LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
AGNĖ CIBULSKYTĖ
PAVASARINIŲ RAKTAŽOLIŲ (PRIMULA VERIS L.) LAPŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ IR ASKORBO RŪGŠTIES KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS
SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Kristina Zymonė 2017 m.
Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis 2018–2019 m.
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
PAVASARINIŲ RAKTAŽOLIŲ (PRIMULA VERIS L.) LAPŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ IR ASKORBO RŪGŠTIES KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS
SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Kristina Zymonė 2017 m.
Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis 2018–2019 m. Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Data Agnė Cibulskytė
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Raktažolių (Primula L.) genties apibūdinimas ir augalų paplitimas ... 10
1.2 Pavasarinių raktažolių (Primula veris L.) morfologiniai požymiai, augavietės, vaistinė augalinė žaliava ir jos kokybės reikalavimai ... 11
1.3 Pavasarinių raktažolių lapų, žiedų ir šakniastiebių su šaknimis cheminės sudėties tyrimai ... 13
1.4 Pavasarinių raktažolių lapų, žiedų ir šakniastiebių su šaknimis panaudojimas medicinoje ... 14
1.5 Flavonoidų įtaka augalams ir jų poveikio medicininis pritaikymas ... 16
1.6 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 18
2. TYRIMO METODIKA ... 19
2.1 Tyrimo objektas ... 19
2.2 Naudoti reagentai ... 19
2.3 Naudota aparatūra ... 20
2.4 Pavasarinių raktažolių lapų tiriamųjų ėminių paruošimas ... 21
2.5 Tyrimo metodai ... 21
2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 21
2.5.2 Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas ... 22
2.5.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 23
2.5.4 Bendro askorbo rūgšties kiekio nustatymas ... 24
2.5.5 Antioksidantinio aktyvumo in vitro nustatymas ... 25
2.5.6 Fenolinių junginių nustatymas ultraefektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija metodu ... 27
2.6 Tyrimo duomenų analizė ... 28
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1 Pavasarinių raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 29
3.2 Fenolinių junginių kiekio įvairavimo nustatymas pavasarinių raktažolių lapų, surinktų iš skirtingų Lietuvos augaviečių, ėminiuose ... 30
3.3 Askorbo rūgšties kiekio įvairavimo nustatymas pavasarinių raktažolių lapų, surinktų iš skirtingų Lietuvos augaviečių, ėminiuose ... 33
3.4 Antioksidantinio aktyvumo in vitro įvairavimo pavasarinių raktažolių lapų ėminių ištraukose nustatymas ... 34
3.5 Pavasarinių raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių, askorbo rūgšties kiekio ir ištraukų
antioksidantinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 36
3.6 Pavasarinių raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas UESC – MS metodu ... 37
3.7 Pavasarinių raktažolių lapuose identifikuotų fenolinių junginių ir etanolinių ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 41
3.8 Rezultatų apibendrinimas ... 43
4. IŠVADOS ... 44
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
SANTRAUKA
A. Cibulskytės magistro baigiamasis darbas „Pavasarinių raktažolių (Primula veris L.) lapų fenolinių junginių ir askorbo rūgšties kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimo tyrimas“. Mokslinio darbo vadovas dr. Kristina Zymonė 2017 m., prof. habil. dr. Valdimaras Janulis 2018–2019 m.; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. Kaunas, 2019.
Tyrimo tikslas. Nustatyti fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties, askorbo rūgšties kiekio ir antioksidantinio aktyvumo in vitro įvairavimą pavasarinių raktažolių (Primula veris L.) lapų ėminiuose, surinktuose skirtingose Lietuvos augavietėse.
Uždaviniai. Atlikti pavasarinių raktažolių lapų fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų optimizavimą. Nustatyti skirtingose Lietuvos augavietėse surinktų raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių kiekybinės sudėties, askorbo rūgšties kiekio ir ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro įvairavimą. Ištirti skirtingose Lietuvos augavietėse surinktų raktažolių lapų ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą. Nustatyti fenolinių junginų ir askorbo rūgšties kiekio koreliacinius ryšius su lapų ištraukų antioksidantiniu aktyvumu in vitro.
Tyrimo objektas ir metodai. Iš 10 skirtingų Lietuvos augaviečių surinkti pavasarinių raktažolių lapų ėminiai. Bendras fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių, flavonoidų kiekis ir antioksidantinis aktyvumas in vitro nustatytas UV – regimosios šviesos spektrofotometriniu analizės metodu. Titravimo metodu įvertintas askorbo rūgšties kiekis. Pritaikius UESC – MS metodą, nustatyta kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių sudėtis.
Tyrimo rezultatai ir išvados. Nustatytas didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis Vilniaus regione surinktų raktažolių lapų ėminiuose, vidutiniškai 27,17±0,13 mg GRE/g (p<0,05). Nustatytas didžiausias flavonoidų kiekis Smilgių km. (Panevėžio raj.) surinktų raktažolių lapų ėminiuose (0,74±0,01 mg RE/g (p<0,05)). Nustatytas didžiausias askorbo rūgšties kiekis Abromiškio km. (Elektrėnų raj.) ir Naudžiūnų km. (Birštono raj.) surinktų raktažolių lapų ėminiuose, atitinkamai 19,89±0,62 mg/g ir 19,76±0,61 mg/g (p<0,05). Nustatytas didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis Anaičių km. (Klaipėdos raj.) surinktų raktažolių lapų ėminiuose – 3,23±0,11 mg CRE/g (p<0,05). Nustatytas stipriausias antiradikalinis aktyvumas, įvertintas ABTS metodu, Arlaviškių km. (Kauno raj.) – 562,16±0,005 μmol TE/g, DPPH metodu – Anaičių km. (Klaipėdos raj.) – 735,91±5,02 μmol TE/g, redukcinis aktyvumas Panevėžio ir Kauno regionuose, atitinkamai 586,37±1,99 μmol TE/g ir 579,89±2,76 μmol TE/g, surinktų raktažolių lapų ėminių ištraukose (p<0,05). Atlikus raktažolių lapų ėminių UESC – MS kokybinę analizę, identifikuoti 6 junginiai: kvercetinas, kemferol–3–O–gliukozidas, izoramnetin–3–O–rutinozidas, rutinas, izokvercitrinas ir chino rūgštis. Nustatytas stiprus koreliacinis ryšys tarp kvercetino kiekio ir antiradikalinio aktyvumo, įvertinto DPPH metodu – r=0,770 (p<0,05).
SUMMARY
The topic of the master thesis by A. Cibulskytė „Qualitative and quantitative studyon phenolic composition and amount of ascorbic acid variation in common cowslip (Primula veris L.) leaves“. Research supervisor dr. Kristina Zymonė 2017, prof. habil. dr. Valdimaras Janulis 2018–2019; Lithuanian University of Health Sciences Faculty of Pharmacy Department of Pharmacognosy. Kaunas, 2019.
The aim of the research. To determine the qualitative and quantitative composition variation of phenolic compounds, amount of ascorbic acid and antioxidant activity in vitro of common cowslip leaves, picked in different locations of Lithuania.
The objectives of the research. To perform optimisation of the extraction conditions of phenolic compounds from the samples of cowslip leaves. To determine the quantitative composition variation of phenolic compounds, amount of ascorbic acid and antioxidant activity in vitro in the samples of cowslip leaves, that were picked at different places in Lithuania. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in samples of cowslip leaves. To evaluate phenolic compounds and the amount of ascorbic acid correlation with the antioxidant activity in vitro.
The object and methods of the research. The samples of cowslip leaves, which were picked from 10 different places in Lithuania. Total phenolic compounds amount, total hidroxycinnamic acid derivatives amount, total flavonoids amount, total ascorbic acid amount and antioxidant activity of common cowslip leaves extracts were determined by UV – VIS spectrophotometric analysis method. The qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds was performed using HPLC – MS method.
The results and conclusions of the research. The highest amount of total phenolic compounds were determinated in the sample of cowslip leaves picked from Vilnius county, at an average 27.17±0.13 mg GRE/g, total hidroxycinnamic acid derivatives (3.23±0.11 mg CRE/g) in Anaiciai (Klaipeda distr.), total flavonoids (0.74±0,01 mg RE/g) in Smilgiai (Panevezys distr.) and total ascorbic acid in Abromiskis (Elektrenai distr.) and Naudziunai (Birstonas distr.) respectively 19.89±0.62 mg/g and 19.76±0.61 mg/g (p<0.05). The strongest antiradical activity (ABTS method) was determinated in extracts of the samples of leaves that were picked from Arlaviskiai (Kaunas distr.) – 562.16±0.005 μmol TE/g, DPPH – Anaiciai (Klaipeda distr.) – 735.91±5.02 μmol TE/g. The strongest reducing activity was determinated in extracts of the samples that were picked in Panevezys and Kaunas counties, respectively 586.37±1.99 μmol TE/g and 652.01±4.80 μmol TE/g (p<0.05). Quercetin, kaempferol–3–O–glucoside, isorhamnetin–3–O–rutinoside, rutin, isoquercitrin and quinic acid were identified. Strong correliations were determinated between the quercetin and antiradical activity, which was measured by DPPH method (r=0.770, p<0.05).
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'–azino–bis(3–etilbenztiazolin–6–sulfono rūgštis); CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas;
CUPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Cupric ion reducing antioxidant
capacity);
CV – variacijos koeficientas (angl. coefficient of variation); DCPIP – natrio 2,6–dichlorfenolindofenoliatas;
DPPH – 2,2–difenil–1–pikrilhidrazilas;
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power); GRE – galo rūgšties ekvivalentas;
RE – rutino ekvivalentas;
TPTZ – 2,4,6–tri–(2–piridil) –1,3,5–triazinas; TE – trolokso ekvivalentas;
UESC – MS – ultraefektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija; UV – VIS – ultravioletinė ir regimoji šviesa.
ĮVADAS
XXI a. augalinių vaistinių preparatų susidomėjimas ir vartojimas labai išpopuliarėjo atsižvelgiant į žmogaus sveikatos priežiūrą, nes fitofarmaciniai preparatai pasižymi platesniu veikimu ir sukelia mažiau nepageidaujamų reakcijų lyginant su sintetiniais vaistiniais preparatais. Augaliniuose preparatuose esančių biologiškai aktyvių junginių moksliniai tyrimai nuolat tampa aktualesni.
Didele fenolinių junginių ir kitų laisvųjų radikalų rišiklių, kaip askorbo rūgštis, įvairove savo cheminėje sudėtyje pasižymi raktažolinių (Primulaceae) šeimos daugiametis žolinis augalas – pavasarinė raktažolė (Primula veris L.) [59]. Augalas plačiai paplitęs Lietuvoje ir tyrinėjamas visame pasaulyje: atliekami sudėties, kiekybės, antioksidantinio aktyvumo tyrimai. Pavasarinių raktažolių vaistinės augalinės žaliavos – lapų – fenoliniai junginiai yra viena svarbiausių biologiškai aktyvių junginių grupė, todėl šiems junginiams yra skiriamas ypač didelis dėmesys. Fenolinių junginių analizė įvairiais kokybiniais ir kiekybiniais metodais leidžia įvertinti raktažolių lapų kokybę, sudėtį, bei palyginti junginių pasiskirstymą skirtingose augalo dalyse [55, 60]. Žaliavos, kuriose nustatyta fenolinių junginių yra labai perspektyvios vaistinių preparatų gamyboje ir atveria naujas galimybes sunkių ligų, Parkinsono ar vėžio prevencijai, todėl susidomėjimas didėja visame pasaulyje [29].
Moksliniais tyrimais, kuriuose analizuojama pavasarinių raktažolių atskirų dalių kiekybinė ir kokybinė sudėtis, nustatyta, kad pavasarinių raktažolių lapai turi platų farmakologinį spektrą. Pavasarinių raktažolių lapai vartojami kvėpavimo takų ligoms, odos pažeidimams gydyti, pasižymi uždegimą mažinančiomis, antivirusinėmis, raminančiomis, spazmus mažinančiomis, antioksidantinėmis savybėmis [40, 48].
Individualių augalų fitocheminė sudėtis skiriasi, kadangi augalui įtaką daro įvairūs skirtingi aplinkos veiksniai: geografinė padėtis, klimato bei agronomijos sąlygos. Sudėties įvairavimas augaluose paskatino išsiaiškinti Lietuvos regiono raktažolių augavietes, kuriose užaugusių pavasarinių raktažolių lapuose sukaupiami didžiausi fenolinių junginių ir askorbo rūgšties kiekiai. Atlikus mokslinius tyrimus bus galima paneigti arba pagrįsti mokslininkų padarytas išvadas apie raktažolių lapų kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti perspektyvias žaliavos rinkimo vietoves Lietuvoje augalinių vaistinių preparatų gamybai.
Mokslinio darbo tikslas – nustatyti fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties, askorbo rūgšties kiekio ir antioksidantinio aktyvumo in vitro įvairavimą pavasarinių raktažolių (Primula veris L.) lapų ėminiuose, surinktuose skirtingose Lietuvos augavietėse.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties, askorbo rūgšties kiekio ir antioksidantinio aktyvumo in vitro įvairavimą pavasarinių raktažolių (Primula veris L.) lapų ėminiuose, surinktuose skirtingose Lietuvos augavietėse.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti pavasarinių raktažolių vaistinės augalinės žaliavos – lapų – fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų optimizavimą.
2. Ištirti skirtingose Lietuvos augavietėse surinktų pavasarinių raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių kiekybinės sudėties ir askorbo rūgšties kiekio įvairavimą.
3. Nustatyti skirtingose Lietuvos augavietėse surinktų pavasarinių raktažolių lapų ėminių ištraukų antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo in vitro įvairavimą.
4. Išanalizuoti skirtingose Lietuvos augavietėse surinktų pavasarinių raktažolių lapų ėminių individualių fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą.
5. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp pavasarinių raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių kiekio, askorbo rūgšties kiekio ir lapų ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Raktažolių (Primula L.) genties apibūdinimas ir augalų paplitimas
Pavasarinė raktažolė yra raktažolinių (Primulaceae) šeimos augalas. Šeimai priskiriami vienmečiai arba daugiamečiai žoliniai arba šiektiek sumedėję augalai [4].Pasaulyje auga 29 raktažolinių šeimos gentys: raktažolių (Primula L.), poraisčių (Naumburgia L.), šimtūnių (Centunculus L.), vyrskydžių(Androsace L.), griovenių(Hottonia L.) ir kitos. Egzistuoja apie 800 raktažolių genties rūšių [4]. Raktažolių gentis viena didžiausių ir plačiausiai paplitusių genčių. Apie 430 raktažolių genties rūšių pasiskirsčiusios Šiaurės pusrutulio drėgnuose ir vidutinės ar žemos temperatūros regionuose [30, 50, 60]. Didžiausia raktažolių genties augalų koncentracija randama Himalajų kalnuose ir vakarinėje Kinijos dalyje [13, 50]. Daugiau kaip 334 rūšys yra randamos Kinijoje, o tai sudaro 42 proc. visų esamų raktažolių genties rūšių. Raktažolių gentis yra klasifikuojama į 37 skyrius. Europoje auga 34 raktažolių genties rūšys, kurios klasifikuojamos į 4 skyrius [13].
Europoje raktažolių genties augalai labiausiai paplitę Ispanijoje, Pirėnų kalnuose, Alpėse, Karpatuose ir Baltijos regione [26]. Lietuvoje žinoma 11 raktažolių genties rūšių [29]. Dauguma raktažolių genties augalų yra vandeniniai, todėl dažniausiai yra randami prie vandens telkinių ar drėgname dirvožemyje [59].
Raktažolių genties augalų populiacijoje egzistuoja heterostilija: augalų liemenėliai įvairiuose žieduose yra skirtingo ilgio – vienų augalų tokio ilgio kaip taurelės vamzdelis, o kitų – du kartus trumpesnis. Neįprasta raktažolių genties augalų savybė sudomino evoliucijos tyrėjus nuo Č. Darvino iki C. D. Darlingtono ir paskatino mokslinių publikacijų, tyrimų gausą, susijusią su raktažolių genties augalais [50].
Raktažolių genties augalų lapai paprasti, dažniausiai dantiškai karpytu kraštu, ištisiniai, skroteliniai, mentūriškai arba spirališkai išsidėstę. Stiebai gali būti šakoti arba nešakoti [46, 59].Žiedaipenkianariai, dvilyčiai, dažniausiai turi 5 (rečiau 4–9) taurėlapius, kurie yra suaugę prie pagrindo. Žiedai yra susitelkę į skėčius (kartais rutuliškus) arba išsidėstę ant žiedynkočio mentūriškai ar pavieniui [21, 29]. Kuokeliai (dažniausiai apie 5) yra išsidėstę žiedo viduryje. Piestelė gali būti viršutinė ar pusiau apatinė, turinti 5 suaugusius sėklapradžius, kurie suformuoja piestelėje ertmę. Mezginė gali subrandinti 1 ar daugiau sėklų [59]. Raktažolių genties augalai gali turėti mezginę su „dangteliu“ [4]. Augalų vaisius – daugiasėklėdėžutė [59]. Atsižvelgiant į raktažolių genties morfologinius požymius ir augalų paplitimą, galima teigti, jog raktažolių genties augalai yra gerai prisitaikę prie Lietuvos gamtinių sąlygų.
1.2 Pavasarinių raktažolių (Primula veris L.) morfologiniai požymiai,
augavietės, vaistinė augalinė žaliava ir jos kokybės reikalavimai
Pavasarinės raktažolės – daugiamečiai, 15–35 cm aukščio skroteliniai augalai, hemikriptofitai – pusiau pasislėpę augalai, kurių pumpurai mezgasi prie pat arba negiliai žemėje [29]. Augalų šakniastiebiai vertikalūs, trumpi, stambėja link viršūnės, apaugę daugybe pluoštinių šaknų, kurios gali būti iki 15 cm ilgio. Augalai turi daugiau ar mažiau mėsingų žvynų, kurie susiformuoja iš sudžiuvusių raktažolių lapų [21].
Pavasarinių raktažolių skrotelės turi pamatinius raukšlėtus lapus, kurie didėja viso augimo metu iki visiško vaisių subrendimo stadijos. Lapalakščių viršutiniame paviršiuje matomi išvagotų gyslų įspaudai, o apatiniame paviršiuje – gyslų iškilimai, todėl lapų paviršius yra tinkliškai vagotas [42]. Viršutinis lapų paviršius plaukuotas, tačiau gali būti ir beveik plikas, o apatiniame paviršiuje plaukeliai ploni, pilkšvi arba balsvi, prigludę [21, 29]. Lapų forma pailgai kiaušiniška, ties pamatu lapai širdiški arba sueina į lapkotį, viršūnė apskrita arba buka, kraštai smulkiai dantyti, o danteliai suapvalintomis viršūnėmis. Išaugus naujam lapui, iš pradžių kraštai būna užsirietę, tačiau augimo metu išsitiesia. Lapkočiai paprastai būna trumpesni už lapalakštį, turi sparnelius. Lapų skrotelėse išauga vienas arba keletas žiedstiebių [10, 42].Pavasarinės raktažolės, numetusios senus lapus, naujus lapus pradeda vystyti vėlyvos žiemos laikotarpiu. Lapai išsiplečia augalo augimo metu, o savo didžiausią biomasę pasiekia vasaros metu. Esant sausam ir karštam klimatui lapai sunyksta augimo sezono pabaigoje, tačiau dauguma išlieka iki naujų lapų susidarymo vėlai žiemą. Žiemos laikotarpiu lapai yra blyškiai žali, trumpi, susitraukę. Nauji augalo ūglai gali virsti naujomis vegetatyvinėmis skrotelėmis arba vienašalio skėčio pavidalo žiedynais [29].
Pavasarinių raktažolių stiebai apaugę plonais, minkštais plaukeliais, kurie dažnai yra paprastojo tipo [17]. Stiebai turi 1–2 kekes, kuriose yra 1–30 žiedų ar žiedų pumpurų. Stiebai lankstūs žydėjimo metu, bet pasidaro standūs vaisių brendimo laikotarpiu ir išauga balandžio mėnesį [42].
Pažiedės 2–7 mm ilgio, siauros, linijiškai lancetiškos, smailios arba smailėjančios, plaukuotos, sudaro bendrą žiedyno apvalkalą. Žiedkočiai 3–20 mm, plaukuoti, liekni, šiektiek išsiplėtę, daugiau ar mažiau krentantys [29]. Taurelės 8–17 mm ilgio, vamzdiškos ar varpiškos, ypač plaukuotos prie kraštų, išsipūtusios, penkiadantės, danteliai smailūs, šviesiai žalios spalvos [17]. Vainikėliai paprastai yra ryškiai geltoni, kartais balti, rusvi, rusvai geltoni ar rausvi, turi oranžinę žymę ant vainiklapių pamato. Vainikėliai turi dantelių ar žvynelių pavidalo ataugėles ir ilgus vamzdelius, kurie dažniausiai yra piltuvėlio, rečiau varpo formos, žiotys susiaurėjusios. Piestelės heteromorfinės, įgaubtos, turi iškarpytus kraštus, praplatėjusi dalis 10–17 mm pločio. Kuokeliai su dulkinėmis 2 mm ilgio, turi trumpus kotelius ir yra išsidėstę viršutinėje vainikėlio dalyje. Staminodžių nėra. Mezginės 8 mm ilgio, rutuliškos arba pailgos, trumpesnės už taureles [8].
Pavasarinių raktažolių augalai turi vaisius – rudas, cilindriškas ar rutuliškas dėžutes, kuriose subręsta gausus kiekis sėklų. Dėžutės atsidaro 5 sąvaromis, kurios kartais būna dantytos su 10 dantelių. Sėklos yra 1–1,5 mm diametro, 0,69–1,24 mg, kiaušinio, kubo ar pusiau rutuliškos formos, iš vienos pusės suplotos, iš kitos išgaubtos, nuo tamsiai rudos iki juosvos spalvos, padengtos tankiais gaureliais arba turinčios smulkiai karpotą paviršių [10, 33].
Augalų užuomazgos paprastai atsiranda rudens sezono antroje pusėje, bet pumpurai pasidaro matomi kovo pabaigoje ir balandžio pradžioje. Žydėjimas vyksta nuo balandžio pradžios iki gegužės vidurio [17].
Pavasarinės raktažolės yra vietiniai augalai gerai nusausintose, žolinių augalų turtingose pievose ir žolynuose. Raktažolės gali augti miško keliuose ar pakraščiuose, kalkinėse uolose, tačiau skurdesnėse vietose pasitaiko rečiau. Raktažolių paplitimas pagausintas krantinėse ir naujų ar atnaujintų kelių ribose [30]. Pavasarinių raktažolių augalai daugiausiai paplitę Europoje: Pietų Švedijoje, Suomijoje, tęsiasi į Pietus, link Alpių, tačiau Viduržemio jūros regionuose raktažolių nėra. Pavasarinės raktažolės auga Šiaurės Ispanijoje, tačiau neauga centrinėje Ispanijos dalyje [60]. Raktažolės randamos ir centrinėje Europoje – nuo Vokietijos iki Lenkijos, Čekijoje, Balkanų pusiasalyje (Kroatija, Albanija, Rytų Graikija), Panonijos žemumose (Vengrija, Rumunija) [26, 30].
Pavasarinių raktažolių augimas suaktyvėja pasiekus 3,7–15,2 °C oro temperatūrą. Raktažolės ypač gausiai auga dirvožemyje, kuriame yra kalkinės prigimties mineralų, pavyzdžiui, kalkakmenis, kreidinės uolos nuolaužos, mėgsta augavietes, kuriose yra molėtas dirvožemis. Pavasarinės raktažolės gali būti paplitusios rūgščiuose (pH 5,0–8,0) dirvožemiuose, toleruoja įvairaus tipo drėgnumą ir mažą trąšų (azoto, fosforo) kiekį [10].
Europos farmakopėjoje reglamentuojama pavasarinių raktažolių vaistinė augalinė žaliava, kuri naudojama vaistinių augalinių preparatų gamybai, yra šakniastiebiai su šaknimis. Raktažolių šakniastiebiai su šaknimis kasami rudenį arba anksti pavasarį, švariai nuplaunami, pašalinamos smulkios šaknelės ir išdžiovinami [21]. Žaliava yra kartaus skonio [20]. Šakniastiebiai turi šiurkštų paviršių, yra geltonai rudos spalvos, tiesūs arba truputį kreivi, apie 1–5 cm ilgio ir apie 2–4 mm storio. Šakniastiebiai dažnai turi stiebų ar lapų liekanų randus. Prie šakniastiebio prisitvirtinusios trapios šaknys, kurios yra apie 1 mm storio ir 6–8 cm ilgio [29]. Šaknys šviesiai geltonos ar gelsvos spalvos. Šaknies lūžis lygus [20].
Kokybiškoje raktažolių vaistinėje augalinėje žaliavoje drėgmės kiekis turi būti ne daugiau 10 proc., džiovinimui paėmus 1 g susmulkintos žaliavos miltelių ir džiovinant džiovinimo krosnyje 105 °C temperatūroje 2 val. Pelenų kiekis negali viršyti 9 proc., iš kurių 3 proc. negali ištirpti druskos rūgštyje [20].
1.3 Pavasarinių raktažolių lapų, žiedų ir šakniastiebių su šaknimis cheminės
sudėties tyrimai
Pavasarinės raktažolės yra augalai, kuriuose nustatyta įvairių biologiškai aktyvių junginių. Didžiausią junginių dalį sudaro augalų antriniai metabolitai – fenoliniai junginiai, kurie yra vertinami dėl savo stipraus antioksidantinio poveikio [3]. Pavasarinių raktažolių augalų žaliavoje esantys įvairūs cheminiai junginiai nevienodais kiekiais pasiskirsto visose augalo dalyse: lapuose, žieduose, šakniastiebiuose su šaknimis, todėl galima spręsti, kodėl šis augalas taip vertinamas medicinoje visame pasaulyje.
Pirmieji pavasarinių raktažolių vaistinės augalinės žaliavos: žiedų, lapų ar šakniastiebių su šaknimis, fenolinių junginių tyrimai pradėti vykdyti XX a. pradžioje [50]. Pavasarinių raktažolių lapuose nustatyta daug įvairių flavonoidų: kvercetin–3–O–diheksozidas, kemferol–3,7–O–triheksozidas, izoramnetin–3–O–dideoksiheksozės heksozidas, rutinas. Rutino nustatytas kiekis raktažolių lapuose didžiausias iš visų fitocheminėje sudėtyje nustatytų biologiškai aktyvių junginių – 30–70 proc. Raktažolių lapuose nustatyti lipofiliniai flavonai: 3–hidroksi–4′,5′–dimetoksiflavonas, zapotinas, primulatinas, chrisinas ir primetinas [18, 36]. Lapuose nustatyti karotinoidai – apie 3 proc. [11]. Askorbo rūgšties raktažolių lapuose nustatyta iki 2,5 proc. [58]. Irano mokslininkai, šiaurinėje Irano pusėje surinktų raktažolių lapų ėminiuose, kiekybinės ir kokybinės analizės metu nustatė kvercetin–3– gliukozidą (įvairavimas raktažolių lapų ėminiuose 16,11–98,46 μg/g) ir katechiną (11,46 μg/g–13,59 μg/g) [43]. Pavasarinių raktažolių lapuose Egipto mokslininkai nustatytė chino rūgštį. Chino rūgštis nėra fenolinis junginys, tačiau jis svarbus priešvirusiniam raktažolių augalinės vaistinės žaliavos – lapų – poveikiui (gripo A ir B profilaktikoje) [29].
Raktažolių žieduose nustatyta, jog didžiausią koncentraciją fitocheminėje sudėtyje sudaro flavonoidai: rikardinas C, metoksiflavonai, kvercetinas, kurio augalo lapuose nustatyta apie 20 proc., ir izoramnetinas [11, 13]. Žieduose askorbo rūgšties nustatytas kiekis du kartus didesnis nei lapuose – 4,7 proc. Teigiama, kad šešiuose raktažolių žiedų vainiklapiuose yra žmogui rekomenduojama vitamino C paros dozė (60 mg) [58].
Mokslinėse publikacijose aprašytuose tyrimuose paminėti pavasarinių raktažolių lapuose bei žieduose nustatyti saponinai: primulasaponinas I, primulasaponinas II ir priverosaponinas. Saponinų didžiausia koncentracija – 2 proc. visų nustatytų junginių kiekio – nustatyta raktažolių taurėlapiuose [13, 40]. Italų mokslininkai raktažolių lapų ir žiedų fitocheminės sudėties kokybiniame tyrime nustatė 3,5–dihidroksiflavoną, kuris raktažolių genties augaluose nustatytas primąjį kartą [13].
Šaknyse ir šakniastiebiuose nustatyta 18,60±1,37 proc. saponinų: primulasaponinas I, primulasaponinas II, priverosaponinas, raktažolės rūgštis I, raktažolės rūgštis II, protoprimulageninas A,
[13, 55]. Šaknyse ir šakniastiebiuose nustatyti 5–metoksisalicilo metilo esterio glikozidai: primeverinas ir primulaverinas, kurie išdžiovintai augalinei žaliavai suteikia būdingą kvapą, kuris primena metilsalicilatą ar anetolį. Kuo intensyvesnis žaliavos kvapas, tuo žaliava yra senesnė [40]. Šakniastiebiuose su šaknimis nustatyta 0,08 proc.eterinio aliejaus, kurio sudėtyje didžiausią kiekį sudaro timolis – 5,11±0,26 mg/100ml [19,20].
Visose pavasarinių raktažolių augalų dalyse nustatyta iki 7 proc.mineraliniųmedžiagų, mažas procentas taninų, organinių rūgščių, kartumynų, bei gleivių [13].
1.4
Pavasarinių
raktažolių
lapų,
žiedų
ir
šakniastiebių
su
šaknimis panaudojimas medicinoje
Gydomosios pavasarinių raktažolių augalų savybės minimos XVI–XVII a. knygose apie mediciną [38, 55]. Pagrindinė pavasarinių raktažolių žiedų, lapų ar šakniastiebių su šaknimis indikacija – kvėpavimo takų susirgimų, pavyzdžiui, paprastojo peršalimo, kosulio, kokliušo, astmos, lėtinio ar ūminio bronchito gydymas. Vaistinius preparatus su raktažolių lapų, žiedų ir šakniastiebių su šaknimis žaliavomis rekomenduojama skirti vaikams, sergantiems tonzilitu, dėl fitocheminėje sudėtyje nustatytų saponinų [24, 40, 46]. Austrijos ir Vokietijos mokslininkai atliko tyrimą su pelėmis, kurioms buvo dirbtinai sukeltas bronchoalveolitas. Pelėms sušertos tabletės su pavasarinių raktažolių šakniastiebių su šaknimis sausuoju ekstraktu [24]. Tyrimo metu nustatyta, jog pelėms, kurioms buvo sušertas raktažolių šakniastiebių su šaknimis preparatas, statistiškai reikšmingai sumažėjo bronchų epitelio uždegimas apatiniuose kvėpavimo takuose ir mucino 5AC baltymo, kuris padidina gleivių hipersekreciją kvėpavimo takuose, koncentracija [24].
Pavasarinių raktažolių žiedai pasižymi antibakteriniu poveikiu. Turkijos mokslininkų atliktame tyrime nustatyta, jog pavasarinių raktažolių žiedų ekstraktai slopina gram teigiamų ir gram neigiamų bakterijų padermes: Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens. Didžiausiu antibakteriniu aktyvumu pasižymėjo raktažolių žiedų ekstraktai, pagaminti etanolio pagrindu, kadangi vartojant etanolinį ekstraktą nustatyta didžiausia nuslopintų mikroorganizmų zona [16]. Ištyrus pavasarinių raktažolių lapų ekstraktų poveikį prieš Mycobacterium tuberculosis bakterijų padermes, nustatyta, jog ekstraktai sukelė M. tuberculosis bakterijų padermių sumažėjimą 41 proc. visų bakterijų padermių procentinės dalies [16].
Pavasarinių raktažolių lapuose esantys biologiškai aktyvūs junginiai rutinas ir kvercetinas suteikia lapams uždegimą mažinantį poveikį [24]. Uždegimą mažinantį poveikį lemia ir sudėtyje esantys saponinai: primulasaponinas I ir priverosaponinas. In vitro atlikto tyrimo metu nustatyta, kad raktažolių
lapų ištraukos inhibuoja ciklooksigenazę (COX), lipooksigenazę (LOX) ir slopina uždegimo induktorių (prostaglandinų ir leukotrienų) gamybą. Mokslinėse publikacijose aprašytas tyrimas, kurio metu žiurkėms sukeltas dermatitas buvo gydomas fenolinių junginių ekstraktais. Pasirinktas gydymo būdas pasižymėjo dideliu uždegimą mažinančiu veikimu, panašiu į gydant cheminiais preparatais indometacinu ir fenilbutazonu, tačiau vartojant fenolinių junginių ekstraktus nepageidaujamų reakcijų pasireiškė mažiau [47]. Eksperimentiniais tyrimais įrodyta, kad biologiškai aktyvių junginių uždegimą mažinančios savybės mažėja tokia tvarka: apigeninas > liuteolinas > kvercetinas > apigenin–7– gliukozidas > rutinas [47].
Fenoliniai glikozidai ir salicilo dariniai, esantys pavasarinių raktažolių cheminėje sudėtyje, suteikia augalui antivirusinį poveikį [24]. Vaistinius preparatus, savo sudėtyje turinčius raktažolių žiedų, lapų ar šakniastiebių su šaknimis, rekomenduojama vartoti kaip nuskausminamuosius, diuretikus ar nosies gleivių sekrecijos stimuliatorius. Persirgus gripu ar vartojant antibiotikus rekomenduojama vartoti pavasarinių raktažolių lapų, žiedų ar šakniastiebių su šaknimis preparatus, nes jie užtikrina greitesnį imuninės sistemos pagerėjimą po ligos, stabdo viduriavimą, jei nuo antibiotikų sutrikusi žarnyno mikroflora [58].
Raktažolių augalinės vaistinės žaliavos – lapų, žiedų ar šakniastiebių su šaknimis – fitocheminius preparatus siūloma vartoti pacientams, sergantiems mažakraujyste, siekiant sustiprinti organizmą [36, 38]. Pavasarinių raktažolių lapai ir žiedai turi angioprotekcinį, antioksidantinį, antihipoksinį bei antikoaguliacinį poveikį, todėl gali būti vartojami širdies funkcijai gerinti [32, 48]. Rusijos mokslininkų atliktame tyrime analizuojama širdies miokardo susitraukimo funkcija pelėms su dirbtinai sukeltu širdies nepakankamumu. Tyrime pelėms sušertas sausas pavasarinių raktažolių lapų ekstraktas. Efektyvumas buvo lyginamas su meldonio dihidrato, kuris plečia kraujagysles ir apsaugo širdį, poveikiu. Atlikus tyrimą, gauti statistiškai reikšmingi rezultatai. Pelėms, kurioms buvo sušerti raktažolių lapų sausieji ekstraktai, susinormalizavo kairiojo skilvelio spaudimas, širdies ritmas. Širdį ir kraujagysles apsaugančiu poveikiu labiausiai pasižymi rutinas, kvercetinas ir kemferolis, esantys raktažolių lapų fitocheminėje sudėtyje [32].
Pavasarinių raktažolių lapų ekstraktai vartojami kaip raminamoji priemonė, CNS stimuliavimui, nervų ligoms gydyti, neuralginiams skausmams, spazmams, raumenų traukuliams, paralyžiui slopinti [58]. Antispazminis poveikis turi įtakos epilepsijos priepuolių gydymui, tremoro slopinimui, todėl šaltiniai teigia, jog raktažolių lapų poveikis gali pagerinti Parkinsono liga sergančių pacientų būklę [58]. Preparatus, kurių sudėtyje yra raktažolių vaistinės augalinės žaliavos – lapų – rekomenduojama vartoti hiperaktyviems vaikams, bei suaugusiems sutrikusiam miego ciklui gerinti [58].
Pavasarinių raktažolių augalų dalis galima vartoti išoriškai [58]. Nuskintus ir susmulkintus raktažolių lapus rekomenduojama uždėti ant sumuštų vietų, esant hematomoms ar išoriniams kūno
dalių patinimams [58]. Patariama vartoti pavasarinių raktažolių lapus ir žiedus odos valymo losijonams gaminti, kadangi augalas turi akne, spuogų ir kitų odos sutrikimų gydymo savybių. Losijonai gali būti vartojami veido nešvarumams valyti, porų atkimšimui, odos gaivumui ir blizgumui palaikyti [58].
Sintetiniai ar natūralūs vaistiniai preparatai, prie kurių priskiriami ir preparatai, pagaminti iš pavasarinių raktažolių vaistinės augalinės žaliavos, kaip lapai ar šakniastiebiai su šaknimis, turi priežasčių, dėl kurių jų negalima vartoti. Raktažolių žaliavoje eterinių aliejų kiekis yra nedidelis, tačiau alergiškiems žmonėms gali sukelti odos bėrimus ar kitas alergines reakcijas [13]. Pavasarinių raktažolių žaliavos, lapų, žiedų ar šakniastiebių su šaknimis, preparatų gydymo tikslais nereikėtų vartoti nėščiosioms ir asmenims, vartojantiems kraujo krešėjimą slopinančius vaistus, pavyzdžiui, varfariną, aspiriną [58]. Saponinai, esantys raktažolių lapų fitocheminėje sudėtyje, gali sukelti pykinimą ar viduriavimą [58].
Pavasarinių raktažolių lapų, žiedų ir šakniastiebių su šaknimis preparatų farmacinių formų yra įvairių, tačiau viena iš pagrindinių yra nuoviras, kuris yra priimtinas tiek vaikams, tiek suagusiems. Nuovirą lengva ir patogu vartoti, jis nedirgina virškinamojo trakto, gali būti skirtas išoriniam bei vidiniam vartojimui [6]. Viena stikline vandens reikia užpilti 10 g pasirinktos sudžiovintos ir susmulkintos pavasarinių raktažolių vaistinės augalinės žaliavos – lapų, žiedų, šaknų su šakniastiebiais – miltelių. Tirpalą pakaitinti 30 min., atvėsinti ir perkošti per dvigubą marlę ar vatą. Perkošus pripilti vandens iki pradinio tūrio [58]. Nuovirą reikia vartoti kelis kartus per dieną į vidų, po vieną ar du valgomuosius šaukštus prieš valgį, arba išoriškai – įtrinimams, skalavimamas [58].
Raktažolių lapai ar žiedai gali būti naudojami gaminant užpilus, tačiau ši farmacinė forma mažiau vartojama sergančiųjų tarpe, kadangi užpilai yra mažesnės koncentracijos ir veikia silpniau už nuovirus [6]. Viena stikline šalto vandens reikia užpilti 2 arbatinius šaukštelius džiovintos pasirinktos raktažolių vaistinės augalinės žaliavos, pavirinti 5 min. ir palaukti, kol pritrauks. Vartoti į vidų, po 2–3 puodelius per dieną, arba išoriškai. [58]
1.5 Flavonoidų įtaka augalams ir jų poveikio medicininis pritaikymas
Flavonoidai, tai grupė biologiškai aktyvių junginių, turinčių fenolio žiedą savo struktūroje ir randami įvairiuose augaluose, vaisiuose, medžio žievėje [45]. Žmogaus organizmui ir augalams flavonoidai turi didelę svarbą [45]. Augaluose šių biologiškai aktyvių junginių didžiausia koncentracija nustatyta vakuolėse, tačiau junginiai gali kauptis ir kitose organelėse [37]. Dalis flavonoidų aglikonų pavidalu kaupiasi augalo epidermio ląstelėse ir apsaugo parenchimą nuo žalingo ultravioletinės spinduliuotės poveikio, kuris pasireiškia 280–315 nm diapazone [5, 9].
Biologiškai aktyvūs junginiai – flavonoidai, atlieka augalo pigmento vaidmenį [37]. Flavonoidai suteikia vainiklapiams spalvą ir padeda privilioti vabzdžius, kurie apdulkina augalą ir padeda jam daugintis. Flavonoidų grupės: chalkonai, auronai, suteikia augalo žiedams geltoną spalvą. Flavonoliai ir flavonai yra pagalbiniai pigmentai augalams, savo cheminėje sudėtyje turintiems antocianinų, kadangi suintensyvina raudoną antocianinų spalvą. Flavonai ir flavonoliai nustatyti raudonos, violetinės, mėlynos, balsvos ir rusvos spalvos vainiklapiuose [57].
Flavonoidai augalus ir žmogaus organizmą apsaugo nuo mikroorganizmų ir virusų [58]. Atliktų mokslinių tyrimų metu nustatytas platus flavonoidų poveikis prieš gram teigiamas bakterijų padermes ir grybelius. Flavonoidai sudaro kompleksus su augalų ląstelių sienelių komponentais ir užkerta kelią mikrobų augimui ir patekimui į ląsteles [24]. Ištyrus flavonoidus: 5,7–dimetoksiflavanon–4–O–β–D– gliukopiranozidą, 5,7,3–trihidroksi–flavanon–4‘–O–β–D–gliukopiranozidą, nikotifloriną ir rutiną, nustatytas stiprus šių biologiškai aktyvių junginių antimikrobinis ir priešgrybelinis aktyvumas prieš
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanni ir Staphylococcus aureus bakterijų padermes, bei Candida krusei grybelį [16]. Flavonoidai veiksmingai slopina Herpes simplex (HSV – 1) virusą ir gram neigiamas E. faecalis bakterijų padermes. Mokslinėse publikacijose aprašytų tyrimų metu nustatytas apigenino, baikaleino, kemferolio, liuteolino ir naringenino poveikis mažinant azijos paukščių gripo A (H5N1) viruso nukleoproteinų ekspresiją plaučių epitelio ląstelėse [16, 23].
Flavonoidų aglikonai pasižymi didesniu aktyvumu ir poveikiu nei glikozidai [49]. Nustatyta, kad flavonoidai pasižymi stipriu antioksidantiniu poveikiu, dėl kurio žaliavos, kuriose yra šių biologiškai aktyvių junginių, naudojamos ligų gydyme [3, 48]. Flavonoidai padeda išvengti laisvųjų radikalų sukeliamos pažaidos prisijungdami laisvuosius radikalus; aktyvindami antioksidantinius fermentus, kurie sustiprina antioksidantinį poveikį; sudarydami chelatinius junginius su toksiškais metalais ir juos neutralizuodami; slopindami oksidazes ar mažindami azoto oksidų sukeltą oksidacinį stresą [49].
Flavonoliai, kvercetinas ir izokvercitrinas, kurių nustatytas didelis kiekis pavasarinių raktažolių vaistinėje augalinėje žaliavoje: lapuose, žieduose ir šakniastiebiuose su šaknimis, yra pagrindiniai antioksidantinį poveikį suteikiantys junginiai [36]. Antioksidantinį flavonoidų poveikį lemia hidroksi grupių skaičius, o ypač svarbi hidroksi grupė prisijungusi prie C3 atomo, ir dviguba jungtis, jungianti C2 ir C3 atomus ar karbonilo grupę ir C4 atomą [28]. Antioksidantinis aktyvumas glaudžiai susijęs su priešvėžiniu poveikiu [27]. Flavonoidai suriša laisvuosius radikalus – tokiu būdu yra sustabdomas ląstelių mutacijų atsiradimas [49]. Flavonoidai stabdo angiogenezę, todėl vėžio pažeistoje vietoje nebesiformuoja naujos kraujagyslės, navikas nebegali savęs aprūpinti krauju ir įvyksta auglio žūtis [51]. Flavonoidai pasižymi stipriu kardioprotekciniu ir antilipideminiu poveikiu, dėl kurio yra labai vertinami [32, 48]. Būdami stiprūs antioksidantai, flavonoidai stabdo mažo tankio lipoproteinų oksidaciją tokiu būdu sumažindami kraujagyslių pažeidimo riziką ir aterosklerozės vystymąsi [25]. Flavonoidai yra plačiai vertinami dėl širdies ir kraujagyslių endotelio funkcijos gerinimo, mažinant
kraujo spaudimą [32, 48]. Pavasarinių raktažolių ir kitų vaistinių augalų žaliavose nustatyti flavonoidai kartu su nitratais praturtintais vaistiniais preparatais veikia sinergiškai prieš kardiovaskulinės sistemos ligas ir padeda jų išvengti [32, 48]. Flavonoidai kemferolis ir kvercetinas kartu su nitratais sugeba efektyviau nei vartojant individualiai padidinti azoto oksido kiekį organizme, pagerinti kraujagyslių lygiųjų raumenų atsipalaidavimą ir endotelio funkciją bei sumažinti kraujo spaudimą. Organizme sumažėjus azoto oksido kiekiui, skatinama aterosklerozė. Azoto oksidas stabdo mažo tankio lipoproteinų oksidaciją slopindamas aterosklerotinių plokštelių formavimąsi [14, 41].
Flavonoidai užtikrina antibakterinį, priešgrybelinį ir antivirusinį poveikį [24]. Flavonoidai apigeninas ir liuteolinas stabdo nukleorūgščių sintezę, o izoramnetinas slopina citoplazminės membranos funkciją, inhibuoja energijos metabolizmą [52]. Junginiai geba inhibuoti bakterijų sporų augimą sumažindami bakterinių ligų atsinaujinimą. Nustatyta, kad antivirusinį poveikį flavonoiduose suteikia C3 atomo padėtyje esanti –OH grupė [28]. Antivirusinis veikimas pagrįstas viruso replikacijos stabdymu bei jo infekcinių savybių slopinimu [51].
Geresnio flavonoidų efekto užtikrinimui rekomenduojama kartu vartoti žaliavas, kuriose nustatyti steroliai ir terpenai [31]. Vaistinių augalinių žaliavų preparatus, kuriuose yra flavonoidų, pavyzdžiui, ekstraktus, rekomenduojama vartoti kiekvieną dieną, tačiau neperdozuoti, kadangi didelėmis dozėmis jie gali veikti kaip prooksidantai, galintys sukelti įvairias ląstelių mutacijas [52].
1.6 Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Pavasarinės raktažolės, tai visame pasaulyje plačiai paplitę raktažolių genties žoliniai augalai, pasižymintys didele biologiškai aktyvių junginių gausa savo cheminėje sudėtyje. Visas raktažolių augalų dalis galima vartoti kaip vaistinę augalinę žaliavą: lapus, žiedus, šaknis su šakniastiebiais. Augaliniai vaistiniai preparatai, pagaminti iš raktažolių augalų dalių, padeda apsisaugoti nuo tokių ligų kaip kvėpavimo takų susirgimai, širdies ir odos ligos, turi uždegimą mažinantį ir antimikrobinį poveikį. Gydomąsias savybes pavasarinių raktažolių augalų žaliavoms: lapams, žiedams ir šakniastiebiams su šaknimis, suteikia fenoliniai junginiai, o ypač flavonoidai, kurių augalo fitocheminėje sudėtyje yra didelis kiekis. Fenoliniai junginiai rutinas ir kvercetinas, randami raktažolių lapų fitocheminėje sudėtyje, sudaro didžiausią koncentraciją.
Mokslinėje literatūroje informacijos apie pavasarinių raktažolių lapų fitocheminę sudėtį, kuri įrodytų šio augalo medicininį pritaikymą, nedaug ir ji nėra aprašyta išsamiai, metodikos sunkiai suprantamos, kad būtų galima jas atkartoti vykdant analizę. Problema turi būti išspręsta, todėl imtąsi ištirti Lietuvoje augančių pavasarinių raktažolių vaistinės augalinės žaliavos – lapų – fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės sudėties bei askorbo rūgšties kiekio įvairavimą.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo metu pasirinkta tirti pavasarinių raktažolių augalų vaistinė augalinė žaliava – lapai.
Tyrimams reikalinga pavasarinių raktažolių žaliava surinkta iš dešimties augalo augaviečių, esančių skirtingose Lietuvos vietose: Anaičių km. (Klaipėdos raj.), Daubiškių km. (Akmenės raj.), Kuršėnų m. (Šiaulių raj.), Smilgių km. (Panevėžio raj.), Abromiškio km. (Elektrėnų raj.), Gineikių km. (Jonavos
raj.), Kernavė (Širvintų raj.), Arlaviškių km. (Kauno raj.), Joneikiškių km. (Vilniaus raj.), Naudžiūnų km. (Birštono raj.) (1 pav.) Augalai surinkti žydėjimo metu – 2017 metų balandžio 10 d. – gegužės 5 d.
2.2 Naudoti reagentai
Tyrimo metu naudojami analitiškai išgryninti ir išvalyti reagentai, tirpikliai ir standartai, kurie atitinka visus jiems parengtus kokybės reikalavimus. Atliekant tyrimus naudojami reagentai: etanolis 96 proc. (v/v) (gamintojas AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva); natrio karbonatas, Folin – Ciocalteu reagentas, natrio hidroksidas, galo rūgštis (gamintojas „Chempur“, Tarnovske Gurai, Lenkija); ABTS (2,2'–azino–bis(3–etilbenzotiazolino–6–sulfoninė rūgštis), kalio persulfatas, amonio acetatas, vario (II) chloridas, neokuproinas, DPPH (2,2–difenil–1–pikrilhidrazilas), natrio acetatas, troloksas (6–hidroksi–2,5,7,8–tetrametilchroman–2–karboksilinė rūgštis) (gamintojas „Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija); TPTZ (2,4,6–tri–(2–piridil) –1,3,5–triazinas) (gamintojas „Carl Roth“, Karlsrūjė, Vokietija); geležies (III) chlorido heksahidratas (gamintojas „Vaseline – Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija); ledinė acto rūgštis 99,8 proc., skruzdžių rūgštis (gamintojas „Lachner“, Neratovicas, Čekijos Respublika); chlorogeno rūgštis, rutinas, kvercetinas, izokvercitrinas, izoramnetin–3–O–rutinozidas, chino rūgštis, kemferol–3–O–gliukozidas, natrio molibdatas, vandenilio chlorido rūgštis, natrio nitritas, aliuminio chlorido heksahidratas, DCPIP (natrio 2,6–dichlorfenolindofenoliatas), heksametilentetraminas, acetonitrilas (gamintojas „Sigma – Aldrich“, Darmštatas, Vokietija). Tyrimo metu naudotas išgrynintas dejonizuotas vanduo, paruoštas Milli-Q® („Millipore“, Bedfordas, JAV) vandens valymo sistema.
2.3 Naudota aparatūra
Pavasarinių raktažolių lapų ėminiai susmulkinti elektriniu malūnėliu „Retsch GM 200“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija). Vaistinė augalinė žaliava pasveriama elektrinėmis analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius CP64 – 0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Gravimetrinė analizė atlikta panaudojant drėgnomatį „Precisa 310 M“ („Precisa“, Dietikonas, Šveicarija). Raktažolių lapuose esančių fenolinių junginių ekstrakcija pagreitinta panaudojus ultragarso vonelę „Bandelin Sonorex Digital 10 P“ („Sigma – Aldrich“, Darmštatas, Vokietija). Spektrofotometriniai tyrimai atlikti naudojant UV – regimosios šviesos spektrofotometrą „Camspec – model M550“ („Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė). Pavasarinių raktažolių lapų fenolinių junginių kokybinės sudėties analizė atlikta naudojant ultraefektyviosios skysčių chromatografijos chomatografą „Waters ACQUITY UPLC® H-Class“ („Waters“, Milfordas, Masačiusetsas, JAV) su kvadrupoliu tandeminiu masių spektrofotometru „Xevo TQD“ („Waters“, Milfordas, Masačiusetsas, JAV). Junginių skirstymui naudota YMC Triart C18 (100 Ä, 100 × 2,0 mm; dalelių dydis 1,9 µm) kolonėlė („ACT“, Kiotas, Japonija) su prieškolonėle.
2.4 Pavasarinių raktažolių lapų tiriamųjų ėminių paruošimas
Tiriamosios vaistinės augalinės žaliavos paruošimas. Pavasarinių raktažolių lapai atskiriami nuo kitų augalo dalių ir džiovinami kambario temperatūroje (20–25 °C) sausoje, nuo saulės šviesos apsaugotoje vietoje. Sudžiovinti raktažolių lapai sumalami į miltelius panaudojant elektrinį malūnėlį. Ėminiai laikomi sandariai uždarytuose inertiškuose induose tamsioje, sausoje vietoje, kambario temperatūroje.
Tiriamosios vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvio nustatymas. Nuodžiūvis vertinamas pagal Europos farmakopėjoje (Ph. Eur. 2.2.32) nurodytą metodiką [20]. Atsveriamas 1 g susmulkintos žaliavos. Atsverta žaliava drėgnomačiu džiovinama 105 °C temperatūroje 2val., iki kol svoris pasidaro pastovus. Kiekvienos augavietės raktažolių lapų ėminiui atlikti trys drėgmės matavimai ir apskaičiuoti nustatytų nuodžiūvių vidurkiai. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai išdžiovintos žaliavos masei (g) [20].
Tiriamosios vaistinės augalinės žaliavos etanolinių ištraukų paruošimas. Ištraukų gamybai pasirinktas 1:10 susmulkintos žaliavos miltelių ir 50 proc. (v/v) etanolio santykis. 5 g susmulkintos raktažolių lapų žaliavos suberiama į tamsaus stiklo buteliukus ir užpilama 50 ml 50 proc. (v/v) etanoliu. Raktažolių lapų ėminiai ultragarso vonelėje ekstrahuojami 40 min., esant 339 W galiai. Po ekstrakcijos etanolinės ištraukos filtruojamos per filtravimo popierėlį ir iki analizės pradžios laikomos tamsioje, sausoje vietoje, kambario temperatūroje. Prieš atliekant UESC – MS kokybinę ir kiekybinę analizes, pavasarinių raktažolių lapų ėminių etanolinės ištraukos papildomai filtruojamos per 0,22 μm porų dydžio membraninius filtrus į chromatografinius buteliukus.
2.5 Tyrimo metodai
2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Raktažolių lapų ėminių bendram fenolinių junginių kiekio nustatymui taikytas Folin – Ciocalteu metodas, kuris yra greitas, pigus bei turintis gerą pasikartojimą [7]. Kiekybinė junginių analizė atlikta panaudojant UV – regimosios šviesos spektrofotometrą. Rezultatai apibendrinti naudojantis galo rūgšties kalibracine kreive ir perskaičiuoti galo rūgšties ekvivalentu (GRE). Naudota
Rumunijos mokslininkų moksliniame straipsnyje aprašyta bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti pasirinkta metodika [36].
Tiriamojo tirpalo paruošimas. 4 ml etanolinės raktažolių lapų ištraukos praskiedžiama 4 ml 50 proc. (v/v) etanoliu. 0,2 ml praskiestos raktažolių lapų ėminių etanolinės ištraukos sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo [36].
Palyginamasis tirpalas paruošiamas kaip tiriamasis, tačiau nepilama tiriamosios pavasarinių raktažolių lapų ėminių etanolinės ištraukos. 0,2 ml 50 proc. (v/v) etanolio sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo [36]. Visi tiriamieji mėginiai 60 min. laikyti tamsioje, sausoje kambario temperatūros vietoje. Praėjus laikui, UV – regimosios šviesos spektrofotometru, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [36]. Kalibracijos grafikas (y=2,2209x+0,036; R2=0,986) sudarytas naudojant 0,025–0,4 mg/ml koncentracijos etaloninius galo rūgšties tirpalus. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:
𝐶=
x×V𝑚
C – bendras fenolinių junginių kiekis, mg GRE/g;
x – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibracijos grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
2.5.2 Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas
Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio pavasarinių raktažolių lapų ėminiuose nustatymui pasirinkta Prancūzijos mokslininkų moksliniame straipsnyje aprašytame tyrime naudota metodika su Arnow reagentu [22]. Rezultatai apibendrinti remiantis chlorogeno rūgšties kalibracine kreive ir perskaičiuoti chlorogeno rūgšties ekvivalentu (CRE). Prieš tiriamųjų ir palyginamųjų tirpalų paruošimą, etanolinės ėminių ištraukos praskiestos 10 kartų su 50 proc. (v/v) etanoliu.
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml tūrio matavimo kolbutę įpilama 0,1 ml praskiestos raktažolių lapų ėminių etanolinės ištraukos ir ji dar kartą skiedžiama 0,9 ml 50 proc. (v/v) etanoliu. Į gautą tirpalą įpilama 2 ml 0,5 M koncentracijos pagaminto HCl tirpalo, 2 ml Arnow reagento (10 proc. natrio molibdato vandeninio tirpalo sumaišyti su 10 proc. natrio nitrito vandeninio tirpalo santykiu 1:1) ir 2 ml 8,5 proc. NaOH [22]. Turinys kolbutėje praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir tirpalas sumaišomas.
Palyginamasis tirpalas paruošiamas kaip ir tiriamasis tirpalas tik nėra pilamas Arnow reagentas. Į 10 ml tūrio matavimo kolbutę įpilama 0,1 ml etanolinės raktažolių lapų ėminių ištraukos, 0,9 ml 50 proc. (v/v) etanolio, 2 ml 0,5 M koncentracijos pagaminto HCl tirpalo ir 2 ml 8,5 proc. NaOH [22]. Turinys kolbutėje išgrynintu vandeniu praskiedžiamas iki žymės ir tirpalas sumaišomas.
UV – regimosios šviesos spektrofotometru, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [22]. Kalibracijos grafikas (𝑦=0,5349x+0,0767; R2=0,994) sudarytas, naudojant 0,0625−1 mg/ml koncentracijos etaloninius chlorogeno rūgšties tirpalus. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:
𝐶=
x×V𝑚
C – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, mg CRE/g;
x – chlorogeno rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibracijos grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
2.5.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas
Pavasarinių raktažolių lapų etanolinėse ištraukose nustatomas bendras flavonoidų kiekis ir rezultatai perskaičiuojami rutino ekvivalentu (RE). Atliekant tyrimą pasirinkta Brazilijos mokslininkų moksliniame straipsnyje aprašytame tyrime naudota metodika su AlCl3 [53].
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml tūrio matavimo kolbutę pilama 4 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,2 ml 33 proc. ledinės acto rūgšties, 0,6 ml 10 proc. AlCl3 vandeninio tirpalo ir 0,4 ml tiriamosios raktažolių lapų ėminių etanolinės ištraukos. Tirpalas laikomas tamsioje, sausoje kambario temperatūros vietoje 30 min. Praėjus laikui, pilamas 0,8 ml 5 proc. heksametilentetramino vandeninis tirpalas [53]. Turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir tirpalas sumaišomas.
Palyginamasis tirpalas ruošiamas kaip ir tiriamasis tik nepilama AlCl3 tirpalo. Į 10 ml matavimo kolbutę pilama 4 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,2 ml 33 proc. ledinės acto rūgšties ir 0,4 ml tiriamos pavasarinių raktažolių lapų ėminių etanolinės ištraukos [53]. Turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir tirpalas sumaišomas.
Etaloninis rutino tiriamasis tirpalas gaminamas kaip ir etanolinės ištraukos tirpalas tik vietoj raktažolių lapų ėminių ištraukos pilamas etaloninis rutino tirpalas. Į 10 ml tūrio matavimo kolbutę pilama 4 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,2 ml 33 proc. ledinės acto rūgšties, 0,6 ml 10 proc. AlCl3 tirpalo
ir 0,4 ml etaloninio rutino tirpalo. Tirpalas laikomas tamsioje, sausoje kambario temperatūros vietoje 30 min. Praėjus laikui, pilama 0,8 ml 5 proc. heksametilentetramino vandeninio tirpalo [53]. Turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir tirpalas sumaišomas.
Etaloninio rutino palyginamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml matavimo kolbutę pilama 4 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,2 ml 33 proc. ledinės acto rūgšties, 0,4 ml etaloninio rutino tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės [53].
Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,0125 g rutino miltelių tirpinant 50 proc. (v/v) etanolyje 25 ml tūrio matavimo kolbutėje.
Visų tiriamųjų ir palyginamųjų tirpalų absorbcijos dydžiai UV – regimosios šviesos spektrofotometru matuojami esant 407 nm šviesos bangos ilgiui [53]. Flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu, apskaičiuojamas pagal formulę:
X=
𝑚(𝑟𝑢𝑡.)×𝑉×𝐷×100 𝑚×𝐷(𝑟𝑢𝑡.)×25X – bendras flavonoidų kiekis, proc.;
m (rut.) – rutino masė etaloniniam tirpalui pagaminti, g; V – paruoštos ištraukos tūris, ml;
D – tiriamos ištraukos absorbcijos dydis; m – ištraukos žaliavos svėrinio masė, g;
D (rut.) – rutino tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis.
2.5.4 Bendro askorbo rūgšties kiekio nustatymas
Bendro askorbo rūgšties kiekio nustatymui pasirinkta Vokietijos mokslininkų moksliniame straipsnyje aprašytame tyrime naudota metodika su DCPIP reagentu atliekant titravimą [2]. Pagamintose pavasarinių raktažolių augalų lapų ėminių vandeninėse ištraukose nustatytas bendras askorbo rūgšties kiekis perskaičiuotas absoliučiai sausai žaliavai [58].
Pavasarinių raktažolių lapų vandeninės ištraukos paruošimas. Tiksliai atsvėrus 2,5 g sudžiovintų ir susmulkintų raktažolių augalų lapų, svėrinys užpilamas 25 ml išgryninto vandens pamatuojant matavimo cilindru. Tirpalas ekstrahuojamas paliekant tamsioje, sausoje vietoje kambario temperatūroje. Po 10 min. ištrauka nufiltruojama per popierinį filtrą [2]. Žaliava piltuvėlyje perplaunama du kartus po 2 ml išgryninto vandens.
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml tūrio matavimo kolbutę įpilama 0,5 ml HCl 20 g/l pagaminto vandeninio tirpalo, 0,5 ml gautos vandeninės ištraukos ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės bei sumaišoma [2].
Tiriamasis tirpalas titruojamas mikrobiurete, kaip titrantą naudojant DCPIP 0,001 M vandeninį tirpalą, kol atsiras blyškia rožinė spalva, neišnykstanti 10 sek. Titravimas neturi trukti ilgiau kaip 2 min. Askorbo rūgšties kiekis procentais absoliučiai sausai žaliavai apskaičiuojamas pagal formulę:
X=
𝑣×𝐹×0,000088×𝑉1×100×100 𝑚×𝑉2×(100−𝑊)X – bendras askorbo rūgšties kiekis, proc.
V – titravimui sunaudotas DCPIP 0,001 M vandeninio tirpalo kiekis, ml;
F – DCPIP 0,001 M vandeninio tirpalo titro paklaida;
V1 – pavasarinių raktažolių lapų ėminių vandeninės ištraukos tūris, ml;
m – pavasarinių raktažolių lapų žaliavos, paimtos vandeninės ištraukos gamybai, masė, g; V2 – vandeninės ištraukos, paimtos titravimui, tūris, ml;
W – pavasarinių raktažolių žaliavos drėgmės kiekis, proc.
2.5.5 Antioksidantinio aktyvumo in vitro nustatymas
Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS metodu
Naudota Palestinos mokslininkų moksliniame straipsnyje aprašyta etanolinių ištraukų antioksidantinio aktyvumo nustatymo ABTS metodu metodika [3]. Rezultatai perskaičiuoti trolokso ekvivalentu (TE).
2 mmol/l koncentracijos ABTS motininio tirpalo pagaminimas. 0,0548 g ABTS miltelių ištirpinama 50 ml išgryninto vandens. Į gautą tirpalą įdedama 0,0095 g K2S2O8 miltelių. Pagamintas tirpalas laikomas tamsoje 16–24 val., kol vyksta oksidacijos −redukcijos reakcija, kurios metu susidaro ABTS•+ radikalas [3].
Darbinio ABTS tirpalo pagaminimas. Motininis 2 mmol/l koncentracijos ABTS tirpalas yra skiedžiamas išgrynintu vandeniu, kol UV – regimosios šviesos spektrofotometru matuojant 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis, esant 734 nm bangos ilgiui, pasiekia 0,8±0,03 [3].
Tiriamojo tirpalo pagaminimas. 20 μl raktažolių lapų etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio ABTS tirpalo. Paruoštas tirpalas laikomas tamsoje 60 min. 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis UV – VIS spektrofotometru išmatuojamas esant 734 nm šviesos bangos ilgiui [3]. Išgrynintas vanduo naudojamas kaip lyginamasis tirpalas. Kalibracijos grafikas (𝑦=0,00003𝑥−0,04021; R2=0,993) sudarytas, naudojant 500–16000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas DPPH metodu. Naudota Rumunijos mokslininkų moksliniame straipsnyje aprašyta etanolinių ištraukų antioksidantinio aktyvumo nustatymo DPPH metodu metodika [36].
60 μmol/l koncentracijos motininio DPPH tirpalo gamyba. 0,0012 g DPPH miltelių ištirpinama 50 ml 96 proc. (v/v) etanolyje.
Darbinio DPPH tirpalo gamyba. 60 μmol/l motininis DPPH tirpalas yra skiedžiamas 96 proc. (v/v) etanoliu, kol 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis, išmatuotas UV – VIS spektrofotometru, esant 517 nm bangos ilgiui, pasiekia 0,8±0,03 [36].
Tiriamojo tirpalo pagaminimas. 20 μl raktažolių lapų etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Tirpalas laikomas tamsoje 60 min. Esant 517 nm šviesos bangos ilgiui, UV – VISspektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [36]. 96 proc. (v/v) etanolis naudojamas kaip lyginamasis tirpalas [21]. Kalibracijos grafikas (𝑦=0,00002𝑥+0,05255; R2=0,992) sudarytas, naudojant 400–16000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas FRAP metodu. Tyrimo metu naudota Rumunijos mokslininkų moksliniame straipsnyje paskelbta redukcinio aktyvumo nustatymo FRAP metodu metodika [56].
Darbinio tirpalo, sudaryto iš A, B ir C tirpalų santykiu 10:1:1, gamyba. A tirpalo gamyba: 250 ml matavimo kolbutėje atsveriama 0,775 g CH3COONa, įpilama 4 ml 99,8 proc. ledinės acto rūgšties ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. B tirpalo gamyba: 25 ml matavimo kolbutėje esančiame 40 mmol/l koncentracijos HCl parūgštintame išgrynintame vandenyje, ištirpinama 0,0781 g TPTZ miltelių ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. C tirpalo gamyba: 25 ml matavimo kolbutėje atsveriama 0,1352 g FeCl3 × 6H2O ir ištirpinama išgrynintame vandenyje. Tirpalas praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės [56].
Mėginio paruošimas: 20 μl raktažolių lapų etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio FRAP tirpalo. Tirpalas laikomas tamsioje, sausoje, kambario temperatūros vietoje 60 min. Prie 593 nm šviesos bangos ilgio, UV – VIS spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis [56]. Lyginamasis tirpalas – darbinis FRAP tirpalas nepridėjus etanolinės raktažolių lapų ėminių ištraukos [56]. Kalibracijos grafikas (𝑦=0,000033𝑥+0,033382; R2=0,998) sudarytas, naudojant 400–16000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas CUPRAC metodu. Taikyta Rumunijos mokslininkų mokslinėje publikacijoje aprašyta redukcinio aktyvumo nustatymo CUPRAC metodu metodika [56].
Darbinio CUPRAC tirpalo, susidedančio iš A, B ir C tirpalų 1:1:1 santykiu, gamyba. Visi tirpalai gaminami 50 ml matavimo kolbutėse. A tirpalo gamyba: 0,085 g CuCl2 miltelių ištirpinama
išgrynintame vandenyje ir praskiedžiama iki žymės. B tirpalo gamyba: 0,0038 g CH3COONH4 miltelių ištirpinama išgrynintame vandenyje ir praskiedžiama iki žymės. C tirpalo gamyba: 0,078 g neokuproino miltelių ištirpinama 96 proc. (v/v) etanolyje ir praskiedžiama iki žymės [56].
Tiriamojo mėginio paruošimas: 20 μl raktažolių lapų ėminių etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio CUPRAC tirpalo. Mėginys laikomas tamsioje, sausoje, kambario temperatūros vietoje 60 min. Prie 450 nm šviesos bangos ilgio, UV – VIS spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis [56]. Lyginamasis tirpalas – darbinis CUPRAC tirpalas, nepridėjus etanolinės raktažolių lapų ėminių ištraukos [56]. Kalibracijos grafikas (𝑦=0,000034𝑥−0,031833; R2=0,997) sudarytas, naudojant 1000−16000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Antioksidantinio aktyvumo in vitro reikšmių apskaičiavimas. Pavasarinių raktažolių lapų ėminių antioksidantinis aktyvumas apskaičiuotas pagal ABTS, DPPH, FRAP, CUPRAC metodų trolokso kalibracijos grafikus ir rezultatai išreikšti trolokso ekvivalentu (μmol TE/g) absoliučiai sausai žaliavai. Trolokso ekvivalentas atitinka trolokso kiekį (μmol), kuris tokiomis pačiomis tyrimo sąlygomis turi tokį patį antioksidantinį aktyvumą kaip ir 1 g augalinės žaliavos. Tiriamųjų etanolinių ištraukų antioksidantinis aktyvumas in vitro, apskaičiuojamas pagal formulę:
𝑇𝐸 =
𝐴+𝑏𝑎×1000
×
𝑉𝑏𝑎𝑛𝑑. 𝑚𝑏𝑎𝑛𝑑.
TE – trolokso ekvivalentas, μmol TE/g;
A – tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos dydis;
a – nuolydis (angl. slope) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties;
b – nuokrypis (angl. intercept) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties;
Vband. – tiriamosios augalinės žaliavos ėminio ištraukos tūris, ml; mband. – tiriamosios augalinės žaliavos atsvertas kiekis, g.
2.5.6
Fenolinių
junginių
nustatymas
ultraefektyviosios
skysčių
chromatografijos su masių spektrometrija metodu
Fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės analizės metu, panaudota validuota ultraefektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija (UESC – MS) metodika. Šią metodiką savo tyrime naudojo ir moksliniame straipsnyje aprašė Lietuvos ir Ispanijos mokslininkai [12]. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija analizė atlikta su H klasės ultraefektyviosios skysčių chromatografijos sistema „ACQUITY UPLC® H – Class“, sujungta su trigubu kvadrupoliu masių spektrofotometru „Xevo TQD“. Chromatografinis skirstymas atliktas
naudojant YMC Triart C18 analitinę kolonėlę (100 Ä, 1,9 μm 100 × 2,0 mm) kartu su prieškolonėle. Kolonėlė laikoma termostate, kuriame palaikoma pastovi 40 °C temperatūra. Ultraefektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija analizės metu judri fazė sudaryta iš 0,1 proc. (v/v) skruzdžių rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Pradinės eliucijos sąlygos – 95 proc. eliuento A ir 5 proc. eliuento B išlaikomos 1 min. Iki 5 min. kinta iki 70 proc. eliuento A, 7 min kinta iki 50 proc. eliuento A. 7,5–8 min. išlaikoma 0 proc. eliuento A, o vėliau grąžinama į pradines sąlygas. Bendra gradientinės eliucijos trukmė – 10 min. Eliuento tėkmės greitis – 0,5 mL/min-1, injekuojamo pavyzdžio tūris – 1 µL. Masių spektrometro parametrai: neigiama elektropurkštuvinė jonizacija, kapiliaro įtampa – 2500 V, jonų šaltinio temperatūra – 150 °C, eliuento išgarinimo temperatūra – 500 °C, eliuento išgarinimo dujų tėkmės greitis – 800 l/val. Fenolinių junginių smailės analizuojamos MRM režimu. Chromatografinės smailės identifikuotos pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką ir masių spektrometriniu detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių masių spektrus. Kiekybinis analičių įvertinimas atliktas remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale pagal sudarytas žinomų koncentracijų (0,08–1 mg/ml) skirtingų standartinių tirpalų kalibracijos lygtis [12].
2.6 Tyrimo duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Excel 2013“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 20“ („IBM“, JAV). Tyrimo metu atilikti trys kiekvienos pavasarinių raktažolių augavietės ėminių rezultatų pakartojimai ir apskaičiuoti aritmetiniai vidurkiai. Kiekybinės sudėties įvairavimo įvertinimui apskaičiuoti variacijos koeficientai. Taikant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA, įvertinta ar skirtumai tarp lyginamųjų duomenų yra statistiškai reikšmingi (p<0,05). Taikytas daugkartinio palyginimo Tukey‘o HSD (angl. Honestly Significant Difference) kriterijus [56]. Duomenų koreliacijai įvertinti, nustatytas Pirsono koreliacijos koeficientas: |r|<0,3 koreliacinis ryšys laikytas labai silpnu; 0,3<|r|<0,5 silpnu; 0,5<|r|<0,7 vidutinio stiprumo; 0,7<|r|<0,9 stipriu; 0,9<|r|≤1 labai stipriu [15].
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Pavasarinių raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos
sąlygų optimizavimas
Atliekant biologinių junginių tyrimus, būtina atkreipti dėmesį į tiriamųjų junginių ektrakcijos etapą, kuris labai svarbus analizėje. Esant optimalioms ekstrakcijos sąlygoms išskiriama didžiausia augalinėje žaliavoje esanti biologiškai aktyvių junginių dalis. Neužtikrinus tinkamiausių sąlygų, gaunama nepakankama tiriamųjų biologiškai aktyvių junginių išeiga [34].
Mokslinių straipsnių, kuriuose būtų nustatomos pavasarinių raktažolių vaistinės augalinės žaliavos – lapų – fenolinių junginių ekstrakcijos optimalios sąlygos, surasti nepavyko [8]. Literatūros stoka pasunkina tolimesnius pavasarinių raktažolių augalinės vaistinės žaliavos fitocheminius tyrimus, kadangi atliekant augalinėje žaliavoje esančių biologiškai aktyvių junginių vertinimą be optimalių ekstrakcijos sąlygų sumažėja gautų duomenų tikslumas. Problemai išspręsti atlikta potenciali raktažolių lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos optimalių sąlygų analizė.
Optimalių ekstrakcijos sąlygų nustatymui pasirinktas etanolis, kadangi jis saugus ir lengvai gaunamas. Etanolis pasirinktas Rusijos mokslininkų pavasarinių raktažolių lapų etanolinių ekstraktų gamyboje nustatant fenolinius junginius [32, 36].
2 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio, išskirto iš pavasarinių raktažolių lapų, įvairavimas skirtingų ekstrakcijos sąlygų metu; raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro fenolinių junginių kiekio skirtumus, gautus ekstrahuojant raktažolių lapų ėminius skirtingomis ekstrakcijos sąlygomis (p<0,05)
B B A B C C 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 30 proc., 20 min., 678 W 50 proc., 73,64 min., 904 W 50 proc., 40 min., 339 W 50 proc., 40 min., 1130 W 30 proc., 20 min., 1017 W 70 proc., 20 min., 1017 W Be nd ra s fe no li nių ju ng in ių k iek is, m g G RE/g EKSTRAKCIJOS SĄLYGOS
