MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
ALGIRDAS DIRGINČIUS
FENOLINIŲ JUNGINIŲ ĮVERTINIMAS GRIKIŲ ŽALIAVOJE
PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Prof. Vitalis Briedis Data
Fenolinių junginių įvertinimas grikių žaliavoje plonasluoksnės
chromatografijos metodu
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Data Darbo vadovas Data Darbą atliko Magistrantas ALGIRDAS DIRGINČIUS Data 2016-01-28 KAUNAS, 2016
Turinys
Santrumpos... 7
Įvadas ... 8
Darbo tikslas ir uždaviniai ... 9
1. Literatūros apžvalga ... 10
1.1. Sėjamasis grikis ... 10
1.1.1 Augalo morfologinis aprašymas ... 10
1.1.2. Grikio vaistinės augalinės žaliavos paruošimas... 11
1.1.3. Sėjamojo grikio paplitimas ir kultivavimas ... 11
1.1.4. Cheminė sėjamųjų grikių sudėtis ... 12
1.2. Sėjamojo grikio pritaikymas maisto ir farmacijos pramonėje... 14
1.2.1. Veikliosios medžiagos ir jų medicininiai efektai ... 14
1.2.2. Grikiai maisto pramonėje... 15
1.2.3. Grikiai farmacijos pramonėje ... 17
1.3. Fenoliniai junginiai ir jų svarba žmogaus organizmui ... 17
1.3.1. Fenoliniai junginiai, jų klasifikacija ... 17
1.3.2. Fenolinės rūgštys ... 18
1.3.3. Fenolinių rūgščių svarba žmogaus organizmui... 19
1.4. Fenolinių junginių įvertinimo metodai ... 19
1.4.1. Kokybiniam fenolinių junginių nustatymui taikomi analizės metodai ... 19
1.4.2. Kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui taikomi analitiniai metodai ... 20
2. Tyrimo metodika ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Naudoti reagentai... 21
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės... 22
2.4. Tyrimų metodai... 22
2.4.1. Nuodžiūvio nustatymas Fagopyrum esculentum Moench augalinėje žaliavoje... 22
2.4.2. Tiriamojo mėginio paruošimas ... 22
2.4.3. Standartinių tirpalų ruošimas ir kalibracinių kreivių sudarymas ... 23
2.4.4. Fenolinių rūgščių nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 23
2.4.5. Duomenų statistinis įvertinimas... 24
3.3. Fenolinių rūgščių kiekybinis nustatymas, efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos
metodu ... 27 3.4. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimo palyginimas grikių stiebų mėginiuose iš skirtingų
žemdirbystės sistemų... 28 3.5. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas grikių lapų mėginiuose skirtingose žemdirbystės
sistemose... 31 3.7. Klasterinė statistinė analizė grikių lapuose ir stiebuose, skirtingose žemdirbystės sistemose.... 35 4. Išvados... 38 Literatūros sąrašas... 39
Darbo pavadinimas: Fenolinių junginių įvertinimas grikių žaliavoje plonasluoksnės chromatografijos metodu. Algirdo Dirginčiaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Prof. Dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2016.
Darbo tikslas: Nustatyti, kaip kinta skirtingų sėjamųjų grikių veislių lapuose ir stiebuose kaupiamų fenolinių rūgščių kiekis, auginant grikius ekologinėje ir intensyvioje žemdirbystės sistemose.
Darbo uždaviniai:
1. Remiantis moksliniais duomenimis, parinkti tinkamiausią plonasluoksnės chromatografijos metodiką kokybiniam ir kiekybiniam, grikių augalinės žaliavos, tyrimui.
2. Pasirinkta efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodika atlikti fenolinių rūgščių identifikavimą ir nustatyti jų kiekius grikių ėminiuose.
3. Palyginti gautus kiekybinius rezulatus tarp skirtingų veislių grikių stiebų ir lapų.
4. Palyginti gautus kiekybinius rezultatus tarp skirtingose žemdirbystės sistemose augintų grikių veislių.
Tyrimų objektas: Intensyviosios ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis auginti sėjamųjų grikių stiebai ir lapai. Fenolinių rūgščių kokybinės ir kiekybinėsnės sudėties tyrimams panaudoti 'VB Vokiai', 'VB Nojai', 'Kora' ir 'Panda' veislių grikių ėminiai, užauginti 2014 m. Lietuvoje, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filiale.
Tyrimo metodika: Darbo metu pritaikytos efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas. Rezultatai ir išvados: Atlikus skirtingose sistemose augintų keturių skirtingų grikių veislių lapų ir stiebų kiekybinę bei kokybinę analizę efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu, nustatyta, kad kaupiamų fenolinių rūgščių kiekis svyruoja priklausomai nuo augalo veislės bei žemdirbystės sistemos, kurioje buvo augintas. Kokybinės analizės metu buvo identifikuota chlorogeno rūgštis. Išsamiau išanalizavus rezultatus, galima teigti, jog intensyvioje žemdirbystės sistemoje auginami grikių lapai ir stiebai sukaupia didesnius kiekius fenolinių rūgščių. VB Vokiai lyginant su kitomis veislėmis yra didžiausius chlorogeno rūgšties kiekius kaupianti veislė.
Work title : Phenolic compounds assement of buckwheat raw by thin layer chromatography method.Algirdas Dirginčius master‘s thesis/ supervised by Prof. Dr. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analitic and Toxicological chemistry - Kaunas, 2016.
Objective: To analyze the evolution of the different varieties of buckwheat leaves and stems collected phenolic acids, and the cultivation of buckwheat in organic and intensive cropping system.
Objectives:
1. According to scientific data, to select the most suitable for thin-layer chromatography method qualitative and quantitative analysis of the raw buckwheat plant.
2. Selected by thin layer chromatography method to carry out the identification of phenolic acids and determine the quantities of buckwheat in the samples.
3. Compare the quantitative generate results between different varieties of buckwheat stems and leaves.
4. Compare quantitative results between different cropping systems grown buckwheat varieties. Methods: During applied in high-performance thin-layer chromatography techniques.
Results and conclusions: After the different systems for four different cultivated varieties of buckwheat leaves and stems of quantitative and qualitative analysis of high-performance thin-layer chromatography revealed that the collected phenolic acid content varies depending on the plant variety and cropping systems, which have been grown. Qualitative analysis was identified as chlorogenic acid. Detail analysis of the results, it can be said that the intensive agricultural system grown buckwheat leaves and stems accumulate greater quantities of phenolic acids. VB Vokiai compared with other varieties is the highest amounts of chlorogenic acid accumulating strain.
Santrumpos
EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija. AP-1 – aktyvatorius proteinas 1.
HIV-1 – žmogaus imunodeficito virusas, tipas 1. SN – standartinis nuokrypis.
Įvadas
Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench), priklausantis Polygonaceae šeimai, kildinamas iš pietryčių Kinijos ir Himalajų kalnų [1]. Šimtmečiais sėjamasis grikis buvo vertinamas dėl savo maistingųjų savybių. Progresuojant mokslui, nustatyta, kad sėjamasis grikis yra turtingas polifenolinių junginių, vitaminų bei būtinųjų amino rūgščių, dėl to pastaraisiais metais susilaukė nemažai susidomėjimo dėl savo naudingų žmogaus sveikatai savybių, tokių kaip cholesterolį mažinantis poveikis, hipertenzijos reguliavimas, kancerogeninių bei uždegiminių procesų kontrolė, diabeto kontrolė [2].
Pastebėta, kad bioaktyvius junginius sėjamasis grikis kaupia visose augalo dalyse – stiebuose ir lapuose, sėklose ir šaknyse. Bioaktyvių junginių gausa vyrauja priklausomai nuo augalo veislės bei kultyvavimo sąlygų. Daugiausiai susidomėjimo kelia sėjamojo grikio kaupiami fenoliniai junginiai, pasižmintys naudingomis savybėmis sveikatai – antioksidacinis, priešvėžinis, priešuždegiminis poveikis, - bei farmakologinėmis savbėmis – prieštuberkuliozinis, priešmaliarinis, priešvirusinis, antibakterinis poveikis. Tokią naudingų savybių įvairovę lemia fenolinių junginių gebėjimas surišti laisvuosius radikalus [3].
Norint įvertinti sėjamąjį grikį kaip potencialią vaistinę augalinę žaliavą, yra būtina atlikti tiek kokybinius, tiek kiekybinius jo kaupiamų bioaktyvių junginių tyrimus. Lietuvoje, atsižvelgiant į mokslinėje literatūroje pateikiamus duomenis, ne tik nėra nė vieno registruoto augalinio vaistinio preparato, kurio sudėtyje būtų grikis, bet sėjamasis grikis iš viso yra mažai tirtas, todėl yra tikslinga atlikti augalo fitocheminę analizę ir palyginti duomenis tarp kelių skirtingų veislių. Gauti tyrimo rezultatai gali būti reikšmingi ne tik ieškant naujų ir efektyvių vaistinių preparatų, taičiau ir maisto pramonei, siekiant užtikrinti sveiką ir visavertę mitybą, kuri lemia mažesnį sveikatos sutrikimų skaičių. Tyrimui atlikti naudojamas paprastas ir patikimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas (EPC).
Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas
:
Nustatyti, kaip kinta skirtingų sėjamojo grikio veislių lapuose ir stiebuose kaupiamų fenolinių rūgščių kiekis, auginant grikius ekologinėje ir intensyvioje žemdirbystės sistemoje.
Darbo uždaviniai:
1. Remiantis moksliniais duomenimis, parinkti tinkamiausią plonasluoksnės chromatografijos metodiką kokybiniam ir kiekybiniam, grikių augalinės žaliavos, tyrimui.
2. Pasirinkta efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodika atlikti fenolinių rūgščių identifikavimą ir nustatyti jų kiekius grikių ėminiuose.
3. Palyginti gautus kiekybinius rezulatus tarp skirtingų veislių grikių stiebų ir lapų.
4. Palyginti gautus kiekybinius rezultatus tarp skirtingose žemdirbystės sistemose augintų grikių veislių.
1. Literatūros apžvalga
1.1. Sėjamasis grikis
1.1.1 Augalo morfologinis aprašymas
Sėjamasis grikis (Fagopyrum Esculentum Moench) (1 pav.) priklauso rūgtinių (Polygonaceae) šeimai. Tai vienmetis, apie 70 cm aukščio augalas. Šaknis – liemeninė prei šakniastiebio labai šakota. Stiebas – status, rausvas ir žalias, tuščiaviduris, viršuje šakotas. Lapai – ištisiniai, pražanginiai, trikampiai, su strėlišku pagrindu ir plėveline makštimi ties apatinių lapų lapkočio pagrindu, viršutiniai lapai - bekočiai. Žiedai – su rausvu apyžiedžiu, žiedynas – kekės, sudarytos iš 7-9 žiedų, vaisius – tribriaunės sėklos. Perikarpiui būdinga kieta pluoštinė struktūra, glaudžiai apgaubianti sėklos apvalkalėlį, endospermą ir gemalą. Endospermas sudarytas beveik vien iš krakmolo. Žydi birželio mėnesį, prinoksta rugpjūtį. Kaip vaistinė žaliava naudojamos žydinčios viršūnėlės ir žolė [5,10].
1 pav. Sėjamasis grikis [7]
Sėjamojo grikio šaknų sistema yra gana nedidelė, tačiau jų fiziologinis aktyvumas yra reikšmingas augalo raidai – sėjamojo grikio šaknys išskiria skruzdžių, acto, oksalo ir citrinos rūgštis, kurios padeda augalui įsisavinti maistines medžiagas, daugiausiai fosforą, iš sunkiai prieinamų jo formų [10].
1.1.2. Grikio vaistinės augalinės žaliavos paruošimas
Kaip vaistinė augalinė žaliava naudojama grikių žolė (Fagopyri herba). Žaliava surenkama ir ruošiama augalo žydėjimo metu – birželio - rugpjūčio mėnesiais. Nupjautos 35-40 cm žydinčios augalų viršūnės džiovinamos pavėsyje gerai vėdinamoje patalpoje arba džiovyklėje esant 35- 40 °C temperatūrai. Išdžiovinta žaliava vartojimui tinkama 2 metus, jei yra laikoma sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje [22].
1.1.3. Sėjamojo grikio paplitimas ir kultivavimas
Sėjamasis grikis pradėtas kultivuoti pietryčių Azijoje. Vieni šaltiniai teigia, kad tai įvyko apytiksliai 1000 metų prieš Kristų, kiti - apytiksliai 6000 metų prieš Kristų. Iš ten paplito į visą Aziją ir Europą. Šiandien tai yra viena gausiausiai kultivuojamų kultūrų Rusijoje, Ukrainoje, Lenkijoje bei Japonijoje [1,9]. Grikis plačiai naudojamas ne tik maistui, bet ir kaip medicininė žaliava [2]. Per daugybę metų išsivystė daug skirtingų grikių veislių. Mokslininkai (Ohnishi, 1996; Matsuoka, 1996) sudarė filgeninį pagrindinių grikių veislių medį, remdamiesi morfologiniu kladizmu (2 pav.).
2 pav. Filogeninis grikių veislių medis, sudarytas, remiantis morfologiniu kladizmu [4]
Sėjamasis grikis yra viena pirmųjų grikio veislių, kuri plačiai kultivuojama pasaulyje ir šiandien (3 pav.). Veliuonos piliakalnio archeologiniai radiniai rodo, kad Lietuvoje grikiai buvo žinomi jau XIII amžiuje, kiti šaltiniai nurodo, kad grikiai Lietuvoje pradėti auginti tik XVIII amžiuje [6,8]. Lietuvoje kasmet sėjami vis didesni plotai grikių - per pastaruosius dvidešimt metų grikių pasėlių plotai Lietuvo išaugo apytiksliai septynis – aštuonis kartus [8].
3 pav. Pasaulio regionai, kuriuose kultivuojamas grikiai 2013 metų duomenimis (tonomis, pagal spalvos intensyvumą)[23]
Sėjamasis grikis nėra lepus augalas, todėl nesunkiai auga ir ne itin derlinguose dirvožemiuose, prisitaiko prie įvairių klimato sąlygų [8]. Grikio populiarumas auga dėl jo funkcinių charakteristikų, kurių atrandama vis daugiau.
1.1.4. Cheminė sėjamųjų grikių sudėtis
Išsamiausiai išnagrinėtos yra grikio sėklos. Mokslinėje literatūroje informacijos apie kitų augalo dalių cheminę sudėtį yra daug mažiau. Grikio sėklos kaupia daug baltymų, riebalų, skaidulų, sacharidų, vitaminų bei mineralų. Skaidulos turi reikšmingą teigiamą poveikį virškinimo sistemos funkcionavimui, padeda įsisavinti kitas maistingąsias medžiagas. Grikiai nuo seno laikomi vienu pagrindinių cinko, mangano ir vario šaltinių. Grikių sėklose nėra glitimo, todėl jie tinkami celiakija sergantiems asmenims [10,11].
Remiantis nesenais moksliniais duomenimis (Petra Vojtiskova 2014), sėjamasis grikis kaupia gausybę mineralų (Na, K, Ca, Mg, Zn, Cu, Fe, Pb, Cd, Cr), amino rūgščių (Lizinas, Histidinas, Argininas, Glutamo rūgštis, Asparto rūgštis, Treoninas, Serinas, Prolinas, Glicinas, Alaninas, Valinas, Izoleucinas, Leucinas, Metioninas, Tirozinas, Fenilalaninas, Cisteinas), vitaminų – B1, B2, B6.
vaisiai (13,1%)(1 lent.) [10,12].
1 lentelė. Vidutinis baltymų kiekis skirtingose sėjamojo grikio augalo dalyse (vidurkis +/-standartinis nuokrypis proc.)
AUGALO DALIS KAUPIAMŲ BALTYMŲ KIEKIS
Šaknys 5,6 +/- 0,16 Stiebai 6,5 +/- 0,03 Lapai 22,7 +/- 0,26 Žiedai 19,1 +/- 0,10 Luobelės 3,5 +/- 0,05 Vaisiai 13,1 +/- 0,04
Krakmolo kiekis (2 lentelė) skirtingose augalo dalyse žymiai skiriasi. Žieduose krakmolo kiekis nustatytas nebuvo, kadangi pavyzdžių kiekis buvo per mažas (grikio žiedai yra labai mažo svorio).
2 lentelė. Vidutinis krakmolo kiekis skirtingose sėjamojo grikio augalo dalyse (vidurkis +/-standartinis nuokrypis proc.)
AUGALO DALIS KAUPIAMO KRAKMOLO KIEKIS
Šaknys 0 Stiebai 1,1 +- 0,00 Lapai 6,0 +/- 0,00 Žiedai -Luobelės 57,2 +/- 0,18 Vaisiai 69,5 +/- 0,00
3 letelėje nurodomas kaupiamų riebalų kiekis skirtingose sėjamojo grikio augalo dalyse – daugiausiai riebalų kaupia žiedai ir šaknys (5,7% ir 4,3% atitinkamai), mažiausiai – luobelės (0,6%) [10].
3 lentelė. Vidutinis riebalų kiekis skirtingose sėjamojo grikio augalo dalyse (vidurkis +/-standartinis nuokrypis proc.)
AUGALO DALIS KAUPIAMŲ RIEBALŲ KIEKIS
Šaknys 4,3 +/- 0,01
Stiebai 2,6 +/- 0,01
Lapai 3,1 +/- 0,01
Luobelės 0,6 +/- 0,01
Vaisiai 3,4 +/- 0,03
Didžiausi rutino kiekiai yra kaupiami augalo lapuose ir žieduose (69,9mg ir 83,6mg atitinkamai), mažiausi – augalo vaisiuose (0,1mg) (4 lentelė)[10]. Grikis kaupia ir kitų flavonoidų, tokių kaip orientinas, viteksinas, kvercetinas, izoviteksinas ir izoorientinas [13].
4 lentelė. Vidutinis rutino kiekis skirtingose sėjamojo grikio augalo dalyse (mg/g)
AUGALO DALIS KAUPIAMO RUTINO KIEKIS
Šaknys 3,6 Stiebai 0,5 Lapai 69,9 Žiedai 83,6 Luobelės 0,1 Vaisiai 0,1
Mokslinėje literatūroje (Oksana Sytar, 2015) nurodytos sėjamojo grikio kaupiamos fenolinės rūgštys bei jų kiekiai (5 lentelė). Daugiausiai sėjamasis grikis kaupia p-anyžių, vanilino bei salicilo rūgščių (744,5 + 100,1, 221,1 +42,0, 11,7 + 0,2, atitinkamai), kiek mažiau p-kumaro, trans-ferulo bei metoksi-cinamono rūgščių (28,3 + 2,6, 31,7 + 1,4, 74,7 + 24, atitinkamai), visai nedaug chlorogeno ir ferulo rūgščių (3,1 + 1,1, 5,6 + 1,1, atitinkamai) [2].
5 lentelė. Vidutinis skirtingų fenolinių rūgščių kiekis sėjamojo grikio mėginiuose (mg 100g-1 sausos žaliavos svorio) p-Anyžių rūgštis 744,5 + 100,1 Vanilino rūgštis 221,1 + 42,0 Salicilo rūgštis 114,7 + 0,2 Metoksi-Cinamono rūgštis 74,7 + 24 Trans-Ferulo rūgšis 31,7 + 1,4 p-Kumaro rūgštis 28,3 + 2,6 Ferulo rūgštis 5,6 + 1,1 Chlorogeno rūgštis 3,1 + 1,1
1.2. Sėjamojo grikio pritaikymas maisto ir farmacijos pramonėje
1.2.1. Veikliosios medžiagos ir jų medicininiai efektai
Pastaraisiais metais grikiai ir jų produktai susilaukia vis daugiau dėmesio. Taip yra todėl, kad gaunama vis daugiau mokslinių duomenų apie vertingąsias grikių savybes – ne tik kaip maisto produkto, bet ir kaip vaistinės žaliavos. Vartojant grikius maistui, vertingosios jų savbės ir teigiamas poveikis sveikatos būklei pasireiškia dėl grikiuose esančių baltymų ir daugybės kitų retų komponentų, pasižyminčių gydomosiomis savybėmis. Labiausiai vertinami naudingieji grikių komponentai yra flavonai, flavonoidai, fitosteroliai, fagopirinai ir tiaminą prisijungiantys baltymai, randami pačiose grikių sėklelėse [13].
1986-aisiais metais buvo tirtas biologinis ir farmakologinis augalinių flavonoidų, tarp jų grikio kaupiamų flavonoidų, poveikis žmonėms bei eksperimentiniams gyvūnėliams. Nustayta, kad tokie biologiniai efektai kaip priešvėžinis, antimutageninis, stabdantis senėjimą efektas atsiranda būtent dėl antioksidacinio poveikio, kurį generuoja antioksidaciniai fermentai ir nefermentiniai antioksidantai [13,14]. Tais pačiais metais buvo nustatyti medicinai reikšmingi augalinių flavonoidų sukeliami efektai – cholesterolio kiekį kraujyje mažinantis poveikis, gebėjimas palaikyti tiek smulkiųjų kapiliarų, tiek arterijų sienelių elastingumą. Maža to, augaliniai flavonoidai yra puiki prevencinė priemonė prieš aukštą kraujospūdį bei kitas širdies ir kraujagyslių ligas [14].
1996-aisiais metais mokslininkai Oomah ir Mazza pasiūlė atkreipti dėmesį į grikių kaupiamus flavonoidus ir jų antioksidacinį poveikį ir įvertinti šių savybių potencialią naudą bei pritaikomumą farmacijos srityje [13,15].
Kaip minėta anksčiau, sėjamasis grikis kaupia šešis skirtingus flavonoidus – rutiną, orientiną, viteksiną, kvercetiną, izoviteksiną, izoorientiną. Pačiuose grikio vaisiuose kaupiasi tik rutinas ir viteksinas, o rutinas sudaro daugiau nei pusę viso bendro flavonoidų kiekio vaisiuose [16]. Rutinas mažina kraujagyslių trapumą, pralaiumą, pasižymi antioksidaciniu poveikiu, užkerta kelią edemų atsiradimui [13,17,18,19].
Fenoliniai junginiai, gauti iš grikių luobelių, prisijungia laisvuosius radikalus, kas yra labai svarbu, siekiant sumažint laisvųjų radikalų keliamą pavojų ir žalą riebalų peroksidacijos proceso metu. Riebalų peroksidacjos procesas atleka svarbų vaidmenį besivystant kai kurioms ligoms, taip pat – maisto irimo procese. 2002-ųjų metų duomenimis, grikio kaupiami 3-flavanoliai, rutinas ir fenolinės rūgštys pasižymi stipresniu antioksidaciniu poveikiu už avižų ir miežių kaupiamų komponentų poveikį [13,20,21,22].
Mokslininkai ir toliau pateikia vis naujų duomenų apie teigiamą grikių ir jų veikliųjų medžiagų poveikį sveikatai (širdies ir kraujagyslių ligos, cukraus kiekio kraujyje kontrolė etc.), todėl nenuostabu, kad išauginamų grikių kiekis pasaulyje per pastaruosius kelis metus kilo. Jungtinių tautų maisto ir agrikultūros organizacijos duomenimis, Europoje išauginamų grikių kiekis 2010-aisiais metais siekė 750 000 tonų, o 2013-aisiais jau 1 250 000 tonų (4pav.).
4 pav. Išaugiamų grikių kiekis Europoje 2010 – 2013 metais tonomis (k - tūkstančiai) [24]
Lietuvoje, palyginimui, išauginamų grikių kiekis tonomis nuo 2010-ųjų metų iki 2013-ųjų metų maždaug dvigubai – nuo 14 000 tonų iki 28 300 tonų (5 pav.).
5 pav. Išauginamų grikių kiekis Lietuvoje 2010 – 2013 metais tonomis (k – tūkstančiai) [24]
Grikiai taip pat nemažai dėmesio susilaukė tarp celiakija sergančų pacientų, kadangi grikiuose nėra glitimo. Celiakija, arba kitaip - gliuteninė enteropatija - yra lėtinė plonosios žarnos liga, kuriai būdingas kviečių baltymo gliuteno arba į jį panašių miežių ir rugių baltymų lemiamas gleivinės pažeidimas bei sutrikęs maisto medžiagų įsisavinimas genetinį polinkį turintiems žmonėms [25].
Lietuvoje vaikams iki 18 metų miltai be glitimo netgi yra kompensuojami. Šiomis dienomis grikių miltai beveik gali pakeisti kvietinius, iš jų taip pat gaminami įvairūs kepiniai, makaronai, kiti maisto produktai. Grikiais netgi kemšamos pagalvės.
1.2.3. Grikiai farmacijos pramonėje
Lietuvoje ir visame pasaulyje yra gausu papildų, kurių sudėtyje kaip pagrindinis ar pagalbinis komponentas yra rutinas. Lietuvoje, jau kuris laikas nėra registruota vaistinių preparatų, kurių gamybai, kaip vaistinė augalinė žaliava, būtų naudojamas grikis. Didžiojoje Britanijoje, Prancūzijoje ir kitose Europos šalyse yra gaminami ir vartojami homeopatiniai grikių preparatai. Nors atlikta daug mokslinių tyrimų, kurie įrodo grikių kaupiamų komponentų, ypač rutino, naudą tiek cukraus kiekio kraujyje reguliavimui, tiek širdies ir kraujagyslių sistemoms, tiek imuniteto stiprinimui, tačiau Lietuvos rinkoje esančių papildų su rutinu aprašymuose nėra nurodoma rutino nauda organizmui ar konkreti jo paskirtis. Todėl naujų grikių preparatų kūrimas ir naudos populiarinimas būtų aktualus.
1.3. Fenoliniai junginiai ir jų svarba žmogaus organizmui
1.3.1. Fenoliniai junginiai, jų klasifikacija
Fenoliniai junginiai yra natūralūs antriniai metabolitai, gaunami šikimate/fenilpropanoidų metalboliniu keliu arba acetato/malonato metaboliniu keliu. Antruoju keliu gaunami ir monomeriniai fenoliniai junginiai, ir polifenoliai. Fenoliniai junginiai, ypač polifenoliai, augalo gyvavimo metu atlieka daug reikšmingų fiziologinių funkcijų. Aukštesnieji augalai gamina kelis tūkstančius fenolinių junginių, žinomų mokslininkams. Augalų gebėjimas sintetinti fenolinius junginius, vystėsi evoliucijos metu, kaip priemonė, skirta prisitaikyti prie kintančių aplinkos sąlygų – fenoliniai junginiai laikomi pagrindinėmis gynybinėmis priemonėmis prieš nepalankius aplinkos faktorius. Apytiksliai yra užregistruota apie 300 000 aukštesniųjų mūsų planetos augalų. Visi šie augalai gamina milžiniškus kiekius skirtingų cheminių medžiagų. Yra identifikuota daugiau nei 200 000 tokių medžiagų, jos yra skirstomos į pirminius ir antrinius metabolitus. Pirminiai metabolitais laikomi įvairūs cukrūs, nukleorūgštys, riebiosios rūgštys, amino rūgštys ir kitos medžiagos, gyvybiškai svarios augalo gyvavimui. Antriniai metabolitai labai įvairūs savo chemine struktūra. Jie nėra gyvybiškai svarbūs tokiems procesams, kaip, pavyzdžiui, fotosintezė, tačiau yra atsakingi už augalo išgyvenimą aplinkoje. Fenoliniai junginiai yra labiausiai paplitę antriniai metabolitai [27, 28, 29].
Fenoliniai junginiai yra cheminiai junginiai, kurie savo struktūroje turi vieną ar daugiau (polifenoliai) fenilo žiedą bei prie jo prisijungusią vieną ar daugiau hidroksi grupę. Fenoliniai junginiai skirstomis į keletą atskirų grupių, remiantis jų struktūriniu pagrindu (6 lentelė) [27].
6 lentelė. Fenolinių junginių klasifikacija, remiantis jų struktūriniu pagrindu [27]
C6 Paprastieji fenoliai, benzochinonai
C6- C1 Fenolinės rūgštys
C6- C2 Acetofenonai, fenilacto rūgštys
C6- C3 Hidroksicinamo rūgštys, kumarinai,
fenilpropanai, chromonai
C6- C4 Naftichinonai
C6– C1- C6 Ksantonai
C6– C2- C6 Stilbenai, antrachinonai
C6– C3– C6 Flavonoidai, izoflavonoidai, neoflavonoidai (C6– C3– C6)2,3 Biflavonoidai, triflavonoidai
(C6- C3)2 Lignanai, neolignanai
(C6- C3)n Ligninai
(C6)n Katecholmelaninai
(C6– C3- C6)n Kondensuoti taninai
Augalai fenolinius junginius naudoja kaip pagrindinę gynybinę priemonę prieš nepalankias aplinkos sąlygas (tiek biotines, tiek abiotines), tokias kaip stipri šviesa, žema temperatūra, patogeninė infekcija, žoliaėdžiai, maisto medžiagų trūkumas. Mokslinių tyrimų duomenimis, augalai į tokius streso faktorius atsako didindami savo galimybes prisijungti laisvuosius radikalus. Antrinio metabolizmo aktyvinimo procese, atsako į stresą metu, dažnai dalyvauja tokios molekulės kaip salicilo rūgštis, jasmono rūgštis bei jų dariniai [27,30,31].
1.3.2. Fenolinės rūgštys
Dažniausiai pasitaikančios ir geriausiai žinomos fenolinės rūgštys yra galo, p-hidroksibenzoinė, protokatechino rūgštis, vanilino bei siringo rūgštis. Paprastai fenolinės rūgštys aptinkamos tirpiuose junginiuose, sudarytuose joms prisijungiant įvairius cukrus arba organines rūgštis, taip pat yra kaip komponentas tokiuose kompleksiniuose junginiuose kaip ligninai ir vandenyje tirpūs taninai. Javuose randamos fenolinės rūgštys gali būti tiek laisvos, tiek prijungtos. Hidroksibenzoinės rūgšties glikozidai
randami kai kuriose žolelėse ir prieskoniuose, augaluose randama ir fenolinių rūgščių aldehidų (salicilaldehidas, p-hidroksibenzaldehidas, p-anyžių aldehidas p-proktokatecholaldehidas). Vanilino aldehidas, dažniausiai siejamas su vanilės lazdelėmis, ištiesų yra labai paplitęs ir kituose augaluose[27,32,33].
1.3.3. Fenolinių rūgščių svarba žmogaus organizmui
Šiuolaikinėje mokslinėje literatūroje galima rasti nemažai duomenų, patvirtinančių maisto, turtingo vaisių ir daržovių, vartojimo sąsają su žmogaus sveikata ir ligų prevencija. Tokios tendencijos gyvavimas paremtas faktu, kad augalai kaupia daug antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų. Būtent oksidacijos procesai dalyvauja širdies lygų vystymosi procese, didina miokardo infarkto riziką bei vėžio riziką. Tam tikri augalinės kilmės produktai dėl minėtų naudingųjų savybių yra priskiriami funkcinio maisto kategorijai [34,35,36,37,38,39]. Funkcinis maistas gali būti apibrėžtas kaip maistas, kuris pasižymi didesne verte nei tiesiog maisto produktas. Du trečdalius fenolinių junginių, esančių augalinės kilmės maisto produktuose, sudaro flavonoidai, likusį trečdalį – fenolinės rūgštys [34,40].
Fenolinės rūgštys pasižymi ne tik antioksidaciniu veikimu, bet ir kitokio pobūdžio biologiniu aktyvumu. Pavyzdžiui, kofeino rūgštis selektyviai blokuoja leukotrienų biosintezę (leukotrienai dalyvauja imunoreguliaciniuose sutrikimuose, astmos, alerginėse reakcijose) [34,41]. Kiti moksliniai tyrimai nurodo, kad kofeino rūgštis ir kai kurie jos esteriai gali turėti priešvėžinį aktyvumą [34,42,43]. Kituose mokslinės literatūros šaltiniuose nurodoma, kad kai kurios fenolinės rūgštys dalyvauja aktyvatoriaus proteino 1 (AP-1) transkripcinio aktyvumo slopinime. AP-1 yra aktyvatorius, dalyvaujantis uždegimo kontrolės procese, ląstelių diferenciacijoje ir poliferacijoje [34,44]. Kofeino rūgšties dariniai pademonstravo stiprų ir selektyvų slopinantį poveikį prieš 1 tipo žmogaus imunodeficito viruso (HIV-1) integrazę. Šis fermentas katalizuoja viruso DNR integraciją į organizmo šeimininko chromatiną [34,45]. Tokios ir panašios studijos, atgaivino susidomėjimą fenolinėmis rūgštimis bei paskatino vystyti bei tobulinti metodikas joms analizuoti.
1.4. Fenolinių junginių įvertinimo metodai
1.4.1. Kokybiniam fenolinių junginių nustatymui taikomi analizės metodai
Kokybiniam fenolinių junginių identifikavimui įvairiose augalinėse žaliavose naudojami pažangūs analizės metodai, tokie kaip branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, plonasluoksnė
chromatografija, efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, IR spektroskopija, UV spektroskopija, dujų chromatografija [46]. Šių metodų dėka, kokybiniai tyrimai atliekami greitai, tiksliai ir efektyviai.
1.4.2. Kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui taikomi analitiniai metodai
Kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui augalinėse žaliavose naudojami plonasluoksnės ar efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodai, dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija. Plonasluoksnė chromatografija yra nuo 1960-ųjų naudojamas analizės metodas fenolinių rūgščių nustatymui natūraliuose produktuose. Plonasluoksnė chromatografija naudojama junginių atskyrimui, identifikavimui, jų valymui po ekstrakcijos. Plonasluoksnė chromatografija yra sąlyginai pigus, paprastas, selektyvus, tikslus, bei plačiai pritaikomas metodas. Šis metodas naudojamas nustatyti nelakiems junginiams. Nudojant plonasluoksnės chromatografijos metodą, nereikia jokios brangios įrangos, galima tirpiklių sistemų bei sorbentų įvairovė, nesunaikinama tiriama medžiaga [47]. Pastaruoju metu populiarėja efektyvioji plonasluoksnė chromatografija – ji greitesnė, efektyvesnė, sunaudojama mažiau tirpiklių.
2. Tyrimo metodika
2.1. Tyrimo objektas
Tiriamos skirtingos sėjamųjų grikių veislės - VB Vokiai, VB Nojai, Kora, Panda. Tiriamos skirtingos augalo dalys - lapai ir stiebai. Tyrimai atlikti su skirtingose žemdirbystės sistemose užaugintomis augalinėmis grikių žaliavomis (ekologinė ir intensyvi auginimo sistemos). Žaliavos buvo užaugintos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialo eksperimentiniuose laukuose. Tyrimui rinktos 2014 m. sezono žaliavos, kurios buvo surinktos 2014-07-13 (lapai, stiebai), žydėjimo laikotarpiu. Žaliavos džiovintos vėdinamoje patalpoje esant ne aukštesnei nei 50 °C temperatūrai. Augalai nebuvo tręšiami nei organinėmis, nei mineralinėmis trąšomis. Augalų apsaugos priemonės nenaudojamos.
2.2. Naudoti reagentai
Sėjamųjų grikių lapuose ir stiebuose esančių fenolinių junginių analizei buvo naudojami analitinio švarumo reagentai:
Skruzdžių (98-100%) rūgštis (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Vokietija); Acto rūgštis (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Etilacetatas (Sigma-Aldrich, Toluca, Meksika);
Metanolis (>99,9%, Sigma-Aldrich, Seelze, Vokietija);
Tirpiklių sistemoje naudojamas vanduo buvo pagamintas naudojant „Milipore“ (JAV) vandens gryninimo sistemą;
Analizėje naudojami Chlorogeno rūgštis (~95,3 proc.; HWI ANALYTIK GMBH; Schnelldorf ,Vokietija), Neochlorgeno rūgštis (>95 proc.; Ekstrasynthese; Geny, Prancūzija) ir Ferulo (≥99.0 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija), Kumaro rūgštis (≥98 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija);
Standartai gauti iš HWI ANALYTIK GMBH (Schnelldorf ,Vokietija);
2-aminoetildifenilborinatas (≥97%), gautas iš Fluka analytical (Schnelldorf, Vokietija); Polietileno glikolis 400 (Fluka BioChemika, Bornem, Belgija);
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės
Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija); Elektrinis malūnas (Retsch 200, Haan, Vokietija);
Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);
Q-Max membraninis filtras (25 mm diametro, 0,45 µm dydžio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija);
Mikrošvirkštas (100 µl; Camag Linomat Syringe, Muttenz, Šveicarija); Termostatinė ultragarsinė vonelė (Heidolph, Schwabach, Vokietija);
10 cm aukščio ir 10 cm pločio stiklo plokštelės (silikagelis 60F254; Merck, Vokietija); Stiklinė, dvivietė, plonasluoksnės chromatografijos kamera su metaliniu dangčiu (Camag, Muttenz, Šveicarija);
Pusiau automatinis mėginių ėmiklis Camag Linomat 5(Camag, Muttenz, Šveicarija); Plonasluoksnės chromatografijos vizualizatorius (Camag, Muttenz, Šveicarija).
2.4. Tyrimų metodai
2.4.1. Nuodžiūvio nustatymas Fagopyrum esculentum Moench augalinėje žaliavoje
Nuodžiūvis vertintas naudojant Kern DBS 60-3 (Balingenas, Vokietija) drėgmės analizatorių. Atsveriamas 1g susmulkintos žaliavos, kaitinama 120°C temperatūroje iki pastovios masės. Visos žaliavos atitiko Europos farmakopėjos 01/2008:2184 straipsnyje minimas ribas, nes tiriamoje augalinėje žaliavoje drėgmės kiekis buvo <10 proc.2.4.2. Tiriamojo mėginio paruošimas
mokslinėje literatūroje pateikta metodika. Išdžiovinta lapų ir stiabų augalinė žaliava susmulkinta elektriniu malūnėliu IKA A11 basic (Vokietija). Tiriamojo mėginio sveriama 0,1g žaliavos, užpilama 10 ml 60 proc. etanoliu, ir laikoma 15 min ultragarso vonelėje, esant 45 oC temperatūrai. Po to centrifūguojama 10 min. Gautas tirpalas nupilamas į 20 ml, kolbutę ir ta pati procedūra kartojama dar du kartus užpilant po 5 ml ekstrahento. Gautas ekstraktas praskiedžiamas iki tikslaus tūrio ekstrahentu, filtruojama per membraninius filtrus, gautas ekstraktas naudojamas plonasluoksnės chromatografijos tyrimams atlikti.
2.4.3. Standartinių tirpalų ruošimas ir kalibracinių kreivių sudarymas
Tyrimams naudoti chlorogeno, neochlorogeno, ferulo ir kumaro rūgščių tirpalai. Standartiniai tirpalai buvo gaminami 70 proc. etanolyje iš chromatografinio švarumo standartinių medžiagų. Kiekvienos standartinės medžiagos sverta po 10 mg ir tirpinta etanolio ir vandens mišinyje, 10 ml kolbutėje. Pradinės tiriamųjų tirpalų koncentracijos buvo 1mg/ml. Šie tirpalai naudoti kokybinei plonasluoksnei analizei atlikti.
Iš chlorogeno rūgšties standarto skiedimo principu paruošti skirtingų koncentracijų etaloniniai tirpalai. Skiedimai atlikti imant pradinio tirpalo 1ml ir skiedžiant jį 1ml 70 proc. etanolio, iš paruoštos koncentracijos nuimamas 1ml, pernešamas į kitą stiklinėlę ir vėl užpilama etanoliu, taip kartojama tol, kol koncentracija pasiekia 0,0078mg/ml. Kalibracinei kreivei sudaryti pagaminti 5 standartiniai tirpalai.
Chlorogeno rūgšties koncentracijos ribos 0,25 – 0,0078 mg/ml.
2.4.4. Fenolinių rūgščių nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos
metodu
Pagaminti etaloniniai chlorogeno, neochlorogeno, ferulo ir kumaro rūgščių tirpalai ir tiriamieji sėjamojo grikio ekstraktų mėginiai užnešti ant silikageliu dengtos aukšto efektyvumo chromatografinės plokštelės, naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją Camag Linomat 5 (užnešama brūkšnio pavidalo dėmė) su 100µl tūrio mikrošvirktu. Paruošta plokštelė perkeliama į chromatografavimo kamerą, kuri užpildoma eliuentų sistemos mišiniu, sudarytu iš skruzdžių rūgšties, acto rūgšties, vandens ir etilacetato (7,5:7,5:17,5:67,5V/V/V/V). Į chromatografavimo kamerą kartu įdėta ir filtrinio popieriaus, siekiant užtikrinti tolygų garų pasiskirstymą joje. Tirpikliui pakilus 7cm nuo mėginių užnešimo linijos (2,5cm nuo plokštelės apačios), plokštelė ištraukiama ir džiovinama ant Camag kaitlentės 100-105oC temperatūroje. Išdžiovinta chromatografinė plokštelė apipurškiama 10g/l
2-aminoetildifenilborinato tirpalu metanolyje. Plokštelė nudžiovinama ir tada apipurškiama 50g/l polietileno glikolio (PEG) 4000 tirpalu metanolyje. Pastarasis reagentas naudojamas tam, kad stabilizuotų šviesos emisiją ir sustiprintų dėmių fluorescenciją [48]. Plokštelės nudžiovinamos traukos spintoje, pernešamos į Camag vizualizacijos sistemą ir apšvitinamos 366 nm bangos ilgio UV šviesa, apšvitinta plokštelė nufotografuojama. WinCats programinės įrangos pagalba nustatomos Rf reikšmės.
Kiekybiniam biologiškai aktyvių junginių nustatymui naudotas Camag vizualizatorius kartu su WinCats programa, apdorojančią duomenis ir VideoScan programa, leidžiančią atlikti kiekybinę chromatogramų analizę.
2.4.5. Duomenų statistinis įvertinimas
Tyrimų duomenys apdoroti pasitelkus Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV), „IBM SPSS statistics 20“ (IBM, JAV) statistines duomenų programas, bei Camag WinCats programiniais paketais. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN). Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas taikant vienfaktorinę dispersinę analizę – ANOVA. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas jei p < 0,05.
3. Rezultatai ir jų aptarimas
3.1. Drėgmės kiekio įvertinimas
Nuodžiūvis – tai vienas iš žaliavos rodiklių nusakančių jos kokybę. Sėjamojo grikio lapų ir stiebų, ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sistemų, ėminių vidutinė nuodžiūvio reikšmės pavaizduotos 7 ir 8 lentelėse.
7 lentelė. Skirtingų grikių veislių nuodžiūvio reikšmės ekologinės žemdirbystės sistemoje (proc.) Nuodžiūvis (proc.) ekologinės žemdirbystės sistemoje
Augalo
dalys VB Vokiai VB NojaiAugalo veislėKora Panda
Lapai 7,81 ± 0,1 7,49 ± 0,1 9,02 ± 0,1 8,07 ± 0,1
Stiebai 8,62 ± 0,1 8,66 ± 0,1 8,80 ± 0,1 8,71 ± 0,1
8 lentelė. Skirtingų grikių veislių nuodžiūvio reikšmės intensyvios žemdirbystės sistemoje (proc.) Nuodžiūvis (proc.) intensyvios žemdirbystės sistemoje
Augalo dalys
Augalo veislė
VB Vokiai VB Nojai Kora Panda
Lapai 7,80 ± 0,1 8,28 ± 0,1 7,65 ± 0,1 7,67 ± 0,1
Stiebai 9,48 ± 0,1 8,84 ± 0,1 8,98 ± 0,1 9,24 ± 0,1
Pagal Europos farmakopėjos 01/2008:2184 straipsnyje pateiktus duomenis grikių augalinės žaliavoje drėgmės kiekis neturėtų viršyti leistinos ribos, kuri yra <10 proc. Atlikus lapų ir stiebų nuodžiūvio matavimus nustatyta, kad visos augalinės žaliavos atitinka, joms keliamus reikalavimus, o drėgmės kiekis svyruoja nuo 7,49 iki 9,48 procentų. Nuodžiūvio matavimai atlikti, kartojant bandymą tris kartus. Apibendrinant gautus tyrimų rezultatus galima teigti, jog augalinė žaliava yra tinkama naudojimui tolimesnių eksperimentinių tyrimų metu.
chromatografijos metodu
Atlikus išsamią mokslinės literatūros šaltinių analizę, pirminiam fenolinių rūgščių identifikavimui pasirinkta efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas, aprašytas moksliniame staripsnyje, kuriame buvo analizuota grikių augalinė žaliava [49]. Tačiau ši metodika reikalavo didelių kiekių eliuentų: skruzdžių rūgšties, acto rūgšties, vandens ir etilacetato (11:11:27:100V/V/V/V). Dėl šios priežasties buvo ieškoma metodikos, kuri reikalautų mažesnių tirpiklių kiekių, būtų paprastesnės sudėties, siekiant sumažinti sunaudojamus analizei kaštus. Analizuojant literatūros šaltinius, buvo rasta alternatyvi farmakopėjinė metodika, kuri buvo tinkama fenolinių junginių identifikavimui (Europos farmakopėjos 01/2008:1828) ir naudojami tie patys reagentai tirpiklių sistemai, tik skirtumas buvo jų procentinėje sudėtyje. Ši metodika buvo panaudota atliekant EPC, siekiant išsiaiškinti ar bus pasiektas tas pats junginių išskirstymas ir metodikos efektyvumas. Gauti teigiami tyrimų rezultatai leido mums padaryti atitinkamas išvadas ir tolimesniuose tyrimuose buvo naudojamas EPC metodas.
Tyrimams buvo naudotos trys fenolinių rūgščių standartinės medžiagos (chlorogeno r., neochlorogenas, ferulo r.), kurie pasak mokslinių literatūros šaltinių yra identifikuojami grikių veislių augalinėse žaliavose ir etanoliniai grikių ekstraktai, pagaminti tirpalai užnešami ant chromatografinių plokštelių po 2 µl, pusiau automatiniu mėginių užnešėju Camag Linomat 5. Chromatografinė plokštelė pernešama į chromatografinę kamerą, į kuria buvo iš anksto supilta eliuentų sistema, sudaryta iš skruzdžių rūgšties, acto rūgšties, vandens ir etilacetato (7,5:7,5:17,5:67,5V/V/V/V). Tirpikliui pakylus 7cm nuo mėginių užnešimo linijos (2,5cm), plokštelė ištraukiama ir perkeliama ant Camag kaitlentės (100-105 oC temperatūra). Laikoma 5 minutes. Išdžiovinta plokštelė ryškinama užpurškiant 10 g/l 2-aminoetildifenilborinato tirpalą metanolyje, po to 50 g/l polietileno glikolio (PEG) 4000 tirpalą metanolyje. Plokštelė nudžiovinama traukos spintoje ir pernešama į Camag vizualizacijos sistemą, apšvitinama 366 nm bangos ilgio UV šviesa ir nufotografuojama. Atlikus kokybinę analizę iš tirtų standartinių junginių, identifikuojama chlorogeno rūgštis, kuri nustatyta visuose analizuotuose grikių lapų ir stiebų ėminiuose, kitos fenolinės rūgštys nenustatytos. Chlorogeno standarto Rf reikšmė sulyginta su ekstraktuose nustatyto chlorogeno rūgšties Rf reikšmėmis. Tyrimai buvo kartoti tris
kartus, chlorogeno rūgšties Rf (0.39±0.02). Paveikslėlyje pateikiama chromatograma, kurioje
pateikiamas lapų ir stiebų mėginių pavyzdys (VB Vokiai-361,376, VB Nojai-362,377, Kora-363,378,
6 pav. Chlorogeno rūgšties chromatografinė plokštelė, (361-364) lapų ėminiai, (376-379), stiebų ėminiai
Apibendrinant kokybinius analitinių tyrimų rezultatus, gautus EPC metodu, buvo identifikuota chlorogeno rugštis visuose tiriamuosiuose ekstraktuose. Tolimesni kiekybiniai tyrimai atlikti su tais pačiais etanoliniais ekstraktais, kiekybiškai vertinant chlorogeno rūgštį.
3.3. Fenolinių rūgščių kiekybinis nustatymas, efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos metodu
Kiekybinis nustatymas atliekamas su skirtingose žemdirbystės sistemose augintais grikių lapų ir stiebų ėminiais. EPC tyrimai atliekami identiškai, kaip ir prieš tai aprašytoje metodikoje. Pirmiausiai buvo pagamintas standartinis tirpalas iš chlorgeno rūgšties (~95,3 proc.; HWI ANALYTIK GMBH; Schnelldorf ,Vokietija) standartinių miltelių. Atsverta 2,5mg standarto ir perkelta į 10ml tikslaus tūrio kolbą, užpilama 70 proc. etanolio ir vandens mišiniu, 5 min. patalpinama į ultragarso vonelę. Ištirpintas standartas praskiedžiamas iki reikiamo tūrio, iš gauto standartinio tirpalo (0,25mg/ml) gaminami sekantys etaloniniai tirpalai. Sudaroma kalibracinė kreivė iš 5 taškų, kurios koncetracijų ribos yra 0,25-0,0078mg/ml. Sekančiame tyrimų etape chromatografuojami tiriamieji ekstraktai ir sudarytos kalibracinės kreivės pagalba suskaičiuojami jų kiekiai sausajam ekstraktui. Tyrimai kartojami tris kartus apskaičiuojant jų standartinį nuokrypį. Analitinių tyrimų rezultatai pateikiami
lentelėse.
9 lentelė. Chlorogeno rūgšties kiekiai lapų ėminiuose (mg/g), skirtingose veislėse ir skirtingose žemdirbystės sistemose
Ekologinės žemdirbystės sistema Intensivios žemdirbystės sistema VB
Vokiai NojaiVB Kora Panda VokiaiVB NojaiVB Kora Panda Chlorogeno rūgštis 5,06 11,98 10,61 5,52 23,03 22,54 18,0 6 10,62 Standartinis nuokrypis 0,25 0,15 0,23 0,10 0,22 0,27 0,13 0,10
10 lentelė. Chlorogeno rūgšties kiekiai stiebų ėminiuose (mg/g), skirtingose veislėse ir skirtingose žemdirbystės sistemose
Ekologinės žemdirbystės sistema Intensivios žemdirbystės sistema VB
Vokiai NojaiVB Kora Panda VokiaiVB NojaiVB Kora Panda Chlorogeno
rūgštis 0,59 1,24 0,05 0,17 2,67 0,82 1,13 1,11
Standartinis nuokrypis
0,10 0,30 0,01 0,05 0,20 0,10 0,23 0,10
Apibendrinant tyrimų rezultatus nustatyta, kad lapų mėginiuose chlorogeno rūgšties didžiausias kiekis įvertinamas intensyvios žemdirbystės sistemoje VB Vokiai veislėje (23,02±0,22 mg/g), o mažiausias toje pačioje veislėje tik ekologinės žemdirbystės sistemoje (5,06±0,25 mg/g). Vertinant stiebų mėginius nustatyta, kad dižiausias chlorogeno rūgšties kiekis stebimas intensyvios žemdirbystės sistemoje VB Vokiai veislėje (2,67±0,20 mg/g), o mažiausias Kora veislėje ekologinės žemdirbystės sistemoje (0,05±0,01 mg/g).
3.4. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimo palyginimas grikių stiebų mėginiuose iš
skirtingų žemdirbystės sistemų
Sisteminant gautus rezultatus, pirmiausia palyginome skirtingų grikių veislių, auginamų skirtingose žemdirbystės sistemose, stiebų ėminiuose esančios chlorogeno rūgšties kiekybinius rodiklius. Duomenys pateikiami grafine išraiška diagramose.
7 pav. Chlorogeno rūgšties kiekiai stiebų ėminiuose (mg/g) ekologinės žemdirbystės sistemoje
Iš pateiktos diagramos matyti, kad VB Nojai veislė ryškiai išsiskiria kaupiamu chlorogeno kiekiu (1,24±0,24 mg/g), lyginant ją su kitomis analizuotomis grikių veislėmis. Atlikus statistinę analizę, statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti (p<0,05) VB Nojus veislę lyginant su visomis kitomis, taip pat statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0,05) nustatyti VB Vokius lyginant su Panda ir Kora veislėmis. Tarp Panda ir Kora veislių statistiškai reikšmingų rezultatų nenustatyta (p>0,05).
8 pav. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas stiebų ėminiuose (mg/g) intensyvios žemdirbystės sistemoje
Kiekybiškai įvertinus intensyvios žemdirbystės sistemos grikių ekstraktuose chlorogeno rūgšties rezultatus, nustatyta, kad VB Vokiai pasižymi didžiausiu chlorogeno rūgšties kiekiu (2,67±0,2 mg/g), o VB Nojai mažiausiu (0,82±0,1 mg/g). Statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti (p<0,05) vertinant VB Vokių veislę su kitomis grikių veislėmis. Tarp kitų veislių statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p>0,05).
9 pav. Chlorogeno rūgšties kiekių paliginimas stiebų ėminiuose (mg/g) intensyvios ir ekologinės žemdirbystės sistemose
Lyginant grikių stiebuose įvertintos chlorogeno rūgšties kiekį, nustatyta, kad ekologinės žemdirbystės sistemoje vienintelė veislė - VB Nojai - kaupia daugiau chlorogeninės rūgšties. Įvertinus visas kitas rūšis, didesnius kiekius kaupia intensyvioje žemdirbystės sistemoje kultivuoti grikių stiebai. Vertinant statistiškai, visose analizuotose veislėse nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp stiebų ėminių skirtingose žemdirbystės sistemose (p<0,05).
Apibendrinant kiekybinių tyrimų rezultatus su grikių stiebų etanoliniais ekstraktais, nustatyta, kad intesyvios žemdirbystės sistemoje chlorogeno rūgšties kiekiai yra didesni, lyginant su ekologinės žemdirbystės sistema, išskyrus VB Nojaus veislę. Rezultatai svyruoja nuo 0,82±0,1 mg/g iki 2,67±0,2 mg/g intensyvios žemdirbystės sistemoje ir nuo 0,05 ±0,1 mg/g iki 1,24±0,3 mg/g ekologinės
žemdirbystės sistemoje. Kaip matome iš pateiktų rezultatų didžiausi chlorogeno rūgšties kiekiai stiebuose skiriasi 2,15 karto, o tarp mažiausių kiekių net 16,4 karto. Taip pat tarp skirtingų žemdirbystės sistemų nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05).
3.5. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas grikių lapų mėginiuose skirtingose
žemdirbystės sistemose
Sisteminant gautus rezultatus, palyginome skirtingų grikių veislių, auginamų skirtingose žemdirbystės sistemose, lapų ėminiuose esančios chlorogeno rūgšties kiekybinius rodiklius. Duomenys pateikiami grafine išraiška diagramose.
10 pav. Chlorogeno rūgšties kiekiai lapų ėminiuose (mg/g) ekologinės žemdirbystės sistemoje
Iš diagramos matome, kad didžiausias chlorogeno r. kiekis įvertintas VB Nojai grikių veislėje (11,98±0,15 mg/g), o mažiausias VB Vokiai veislės mėginiuose (5,06±0,25 mg/g). Statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti (p<0,05) tarp VB Nojai, Panda ir Kora veislių, vertinant chlorogeno rūgšties kiekį lapų ėminiuose. Taip pat statistiškai reikšmingi rezultatai gauti (p<0,05) tarp Kora, Panda ir VB Vokiai. O statistiškai apdorojant VB Nojai ir Kora kiekybinius rodiklius, statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas(p>0,05).
11 pav. Chlorogeno rūgšties kiekiai lapų ėminiuose (mg/g) ekologinės žemdirbystės sistemoje
Įvertinus kiekybinius chlorogeno rūgšties rezultatus intensyvios žemdirbystės sistemos grikių ekstraktuose, nustatyta, kad didžiausią chlorogeno rūgšties kiekį sukaupia VB Vokiai (23,03±0,22 mg/g), o mažiausiai Panda veislės grikių augalinė žaliava (1,11±0,1 mg/g). Atlikus statistinį duomenų apdorojimą, statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti (p<0,05) tarp VB Vokiai ir Panda , taip pat tarp VB Nojai ir Panda veislių, vertinant chlorogeno rūgšties kiekį lapų ėminiuose.
.
12 pav. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas lapų ėminiuose (mg/g) intensyvios ir ekologinės žemdirbystės sistemose
Įvertinus grikių lapuose clorogeno rūgšties kiekį, nustatyta, kad daugiausiai šios fenolinės rūgšties sukaupia intensyvioje žemdirbystės sistemoje kultivuoti grikių lapai. Vertinant statistiškai, visose analizuotose veislėse, nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp lapų ėminių, skirtingose žemdirbystės sistemose (p<0,05).
Apibendrinant kiekybinių tyrimų rezultatus su grikių lapų etanoliniais ekstraktais, nustatyta, kad intesivios žemdirbystės sistemoje chlorogeno rūgšties kiekiai yra didesni, lyginant su ekologinės žemdirbystės sistema. Tie patys rezultatai nustatyti įvertinus ir stiebų ekstraktų mėginius. Rezultatai svyruoja nuo 1,11±0,1 mg/g iki 23,03±0,22 mg/g intensyvios žemdirbystės sistemoje ir nuo 5,06±0,25 mg/g iki 11,98±0,15 mg/g mg/g ekologinės žemdirbystės sistemoje. Kaip matyti iš pateiktų rezultatų, didžiausi chlorogeno rūgšties kiekiai lapuose skiriasi 1,92 karto, o tarp mažiauisių kiekių net 4,55 karto. Tarp skirtingų žemdirbystės sistemų nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05).
3.6. Chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimas grikių lapų ir stiebų mėginiose,
skirtingose žemdirbystės sistemose
kiekius intensyvioje ir ekologinėje žemdirbystės sistemoje. Pirmiausiai palyginome ekologinėje žemdirbystėje augusius lapų ir stiebų ėminius. Gauti rezultatai pateikiami diagramoje.
13 pav. Chlorogeno rūgšties kiekių (mg/g) palyginimas lapų ir stiebų ėminiuose ekologinės žemdirbystės sistemoje
Atlikus palyginamąją analizę, nustatyta, kad didžiausius kiekius chlorogeninės rūgšties ekologinės žemdirbystės sistemoje kaupia, lyginant su kitomis tirtomis grikių veislėmis, VB Nojai lapuose ir žieduose. Atlikus statistinę analizę, statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti visose veislėse tarp žiedų ir lapų ėminių (p<0,05). Tie patys tyrimai atlikti su intensyvioje žemdirbystės sistemoje augintais grikių lapais ir stiebais. Rezultatai pateikiami diagramoje.
14 pav. Chlorogeno rūgšties kiekių (mg/g) palyginimas lapų ir stiebų ėminiuose intensyvios žemdirbystės sistemoje
Atlikus palyginamąją analizę, nustatyta, kad didžiausius kiekius chlorogeninės rūgšties intensyvios žemdirbystės sistemoje kaupia, lyginant su kitomis tirtomis grikių veislėmis, VB Vokiai lapai ir žiedai. Atlikus statistinę analizę, statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti visose veislėse tarp žiedų ir lapų ėminių (p<0,05).
Abibendrinant tyrimų rezultatus galima daryti išvadą, kad lapai fenolinių rūgščių kaupia daugiau, negu stiebai. Tie patys rezultatai pasiekti ekologinėje ir intensyvioje žemdirbystės sistemoje.
3.7. Klasterinė statistinė analizė grikių lapuose ir stiebuose, skirtingose
žemdirbystės sistemose
Intensyvios ir ekologinės žemdirbystės sistemose augintų grikių lapų ir stiebų ėminiai tarpusavyje palyginti pagal chlorogeno rūgšties kiekinę sudėtį taikant hierarchinės klasterinės analizės metodą. Tirtų grikių veislių lapų ir stiebų ėminiai tarpusavyje palyginti naudojant Euklido atstumo kvadratus taikant vidutinės jungties tarp gupių panašumo matą. Klasterinė analizė atlikta atskirai stiebų ir lapų ėminiams.
Atlikus grikių lapų ėminių klasterinę analizę pagal chlorogeno rūgšties kiekinę sudėtį nustatytos 2 grupės (15 pav.). Nustatyta, kad šios grupės tarpusavyje skiriasi statistiškai patikimai (p<0,05). Pirmąją grupę sudaro ekologinės žemdirbystės sąlygomis augintų Kora, Panda, VB Nojai ir VB Vokiai veislių
bei intensyvios žemdirbystės sąlygomis augintų Panda veislės grikių lapų ėminiai. Šiems grikių lapų ėminiams būdingas mažesnis chlorogeno rūgšties kiekis. Antrai grupei priskirti intensyvaus auginimo sistemoje augintų Kora, VB Vokiai ir VB Nojai veislių lapų ėminiai, kurie išsiskiria didesniu sukaupiamu chlorogeno rūgšties kiekiu. Šios veislės, būtent intensyvaus auginimo sistemoje, pasižymėjo didžiausiais sukaupiamais clorogeno kiekiais, lyginant su kita žemdirbystės sistema ir veislėmis.
15 pav. Chlorogeno rūgšties kiekių klasterinė analizės rezultatai skirtingų veislių lapų ėminiuose (eko – ekologinė žemdirbystės sistema, int – intensyvi žemdirbystės sistema)
Atlikus grikių stiebų ėminių klasterinę analizę pagal chlorogeno rūgšties kiekinę sudėtį nustatytos 2 grupės (16 pav.). Nustatyta, kad šios grupės tarpusavyje skiriasi statistiškai patikimai (p<0,05). Tirtų ekologiškai augintų grikių veislių ir intensyviai augintų Kora, Panda ir VB Nojai veislių grikių stiebų ėminiai priskirti pirmai grupei. Juose nustatyti mažesni chlorogeno rūgšties
kiekiai. Chlorogeno rūgšties kiekine sudėtimi išsiskyrė intensyvaus auginimo sistemoje augintų VB Vokiai veislės grikių stiebų ėminiai, kuriuose nustatytas didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis. Šios veislės grikių stiebų ėminiai priskirti atskirai grupei.
16 pav. Chlorogeno rūgšties kiekių klasterinė analizės rezultatai skirtingų veislių stiebų ėminiuose (eko – ekologinė žemdirbystės sistema, int – intensyvi žemdirbystės sistema)
Abibendrinanat rezultatus, galima teigti, jog intensyvioje žemdirbystės sistemoje auginami grikių lapai ir stiebai sukaupia didesnius kiekius fenolinių rūgščių. VB Vokiai lyginant su kitomis veislėmis yra didžiausius chlorogeno rūgšties kiekius kaupianti veislė.
4. Išvados
1. Pritaikyta efektyvioji plonasluoksnės chromatografijos metodika, atlikta kokybinė bei kiekybinė skirtingų grikių veislių kaupiamų fenolinių rūgščių analizė.
2. Atlikus grikių stiebų ir lapų mėginių kokybinę analizę, buvo identifikuota chlorogeno rūgštis. Atlikus kiekybinę analizę, gauti rezultatai buvo palyginti tarp skirtingų grikių veislių bei skirtingų auginimo sąlygų.
3. Atliktas chlorogeno rūgšties kiekių palyginimas tarp skirtingų grikių veislių lapų ir stiebų. Nustatyta, kad lapuose sukiaupiami didesni chlorogeno rūgšties kiekiai nei stienuose (p<0,05). Ta pati tendencija pastebėta intensyvios žemdirbystės ir ekologinės žemdirbystės sistemose (p<0,05).
4. Palyginus grikių kaupiamos chlorogeno rūgšties kiekį skirtingose žemdirbystės sistemose, nustatyta, kad didesni kiekiai sukaupiami grikius auginant intensyvios žemdirbystės sąlygomis (p<0,05).
5. Grikių veislė, kuri kaupia didžiausius chlorogeno rūgšties kiekius stiebuose ir lapuose auginant ekologinėmis sąlygomis, yra VB Nojai, o auginant intensyviomis sąlygomis - VB Vokiai.
Literatūros sąrašas
1. Ohnishi O. Search for the wild ancestor of buckwheat III. The wild ancestor of cultivated common buckwheat, and of tatary buckwheat. Economic Botany 1998; 52(2): 123–33.
2. Sytar O. Phenolic acids in the inflorescences of different varieties of buckwheat and their antioxidant activity. Journal of King Saud University – Science 2015; 27:136-42.
3. Kim SJ, Zaidul ISM, Suzuki T, Mukasa Y, Hashimoto N, Takigawa S, Noda T, Matsuura-Endo C, Yamauchi H. Comparision o f phenolic compositions between common and tartary buckwheat (Fagopyrum) sprouts. Food Chemistry 2008; 110: 814-20.
4. Ohnishi O, Matsouka Y. Search for the wild ancestor of buckwheat II. Taxonomy of Fagopyrum (Polyginacea) species based on morphology, isozymes and cpDNA variability. Genes & Genetic Systems 1996; 71:383-90.
5. Vasiliauskas J. Gamtos vaistinė. Vilnius: 2011. p. 314-17. 6. Vasiliauskas J. Augalai ir sveikata. Vilnius: 1991. p. 299-301.
7. Sėjamojo grikio nuotrauka. Prieiga per internetą http://www.uniprot.org/taxonomy/3617.
8. Romanovskaja D, Ražukas A. Grikių hibridinių numerių ūkiškai naudingų požymių paveldimumo tyrimai selekcinio darbo procese. Žemdirbystė 2007; 4: 62-70.
9. Cawoy V, Ledent JM, Kinet AL, Jacquemar L. Floral biology of common buckwheat. The European Journal of Plant Science and Biotechnology 2009; 3: 1-9.
10. Vojtiskova P, Svec P, Kuban V, Krejzova E, Bittova M, Kracmar S, Svobodova B. Chemical Composition if Buckwheat Plant Parts and Selected Buckwheat Products. Scientific Journal for Food Industry 2014; 8(1): 247-53.
11. Ikeda S, Yamashita Y. Buckwheat as a dietary source of zinc, copper and manganese. Fagopyrum 1994; 14: 29-34.
12. Wu Y, Sun B, Huang J, Gao H, Wu L. A new flavonoid glycoside from the seeds of Fagopyrum tataricum. Asian Journal of Traditional Medicines 2007; 2(5).
13. Sedej IJ, Sakač MJ, Mišan AČ, Mandic AI. Antioxidant activity of wheat and buckwheat flours. Zbornik Matice srpske za prirodne nauke 2010; 118: 59-68.
14. Cody V, Middleton E, Harborne JB. Plant Flavonoids in Biology and Medicine, Biochemical, Pharmacological and Structure-Activity Relationships. 1986; New York: Alan R. Liss.
15. Oomah BD, Mazza G. Flavonoids and antioxidative activities in buckwheat. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1996; 44(7):1746-50.
16. Dietrych-Szostak D, Oleszek W. Effect of processing on the flavonoid content in buckwheat (Fagopyrum esculentum Möench) grain. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999; 47(10):
4383-8787.
17. Evans WC. Trease and Evans' Pharmacology. London: 1996. WB Saunders.
18. Wojcicki J, Samochowiec L, Gonet B, Juzwiak S, Dabrowska-Zamojcin E, Katdonska M, Tustanowski S. Effect of buckwheat extracts on free radical generation in rabbits administrated high-fat diet. Phytotherapy Research 1995; 9: 323-26.
19. Ihme N, Kiesewetter H, Jung F, Hoffmann KH, Birk A, Müller A, Grützner KI. Leg oedema protection from buckwheat herb tea in patients with chronic venous insufficiency: a single centre, randomised, duble-blind, placebo-controlled clinical trial. European Journal of Clinical Pharmacology 1996; 50: 443-47.
20. Watanabe M. Catechins as antioxidants from buckwheat (Fagopyrum esculentum Möench) groats. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1998; 46(3): 839-45.
21. Watanabe M, Ohshita Y, Tsushida T. Antioxidant compounds from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) hulls. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1997; 45(4): 1039-44.
22. Holasova M, Fiedlerova V, Smrcinova H, Orsak M, Lachman J, Vavreinova S. Buckwheat — the source of antioxidant activity in functional foods. Food Research International 2002; 35(2-3), 207-11.
23. Pasaulyje išauginamų grikių kiekiai. Internetinė prieiga:
http://www.factfish.com/statistic/buckwheat%2C%20production%20quantity/map
24. Food and Agriculture organization of The United Nations. Statistics division. Internetinė prieiga: http://faostat3.fao.org/home/E
25. Celiakija. Simptomai, priežastys ir eiga. Internetinė prieiga: http://ligos.sveikas.lt/lt/ligos/virskinimo_organu_ligos/celiakija
26. Ragažinskienė O., Rimkienė S., Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas: Lututė;
2005. p. 134-136.
27. Lattanzio V. Phenolic compounds: Introduction. Natural products. Springer – Verlag Berlin Heideberg;2013. p. 1543 – 73.
28. Fiehn O. Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology 2002; 48: 155-71.
29. Wu S, Chappell J. Metabolic engineering of natural products in plants; tools of the trade and challenges for the future. Current Opinion in Biotechnology 2008; 19: 145-52.
30. Winkel-Shirley B. Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Current Opinion in Plant Biology 2002; 5: 218-23.
31. Gould KS, Lister C. Falvonoid functions in plants. In: Flavonoids – chemistry, biochemistry and applications. Boca Raton: CRC Taylor & Francis; 2006. p. 397-411.
32. Van Sumere CF. Phenols and phenolic acids. In: Harborne JB (ed) Methods in plant biocheistry, vol 1. Plant phenolics. Academic, London 1989. p. 29-73.
33. Tomas-Barberan FA, Clifford MN. Dietary hydroxybenzoic acid derivatives – nature, occurrence and dietary burden. Journal if the Science of Food and Agriculture 2000; 80: 1024-32. 34. Robbins RJ. Phenolic Acids in Foods: An Overview of Analytical Methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003; 51: 2866-87.
35. Jacob RA, Burri BJ. Oxidative damage and defense. The American Journal of Clinical Nutrition 1996; 63.
36. Paganga G, Miller N, Rice-Evans C A. The polyphenolic content of fruit and vegetables and their antioxidant activities. What does a serving constitute? Free Radical Research 1999; 30: 153-62. 37. Huang MT, Ferraro T. Phenolic Compounds in Food and Cancer Prevention. In Phenolic Compounds in Food and Their Effects on Health. II. Antioxidants and Cancer PreVention. American Chemical Society: Washington, DC, 1992; pp 8-34.
38. Powles JW, Ness AR. Fruit and vegetables, and cardiovascular disease: A review. International Journal of Epidemiology 1996; 26: 1-13.
39. Block G, Patterson B, Subar A. Fruit, Vegetables, and Cancer Prevention: A Review of the Epidemiological Evidence. Nutrition and Cancer 1992; 18: 1-29.
40. Scalbert A, Williamson G. Dietary intake and bioavailablity of polyphenols. Journal of Nutrition 2000; 130: 2073-85.
41. Koshihara Y, Neichi T, Murota SI, Lao AN, Fujimoto Y, Tatsuno T. Caffeic acid is a selective inhibitor for leukotriene biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta 1984; 792: 92-97.
42. Rao CV, Desai D, Simi B, Kulharni N, Amin S, Reddy BS. Inhibitory effect of caffeic acid esters on azoxymethaneinduced biochemical changes and aberrant crypt foci, formation in rat colon. Cancer Research 1993; 53: 4182-88.
43. Olthof MR, Hollman PCH, Katan M. Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans. Journal of Advanced Nutrition and Human Metabolism 2001; 131: 66-71.
44. Maggi-Capeyron MF, Ceballos P, Cristol JP, Delbosc S, Le Doucen C, Pons M, Leger CL, Descomps B. Wine phenolic antioxidants inhibit ap-1 transcriptional activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2001; 49: 5646-52.
45. King PJ, Ma G, Miao W, Jia Q, McDoughall BR, Reinecke MG, Cornell C, Kuan J, Kim TR, Robinson JrWE. Structure-activity relationships: analogues of the dicaffeoylquinic and dicaffeoyltartaric acids as potent inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 integrase and replication. Journal of Medicinal Chemistry 1999; 42: 497-509.
46. De Rijke E, Out P, Niessen WM, Ariese F, Gooijer C, Udo AT. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography 2006; 1112(1): 31-63.
47. Bloor SJ. Overview of methods for analysis and identification of flavonoids. Methods in enzymology 2001; 335: 3-14.
48. Wall PE, editor. Thin-layer Chromatography: A modern Practical Approach. Great Britain: The Royal Society of Chemistry; 2005.
49. Raina AP, Gupta V.
Evaluation of buckwheat (Fagopyrum species) germplasm for rutin content in seeds. Indian Journal of Plant Physiology2015; 20(2): 167-171.
50. Žvikas V, Jakštas V, Šopaga
L. Optimization of extraction process of rutin from Fagopyrum esculentum Moench. The 5 th International conference on pharmaceutical sciences and pharmacy practice. 2014 Kaunas.
