio koncentracija yra 70%, nes esant šiai koncentracijai ekstraktuose aptiktas didžiausias fenolinių medžiagų kiekis. (9 pav.)

9 pav. Fenolinių junginių kiekio (mg/g) priklausomybė nuo ekstrakcijai panaudoto etanolio koncentracijos.

Nustatyta, jog optimaliausias laikas ultragarso vonelėje yra 15 minučių, o optimali temperatūra 60°C – esant šiom sąlygoms nustatytas didžiausias fenolinių junginių kiekis. (10 pav.)

1 lentelė. Fenolinių junginių kiekybinė priklausomybė nuo ekstrakcijos sąlygų.

Vertinant laiko tarpą nuo reagentų sumaišymo su tiriamuoju tirpalu iki fenolinių junginių kiekio matavimo, optimaliausiu nustatytas 60 minučių laikotarpis. Tai nuspręsta, atlikus papildomus

Sąlygos Fenolinių junginių kiekis mg/g po 30min. Fenolinių junginių kiekis mg/g po 60min. Fenolinių junginių kiekis mg/g po 90min. 10 min. ultragarso vonelėje kambario

(18°C) temperatūroje 15,95 17,24 17,89

10 min. ultragarso vonelėje 30°C

temperatūroje 17,71 18,81 19,33

15 min. ultragarso vonelėje 30°C

temperatūroje 18,27 19,33 19,84

15 min. ultragarso vonelėje kambario

temperatūroje 19,26 20,42 20,96

15 min. ultragarso vonelėje 60° temperatūroje 22,31 23,56 24,03 18.97 19.44 19.7 18.23 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 50% 60% 70% 80% Fe n oli n ių jun gin ių k ieki s m g/g

augalinių ekstraktų, paruoštų anksčiau nustatytomis optimaliomis ekstrahavimo sąlygomis tyrimus. Tyrimui naudoti trys skirtingi ekstraktai. Praėjus 60 minučių nuo reagentų sumaišymo fenolinų junginių mėginiuose nustatyta 7,61 – 9,40% daugiau nei praėjus 30 minučių. Po 90 minučių fenolinių junginių padaugėjotik 1,57 – 4,14%. (10 pav.)

10 pav. Fenolinių junginių kiekio priklausomybė nuo laiko, praėjusio nuo reagentų supylimo.

Eksperimentiškai buvo nustatyta, jog optimalus ekstrakto praskiedimas yra 1:400, nes esant tokiam praskiedimui, galimi tiksliausi matavimai. Spektrofotometras pakankamai tiksliai matuoja šviesos pralaidumą tarp 10 ir 90%, t.y. nuo T=0,1 iki T=0,9. Kai toks pralaidumas, absorbcija yra atitinkamai nuo 0,046 iki 1,000. [3] Naudojant ekstrakto praskiedimą 1:400 mėginių optinis tankis yra optimaliose ribose ir neviršija vieneto. (12 pav.)

2 lentelė. Ekstraktų optinio tankio priklausomybė nuo praskiedimo

2.5.2. Spektrofotometrinis suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas

Sėjamojo esparceto fenolinių junginių kiekis buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Tiriamojo tirpalo optinis tankis buvo lyginamas su ekvivalentinio galo rūgšties tirpalo optiniu tankiu.

0 5 10 15 20 25 30

30 min. 60 min. 90 min.

Fen o lin ių ju n gi n ių ki e ki s m g/ g Ekstraktas Nr.1 Ekstraktas Nr.2 Ekstraktas Nr.3 Optinis tankis Ekstraktų praskiedimas 1:200 1:300 1:400 Ekstraktas Nr.1 1,064 0,821 0,672 Ekstraktas Nr.2 0,919 0,799 0,638 Ekstraktas Nr.3 1,034 0,808 0,649

1ml tiriamojo ekstrakto (1:400) sumaišomas su 5ml 0,2N Folin-Ciocalteu reagento ir 4ml natrio karbonato (7,5%) tirpalo. Tirpalas laikomas tamsoje ir po 1h matuojamas optinis tankis. Spektrofotometro šviesos bangos ilgis – 765 nm , palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. [4]

Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais pagal kalibracinę kreivę.

Galo rūgšties kreivė sudaroma paruošiant etaloninius galo rūgšties tirpalus 70% etanolyje. Buvo ruošiami 0,35; 0,175; 0,0875; 0,04375; 0,021875; 0,010938 mg/ml koncentracijų tirpalai. (11 pav.) 1ml atitinkamos koncentracijos galo rūgšties tirpalo sumaišomas su 5ml Folin-Ciocalteu reagento ir 4ml natrio karbonato tirpalo. Po 1h matuojamas optinis tankis, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, kai palyginamasis tirpalas - išgrynintas vanduo. [29] [66] [48] [14]

11 pav. Kalibracinė galo rūgšties kreivė

Fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas pagal formulę: 𝐶 = 𝑐 × V × m−1

C – polifenolinių junginių koncentracija galo rūgšties ekvivalentais c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml)

V – ekstrakto tirpalo tūris (ml)

2.5.3. Spektrofotometrinis suminio flavonoidų kiekio nustatymas

Sėjamojo esparceto suminio flavonoidų kiekio nustatymui tiriamieji ekstraktai buvo veikiami aliuminio chlorido ir heksametilenteramino tirpalais acto rūgštimi parūgštintoje terpėje. Mėginys tirtas spektrofotometriškai – gautas absorbcijos koeficientas lygintas su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu.

Tiriamojo tirpalo ruošimas: 1 ml etanolinio ekstrakto (1:400), 10 ml 96% etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo ir 2 ml 5% heksametilentetramino tirpalo pilami į 25 ml matavimo kolbutę ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Tirpalas išmaišomas. Praėjus 30 minučių matuojamas absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu. Bangos ilgis – 407 nm.

Palyginamojo tirpalo ruošimas: 1 ml etanolinio ekstrakto, 10 ml 96% etanolio ir 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo pilama į 25 ml matavimo kolbutę ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Tirpalas išmaišomas.

Etaloninio ir palyginamojo rutino tirpalas ruošiamas vietoje 1 ml sėjamojo esparceto ekstrakto pilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo. Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,05 g rutino tirpinant 100 ml 70% etanolio.

Flavonoidų suminis kiekis, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas mg/g, apskaičiuojamas pagal formulę:

X =𝑚𝑅× 𝐴 × 𝑉

𝑚 × 𝐴_𝑅 × 𝑉_𝑅 x 1000

mR – rutino masė gramais, sunaudota etanoliniam rutino tirpalui ruošti. A – sėjamojo esparceto ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis. V – sėjamojo esparceto ekstrakto tūris ml.

m – sėjamojo esparceto bandinio masė g, sunaudota ekstraktui paruošti. AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis.

VR – etaloninio rutino tirpalo tūris ml. [14]

2.5.4. Spektrofotometrinis antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu

Sėjamojo esparceto žaliavų antiradikalinio aktyvumo įvertinimui taikomas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas. DPPH radikalų surišimo metodas yra ekonomiškai efektyvus būdas nustatyti žaliavos komponentų antiradikalinį aktyvumą. DPPH yra violetinės spalvos azoto turintis radikalas, kuris prisijungęs vandenilio ar deguonies atomus iš

antioksidantų tampa bespalviu. Radikalo spalvos kitimo stiprumas tiesiogiai susijęs su antioksidacinio veikimo stiprumu. [61]

Kiekvienam matavimui buvo ruoštas šviežias 6x10-5M DPPH tirpalas 96% etanolyje (paruoštas tirpalas laikomas tamsaus stiklo buteliuke).

50μl tiriamojo etanolinio esparceto žaliavos ekstrakto kiuvetėje buvo maišoma su 2ml DPPH tirpalo. Tuščias bandinys buvo ruošiamas su 50μl 70% etanolio. Kaip palyginamasis tirpalas naudotas 96% etanolis. DPPH reagento radikalų surišimas buvo nustatomas spektrofotometriškai 515nm bangos ilgyje.

Spektrofotometru buvo matuojamas mėginių absorbcijos dydžio mažėjimas kol buvo pasiekta absorbcijos pusiausvyra. (12 pav.) Optimaliu mėginių matavimo laiku nustatytos 30 minučių.

12 pav. Antiradikalinio aktyvumo tyrimo DPPH metodu optimalios trukmės tyrimas.

Antiradikalinis sėjamojo esparceto skirtingų augalo dalių ekstraktų aktyvumas buvo išreiškiamas surišto DPPH procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę:

DPPH surišimas = [(Ab – Aa)/Ab] x 100%

Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min)

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (pasiekus absorbcijos pusiausvyrą – po 30 min.) [4] [66] [48] [12] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Antir ad ik ali n is ak tyvum as DP PH% Laikas, min.

Viso augalo žaliava Esparceto žiedai

Liofilizuota viso augalo žaliava Esparceto lapai

2.5.5. Spektrofotometrinis chelatinio aktyvumo nustatymas

Chelatinėms tiriamųjų ekstraktų savybėms įvertinti matuojamas dvivalentės geležies ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimas, tiriant spektrofotometriškai, esant 562 nm bangos ilgiui.

Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 1 ml tiriamojo ekstrakto dedama 50μl 2mM FeCl2 tirpalo, sumaišoma. Reakcija inicijuojama įdėjus 0,2 ml 5mM ferozino tirpalo. Reakcijos mišinys sumaišomas ir po 10 minučių tiriamas spektrofotometriškai. Tuščias bandinys ruošiamas vietoje 1 ml sėjamojo esparceto ekstrakto įpilant 1 ml 70% etanolio. [25] Geležies jonų surišimas išreiškiamas procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę:

X =(𝐴𝑏− 𝐴𝑎) 𝐴𝑏

× 100% Ab - tuščio bandinio absorbcijos dydis.

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis.

2.5.6. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas

Duomenų statistinis įvertinimas atliktas naudojant „Microsoft Office Excel 2007“ (Microsoft, JAV) bei „SPSS 20.0“ (SPSS Inc., JAV) programomis. Duomenys įvertinti nustatant jų matematinius vidurkius bei standartines paklaidas. Visi matavimai pakartoti tris kartus, kiekvienam žaliavos mėginiui paruošta po tris ekstraktų pavyzdžius. „SPSS 20.0“ programa įvertinta duomenų koreliacija ir tyrimo statistinis patikimumas. Statistinė analizė atlikta pagal Stjudento testą, kur reikšmės p < 0.05 buvo laikomos reikšmingomis.

3. REZULTATAI

3.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingų sėjamojo esparceto

(Onobrychis viciifolia) augalo dalių ekstraktuose spektrofotometrinės

analizės metodu

Atlikus sėjamojo esparceto skirtingų antžeminių augalo dalių žaliavų ekstraktų spektofotometrinę analizę, didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo aptiktas augalo lapuose (21,99±0,73 mg/g), mažiausias kiekis – augalo stiebuose (4,04±0,64 mg/g). Nuo sėjamojo esparceto lapų fenolinių junginių kiekiu nedaug atsiliko augalo žiedynai (21,20±1,99 mg/g). (13 pav.)

13 pav. Sėjamojo esparceto skirtingų augalo dalių fenolinių junginių kiekio įvairavimas. (P < 0.05)

Vertinant skirtingais vegetacijos tarpsniais rinktas visos augalo antžeminės dalies biomasės žaliavas, didesnis fenolinių junginių kiekis nustatytas krūmijimosi tarpsniu rinktoje žaliavoje (38,49±1,80 mg/g) nei augalo žydėjimo tarpsniu (16,14 ± 2,22 mg/g). (14 pav.)

14 pav. Sėjamojo esparceto skirtingų vegetacijos tarpsnių fenolinių junginių kiekio įvairavimas. (P < 0.05) 21.99 4.04 21.20 12.78 13.71 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Lapai Stiebai Žiedynai Sėklos be lukštų Sėklos su lukštais

Fe n oli n ių jun gin ių k ieki s m g/g 16.14 38.49 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00

Visas augalas (žydėjimo tarpsnis) 2014

Visas augalas (krūmijimosi tarpsnis) džiovintas 2014 Fe n oli n ių jun gin ių k ieki s m g/g