FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
ASTA KAMINSKAITĖ
ŠILINIO DOBILO (Trifolium medium L.) AUGALŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
doc. dr. Raimondas Benetis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
ŠILINIO DOBILO (Trifolium medium L.) AUGALŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
doc. dr. Raimondas Benetis
Darbą atliko
Magistrantė
Asta Kaminskaitė
Recenzentas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1. SANTRUMPOS ... 7
2. ĮVADAS ... 8
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
4.1. Oksidacinis stresas ... 11
4.1.1. Laisvieji radikalai ir jų susidarymas organizme ... 11
4.1.2. Oksidacinio streso poveikis organizmui ... 12
4.2. Antioksidantai ... 14
4.2.1. Natūralūs antioksidantai ir jų panaudojimas ... 14
4.2.2. Antioksidantų veikimo mechanizmai ... 15
4.3. Fenoliniai junginiai ... 16
4.3.1. Fenolinių junginių bendroji charakteristika ... 16
4.3.2. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės ... 18
4.3.3. Fenolinių junginių ekstrakcija, suminio kiekio ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas augaliniuose ekstraktuose ... 20
4.4. Trifolium pratense L. ir Trifolium medium L. bendroji charakteristika ... 22
4.4.3. Trifolium pratense L. ir Trifolium medium L. panaudojimas medicinoje ... 24
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 26
5.1. Tyrimų objektas ... 26
5.2. Medžiagos ir reagentai ... 27
5.3. Naudota aparatūra ... 27
5.4. Tyrimų metodai ... 27
5.4.2. Reagentų paruošimas ... 28
5.4.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 28
5.4.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 30
5.4.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu ... 31
5.4.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe2+ jonų surišimo metodu ... 31
5.5. Duomenų analizė ... 32
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33
6.1. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 33
6.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas ... 33
6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas ... 34
6.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros parinkimas ... 35
6.2. Fenolinių junginių ir flavonoidų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 37
6.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas T. medium ir T. pratense žaliavose ... 37
6.2.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas T. medium ir T. pratense žaliavose ... 40
6.3. T. medium ir T. pratense žaliavų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas... 43
6.3.1. T. medium ir T. pratense augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo nustatymas DPPH surišimo metodu ... 44
6.3.2. T. medium ir T. pratense augalinių žaliavų ekstraktų chelatinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų surišimo metodu ... 47
6.4. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp suminio fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių ir antioksidacinio aktyvumo ... 51
7. IŠVADOS ... 53
8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 55
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 56
SANTRAUKA
Astos Kaminskaitės magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.
Šilinio dobilo (Trifolium medium L.) augalų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas.
Tikslas: ištirti Lietuvoje kultivuojamo šilinio dobilo (Trifolium medium L.) augalinių žaliavų
fenolinių junginių bei flavonoidų kiekybinę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą.
Uždaviniai: 1) Parinkti optimalias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš T. medium žaliavų
mėginių. 2) Spektrofotometriniu metodu ištirti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei šių rodmenų pokyčius T. medium augalinių žaliavų ėminiuose. 3) Įvertinti T. medium žaliavų ekstraktuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą bei jo kitimo dėsningumus DPPH ir FIC metodais. 4) Įvertinti kiekybinės fenolinių junginių bei flavonoidų sudėties ir antioksidantinio aktyvumo koreliacinius ryšius. 5) Palyginti T. medium ir dviejų diploidinių T. pratense veislių augalinių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties rodiklių bei antioksidantinio aktyvumo įvairavimą.
Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti buvo naudojamos kultivuojamos šilinio ir raudonojo (dvi
veislės: Liepsna ir Kiršinai) dobilų augalinės žaliavos. Ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu, ekstrahentas – 70% (V/V) etanolis, ekstrakcijos laikas – 15 min, ekstrakcijos temperatūra – 50˚C. Nustatant suminį fenolinių junginių kiekį taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, o rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentu (mg/g). Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti taikyta reakcija su AlCl3, o rezultatai išreikšti rutino ekvivalentu (mg/g). Spektrofotometriniai DPPH ir FIC (geležies (II)
jonų surišimo) metodai naudoti nustatant ekstraktų antioksidantinį aktyvumą, kuris išreikštas procentais.
Rezultatai ir išvados: Tyrimo metu nustatyta, kad T. medium žaliavose sukaupiami reikšmingi
SUMMARY
The supervisor of the final master’s thesis/research prepared by Asta Kaminskaitė is assoc. prof. PhD. Raimondas Benetis; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. – Kaunas.
The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of zigzag clover (Trifolium
medium L.) plants.
The aim: to assess quantitative composition of phenolic compounds and flavonoids in the raw
materials of zigzag clover (Trifolium medium L.) cultivated in Lithuania, as well as to evaluate the antioxidant activity of these plants.
The objectives of the study: 1) To optimize the extraction conditions of phenolics compounds
from T. medium raw materials. 2) To analyze the quantitative composition of total phenolic and flavonoids and their variation patterns in T. medium raw materials using spectrophotometric methods. 3) To evaluate antioxidant activity and its variability in extracts of T. medium raw materials using DPPH and FIC assays. 4) To estimate correlation between quantitative composition of total phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity. 5) To compare the content of total phenolics, flavonoids and antioxidant activity in raw materials of T. medium and two diploid cultivars of T. pratense.
Research methodology: The study was carried out using samples of the raw materials of
cultivated zigzag and red (two cultivars: Liepsna and Kiršinai) clovers. The method of extraction - ultrasonic agitation, extractant – 70% (V/V) ethanol, extraction time – 15 min, extraction temperature - 50ºC. Spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used to determine the total content of phenolic compounds and results were expressed as gallic acid equivalent (mg/g). Specific reaction with AlCl3 was
used to determine the total content of flavonoids and results were expressed as rutin equivalent (mg/g). Two spectrophotometric assays, namely DPPH and FIC, were applied to determine radical scavenging and chelating activities of plant extracts.
Results and conclusions: This study revealed that T. medium raw materials accumulate
1. SANTRUMPOS
DNR deoksiribonukleorūgštisDPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
F-C Folin-Ciocalteu analizės metodas
FIC geležies (II) jonų surišimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay) GSH gliutationas (angl. glutathione)
mRNR matricinė ribonukleorūgštis
ROS aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species)
RNS aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species)
RSS aktyvieji sieros junginiai (angl. reactive sulfur species)
R2 regresijos koeficientas
UV ultravioletiniai spinduliai
2. ĮVADAS
Jau priešistoriniais laikas žmonės diena iš dienos rinko įvairius augalus maistui ir tikėjo jų gydomosiomis ir stiprinančiomis savybėmis [13]. Nors šiais laikais ligų spektras žymiai didesnis, o joms gydyti išrasta dar daugiau cheminės prigimties vaistų, žmonių populiacija orientuojasi į kokybiškų ir natūralių naujų gyvenimo būdo modelių sukūrimą ir įgyvendinimą. Kadangi šiuolaikinėje visuomenėje vis daugiau dėmesio skiriama ekologiškumui, nuolat auga poreikis sintetines medžiagas pakeisti natūraliomis, kurios yra ne tik efektyvesnės, bet ir pasižymi daugialypiu veiksmingumu ir manoma yra saugesnės.
Laisvieji radikalai dažniausiai yra gana nedidelės molekulės, tačiau dėl savo aktyvumo žmogaus organizme gali būti tiek naudingos, tiek žalingos. Jau prieš 60 metų Denham Harman pasiūlė senėjimo „laisvųjų radikalų teoriją“ (D. Harman, 1956), kuri teigia, kad endogeninėse ląstelėse susidariusios deguonies reaktyviosios formos (ROS) kaupiasi ir dėl to vyksta ląstelių ir viso organizmo senėjimas [1]. Ir šiais laikais aktyvieji deguonies junginiai laikomi pagrindiniu senėjimo ir daugiaveiksmių lėtinių ligų (pvz., neurodegeneracinės, širdies-kraujagyslių ligos, vėžys ir t.t.) vystymosi veiksniu.
Antioksidantai apibūdinami kaip junginiai, kurie gali sumažinti, slopinti ar net apsaugoti nuo oksiduojančių medžiagų sukeltų žalingų oksidacijos procesų, surišant laisvuosius radikalus ir sumažinant oksidacinį stresą organizme [13]. Natūralūs fenoliniai antioksidantai sintetinami augaluose kaip antriniai metabolitai ir atlieka pagrindines reprodukcijos ir augimo funkcijas: veikia kaip gynybos mechanizmai prieš patogenus, parazitus ir kenkėjus [14]. Visi sintetiniai antioksidantai maisto produktuose turi tik vieną funkciją – apsaugoti nuo oksidacijos; o jų nauda, kaip pridėtinių maisto priedų, sukelia vis daugiau diskusijų [3]. Natūralūs antioksidantai veikia ne vienu, bet net keletu antioksidantinio funkcionavimo mechanizmų ir turi daugialypį poveikį įvairioms organizmo sistemoms. Veikdami įvairiais mechanizmais, natūralūs antioksidantai gali efektyviau už sintetinius surišti laisvuosius radikalus ir chelatuoti pereinamųjų metalų jonus, taip sustabdydami oksidacinio proceso sukeliamą pažaidą ir tolimesnį žalingų organizmui reakcijų inicijavimą [17].
Trifolium gentis yra viena svarbiausių Pupinių (Fabaceae L.) augalų šeimoje. Šios genties
augalai yra paplitę visame pasaulyje, auga įvairiomis oro ir klimato sąlygomis. Ilgą laiką dobilų rūšies augalai buvo naudojami ūkio sektoriuje kaip pašarinis augalas, tačiau dabar jau yra įrodyta, kad daugelis dobilų rūšių kaupia didelį kiekį fenolinių junginių ir pasižymi antioksidantinėmis, antiuždegiminėmis, citostatinėmis savybėmis [23]. Kadangi T. pratense medicinos praktikoje naudojamas kaip izoflavonų šaltinis [33], tikslinga įvertinti ir kitų šios genties augalų kaupiamus biologiškai aktyvių junginių kiekius. Siekiant dar labiau išplėsti natūralių fenolinių junginių gavybos šaltinius yra aktualu kompleksiškai įvertinti augalinių žaliavų kokybines charakteristikas bei tikslines panaudojimo perspektyvas.
Lietuvoje iki šiol nebuvo atlikta išsamių T. medium antioksidantinio aktyvumo įvertinimo keletu antioksidantinio funkcionavimo mechanizmų tyrimų. Šių tyrimų metu buvo tirtos kultivuojamo šilinio dobilo dviejų auginimo metų, dviejų fenologinio vystymosi tarpsnių ir skirtingų morfologinių augalo dalių žaliavos, atliktas ekstrakcijos sąlygų optimizavimas bei įvertinti gautų ekstraktų suminiai fenolinių junginių, flavonoidų kiekiai ir antioksidantinis aktyvumas spektrofotometriniais metodais. Gauti rezultatai leidžia įvertinti šilinio dobilo augalinės žaliavos svarbą natūralių antioksidantų gavyboje.
Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje kultivuojamo šilinio dobilo (Trifolium medium L.) augalinių
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje kultivuojamo šilinio dobilo (Trifolium medium L.) augalinių
žaliavų fenolinių junginių bei flavonoidų kiekybinę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti optimalias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš T. medium žaliavų mėginių.
2. Spektrofotometriniu metodu ištirti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei šių rodmenų pokyčius T. medium augalinių žaliavų ėminiuose.
3. Įvertinti T. medium žaliavų ekstraktuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą bei jo kitimo dėsningumus DPPH ir FIC metodais.
4. Įvertinti kiekybinės fenolinių junginių bei flavonoidų sudėties ir antioksidantinio aktyvumo koreliacinius ryšius.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Oksidacinis stresas
Oksidacinio streso sąvoka apima fiziologinius ir patofiziologinius, endogeninius ir egzogeninius procesus, ir tiesiogiai arba netiesiogiai yra susijusi su ląsteliniu oksidatorių/antioksidantų balansu. Disbalansas tarp antioksidantų ir oksidatorių kiekio susiformuoja padidėjus oksidatorių gamybai ir/arba sumažėjus antioksidantų kiekiui, dėl to išsivysto stresinė būklė, kuri ląsteliniame lygmenyje vadinama oksidaciniu stresu[1; 2].
Oksidacinio streso sąvoka yra labai plati, nes jo sukeltas rezultatas priklauso nuo to, kurioje ląstelinėje sistemoje oksidatorius dalyvauja. Yra daug potencialių oksidatorių šaltinių ir jų poveikis priklausys nuo aplinkos sąlygų [2]. Oksiduojančių medžiagų reakcijos dažnai yra ribojamos difuzijos, todėl sukeltą poveikį ląstelių funkcijoms lems biomolekulių padėtis [3]. Be to, oksidacinio streso poveikis retai būna izoliuotas. Sudėtingos sąveikos vyksta tarp oksiduotų ir kitų molekulių esančių oksidacinio streso paveiktoje ląstelėje. Todėl klinikinis atsakas gali visiškai skirtis tarp įvairių sistemų ar ląstelių, o tai priklausys nuo medžiagų apykaitos balanso konkretaus tipo ląstelėse ar organuose [4].
4.1.1. Laisvieji radikalai ir jų susidarymas organizme
Laisvieji radikalai yra apibrėžiami kaip molekulės, atomai, cheminių medžiagų grupės, turinčios vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų, todėl turi nepilną elektronų komplektą ir yra labai reaktyvios. Laisvieji radikalai gali sukelti grandinines reakcijas siekdami užpildyti savo nesuporuotą elektronų orbitalę elektronu, atplėštu nuo kitos molekulės, ir taip ją paversdami laisvuoju radikalu [5]. Laisvieji radikalai gali susiformuoti iš daugelio molekulių, tačiau biologinėse sistemose svarbiausios tos, į kurių struktūrą įeina azotas ir deguonis [1].
Terminas reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) apima ne tik laisvuosius radikalus, bet ir chemiškai aktyvius deguonies, sieros (RSS) ir azoto (RNS) junginius bei neradikalinius jų darinius [4; 5]. Dažniausiai ROS yra deguonies dariniai, mažos molekulės, įvairios struktūros deguonies radikalai, pvz., superoksidoanijonas (O2∙-), hidroksilo radikalas (∙OH), peroksilo radikalas (RO2∙) ir alkoksilo radikalas
hidroksilo, yra labai nestabilūs, o kiti, pvz., vandenilio peroksidas turi žymiai ilgesnį gyvavimo laiką. Azoto atomą turintys oksidatoriai, pvz., azoto oksidas (NO∙) ir stiprus oksidatorius peroksinitrito anijonas (ONOO-), yra vadinami reaktyviomis azoto formomis (RNS) [7]. Reaktyviosios sieros formos (RSS) lengvai susiformuoja ROS ir tiolių reakcijų metu [3].
ROS gali būti tiek žalingos, tiek ir naudingos mūsų organizmui. Jos dalyvauja pernešant elektronus pernašos grandinėse, geba reguliuoti kraujospūdį (azoto oksidas), net apsaugoti organizmą nuo neigiamo mikroorganizmų poveikio. Taip pat ROS gali būti signalo nešikliais, o vandenilio peroksidas skydliaukėje naudojamas tiroksino sintezei. Tačiau tuo pačiu ROS gali sukelti ir ląstelių žūtį [3; 5].
Vykstant medžiagų apykaitos reakcijoms ROS ir RNS gali susidaryti įvairiose ląstelių vietose ir daugelio fermentų poveikyje, veikiant tiek vidaus, tiek išorės (rūkymas, aplinkos užterštumas, jonizuojančioji spinduliuotė) veiksniams. ROS koncentracija organizme sparčiai didėja išemijos ir reperfuzijos, uždegiminių procesų, aerobinio metabolizmo metu, oksiduojant ksenobiotikus, o ypač sumažėjus antioksidantų kiekiui [5]. Iš tiesų didžioji dauguma fermentų, dalyvaujančių deguonies metabolizmo reakcijose, taip pat dalyvauja ir ROS gamyboje [1]. Pavyzdžiui, įprastomis sąlygomis 2% suvartoto deguonies yra konvertuojamas į O2∙- mitochondrijose, o ne panaudojamas vandens molekulei
gauti. Dėl savo krūvio O2∙- negali praeiti membranos ir kaupiasi mitochondrijų matrikse [8].
Hidroksilo radikalo susidarymo reakciją katalizuoja laisvieji geležies jonai (Fenton‘o reakcija). Hidroksilo jono gyvavimo laikas yra 10-9 s. Pavojingas jis yra dėl to, kad reaguoja su bet kuria biologine molekule, pasitaikiusia jo kelyje. Kadangi, jis yra labai reaktyvus, netgi nėra žinomi jo konkretūs galimi surišėjai [1].
Toksiški metalai, pvz., kadmis ar chromas, taip pat yra oksidatoriai ir gali sukelti oksidacinį stresą įvairiose ląstelėse-taikiniuose per įvairius mechanizmus, kurie tiesiogiai kenkia mitochondrijų kvėpavimo procesui, padidina ROS gamybą, lipidų peroksidaciją ir išeikvoja ląstelės antioksidantus, tokius kaip gliutationas (GSH) ir kt. [1]. Taip pat įvairūs augimo faktoriai, vaistai ir toksinai gali keisti įvairius organizmo procesus, padidinti ROS formavimąsi ir sukelti oksidacinį stresą [6].
4.1.2. Oksidacinio streso poveikis organizmui
modifikacijos didžiausia pasekmė yra mutacijos [1]. Daug ROS atakų gali sukelti didelę ir nepataisomą žalą ląstelėms: ląstelių žūtį, nekrozę, apoptozę ir t.t. [9].
Oksidacinis stresas yra susijęs su daugelio ligų patogeneze: urogenitalinės sistemos, kepenų veiklos sutrikimai, katarakta, nutukimas, autizmas, Huntingtono sutrikimas, skrandžio opos, preeklampsija ir daugelis kitų. Susidarę reaktyvios deguonies formos, O2 metabolizmo šalutiniai produktai, turi neigiamą
poveikį ląstelinėms sistemoms. ROS, tokie kaip superoksidoanijonas (O2∙-) ir hidroksilo radikalas (∙OH),
sąveikauja su baltymais, lipidais, nukleino rūgštimis ir taip negrįžtamai pakeičia taikinių molekulių funkciją [3]. Pavyzdžiui, aterosklerotinės plokštelės susidaro iš oksiduotų mažo tankio lipoproteinų (LDL, angl. low-density lipoprotein), kurie nusėda kraujagyslių sienelėse ir sukelia daugumą sutrikimų, kuriems įtakos turi aterosklerozė. Oksidacinis stresas taip pat prisideda prie diabeto ir jo komplikacijų išsivystymo. Pvz., aukštas gliukozės lygis skatina ROS formavimąsi kardiomiocituose. Todėl ROS turi svarbią įtaką širdies-kraujagyslių bei metabolinių ligų išsivystyme [10].
Jau prieš 60 metų Denham Harman pasiūlė senėjimo „laisvųjų radikalų teoriją“ (D. Harman, 1956), kuri teigia, kad endogeninėse ląstelėse susidarę deguonies reaktyviosios formos kaupiasi ir dėl to vyksta ląstelių ir viso organizmo senėjimas [1]. Ir šiais laikais ROS laikoma pagrindiniu senėjimo ir lėtinių ligų vystymosi veiksniu (pvz., neurodegeneracinės, širdies-kraujagyslių ligos, vėžys). Egzogeniniai patogenai (pvz., mikrobai), aplinkoje esantys kancerogenai, toksiniai maisto produktai taip pat gali sukelti ROS formavimąsi organizme, kurios veikia mitochondrijų funkcijas ar skatina neigiamus endogeninius procesus, pvz., uždegimą [6].
Hidroksilo radikalas yra pagrindinis veiksnys, kuris sukelia DNR pažeidimus, keisdamas purino ir pirimidino bazes bei dezoksiribozės cukrus [1; 9]. Cukraus fragmentų pakeitimas gali sukelti DNR susivyniojimo, taisymo, transkripcijos procesų sutrikimus. Dėl to įvyksta mutacijos ir netipinės genų ekspresijos [9]. Mitochondrijų DNR yra jautresnė oksidaciniam stresui nei branduolio DNR, todėl mitochondrijų DNR pažeidimas gali atsirasti ir normaliomis sąlygomis, o mutacijos gali vykti nuo penkių iki dešimt kartų dažniau nei branduolio DNR. Pažeistos mitochondrijos atpalaiduoja daugiau ROS ir išjudina "užburtą ratą", didėja DNR pažeidimai ir ROS gamyba, kuri savo ruoštu sukelia dar didesnius DNR pažeidimus, jie ilgainiui paveikia mitochondrijų funkcijas jas slopindami ir vystosi ląstelių bei viso organizmo senėjimas [1; 9].
susivyniojimą. Netinkamas baltymo susisukimas lemia funkcijų praradimą, baltymų agregaciją ar net ląstelių žūtį [9]. Būtent dėl to ROS pasižymi ir tumurogeniškomis savybėmis: geba padidinti ląstelių proliferaciją, migraciją ir išlikimą bei indukuoti DNR pažeidimus. Didžioji dauguma laisvųjų radikalų prisideda prie naviko inicijavimo, didinimo ir metastazių [1].
Oksidacinis stresas prisideda prie lėtinių uždegiminių ligų iniciacijos ir progresavimo skatindamas ląstelių proliferaciją, molekulių adheziją, citokinų ir chemokinų produkciją [11]. Užburto rato modelis gali paaiškinti, kodėl oksidacinis stresas dažniausiai susijęs su lėtiniais susirgimais, tokiais kaip neurodegeneraciniai pažeidimai, lėtiniai uždegimai ir įvairaus pobūdžio vėžiniai susirgimai. Pagrindinės lėtinės ligos tolygiai dažnėja su amžiumi [12]. Toks stiprus ryšys tarp amžiaus ir lėtinių ligų yra dėl mitochondrijose susiformavusių ROS bendro veikimo mechanizmo. Šių mechanizmų išmanymas svarbus atsižvelgiant į specifinius ligos procesus gydant ir apsaugant nuo lėtinių ligų [1].
4.2. Antioksidantai
4.2.1. Natūralūs antioksidantai ir jų panaudojimas
Antioksidantai apibūdinami kaip junginiai, kurie gali sumažinti, slopinti ar net apsaugoti nuo oksiduojančių medžiagų oksidacijos procesų, surišant laisvuosius radikalus ir sumažinant oksidacinį stresą organizme [13]. Antioksidantai skirstomi į dvi dideles grupes: fermentiniai (gliutationo peroksidazė, katalazė) ir nefermentiniai (vitaminai, peptidai, šlapimo rūgštis) [3]. Daugelis jų yra natūraliai sintetinami augalų ar gyvūnų organizmuose, o kitų atsargas reikia nuolat papildyti.
Jau tūkstančius metų augalai yra naudojami įvairių ligų gydymui. Augaluose yra kaupiama daug antrinių metabolitų, o kai kurie iš jų pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Natūralūs antioksidantai apsaugo nuo laisvųjų radikalų oksidacijos reakcijos grandinių inicijavimo ir neutralizuoja ROS sukeltus pažeidimus [7; 13]. Anksčiau augalinės kilmės produktai buvo laikomi tik kaip pirminiai maisto medžiagų šaltiniai, tačiau dabar labiau vertinami kaip potencialūs natūralių antioksidantų šaltiniai. Natūralūs antioksidantai gali būti ekstrahuojami iš įvairių augalo dalių: lapų, šaknų, stiebų, vaisių, sėklų, žievės [14].
panaudojant juos kaip konservantus arba kaip kremų sudedamąsias dalis, dėl jų galimo teigiamo poveikio odos ląstelių funkcijoms [10; 15].
Kai kurios medžiagos, sintetinamos augaluose arba esančios jų metabolitai, yra naudojamos žmonių maisto pramonėje ir laikomos efektyviais ir saugiais antioksidantais (beta karotenas, vitaminas C, vitaminas E) [16; 17]. Pastaraisiais metais vis daugiau tyrimų yra atliekama su augalais ir jų ekstraktais. Galbūt dėl jų natūralumo ir augančio poreikio sintetines medžiagas pakeisti natūraliomis, sukeliančiomis mažiau nepageidaujamų reakcijų, o gal siekiant atrasti naujus ir dar efektyvesnius antioksidantus ar tiesiog įrodyti jų buvimą tam tikrose augalų gentyse [11; 18].
4.2.2. Antioksidantų veikimo mechanizmai
Žmogaus ir kitų žinduolių organizmai turi galingą apsaugos sistemą, saugančią nuo aktyviųjų deguonies formų poveikio. Šią gynybos sistemą sudaro trys grupės: 1. Fermentai, ardantys aktyviąsias deguonies formas – antioksidaciniai fermentai; 2. Antioksidaciniai vitaminai; 3. Junginiai, prisijungiantys laisvuosius radikalus [6].
Fermentiniai ir nefermentiniai gynėjai slopina oksidatorių atakas. Visi fermentiniai gynėjai savo šerdyje turi pereinamąjį metalą, galintį turėti skirtingus valentingumus, kai perduoda savo elektronus detoksikacijos metu [19]. Dvi superoksido dismutazės izoformos (mangano forma, kuri yra mitochondrijose bei vario ir cinko forma – citozolyje) konvertuoja O2∙- į vandenilio peroksidą ir taip jį
detoksikuoja. Vandenilio peroksidas nėra laisvasis radikalas ir yra mažiau reaktyvus nei O2∙- [3]. Toliau
vandenilio peroksidas suskaidomas į vandenį katalazės arba gliutationo peroksidazės. Gliutationo peroksidazės aktyvumas priklauso nuo redukuoto gliutationo (GSH) kiekio, kuris yra kaip vandenilio atomų donoras [19]. Gliutationas, manoma, yra pats svarbiausias mažos molekulinės masės antioksidantas. GSH taip pat gali tiesiogiai susijungti ir neutralizuoti ROS (hipochloritą ir kitus junginius) [5]. Svarbu, kad fermentiniai antioksidantai visada veikia kartu, t. y., reaguoja tiek į O2∙-, tiek į peroksido
koncentracijų pasikeitimus, nes nukrypimai gali sukelti daug pavojingesnio hidroksilo jono radikalo susiformavimą [1].
yra būtinas vitamino E aktyvumui. Karotenoidai yra membraniniai antioksidantai ir veikia kaip radikalų gaudyklės. Polifenoliniai antioksidantai yra nustatyti ankštiniuose augaluose, vaisiuose, daržovėse. Dėl savo struktūros jie geba surišti laisvuosius radikalus ir mažina žalingą aktyviųjų deguonies formų poveikį. Tuo tarpu baltymai, savo sudėtyje turintys metalo jonus (feritinas, transferinas, laktoferinas, ceruloplazminas), suriša laisvuosius metalų jonus, dėl ko nebegali vykti laisvųjų radikalų susidarymo reakcijos, pvz., Fenton‘o reakcija. Panašiai veikia ir šlapimo rūgštis [5].
Įgimtas ar įgytas antioksidantinių fermentų polimorfizmas bei mikroelementų ir vitaminų apribojimas, gali turėti svarbų vaidmenį antioksidantiniam atsakui. Trūkstant medžiagų, reikalingų antioksidacinių mechanizmų veikimui, sutriks antioksidantų-oksidatorių pusiausvyra ir įsivyraus oksidacinio streso mechanizmai, o tai sukels jau minėtų sutrikimų vystymąsi [19].
Tyrimų su gyvūnais metu buvo pastebėta, kad pelių, turinčių greitą medžiagų apykaitą, organizmuose ROS yra greičiau neutralizuojamos net ir esant padidėjusiam deguonies suvartojimui, todėl senėjimas vyksta lėčiau. Taip pat yra manoma, kad didėjantis antioksidantų kiekis gali sumažinti ląstelinius senėjimo procesus, uždegiminius pakitimus bei visus kitus oksidatorių sukeltus fiziologinius organizmo pakitimus [1].
4.3. Fenoliniai junginiai
4.3.1. Fenolinių junginių bendroji charakteristika
Fenoliniai junginiai yra vieni dažniausiai augaluose aptinkamų antrinių metabolitų. Augalinių polifenolinių junginių populiarumas vis auga dėl jų potencialių antioksidacinių savybių ir gebėjimo apsaugoti nuo įvairių oksidacinio streso sukeltų sutrikimų. Paskutinius keletą metų sveikatinimo bei medicinos srityse vis daugiau dėmesio sulaukia fenoliniai junginiai, ar jais turtingi įvairių augalų ekstraktai [19].
Augaluose labiausiai paplitę fenoliniai junginiai yra fenolinės rūgštys, flavonoidai, taninai, stilbenai, kurkuminoidai, kumarinai, lignanai, chinonai ir kt. [19]. Fenolinės rūgštys yra viena svarbiausių grupių, priklausančių fenoliniams junginiams. Augaluose jos gali būti sutinkamos laisvos arba esterių ir amidų pavidale. Galo, ferulo, kavos, p-kumaro, chlorogeno rūgštys dažniausiai aptinkamos vaisiuose, daržovėse bei vaistinguosiuose augaluose ir plačiai panaudojamos medicinos bei maisto pramonės srityse. Flavonoidams priskiriama daugiau kaip pusė visų žinomų polifenolių. Gamtoje flavonoidai egzistuoja laisvi arba konjuguoti su glikozidais. Šie mažos molekulinės masės cheminiai junginiai gali indukuoti II fazės detoksifikuojančius fermentus (NAD(P)H-kvinono oksidoreduktazė, glutationo S-transferazė ir UDP-gliukuronozil transferazė) prieš oksidacinio streso sukeltas pažaidas [20].
Nors fenoliniai junginiai yra labai didelė grupė įvairios struktūros junginių, paprastai jie yra apibrėžiami kaip vieno ar daugiau aromatinių žiedų struktūra su viena ar daugiau prijungtų hidroksilo grupių. Šiuo metu žinoma daugiau nei 8 000 fenolinių junginių struktūrų [20]. Didžiausia šių junginių grupė yra flavonoidai, sudaryti iš 15 anglies atomų (difelnilpropano (C6C3C6) skeleto) [3] sujungtų į tris
žiedus (A, B ir C), bei dar skaidomi į pogrupius, atsižvelgiant į centrinio C žiedo oksidacijos laipsnį (1
pav) [20].
1 pav. Pagrindinių flavonoidų pogrupių bendrosios struktūros. A-flavonas, B-flavonolis, C-izoflavonas, D-flavanonas, E-flavanonolis, F-flavanolis [20]
Fenoliniai junginiai, išskirti iš vaistingųjų augalų, pasižymi bioaktyviomis savybėmis ir gali būti panaudoti įvairių ligų gydyme. Jie papildo vienas kitą ir kartu gali sukelti naudingą farmakologinį poveikį žmogaus organizmui. 2011 m. Kolodziejczyk su savo kolegomis in vitro tyrimais įrodė, kad Trifolium
pallidum fenolinis ekstraktas apsaugo kraujo trombocitų baltymus ir lipidus nuo oksidacinio streso sukeltų
pažeidimų [22]. Todėl aktualu nustatyti fenolinių junginių kiekį augalinėse žaliavose, įvertinti jų antioksidacinį aktyvumą ir panaudoti jas įvairių ligų gydymui, profilaktikai ar išplėsti jų vartojimo indikacijas [20]. 2010 m. Barros su kolegomis įrodė, kad Trifolium genties augalai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, o T. angustifolium pasižymi silpnomis antioksidacinėmis savybėmis būtent dėl kaupiamo mažo fenolinių junginių kiekio [21].
4.3.2. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės
Atvirkštinis ryšys tarp vaisių, daržovių vartojimo ir oksidacinio streso sukeliamų ligų, tokių kaip širdies-kraujagyslių sutrikimų, vėžio ar osteoporozės, pasireiškimas sąlyginai gali būti siejamas su fenoliniais junginiais. Manoma, kad fenolinių junginių antioksidacinės savybės siejamos su šiais mechanizmais: 1. Laisvųjų radikalų (ROS/RNS) surišimas; 2. ROS/RNS susidarymo slopinimas inhibuojant tam tikrus fermentus ar sujungiant metalų jonus, kurie dalyvauja laisvųjų radikalų susidaryme; 3. Endogeninių antioksidantų apsauga [19].
Fenoliniai junginiai (POH) veikia kaip laisvųjų radikalų akceptoriai ir radikalinių reakcijų stabdytojai. Jie trukdo lipidų ir kitų molekulių oksidacijai greitai atiduodami vandenilio atomą radikalui (R):
R + POH → RH + PO∙ (1)
Tarpinis fenoksilo radikalas (PO∙) yra mezomeriškai stabilizuotas, todėl santykinai stabilus, o nauja reakcija nėra lengvai inicijuojama. Be to, tarpiniai fenoksilo radikalai taip pat veikia kaip reakcijų stabdytojai, susijungdami su kitais laisvaisiais radikalais [17]:
Teigiama, kad fenoliniai junginiai turi chemiškai idealią struktūrą surišti laisviesiems radikalams, nes turi fenolinę hidroksi grupę, kuri linkusi atiduoti savo vandenilio atomą ar elektroną laisvajam radikalui. Antocianinai yra ypač reaktyvūs į ROS/RNS dėl savo savitos cheminės struktūros, elektronų trūkumo [11].
Pereinamųjų metalų jonai, tokie kaip Cu+
ar Fe2+ reaguoja su vandenilio peroksidu (H2O2) ir
suformuoja hidroksilo radikalą (Fenton‘o reakcija), kuris yra vienas aktyviausių ROS. Fenoliniai junginiai su katecholio ir galato grupėmis gali slopinti metalų sukeltą deguonies radikalų susidarymą arba koordinuoti Fe+2 ir inicijuoti autoksidaciją (Fe+2 → Fe+3), arba suformuoti neaktyvius kompleksus su Cu+2, Fe+2, Cu+.
Teoriškai antioksidantų veikimo mechanizmai gali sukelti pastovų laisvųjų radikalų koncentracijos mažėjimą. Dėl tokio poveikio palaipsniui sumažėja tam tikrų molekulių (lipidų, baltymų, nukleorūgščių) oksidavimas. Be to, buvo pastebėta, kad fenolinių junginių tarpusavio arba su kitais nefenoliniais antioksidantais deriniai, pasižymi geresniu antioksidantiniu efektu nei jų atskiros molekulės.
Kai kurie fenoliniai antioksidantai gali inicijuoti autoksidacijos procesus ir tam tikromis sąlygomis elgtis kaip prooksidantai. Jie nutraukia laisvųjų radikalų grandinines reakcijas reaguodami su antriniais radikalais. Reaguojant fenoksilo radikalui su deguonimi susidaro chinonai (P ꞊ O) ir superoksido anijonai (O2∙-):
PO∙ + O2 → P꞊O + O2∙- (3)
Pereinamieji metalai taip pat gali sukelti fenolinių antioksidantų prooksidantinį aktyvumą. Manoma, kad fenoliniai antioksidantai elgiasi kaip prooksidantai tik tam tikromis autoksidacijos sąlygomis, pvz., esant tik aukštam pH ir didelėms koncentracijoms pereinamųjų metalų jonų bei deguonies molekulėms. Mažos fenolinių junginių molekulės, kurios lengvai oksiduojasi (kvercetinas, galo rūgštis) turi prooksidantinį aktyvumą; tuo tarpu didelės molekulinės masės fenoliniai junginiai (kondensuoti ir hidrolizuoti taninai) turi mažą arba neturi prooksidantinio aktyvumo.
4.3.3. Fenolinių junginių ekstrakcija, suminio kiekio ir antioksidantinio aktyvumo
nustatymas augaliniuose ekstraktuose
Dėl fenolinių junginių cheminės įvairovės ir augalinių ekstraktų sudėties įvairavimo, brangu ir sudėtinga išskirti tik fenolinius antioksidantus ir juos analizuoti atskirai. Be to, yra daug prasmingiau įvertinti sudėtinių mėginių suminę antioksidantinę jėgą ir galimą naudą sveikatai dėl jų galimo suminio antioksidantinio poveikio. Todėl svarbu parinkti patogius, atkartojamus ir atrankinius patikros metodus greitam kiekybiniam antioksidantų efektyvumo nustatymui fenolinių ekstraktų mėginiuose [10].
Fenoliniai junginiai gali būti ekstrahuojami iš šviežių, liofilizuotų ar džiovintų augalų žaliavų. Remiantis literatūra, ekstrahentu galime naudoti metanolį, etanolį, acetoną, etilacetatą ir jų mišinius įvairiomis proporcijomis su vandeniu. Etanolis yra universaliausias ekstrahentas įvairių polifenolinių junginių ekstracijai, be to, jis yra mažiausiai toksiškas žmogaus sveikatai. Žinoma, svarbu parinkti ir tinkamą temperatūrą bei ekstrakcijos trukmę, kurių pasirinkimas priklausys ne tik nuo žaliavos, bet ir nuo norimų išekstrahuoti fenolinių junginių tipo. Ekstrakcijai galima panaudoti daug metodų: maceracija, ekstrakcija soksleto aparate, ekstrakcija ultragarsu, superkritinių skysčiųekstrakcija ir kt. [9].
Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti yra naudojama net keletas metodų, tačiau dėl junginių gausos ir sudėtingumo nei vienas iš jų nėra tobulas. Dažniausiai pritaikomi metodai: Folin Denis (FD), Folin-Ciocalteu (F-C), permanganatinis titravimas, kolorimetrija su geležies druskomis, UV sugertis. Dažniausiai naudojamas yra Folin-Ciocalteu metodas dėl savo pigumo, paprastumo, pakartojamumo. F-C analizė paremta elektronų perdavimo reakcijomis. Galo rūgštis naudojama kaip etaloninis junginys ir rezultatai pateikiami galo rūgšties ekvivalentais [9]. Svarbu įvertininti, kad kitos medžiagos gali trukdyti tiksliai nustatyti fenolinių junginių kiekį, nes augaliniai ekstraktai yra daugelio medžiagų sudėtiniai mišiniai, o reagentas reaguoja su visomis oksiduojančiomis medžiagomis, esančiomis ekstrakte [3]. Pavyzdžiui, aromatiniai aminai ar askorbo rūgštis gali padidinti nustatomą fenolinių junginių kiekį, o oksiduojančios medžiagos gali sumažinti dėl reakcijos reagento neutralizavimo. Nepaisant to, F-C analizė yra paprasta ir itin plačiai naudojama suminio fenolinių junginių kiekio augaliniuose ekstraktuose nustatymui [9].
Suminiam flavonoidų kiekio nustatymui dažniausiai naudojamas spektrofotometrinis metodas, pagrįstas reakcija su AlCl3. Nustatymas pagrįstas tais pačiais principais kaip ir atliekant bendrą fenolinių
junginių kiekio nustatymą. Metodo pagrindas yra tai, jog rūgščioje aplinkoje AlCl3 suformuoja stabilius
matuojama absorbcija 407 nm bangos ilgyje. Rezultatai dažniausiai pateikiami mg/g pagal rutino ekvivalentą [23].
Tradicinė spektrofotometrinė analizė yra greita ir paprasta, tačiau ne visada tiksli, jei tiriami itin sudėtingos sudėties ekstraktai. Dažnai modernios chromatografinės metodikos yra derinamos su kitais instrumentės analizės metodais [10]. Dujų chromatografija (GC, angl. gas chromatography) dažnai naudojama fenolinių rūgščių ir flavonoidų analizėje. Tačiau GC panaudojimą riboja mažas fenolinių junginių lakumas ir brangi aparatūra. Efektyvioji skysčių chromatografija(HPLC, angl. high-performance
liquid chromatography) yra vienas tobuliausių analizės metodų fenoliniams junginiams. Keičiant
kolonėlės ir tirpiklių charakteristikas galima identifikuoti beveik visus fenolinius junginius ne tik sudėtinguose įvairių augalų ekstraktuose, bet ir maistinių medžiagų mėginiuose. Šis metodas yra ypač tikslus, tačiau jo pritaikymą riboja brangi aparatūra ir tirpikliai [3]. Kiti metodai, kuriuos galima pritaikyti fenolinių junginių analizėje yra masių spektrometrija (MS, angl. mass spectrometry), branduolių magnetinis rezonansas (NMR, angl. nuclear magnetic resonance), kapiliarinė elektroforezė (CE, angl.
capillary electrophoresis), kapiliarinė zonų elektroforezė (CZE, angl. capillary zone electrophoresis) bei
įvairių metodų deriniai. Tačiau šių metodų pritaikymą gali riboti materialūs ištekliai ar informacijos trūkumas, pritaikant tam tikrų junginių analizėje [19].
Antioksidantų aktyvumo nustatymui naudojama gana daug įvairių metodų: TEAC (angl. trolox equivalent antioxidant capacity), ORAC (angl. oxygen radical absorbance capacity), TRAP (angl. total radical-trapping antioxidant parametre), FRAP (angl. ferric reducing antioxidant power), CUPRAC (angl. copper reduction assay) ir t.t. Nors visi metodai skirti antioksidantinio aktyvumo įvertinimui, kiekvienas jų yra paremtas skirtingais ROS neutralizavimo mechanizmais. Visi šie metodai plačiai naudojami antioksidantų aktyvumo įvertinimui fenolinių ekstraktų mėginiuose iš vaisių ir daržovių [19].
Fotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas padeda įvertinti ekstraktų gebėjimą surišti
laisvuosius radikalus [13]. Analizės metu naudojamas DPPH radikalas, kuris keičia savo spalvą iš violetinės į geltoną, priklausomai nuo antioksidanto stiprumo, gebėjimo jį neutralizuoti [3; 16]. Reakcijos metu pirmiausia labai greitai perduodami elektronai, o po to sekantis vandenilio atomo atidavimas vyksta lėtai ir priklauso nuo terpės vandenilinių ryšių stiprumo [24]. Tiriant tiriamųjų medžiagų antioksidantinį aktyvumą šiuo metodu, vertinamas absorbcijos sumažėjimas prie 515 nm bangos ilgio.
antioksidacinį aktyvumą. Kuo didesnis procentas, tuo didesnis antioksidacinis aktyvumas. Šis metodas yra patikimas, labai jautrus bei reikalaujantis didelio analitiko kruopštumo [27].
Augaliniai antioksidantai veikia net keletu mechanizmų. Todėl siekiant tiksliau įvertinti ekstrakto aktyvumą tikslinga pritaikyti keleta in vitro metodų, įgalinančių nustatyti jų gebėjimą funkcionuoti įvairiais mechanizmais. Nuoseklus ekstrakto antioksidantinio aktyvumo įvertinimas gali padėti įvairiapusiškiau nustatyti galimą augalinių ekstraktų antioksidantinį potencialą bei galimą naudą žmogaus organizmui.
4.4. Trifolium pratense L. ir Trifolium medium L. bendroji charakteristika
Dobilų (Trifolium L.) gentis priklauso pupinių (Leguminosae L. arba Fabaceae L.) šeimai. Dobilų gentį sudaro apie 250 augalų rūšių [28]. Lietuvoje natūraliose augimvietėse auga 15 rūšių. Grynuose pasėliuose dažniausiai aptinkami trijų rūšių dobilai: raudonasis (T. pratense), baltasis (T.
repens), ir rausvasis (T. hybridum) [29]. Šios genties augalų dažniausiai randama šiaurės regionuose. Nuo
senų laikų dobilas yra naudojamas kaip pašaras gyvūnams. Taip pat dobilai yra vertinami dėl savo gebėjimo fiksuoti atmosferos azotą dirvožemyje, taip gerindami jo derlingumą [30]. Pastaraisiais metais vis daugiau šalių (Didžioji Britanija, JAV, N. Zelandija, Australija, Kanada, Indija) įsitraukia į įvairių pupinių šeimos augalų - dobilų (Trifolium L.), liucernų (Medicago L.), garždenių (Lotus L.), ožiarūčių (Galega L.) rūšių, kurias būtų galima sukultūrinti arba panaudoti netradiciškai, tyrimus [31]. Daugelis rūšių naudojamos paįvairinti gyvulių pašarui, konservuoti eroduojamas dirvas. Selekcionuojamų ir natūraliai augančių dobilų rūšių augalai skiriasi savo chemine sudėtimi, biomasės kiekiu, atsparumu atšiaurioms oro sąlygoms bei kenkėjams, žaliųjų baltymų kiekiu, virškinamumu ir t.t. Tai gali lemti ir sukaupiamų bioaktyvių medžiagų kiekybinius bei kokybinius skirtumus. Esant didelei dobilų įvairovei, jų visapusiškam įvertinimui būtini agromorfologiniai ir cheminiai tyrimai [29].
T. medium (šilinis dobilas) yra daugiametis augalas, priklausantis pupinių (Fabaceae arba Leguminosae) šeimai. Taip pat literatūroje galime sutikti ir jo liaudiškąjį pavadinimą – zigzago dobilas.
dobilas dažniausiai aptinkamas Euroazijos žemyne, ypač saulėtose pievose, pakelėse, apleistuose soduose ir miško pakraščiuose, mažai derlingose vietose [33]. Įdomu tai, kad T. medium labai dažnai naudojamas tarprūšiniuose kryžminimuose, siekiant sukurti naują, kokybišką selekcinę medžiagą [29].
A B
2 pav. Trifolium pratense L. (A) ir Trifolium medium L. (B)
Vilčinskas ir kt. 2009 m. pateikė duomenis, kad T. pratense yra labai neatsparus dobilų vėžiui ir miltligei, tuo tarpu T. medium atsparesnis miltligės sukėlėjams, bet labai jautrus žiemos šalčiams. Abi rūšys pradeda žydėti panašiu laiku (birželio pradžioje) [29]. Ates E. Bulgarijoje atliktų tyrimų meto nustatė, kad iš 5 tirtų dobilų rūšių T. medium užauga aukščiausias, užaugina mažiausią stiebų ir didžiausią kiekį lapų. Be to, iš visų rūšių šiliniame dobile nustatyta daugiausia Mg (0,41%) [28].
Pagal Vilčinsko nustatytus derliaus struktūrinius parametrus, T. medium kero skersmuo yra didesnis nei T. pratense, T. medium sausųjų medžiagų derlių sudaro mažesnis procentas stiebų bei didesnis lapų ir žiedų, kuris yra svarbus kokybės rodiklis, nulemiantis ląstelienos, baltymų kiekį bei virškinamumą. Dėl to T. medium turi didelį pranašumą, nes dažniausiai didžiausi fenolinių junginių kiekiai yra kaupiami lapuose ir žieduose [31]. Tačiau šie visi rodikliai gali kisti net tik dėl genotipo savybių, bet ir priklausomai nuo metinių meteorologinių sąlygų [29].
Trifolium genties augalai sintetina daugybę fenolinių ir polifenolinių junginių, tokių kaip
šilinio dobilo lapai (8,270 mg/g) [45]. To pačio tyrimo metu buvo nustatyta, kad daugiausia daidzeino, formononetino ir genisteino (atitinkamai 1,417 mg/g 2,923 mg/g ir 3,928 mg/g) kaupia taip pat šilinio dobilo augalinė žaliava. Šis ir B. Butkutės [30] atlikti tyrimai parodė, jog T. medium dobilų rūšis kaupia daugiau izoflavonų, nei šiuo metu medicinos praktikoje naudojamas T. pratense.
Pagrindiniai žieduose aptinkami flavonoidai yra kvercetinas, miricetinas, biochaninas A, formononetinas, maži kiekiai genisteino ir daidzeino bei kiti, ir jų konjugatai su gliukozidais [35; 36]. R. Bercevič atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad T. pratense žaliavoje didžiausias flavonoidų kiekis kaupiamas masinio žydėjimo metu (0,46%) [37].
Yra nustatyta, kad T. medium kaupia reikšmingą kiekį fenolinių rūgščių (1-1,8%). Tuo tarpu T.
pratense kaupia didelį suminį fenolinių junginių, fenolinių rūgščių bei flavonoidų kiekį. T. pratense
žieduose aptinkamos 9-10 fenolinės rūgštys, iš kurių 7 yra identifikuotos. Iš visų fenolinių rūgščių dominuojančios yra p-hidroksibenzoinė ir salicilo rūgštys [34].
Be fenolinių junginių dobiluose kaupiama vitaminų, mineralų bei riebalų ir riebiųjų rūgščių. Didžiausi kiekiai kaupiami linoleno ir palmitino rūgščių. Manoma, jos taip pat prisideda prie anktioksidantinio aktyvumo. Taip pat dobilų lapuose, žieduose ir sėklose nustatyta apie 210 lakių komponentų [38], saponinų bei jų glikozidų. Nedideli kiekiai proantocianinų nustatyta baltojo dobilo žieduose, o triterpeninių saponinų raudonojo dobilo šaknyse ir purpurinio dobilo sėklose [35].
4.4.3. Trifolium pratense L. ir Trifolium medium L. panaudojimas medicinoje
Rytų ir Europos gyventojai dobilus vartojo egzemai ir psoriazei gydyti [32]. Turkų tradicinėje medicinoje T. pratense buvo naudojamas kaip atsikosėjimą gerinanti, antiseptinė, analgetinė, raminanti priemonė [35]. Taip pat T. pratense yra populiarus Pakistane ir naudojamas gerklės skausmui, karščiavimui, pneumonijai, meningitui gydyti. Kosove liaudies medicina raudonąjį dobilą naudoja skrandžio sutrikimams, o amerikiečiai – paviršinėms odos ligoms, plaučių susirgimams, ar net gi kai kuriems nervų ir reprodukcinės sistemos sutrikimams gydyti [34; 39]. Kinų medicinoje T. pratense naudojamas kaip raminanti priemonė bei pirma pagalba menopauzės simptomų gydyme [40].
aktyvumu, bet organizme šių junginių gali susikaupti iki 100 kartų didesnės koncentracijos nei endogeninių estrogenų, ir todėl turi įtakos hormonų veiklai [40; 41]. Dobilų ekstraktų ir izoflavonų fiziologinio ir terapinio efekto molekuliniai mechanizmai yra tik iš dalies aiškūs. Manoma, kad dauguma izoflavonų jungiasi prie vieno arba abiejų estrogeno receptorių (α ir β) [34; 41].
Fitoestrogenai gali turėti įtakos angiogenezei. Izoflavonai, pvz., genisteinas ir daidzeinas, slopina genų ir mRNR baltymų sintezę, dalyvaujančių angiogenezėje. Todėl raudonųjų dobilų ekstraktas pasižymi angiogenezę slopinančiu poveikiu [33]. Taip pat pastebėta, kad nemetilinti izoflavonoidai (daidzeinas ir genisteinas) turi stipresnį antiangiogentinį poveikį nei metilinti (formononetinas, biochaninas A) [34].
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI
5.1. Tyrimų objektas
Suminiam fenolinių junginių kiekiui ir antioksidaciniam aktyvumui įvertinti buvo naudotos centrinėje Lietuvoje (55°23′49″N; 23°51′40″E) kultivuotos raudonojo (Trifolium pratense L.) ir šilinio (Trifolium medium L.) dobilų žaliavos. Tyrimui naudotos dobilų rūšys: T. medium (A kolekcija, laukinis ekotipas, katalogo nr. 2148) ir dvi T. pratense lietuviškosios veislės (Liepsna ir Kiršinai, B kolekcija, ploidiškumas 2n).
Kolekcija įrengta 2012 m. birželio mėn. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centre, Žemdirbystės instituto bandymų laukuose. Žaliavos augintos vidutinio sunkumo priemolio rudžemyje, kur armuo 25-30 cm, o pH – 6,5-7,0, nenaudojant herbicidų. Tos pačios veislės ir selekcinė medžiaga pasėta 4 pakartojimais, 2,5 m2 laukeliais: po 2 eilutes, kurių ilgis – 5 m., atstumas tarp numerio eilučių – 0,5 m., atstumas tarp skirtingų numerių – 0,5 m.
Žaliavų mėginiai buvo renkami masinio žydėjimo stadijoje 2013-2014 m. ir krūmijomosi stadijoje 2014 m. rugsėjo mėn. Antrųjų auginimo metų antžeminės dalies mėginiai buvo padalijami į dar du mėginius. Vienas jų panaudojamas antžeminės dalies mėginiui gauti, o kitas išskirstomas į morfologines augalo dalis: lapus, žiedus, stiebus. Surinkti mėginiai atsargiai nuplauti vandeniu, skalauti distiliuotu vandeniu ir paliekami išdžiūti ant filtro popieriaus. Tuomet žaliavos susmulkinamos, palaikomos 105 °C temperatūroje 15 min ir džiovinamos džiovyklėje 65±1°C temperatūroje. Išdžiūvusios žaliavos susmulkinamos ir sijojamos. Žaliavos, surinktos krūmijimosi stadijoje, pusė mėginio liofilizuojama. Žaliavų mėginiai buvo apdorojami tą pačią dieną, kai jie buvo nuskinti.
5.2. Medžiagos ir reagentai
Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai. Bevandenis geležies (II) chloridas (99,5%) ir DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) (95%) radikalas įsigyti iš Alfa Aesar GmbH & Co (Karlsruhe, Vokietija), rutino hidratas (≥94%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Vokietija), ferozinas (≥97,0%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (JAV), heksametilentetraminas (≥99,5%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Rusija), natrio karbonatas (99,5-100,5%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Prancūzija), galo rūgšties monohidratas (≥98,0%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Kinija), Folin-Ciocalteu fenolinis reangentas (2M) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Šveicarija), aliumino chlorido heksahidratas (≥95%) ir acto rūgštis (100%) išsigyti iš Carl Roth GmbH (Vokietija). 96 proc. (V/V) etanolis, įsigytas iš UAB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva). Taip pat tyrimams naudotas išgrynintas vanduo.
5.3. Naudota aparatūra
Bandinių ekstrakcijai atlikti naudota ultragarso vonelė „ElmaSonic S40H“ (Elma Schmidbauer GmbH, Vokietija), orbitalinė kratyklė „IKA®KS 130 basic (Vokietija). Spektrofotometrinei analizei naudotas spektrofotometras „Genesys 2“ (Spectronic, JAV).
5.4. Tyrimų metodai
5.4.1. Tiriamųjų mėginių paruošimas
5.4.2. Reagentų paruošimas
70% (V/V) etanolio tirpalas paruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele, 665 ml 96% (V/V)
etanolio praskiedžiama 335 ml išgryninto vandens.
0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas paruošiamas matavimo kolboje 10 ml Folin-Ciocalteu fenolinio
reangento (2M) skiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
7,5% (W/V) Na2CO3 tirpalas paruošiamas 7,5 g bevandenio Na2CO3 ištirpinant 100 ml išgryninto
vandens.
33% acto rūgšties tirpalas paruošiamas 33 ml 99,8% ledinės acto rūgšties praskiedžiant
išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
10% aliuminio chlorido tirpalas paruošiamas 5,0 g aliuminio chlorido ištirpinant 50 ml
išgryninto vandens.
5% heksametilentetramino tirpalas paruošiamas 2,5 g analitinio grynumo heksametilentetramino
ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.
Rutino etanolinis tirpalas ruošiamas 0,025 g tiksliai atsverto 99% grynumo rutino ištirpinant 25
ml 70% (V/V) etanolio tirpalo.
6×10-5
M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas ruošiamas tiksliai atsveriant 0,00118 g
chemiškai švaraus DPPH reagento ir jį ištirpinant 50 ml 96% (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas ruošiamas kiekvieną dieną šviežias ir laikomas tamsaus stiklo butelyje apsaugančiame nuo saulės spindulių.
2 mM FeCl2 tirpalas ruošiamas tiksliai atsveriant 0,0063 g chemiškai gryno FeCl2 ir jį ištirpinant
25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas vis naujas tirpalas.
5 mM ferozino tirpalas paruošiamas tiksliai atsveriant 0,0616 g ferozino ir jį ištirpinant 25 ml
išgryninto vandens.
5.4.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
ilgiui 765 nm, palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Kiekvienas ekstraktas matuojamas mažiausiai po tris kartus.
3 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n꞊3)
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) (mg galo rūgšties/g bandinio) pagal galo rūgšties kalibracinę kreivę (3 pav) naudojant formulę:
GRE (mg/g) = c × V/m ;
c - galo rūgšties koncentracija (mg/ml) (iš kalibracinės kreivės); V - pagaminto ekstrakto tūris (ml);
5.4.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Tyrimų metu, kiekvieno ekstrakto vienam analizės bandymui buvo pagaminama po du tirpalus: tiriamasis ir lyginamasis. Tiriamasis tirpalas pagamintas sumaišius 25 ml kolbutėje 1 ml tiriamo ekstrakto (1:400), 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5% heksametilenteramino tirpalo; kolbutės turinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir sumaišoma. Praėjus 30 min matuojamas absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant bangos ilgiui 407 nm.
Lyginamuoju tirpalu buvo naudojamas tirpalas paruoštas 25 ml matavimo kolbutėje sumaišant 1 ml tiriamo ekstrakto (1:400) su 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo; kolbutės turinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir sumaišoma. Kiekvienas ekstraktas tirtas po tris kartus.
Duomenys įvertinami gautą absorbcijos koeficiento dydį lyginant su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu. Etaloninio tiriamojo ir palyginamojo rutino tirpalo paruošimas vykdomas vietoje 1 ml ekstrakto pilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo.
Flavonoidų suminis kiekis, perskaičiuojamas rutinu ir išreiškiamas mg/g remiantis formule:
;
mR – rutino masė g, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti;
A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – augalinio ekstrakto tūris, ml;
m – augalinio bandinio masė g, sunaudota ekstraktui paruošti; AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
5.4.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu DPPH radikalų surišimo
metodu
Antioksidacinio aktyvumo įvertinimui taikomas elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas. 50 μl tiriamojo etanolinio (70% (V/V)) ekstrakto (1:400) 1 cm kiuvetėje sumaišoma su 2 ml 6×10-5 M DPPH tirpalo. Taip pat paruošiamas tuščias bandinys su 50 μl 70% (V/V) etanolio ir 2 ml 6×10-5
M DPPH tirpalo. Spektrofotometru išmatuojamas mėginių absorbcijos dydžio mažėjimas 515 nm bangos ilgyje, kol pasiekiama pusiausvyra (po 30 min). Kiekvienas ekstraktas matuojamas po tris kartus. Palyginamasis tirpalas – 70% (V/V) etanolis.
Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais:
DPPH surišimas = [(Ab-Aa)/Ab] × 100%;
Ab– tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min);
Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu adsorbcijos dydis (po 30 min).
5.4.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe
2+jonų surišimo metodu
Chelatinės ekstraktų savybės įvertinamos matuojant Fe(II) ir ferozino komplekso sumažėjimą prie 562 nm bangos ilgio. Eksperimento metu į 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:800) įpilama 50 μl 2mM FeCl2
tirpalo ir sumaišoma. Po 5 min dar įpilama 0,2 ml 5mM ferozino tirpalo. Dar kartą gerai sumaišoma ir po 10 min matuojamas reakcijos mišinio absorbcija. Taip pat paruošiamas ir tuščias bandinys susidedantis iš 1 ml 70% (V/V) etanolio ir 50 μl 2mM FeCl2 bei 0,2 ml 5mM ferozino tirpalų. Kiekvienas ekstraktas
tiriamas po tris kartus. Palyginamasis tirpalas – 70% (V/V) etanolis.
Ekstrakto chelatinės savybės išreikšiamos procentais ir apskaičiuojamos pagal formulę:
Fe+2 surišimas ꞊ [(Ab – Aa)/Ab] × 100%
Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis;
5.5. Duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė ir duomenų grafinis atvaizdavimas atlikti „MS Excel 2010“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa ir Statistica 7 (StatSoft, JAV) statistiniu paketu. Duomenų statistiniam įvertinimui apskaičiuota tyrimo metu gautų duomenų matematinis vidurkis, mediana, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida, variacijos koeficientas [42].
6.
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Ekstrakcijos tirpiklio parinkimas, poliškumas, ekstrahavimo metodas bei jo sąlygos yra svarbūs augalinių ekstraktų biologiškai aktyvių junginių sudėties kokybiniams ir kiekiniams rodmenims įvertinti. Kadangi niekada nebus dviejų identiškų žaliavų (skirsis augimo sąlygos, džiovinimas, žaliavos sudėtis), būtina parinkti optimalias ekstrahavimo sąlygas konkrečiai žaliavai. Remiantis literatūra ekstrahentu pasirinktas vandens-etanolio mišinys dėl jo universalumo įvairių polifenolinių junginių struktūrų ekstrakcijai ir mažiausio toksiškumo žmogaus sveikatai [19; 23]. Kadangi buvo rasta mažai literatūros apie biologiškai aktyvių fenolinių junginių ekstrakciją iš dobilų genties augalų žaliavų, buvo nuspręsta atlikti tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimą (tinkamiausio ekstrahento poliškumą, laiko ir temperatūros nustatymą).
6.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas
Siekiant išsiaiškinti tinkamiausią ekstrahentą biologiškai aktyvių medžiagų ekstrakcijai iš T.
medium augalinių žaliavų buvo naudojamas paprastosios maceracijos metodas. Buvo tiriami su 40%,
4 pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas T. medium pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies mėginiuose paprastosios maceracijos metodu (vidurkis ± standartinė paklaida).
GRE-galo rūgties ekvivalentai. (n꞊9)
Iš grafiko (4 pav) matome, kad nors ir nežymiai, bet daugiau fenolinių junginių išekstrahuojama su 70% (V/V) vandens-etanolio mišiniu (28,248 ± 0,265 mg/g). Siekiant kuo tiksliau įvertinti suminį fenolinių junginių kiekį, esantį žaliavose, tolimesnei analizei pasirenkamas būtent 70% (V/V) ekstrahentas, nes naudojant jį yra pasiekiama didžiausia fenolinių junginių išeiga.
6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas
Ekstrakcijos ultragarsu laiko parinkimui naudojama ultragarso vonelė, 70% (V/V) etanolis bandinių ekstrakcijai(1:400) ir pirmųjų auginimo metų antžeminė šilinio dobilo žaliava surinkta masinio žydėjimo metu. Bandiniai ultragarsu veikiami 5, 10, 15, 20, 25 min, 30±5°C temp. Rezultatų atsikartojamumui ruošiame po šešis kiekvieno laiko mėginius. Gauti rezultatai apibendrinami grafike (5
pav).
nustatyti fenolinius junginius neutralizuodamos reagentus [19]. Todėl tolimesniems tyrimams fenolinių junginių ekstrakcijai pasirenkamas būtent 15 min laiko intervalas ultragarso vonelėje.
5 pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės įvertinimas naudojant 70% (V/V) etanolinius T. medium pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies mėginius (vidurkis ± standartinė paklaida).
Temperatūra – 30 ± 5°C. GRE-galo rūgties ekvivalentai. (n꞊6)
Tyrimo metu taip pat pastebėta, kad taikant ekstrakciją ultragarsu išekstrahuojamas didesnis bendras fenolinių junginių kiekis nei paprastosios maceracijos būdu (atitinkamai 28,248 ± 0,265 mg/g ir 29,086 ± 0,475 mg/g). Būtent dėl to, kad ekstrakcija maceracijos metodu užtrunka žymiai ilgiau nei ekstrakcija ultragarsu (ultragarsu - 15 min, maceracija - 26 val), tikslinga ekstraktų gamybai rinktis ekstrakciją ultragarsu.
6.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros parinkimas
Iš grafiko matome, kad efektyviausia analizei temperatūra yra 50°C. Esant 50°C temperatūrai nors ir nežymiai, bet išekstrahuojamas didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis (29,440 ± 0,669 mg/g). Taip pat matyti, kad esant 60°C temperatūrai fenolinių junginių kiekis ženkliai sumažėja (25,218 ± 0,434 mg/g). Taip gali atsitikti dėl fenolinių junginių neatsparumo aukštai temperatūrai.
6 pav. Ekstrakcijos temperatūros įvertinimas su 70% (V/V) etanoliniais T. medium pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies žaliavos mėginiais ultragarso vonelėje (vidurkis ± standartinė
paklaida). Laiko intervalas – 15 min. GRE-galo rūgties ekvivalentai. (n꞊6)
Remiantis literatūra fenolinių junginių ekstrakcijai labai svarbu ne tik tinkamas ekstrahento, bet ir metodo, laiko bei temperatūros parinkimas. Ekstrakcija ultragarsu yra gana paprastas, greitas ir sudėtingos aparatūros nereikalaujantis metodas, be to plačiai taikomas fenolinių junginių ektracijai iš įvairių augalo morfologinių dalių žaliavų [19]. Be to, taikant ekstrakciją ultragarsu suyra mažesnis fenolinių junginių kiekis nei taikant kitus ekstrakcijos metodus [44]. Padidinus ekstrakcijos temperatūrą galima sutrumpinti ekstrakcijos laiką ir padidinti fenolinių junginių išeigą, tačiau dauguma fenolinių junginių lengvai hidrolizuojasi ir oksiduojasi ilginant ekstrakcijos laiką ir keliant temperatūrą. Pvz., antocianinams optimaliausia ekstrakcijos temperatūra 20-50°C, nes esant >70°C temperatūrai jie greitai ir negrįžtamai suyra [19].
Apibendrinus tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimo rezultatus, tolimesniems tyrimams visų žaliavų mėginių ekstraktai ruošiami su 70% (V/V) etanolio-vandens mišiniu, naudojant ultragarso vonelę, laiko intervalą pasirenkant 15 min, o ultragarso vonelės vandens temperatūrą palaikant ties 50 ± 5°C.
6.2. Fenolinių junginių ir flavonoidų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu
Dėl fenolinių junginių cheminės struktūros įvairovės ir augalų ekstraktų sudėties įvairavimo, brangu ir sudėtinga išskirti ir analizuoti pavienius fenolinius junginius. Be to, dažnai būtent bendras fenolinių junginių kiekis yra siejamas su antioksidantiniu aktyvumu. Todėl tampa daug svarbiau įvertinti augalinių žaliavų ekstraktų mėginių suminį fenolinių junginių kiekį ir prognozuoti galimą jų poveikį žmogaus organizmui [10]. Siekiant detaliau ištirti suminius fenolinių junginių ir flavonoidų kiekius bei jų kitimo dėsningumus T. medium ir T. pratense žaliavų ekstraktuose, atsižvelgiant į skirtingų augalinių bandinių matricos kompleksiškumą analizės metodai buvo modifikuoti ir pritaikyti patikimam kiekybinių charakteristikų įvertinimui.
6.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas T. medium ir T. pratense žaliavose
Tyrimo metu spektrofotometriniu metodu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis Lietuvoje kultivuoto šilinio ir raudonojo dviejų diploidinių veislių dobilų žaliavose naudojant Folin-Ciocalteu metodą. Tyrimo rezultatai gauti atliekant analizę su T. medium žaliavų ekstraktais pateikti 7 pav.
Suminis fenolinių junginių kiekis T. medium žaliavų ekstraktuose varijavo labai plačiose ribose, nuo 8,436 mg/g iki 64,090 mg/g. Pastebėta, kad fenolinių junginių kiekis kito nežymiai priklausomai nuo augalo auginimo metų; tik šiek tiek didesnį bendrą fenolinių junginių kiekį sukaupia antrųjų augimo metų antžeminės augalo dalies žaliava (30,010 ± 0,320 mg/g), lyginant su pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies žaliava (29,440 ± 0,669 mg/g), kurios abi surinktos masinio žydėjimo metu.
0,560 mg/g). Mažiausias suminis fenolinių junginių kiekis kaupiamas T. medium stiebų (8,436 ± 0,163 mg/g) ir pirmųjų auginimo metų sėklų (13,880 ± 0,653 mg/g) ekstraktuose.
7 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis T. medium žaliavų 70% (V/V) etanolinių ekstraktų mėginiuose (vidurkis ± standartinė paklaida). 1 visas – pirmųjų auginimo metų antžeminė augalo dalis.
2 visas – antrųjų auginimo metų antžeminė augalo dalis. Krūm. – krūmijimosi tarpsnio antžeminė augalo dalis džiovinta įprastai. Krūm. (L) – krūmijimosi tarpsnio antžeminė augalo dalis džiovinta
liofilizuojant. GRE-galo rūgties ekvivalentai. (n꞊6)
Tyrimo rezultatai atskleidė, kad fenolinių junginių kiekiai T. medium žaliavose įvairuoja priklausomai ir nuo fenologinio tarpsnio. Antrųjų auginimo metų krūmijimosi tarpsnio žaliavoje yra sukaupiami didesni fenolinių junginių kiekiai (40,716 ± 1,067 mg/g) nei masinio žydėjimo metu rinktoje antžeminėje augalo žaliavoje. Be to, tyrimo metu pavyko nustatyti ir galimą žaliavų paruošimo būdo įtaką fenolinių junginių kiekiui ekstrakte. Rezultatai parodė, kad krūmijimosi laikotarpio įprastai džiovintoje žaliavoje nustatytas didesnis suminis fenolinių junginių kiekis (40,716 ± 1,067 mg/g) nei džiovintoje liofilizuojant (37,416 ± 0,580 mg/g).
8 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis T. pratense dviejų diploidinių veislių (Liepsna ir Kiršinai) žaliavų 70% (V/V) etanolinių ekstraktų mėginiuose. 1 visas – pirmųjų auginimo metų antžeminė augalo dalis. 2 visas – antrųjų auginimo metų antžeminė augalo dalis. Krūm. – krūmijimosi tarpsnio antžeminė augalo dalis džiovinta įprastai. Krūm. (L) – krūmijimosi tarpsnio antžeminė augalo
dalis džiovinta liofilizuojant. GRE-galo rūgties ekvivalentai. (n꞊3)
Fenolinių junginių kiekis labai įvairavo abiejų T. pratense diploidinių veislių augalinių žaliavų mėginiuose: Liepsna – nuo 8,944 mg/g iki 56,738 mg/g, Kiršinai – nuo 6,239 mg/g iki 58,686 mg/g. Pastebėta, kad fenolinių junginių suminio kiekio rodiklių kitimo įvairavimo tendencijos tarp dviejų
Trifolium pratense veislių augalinių žaliavų yra panašios. Kiek didesnis suminio fenolinių junginių kiekio
skirtumas yra tik tarp lapų ekstraktų (Liepsna 34,890 ± 0,357 mg/g, Kiršinai 24,638 ± 0,309 mg/g). Vertinant sukaupiamo suminio fenolinių junginių kiekio dėsningumus tarp dviejų T. pratense veislių žaliavų pastebėta, kad Kiršinai veislės pirmųjų ir antrųjų auginimo metų antžeminių augalo dalių ir žiedų žaliavose sukaupiamas didesnis šių bioaktyvių junginių kiekis, tačiau kitose žaliavose Liepsna veislės kiekybiniai rodikliai buvo didesni.
junginių kiekis (Liepsna – 35,137 ± 0,573 mg/g, Kiršinai – 31,285 ± 0,572 mg/g) yra didesnis nei masinio žydėjimo metu rinktose žaliavose (Liepsna – 22,735 ± 0,203 mg/g, Kiršinai – 24,323 ± 0,419 mg/g). Nustatyta, kad krūmijimosi fazėje įprastai džiovintose žaliavose aptinkami didesni suminiai fenolinių junginių kiekiai (Liepsna – 35,137 ± 0,573 mg/g, Kiršinai – 31,285 ± 0,572 mg/g) nei džiovintoje liofilizuojant (Liepsna – 31,942 ± 0,303 mg/g, Kiršinai – 28,718 ± 0,255 mg/g).
Apibendrinant abiejų dobilų rūšių fenolinių junginių kiekybinės sudėties kitimo dinamiką matome, kad T. medium antrųjų auginimo metų žiedų žaliavoje nustatytas maksimalus suminis fenolinių junginių kiekis didesnis nei atitinkamose T. pratense žaliavose. Gautų rezultatų išsibarstymas didesnis tarp
T. medium žaliavų (233%), lyginant su T. pratense veislėmis (Liepsna 209%, Kiršinai 223%). Taigi,
tyrimai atskleidė, kad T. medium beveik visos žaliavos yra turtingesnės fenoliniais junginiais, lyginant su dviem diploidinėmis T. pratense veislėmis.
Remiantis užsienio mokslininkų atliktais tyrimais bendras fenolinių junginių kiekis T. pratense ekstraktuose gali siekti 4,3% [23], tačiau mūsų tyrimo rezultatuose šis rodiklis žiedų ekstraktuose siekia net 5,87%. Kito tyrimo duomenimis, kur tirta tik fenolinių rūgščių kiekis, matyti, kad rūgščių kiekis raudonųjų dobilų žaliavose varijuoja 1-1,8% ribose [34], lapuose nustatyta 0,65%, o žieduose net 1,22% [46]. Kadangi dobiluose be fenolinių rūgščių kaupiama ir kitų grupių fenolinių junginių (izoflavonai, flavonoidai, saponinai, kavos rūgšties esteriai) [32; 34], tai galima numanyti, kad žaliavose kaupiamas suminis fenolinių junginių kiekis bus žymiai didesnis.
Deja, mokslinėje literatūroje nepavyko rasti duomenų apie suminį fenolinių junginių kiekį ir jo įvairavimą T. medium augalinėse žaliavose.
