FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
SILVIJA DAGYTĖ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO DIRVINIŲ
ASIŪKLIŲ (Equisetum arvense L.) IR MIŠKINIŲ ASIŪKLIŲ (Equisetum
sylvaticum L.) ŽOLĖJE TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Dr. K. Zymonė 2016 - 2017 m. m. Prof., habil. dr. V. Janulis 2018 m. m.
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO DIRVINIŲ
ASIŪKLIŲ (Equisetum arvense L.) IR MIŠKINIŲ ASIŪKLIŲ (Equisetum
sylvaticum L.) ŽOLĖJE TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Dr. K. Zymonė 2016 - 2017 m. m. Prof., habil. dr. V. Janulis 2018 m. m. Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantė: Silvija Dagytė Data KAUNAS, 2018
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) morfologiniai požymiai ir paplitimas... 10
1.2. Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolės fitocheminė sudėtis ... 12
1.3. Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) žolės ir jos preparatų biologinis poveikis ... 14
1.4. Antioksidantinis aktyvumas ir jo įvertinimo metodai ... 16
1.5. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimų objektas ... 20
2.2. Naudoti reagentai ... 20
2.3. Naudota aparatūra ... 21
2.4. Tiriamojo mėginio paruošimas ... 21
2.5. Tyrimų metodai ... 22
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 22
2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 23
2.5.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu... 23
2.5.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika asiūklių žolės ėminių fenolinių junginių kokybinei ir kiekinei sudėčiai nustatyti ... 24
2.5.5. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas DPPH radikalų surišimo gebos metodu ... 24
2.5.6. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas ABTS katijonų – radikalų surišimo gebos metodu... 25
2.5.7. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas FRAP (geležies jonų redukcijos antioksidantinės galios) metodu ... 26
2.6. Duomenų analizės metodai ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) augalinių žaliavų ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 27
3.2. Bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas E. arvense L. ir E. sylvaticum L. žolės ėminių ekstraktuose
spektrofotometriniu metodu ... 29
3.3. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas E. arvense L. ir E. sylvaticum L. žolėje DPPH, ABTS, FRAP metodais ... 33
3.4. E. arvense L. ir E. sylvaticum L. žolės fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 36
3.5. Rezultatų apibendrinimas... 42
4. IŠVADOS ... 43
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); ANOVA - vieno faktoriaus dispersinė analizė;
DPPH – 2,2 – difenil–1–pikrilhidrazilo laisvasis radikalas; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FRAP – trivalentės geležies jonų redukcinė galia; GRE – galo rūgšties ekvivalentai;
N – imties tūris;
p – reikšmingumo lygmuo; R2 – regresijos koeficientas;
TE – trolokso ekvivalentai;
TFC – bendras fenolinių junginių kiekis; TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas; UV – ultravioletinė spinduliuotė.
SANTRAUKA
Silvijos Dagytės magistro baigiamasis darbas „Fenolinių junginių sudėties įvairavimo dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) ir miškinių asiūklių (Equisetum sylvaticum L.) žolėje tyrimai“/ mokslinis vadovas Dr. K. Zymonė 2016 - 2017 m. m., Prof., habil. dr. V. Janulis 2018 m. m.; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas: ištirti Lietuvos klimato sąlygomis augančių asiūklių (E. arvense L. ir E. sylvaticum L.) žolės fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.
Tyrimo uždaviniai: ištirti Lietuvoje augančių dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių
asiūklių (E. sylvaticum L.) žolės fenolinių junginių kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą; ištirti asiūklių žolės flavonoidų kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą; taikant ESC metodą ištirti asiūklių žolės fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį; spektrofotometriniais metodais nustatyti asiūklių žolės antioksidantinį aktyvumą.
Tyrimo metodai: bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu
Folin-Ciocalteu metodu. Bendras flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant AlCl3 reagentą. Individualių fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė sudėtis tirta efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu, taikant atvirkščių fazių chromatografiją. Asiūklių žolės antioksidantinis aktyvumas nustatytas DPPH, ABTS, FRAP spektrofotometriniais metodais.
Tyrimo objektas: Lietuvos klimato sąlygomis skirtingose augavietėse surinktos dirvinių
asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolės ėminiai (n=8).
Tyrimo rezultatai: Bendras identifikuotų fenolinių junginių kiekis asiūklių žolės mėginiuose
įvairavo nuo 3,934 ± 0,882 mg/g (E. arvense L., Glaudžių k. Plungės r.) iki 35,964 ± 3,693 mg/g (E.
sylvaticum L., Biržų r. Spalviškių k.). Stipriausias antioksidacinis aktyvumas (41,623 ± 2,821 mg TE/g
DPPH metodu, 78,628 ± 13,102 mg TE/g ABTS metodu ir 63,074 ± 1,483 mg TE/g FRAP metodu) nustatytas E. sylvaticum L. žolės, surinktos Spalviškių k. Biržų r., ekstrakte. Visuose asiūklių žolės ekstraktuose izokvercitrinas ir astragalinas yra vyraujančios analitės. Rutino kiekis įvairavo nuo 0,027 ± 0,002 mg/g (E. arvense L., Anglininkų k., Biržų r.) iki 2,688 ± 0,554mg/g (E. sylvaticum L., Keblonių k. Anykščių r.). Kvercetino 3-O-(6''-O-malonil)-gliukozidas identifikuotas tik dirvinių asiūklių žolės ėminiuose, jo kiekis įvairavo nuo 0,479 ± 0,022 mg/g (Glaudžių k. Plungės r.) iki 7,472 ± 0,922 mg/g (Šiškrantės k. Šilutės r.).
Tyrimo išvados: Asiūklių žolės ekstraktų antioksidantinio aktyvumo rezultatai skyrėsi,
priklausomai nuo naudotų įvertinimo metodų. Nustatyta labai stipri koreliacinė priklausomybė tarp asiūklių žolės mėginių antioksidantinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio. ESC metodu nustatyti ir įvertinti antriniai metabolitai – rutinas, izokvercitrinas, kvercetino 3-O-(6''-O-malonil)-gliukozidas, astragalinas, chlorogeno rūgštis ir neochlorogeno rūgštis.
SUMMARY
The topic of the master thesis by Silvija Dagytė is “Variation of composition of phenolic compounds in stem of horsetail (Equisetum arvense L. and Equisetum sylvaticum L.) plants”. The supervisor is Dr. K. Zymonė 2016 -2017 m. m., Prof., habil. dr. V. Janulis 2018 m. m., Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosis. – Kaunas.
The aim of this study: to explore variation peculiarities of qualitative and quantitative
composition of phenolic compounds in stem samples of horsetail (Equisetum arvense L. and Equisetum
sylvaticum L.) plants growing in natural habitats of Lithuania.
The objectives of the research: to evaluate the total content of phenolic compounds and their
variability in the horsetail stem samples collected in natural habitats in different parts of Lithuania; to evaluate the quantitative distribution of phenolic compounds in horsetail stems by HPLC method; to measure the antioxidant activity of ethanolic extracts of horsetail (Equisetum arvense L. and Equisetum
sylvaticum L.) stems;
The methods of the research: Spectophotometric method was applied for quantitative analysis
of phenolic compounds and determination of antioxidant activity. The antioxidant activity has been measured using the spectrophotometric method with DPPH, ABTS, FRAP reagents. The contents of rutin, isoquercitrin, quercetin malonyl glucoside, astragalin, chlorogenic acid and neochlorogenic acid has been evaluated by HPLC method.
The object the research: The samples of the E. arvense L. and E. sylvaticum L. stems collected
in natural habitats in different parts of Lithuania (n=8).
The results of the research: Analysis of the composition of phenolic compounds in stem of
horsetail show that the total content of phenolic compounds quantity varies from 3.934 ± 0.882 mg/g (E.
arvense L., Glaudžių k. Plungės r.) to 35.964 ± 3.693 mg/g (E. sylvaticum L., Biržų r. Spalviškių k.).
The total content of flavonoids varies from 0.791 ± 0.291 mg/g (E. arvense L., Glaudžių k. Plungės r.) to 14.765 ± 0.161 mg/g (E. arvense L., Šilutės r. Šiškrantės k.) in analyzed samples. The highest antioxidant activity of horsetail stem extracts was determined in E. sylvaticum L., Biržų r. Spalviškių k. (41.624 ± 2.822 mg TE/g using DPPH method, 63.074 ± 1.484 mg TE/g using FRAP method and 78.628 ± 13.102 mg TE/g using ABTS method). Isoquercitrin and astragalin were the predominant analytes in all extracts.
The conclusions of the research: Very strong correlative dependence has been established
between the phenolic compounds quantity and the antioxidant activity of the stems samples. HPLC has been utilized to identify and quantify the secondary metabolites rutin, isoquercitrin, quercetin malonyl glucoside, astragalin, chlorogenic acid and neochlorogenic acid.
ĮVADAS
Jau nuo seno žmonija domisi vaistiniais augalais, siekiant gydyti įvairias ligas. Didėjant šiuolaikinei mokslo sklaidai, vis labiau domimasi augaliniais preparatais, jų farmakologinėmis, cheminėmis savybėmis. Pasaulinė sveikatos organizacija (PSO) praneša, kad PSO priklausančiose valstybėse narėse susidomėjimas gydymu fitoterapiniais vaistais kiekvienais metais didėja. Nustatyta, jog šiuo metu daugiau nei 50 proc. rinkoje esamų vaistų yra augalinės kilmės [1]. Preparatams, gaminamiems iš vaistinių augalinių žaliavų, būdingas įvairus farmakologinis poveikis bei maža šalutinių poveikių rizika.
Dirvinis asiūklis (Equisetum arvense L.) yra vaistinis augalas, augantis Europoje ir taip pat plačiai paplitęs Amerikoje, Šiaurės Afrikoje bei Azijoje. Dirvinių asiūklių žolės preparatai tradicinėje medicinoje skiriami gydant įvairius sveikatos sutrikimus ir pasižymi plačiu bei įvairiu biologiniu aktyvumu: diuretiniu, anksiolitiniu, prieštraukuliniu, antimikrobiniu, antibakteriniu, priešgrybeliniu, antiproliferaciniu, citotoksiniu, hepatoprotekciniu bei glikemiją mažinančiu poveikiais. Remiantis ikiklinikinių tyrimų rezultatais ir ilgu vartojimu tradicinėje medicinoje, Europos vaistų agentūra (EMA) augalinių vaistinių preparatų komiteto ataskaitoje dirvinį asiūklį patvirtino kaip vaistinį augalą [2]. Skirtingose šalyse įteisintas dirvinių asiūklių vartojimas remiasi ilgalaikio tradicinio vartojimo metu nusistovėjusiomis indikacijomis, etniniais farmakologiniais tyrimais, fitochemine analize ir farmakologiniais tyrimais [3].
Fenolinių junginių sudėtis augalinėje žaliavoje yra labai svarbus rodiklis vertinant augalinės žaliavos kokybę. Fenoliniai junginiai sudarydami metalų chelatus, neutralizuoja laisvuosius radikalus, todėl augalinės žaliavos antioksidantinis aktyvumas tiesiogiai siejamas su fenolinių junginių kiekiu [4]. Dėl šios priežasties fenoliniai junginiai yra daugelio antioksidantinio aktyvumo tyrimų objektas [5]. Pasaulyje atlikta nemažai tyrimų, kurių metu įvairių augalų ekstraktai įvertinami kaip natūralūs antioksidantų šaltiniai [6–8].
Fenolinių junginių kiekinės sudėties analizė yra reikalinga asiūklių žaliavą naudojant medicininiais tikslais bei kuriant naujas panaudojimo galimybes. Fenolinių junginių kiekis gali varijuoti priklausomai nuo augalinės žaliavos augimo sąlygų, todėl svarbu ištirti skirtingomis sąlygomis augusių asiūklių, rinktų įvairiose Lietuvos augavietėse, ėminių ekstraktų fenolinių junginių kiekio varijavimą.
Šios vaistinės augalinės žaliavos - asiūklių žolės, analizė ir veikliųjų medžiagų kokybinis ir kiekybinis įvertinimas yra svarbus, siekiant įvertinti žaliavos kokybę, biologiškai aktyvių medžiagų kaupimosi dėsningumą. Tyrimo tikslas - ištirti Lietuvoje augančių asiūklių (Equisetum) genties dirvinių (E. arvense L.) ir miškinių (E. sylvaticum L.) asiūklių žolės fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę cheminę sudėtį ir jos įvairavimą bei nustatyti asiūklių žolės ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas: ištirti natūraliai Lietuvoje augančių asiūklių (Equisetum) genties dirvinių (E. arvense L.) ir miškinių (E. sylvaticum L.) asiūklių žolės fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę
cheminę sudėtį ir jos įvairavimą bei nustatyti asiūklių žolės ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Tyrimo uždaviniai:
1. Ištirti dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolės ekstraktų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą;
2. Ištirti dirvinių ir miškinių asiūklių žolės ekstraktų flavonoidų kiekybinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą;
3. Ištirti dirvinių asiūklių ir miškinių asiūklių žolės ekstraktų hidroksicinamono rūgšties darinių kiekybinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą;
4. Taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą ištirti dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolės ekstraktų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį;
5. Spektrofotometriniu metodu nustatyti dirvinių asiūklių ir miškinių asiūklių žolės ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.)
morfologiniai požymiai ir paplitimas
Asiūklinių (Equisetaceae L.) šeimos augalai priklauso asiūklių (Equisetum L.) genčiai. Tai nedideli arba vidutinio dydžio augalai, turintys ilgą, giliai į žemę įsišaknijusį šakniastiebį, iš kurio kasmet išauga antžeminiai stiebai. Daugelis asiūklių augalų rūšių, turi šakniastiebius, kurie turi šonines, į gumbelius panašias ataugas (1 pav.). Šios šoninės ataugos turi daug vertingų maistinių medžiagų ir yra kaip vegetatyvinio dauginimosi organas. Asiūklių augalų šakniastiebiai ir antžeminiai stiebai yra nariuoti bei sudaryti iš bamblių ir tarpubamblių. Antžeminio stiebo tarpubamblių pagrindą sudaro redukuotų, žvynelių pavidalo lapų menturė, iš kurios išauga šakos. Šakos, kaip ir stiebas, nariuotos ir pakartotinai menturiškai šakojasi. Dengiamiesiems ir sklerenchiminiams asiūklių stiebo ir šakų audiniams būdingas paviršiaus šiurkštumas, dėl sudėtyje esančios silicio rūgšties. Sporos susidaro sporofiluose, kurie tankiomis menturėmis grupuojasi stiebo viršūnėje ir sudaro varpos pavidalo organą. Daugumos asiūklių augalų rūšių vegetatyviniai ir sporifikuojantys stiebai yra panašūs. Kai kurios asiūklių rūšys pirmiausia išaugina rausvos ar gelsvos spalvos sporifikuojančius stiebus su sporofilų varpa ir tik vėliau, kai sporos išsibarsto ir stiebai sunyksta - vegetatyvinius [9].
1 pav. Equisetum arvense L. – dirvinis asiūklis. 1 – vegetatyvinis stiebas su šakomis, 2 – sporifikuojantis stiebas su sporangių varpa, 3 – šakniastiebis su gumbeliais.
Morfologiškai asiūklinių šeimos augalų rūšys yra gana panašios ir remiantis vien morfologija gali būti sunkiai nustatomos.
Kariosistematiškai ištyrus asiūklių genčiai priklausančias augalų rūšis, išskirtos dvi pogentis –
Equisetum ir Hippochaete [10]. Equisetum pogentį sudaro aštuonios asiūklių rūšys (dirvinis asiūklis (E. arvense L.), andų asiūklis (E. bogotese Kunth.), himalajų asiūklis (E. diffusum Don.), balinis asiūklis (E. fluviatile L.), gegužinis asiūklis (E. palustre L.), ožkabarzdis asiūklis (E. pratense Ehrh.), miškinis
asiūklis (E. sylvaticum L.) ir didysis asiūklis (E. telmateia Ehrh.)), kurios nuo Hippochaete pogentės skiriasi esančiomis paviršinėmis žiotelėmis ir šakotais stiebais [11]. Hippochaete pogentį sudaro septynios asiūklių rūšys - šakotasis asiūklis (E. giganteum L.), šiurkštusis asiūklis (E. hyemale L.), švelnusis asiūklis (E. laevigatum A. Braun.), Meksikos gigantiškasis asiūklis (E. myriochaetum Schltdl. Cham.), šakotasis asiūklis (E. ramosissimum Desf.) ir margasis asiūklis (E. variegatum Schleich.).
Hippochaete pogenčio augalų stiebai dažniausiai yra nešakoti, o žiotelės - pasislėpusios epidermyje.
Dirvinis asiūklis (Equisetum arvense L.) asiūklinių (Equisetaceae) šeimos daugiametis sporinis žolinis augalas. Pavasarį, balandžio ir gegužės mėnesiais, išaugę sporifikuojantieji stiebai auga iki 20-40 cm aukščio, 3-5 mm skersmens. Pavasariniai stiebai šviesiai rudi arba rausvi, dažniausiai su penkiomis viena nuo kitos atitolusiomis makštimis. Makštys sudarytos iš 8 – 12 dantelių. Dirvinio asiūklio stiebų viršūnėse susidaro sporų turinčios sporangės, kurių varpų ilgis - iki 3,5 cm. Vietoje pavasarinių stiebų vėliau išauga 3 mm skersmens vegetatyviniai stiebai, kurių aukštis siekia iki 50 cm. Vegetatyviniai stiebai išilgai turi 6 - 19 briaunelių ir yra žalios spalvos, nariuoti, tuščiaviduriai ir šiurkštūs. Makštys yra 5 – 12 mm ilgio ir jų danteliai trikampiškai lancetiški, su baltais kraštais. Šakos paprastai yra keturbriaunės ar penkiabriaunės, retai – šešiabriaunės, dažniausiai stačios, kartais šakotos. Šakų pagrinduose esančios makštys yra žalsvos ar rudos, paprastai matinės spalvos. Šakų makščių danteliai trikampiški ir nusmailėję (1 pav.) [9].
Dirvinių asiūklių rūšis yra plačiai paplitusi visame šiauriniame pusrutulyje – Kanadoje, Jungtinėse Amerikos Valstijose, Europoje, pietų Turkijoje, Irane, Kinijoje, Korėjoje, Japonijoje. Dirvinis asiūklis (Equisetum arvense L.) randamas apydrėgnėse, ypač smėlingose dirvose ar nedirbamoje žemėje, pakelėse, pievose, kartais miškuose ir yra paplitęs visoje Lietuvos teritorijoje [12]. Atskirti dirvinį asiūklį nuo kitų asiūklinių (Equisetaceae) šeimos rūšių, ypatingai nuo nuodingo pelkinio asiūklio (E. palustre L.), yra sudėtinga net remiantis mikroskopiniu tyrimu [13]. Europos farmakopėjos monografijoje yra nurodomas plonasluoksnės chromatografijos testas skirtas identifikacijai bei priemaišų nustatymui dirvinių asiūklių žaliavoje [14].
Europos farmakopėjoje aprašomi sveiki arba supjaustyti, sudžiovinti vegetatyviniai dirvinių asiūklių stiebai, kurie yra renkami visą vasarą ir apibūdinami kaip asiūklių žolė (Equiseti Herba). Dirvinių asiūklių žolė džiovinama pavėsyje, gerai vėdinamoje patalpoje. Išdžiovinta žolė turi būti pilkai žalios spalvos, bekvapė ir silpnai rūgštaus skonio [12,15].
Miškinis asiūklis – (Equisetum sylvaticum L.) auga iki 60 – 80 cm aukščio. Miškinių asiūklių vegetatyviniai ir sporifikuojantys stiebai, priešingai nei dirvinių asiūklių, išauga tuo pačiu metu, pavasario laikotarpyje. Sporifikuojantys stiebai išbarstę sporas, pažaliuoja ir išsišakoja. Sporifikuojančių ir vegetatyvinių stiebų makštys yra išpusto vamzdelio formos ir kartu su danteliais siekia 25 mm ilgį. Vegetatyviniai augalo stiebai nuo viršūnės iki pusės yra menturiškai šakoti, su 10 – 18 briaunelių. Vegetatyvinio stiebo makštys yra iki 15 mm ilgio, viršutinėje dalyje raudonai rudos spalvos. Makščių danteliai yra lancetiškai susijungę į 3 – 4 lancetiškos formos skiauteles. Šakos ilgos, nusvirusios žemyn, keturbriaunės ar penkiabriaunės ir pakartotinai išsišakojusios į antraeiles ar trečiaeiles šakutes. Šakų pagrindus supa raudonai rudos spalvos makštys, kurios turi lancetiškus dantelius, nusmailėjusiomis viršūnėlėmis. Varpa yra rudos spalvos, cilindriškos formos, pilnavidurės centrinės ašies (2 pav.) [9].
2 pav. Miškinio asiūklio (Equisetum sylvaticum L.) vegetatyviniai ir sporifikuojantys stiebai [http://davydovbotany.blogspot.lt/2016/12/equisetaceae.html]
Miškiniai asiūkliai auga miškuose, miškų pievose ar krūmynuose ir sporifikuoja gegužės – birželio mėnesiais [9].
1.2.
Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolės
fitocheminė sudėtis
Vertinant vaistinės augalinės žaliavos fitocheminę sudėtį, svarbu atsižvelgti į biologiškai aktyvių medžiagų kaupimosi dėsningumus vegetatyviniuose ir generatyviniuose augalo organuose.
Fitocheminės sudėties įvairavimas taip pat priklauso nuo vaistinės augalinės žaliavos geografinės augavietės.
Dirvinių asiūklių žolės sudėtyje nustatyta daugiau nei 10 proc. neorganinių druskų: silicio rūgštis ir silikatai (5-8 proc.), kalis (1,8 proc.), kalcis (1,3 proc.), aliuminis, siera, magnis bei manganas. Silicio rūgštis ir kalio druskos sudaro du trečdalius neorganinių medžiagų. Dirvinio asiūklio žaliavoje gausu sterolių (β - sitosterolio, kampesterolio, izofukosterolio), askorbo rūgšties, fenolinių rūgščių (cinamono rūgšties, kavos rūgšties, chlorogeno rūgšties, di-E-kafeoil-meso-tartaro rūgšties, mono-O-kafeil-meso-tartrato ir daktilifriko rūgšties), polieninių rūgščių, retų dikarboksilinių rūgščių (ekvizetolino rūgšties), flavonoidų (genkvanino-5-O-gliukozido, kemferolio-3,7-di-O-gliukozido, kemferolio-3-O-(6`-O-malonil-gliukozido)-7-O-gliukozido, kemferolio-3-O-soforosido) [12,15,16].
Pavasario metu surinktuose dirvinio asiūklio sporifikuojančiuose stiebuose nustatomi fenoliniai glikozidai: ekvisetumosidas A, ekvisetumosidas B, ekvisetumosidas C. Vegetatyviniuose dirvinio asiūklio stiebuose nustatomi triterpenoidai: izoborneolis, tarakserolis, germanikolis, ursolo rūgštis, oleanolio rūgštis, betulino rūgštis bei saponinas – ekvisetoninas. Dirvinių asiūklių stiebų sudėtyje nustatyti fitosteroliai: cholesterolis, epicholestanolis, 24-metilenecholesterolis, izofukosterolis (5,9 proc.), kampesterolis (32,9 proc.) ir β-sitosterolis (60 proc.) [12].
Vegetatyviniuose stiebuose nustatomas flavonoidų kiekis varijuoja nuo 0,3 proc. iki 0,9 proc. Pagrindiniai dirvinių asiūklių žolėje nustatomi flavonoidai yra kemferolio 3-O-soforosido-7-O-glikozidas, kempferolio 3-O-(6``-O-malonil-glikozido)-7-O-3-O-soforosido-7-O-glikozidas, kemferolio 3-O-soforosidas, izokvercitrinas, apigeninas, apigenino 5-O-glikozidas, liuteolinas, liuteolino 5-O-glikozidas, genkvanino 5-O-glikozidas [12]. Europos farmakopėjos monografijoje reglamentuojamas flavonoidų kiekis, pagal kurį, dirvinių asiūklių vegetatyvinėje augalinėje žaliavoje izokvercitrino turi būti ne mažiau 0,3 proc. [14].
Skirtingose geografinėse vietose auganti asiūklių žolė skiriasi flavonoidų sudėtimi. Išskiriami du dirvinių asiūklių chemotipai. Pirmasis chemotipas auga Azijoje ir Šiaurės Amerikoje, kitas - Europoje. Žaliava surinkta Azijoje ir Šiaurės Amerikoje, priešingai nei Europoje rinkta žaliava, sudėtyje turi luteolino-5-O-gliukozido ir jo malonilo esterio junginius. Abiejų chemotipų augalinei žaliavai yra būdinga di-E-kafeoil-meso-vyno rūgštis. Europoje rinktoje žaliavoje kaip dominuojantys junginiai nustatomi: izokvercitrinas (kvercetino 3-O-glikozidas), apigenino 5-O-glikozidas ir dikafeil-meso-vyno rūgštis [15,16].
Kukric et al. (2013) nustatė dirvinių asiūklių (E. arvense L.) žolės ekstraktų antioksidantinį aktyvumą. Folin-Ciocalteu metodu, dirvinių asiūklių žolės etanoliniame ekstrakte nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis – 355,80 ± 17,8 mg GAE/g. Remiantis tyrimo rezultatais, mokslininkai teigia, kad stiprus antioksidantinis poveikis yra tiesiogiai susijęs su dideliu fenolinių junginių kiekiu [4].
Dukic (2008) atliko dirvinių asiūklių (E. arvense L.) fenolinių junginių sudėties tyrimą skirtinguose asiūklių ekstraktuose (etanoliniame, butanoliniame, vandeniniame). Etanoliniame ekstrakte nustatyti: izokvercitrinas (152,0 mg/g), apigenino 5-O-gliukozidas (22,40 mg/g) ir kempferolio 3-O-gliukozidas (26,20 mg/g). Butanoliniame ekstrakte nustatyti du fenoliniai junginiai: izokvercitrinas (382,0 mg/g), di-E-O-kafeil-meso-tartrato rūgštis (100,0 mg/g), tuo tarpu vandeniniame ekstrakte di-E- O-kafeil-meso-tartrato rūgšties nustatyta tik 10 mg/g. Vandeniniame dirvinių asiūklių ekstrakte taip pat nustatytos dvi fenolinės rūgštis (atitinkamai 3,0 mg/g ir 6,0 mg/g). Remdamiesi tyrimo rezultatais, mokslininkai daro išvadą, jog etanolinių ir butanolinių ekstraktų sudėtyje pagrindiniai komponentai yra flavonoidai, o vandenių ekstraktų – fenolinės rūgštys [16].
Radulovic (2006) atliko tyrimą, kurio metu dujų chromatografijos - masių spektrometrijos ir branduolių magnetinio rezonanso spektroskopijos metodais nustatyta dirvinių asiūklių eterinio aliejaus cheminė sudėtis. Eterinis aliejus, gautas iš dirvinių asiūklių vegetatyvinių stiebų, yra gelsvai oranžinės spalvos, labai tirštos konsistencijos bei aromatingo vaisių kvapo. Asiūklių eterinio aliejaus išeiga labai maža (0,01 proc.). Eteriniame aliejuje nustatyti dvidešimt penki junginiai, iš jų daugiausia: heksahidrofarnesil acetono (18,34 proc.), cis-geranilo acetono (13,74 proc.), timolio (12,09 proc.) ir
trans-fitolio (10,06 proc.) [17].
Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad dirvinių asiūklių (E. arvense L.) augalinėje žaliavoje gausu flavonoidų, fenolinių rūgščių, polieninių rūgščių, sterolių, triterpenoidų, fitosterolių, neorganinių druskų.
1.3.
Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) žolės ir jos preparatų biologinis poveikis
Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) vaistinė augalinė žaliava dėl sudėtyje esančių biologiškai aktyvių medžiagų yra plačiai pritaikoma medicinoje. Dirvinio asiūklio vaistinės augalinės žaliavos ir jos preparatų naudojimas gydymo tikslams aprašomas mokslinėje literatūroje.
Priešuždegiminis poveikis. Dirvinių asiūklių žolės preparatai yra plačiai naudojami dėl
uždegimą slopinančių savybių. Šis poveikis ištirtas su pelėmis, naudojant etanolinį ekstraktą. Dėl savo priešuždegiminių savybių žaliava skiriama gydyti artritą, cistitą, nušalimus, podagrą, apatinių šlapimo takų uždegimą. Dirvinių asiūklių arbata valomos žaizdos, opos, problematiškos odos vietos, skalaujant gydomi dantenų uždegimai [12].
Diuretinis poveikis. Vaistiniai preparatai, į kurių sudėtį įeina dirvinių asiūklių žolė, skatina
šlapimo išsiskyrimą. Asiūklių preparatais gydomi šlapimtakių ir šlapimo pūslės uždegimai. Dirvinių asiūklių žolės ekstraktas savo poveikiu šlapimo sistemai yra lygiavertis tiazidiniam diuretikui hidrochlortiazidui ir nesukelia reikšmingo elektrolitų disbalanso ir kitų nepageidaujamų reakcijų [18].
Anksiolitinis poveikis ir prieštraukulinis poveikis. Moksliniais tyrimais įrodyta, jog dirvinių
asiūklių (Equisetum arvense L.) žolės hidroalkoholiniai ekstraktai pasižymi raminamuoju ir prieštraukuliniu poveikiais. Toks poveikis aiškinamas izokvercitrino veikimu, kuris prailgina diazepamo sukelto miego laiką ir laikomas kaip geras indikatorius raminamajam poveikiui nustatyti [19,20]. Naujesni tyrimai rodo, kad dirvinių asiūklių žolės etanoliniai ekstraktai terapinėmis dozėmis pasižymi anksiolitiniu poveikiu, kuris aiškinamas ekstrakto sąveika su nervų sistemos substratais ar cheminiais mediatoriais, tokiais kaip noradrenalinas, seratoninas, kurie, manoma, yra susiję su nerimo sutrikimu. Anksiolitinis poveikis galimas dėl ekstrakto sudėtyje esančių flavonoidų, ypatingai apigenino, kuris tiksliai atpažįsta centrinius benzodiazepinų receptorius [21].
Antimikrobinis, antibakterinis, priešgrybelinis poveikis. Įrodyta, kad dirvinių asiūklių
eterinio aliejaus hidrolatas, santykiu 1:10, turi platų antimikrobinio poveikio spektrą prieš bakterijų (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis) ir grybų (Aspergillus niger, Candida albicans)
padermes. Dirvinių asiūklių antimikrobinis poveikis siejamas su eterinio aliejaus sudėtyje esančiais monoterpeninių fenolių dariniais, ypatingai timoliu. Pastaroji medžiaga kartu su 1,8-cineoliu, turi reikšmingą sinergistinį priešgrybelinį veikimą. Timolis taip pat veikia sinergistiškai su linaloliu, pasižyminčiu antibakteriniu bei priešgrybeliniu aktyvumu [17]. Dar vienas tyrimas, atliktas su dirvinio asiūklio etilo acetato, butanolio ekstraktais, parodė poveikį slopinant P. aeruginosa, S. aureus, B. cereus,
S. cerevisiae ir C. pseudotropicalis bakterijų augimą [22]. Tyrimuose, atliktuose su dirvinio asiūklio
etanoliniais ir metanoliniais ekstraktais, nustatytas abiejų ekstraktų antimikrobinis veikimas prieš Gram neigiamą Escherichia coli bakteriją. Etanolinis ekstraktas taip pat pasižymėjo antimikrobiniu veikimu prieš Staphylococcus epidermidis bakteriją [23,24].
Antiproliferacinis, citotoksinis poveikis. Dirvinių asiūklių žolės ekstraktai pasižymi
priešvėžiniu aktyvumu, geba slopinti melanomos, plaučių karcinomos, leukemijos ląstelių proliferaciją priklausomai nuo ekstrakto koncentracijos [25]. Tiriant dirvinių asiūklių vandeninių ekstraktų poveikį leukemijos ląstelėms, nustatyta, kad mažos koncentracijos ekstraktai slopina vėžinių ląstelių augimą, o didesnės koncentracijos – mažina ląstelių populiaciją. Mažos koncentracijos ekstraktai, priešingai nei didesnės koncentracijos ekstraktai, nesukelia ląstelių apoptozės. Priešvėžiniu aktyvumu labiausiai pasižymi ekstraktuose esantis fenolinis junginys – kvercetinas [26]. Tiriant tris histologiškai skirtingas žmogaus vėžio ląstelių linijas HeLa, HT- ir MCF7 nustatyta, kad dirvinių asiūklių etilacetato ekstraktas pasižymėjo antiproliferaciniu poveikiu, nestimuliuojant žmogaus vėžinių ląstelių linijų augimo [27]. Mokslininkų ištirta, jog dirvinių asiūklių ekstraktas mišinyje su kitais augalais, pasižymi citotoksiniu poveikiu plaučių karcinomai [28].
Hepatoprotekcinis poveikis. Tyrimais įrodytas dirvinių asiūklių žolės metanolinio ekstrakto
Iš tyrimo metu izoliuotų junginių, onitinas ir ypatingai liuteolinas parodė stiprų kepenis apsaugantį veikimą, manoma, dėl antioksidantinio efektyvumo surišant DPPH radikalus [29].
Glikemiją mažinantis poveikis. Moksliniais tyrimais nustatytas dirvinių asiūklių žolės
metanolinio ekstrakto antidiabetinis aktyvumas. Ekstraktas pasižymi gliukozės kiekį kraujyje mažinančiu poveikiu, be jokių ryškesnių kūno svorio pakitimų, pelėms, sergančioms streptozotocino sukeltu diabetu. Tyrimo metu atlikti kasos histologiniai tyrimai parodė ląstelių, nekrozavusių dėl streptomicino poveikio, regeneraciją [30].
Moksliniais tyrimais įrodytas dirvinio asiūklio antioksidantinis, uždegimą mažinantis, antidiabetinis, antibakterinis, priešgrybelinis, konvulsijas slopinantis ir priešvėžinis poveikis [31]. Yra atlikta tyrimų, įrodančių kitų asiūklio žolės rūšių poveikį mažinant cukraus kiekį kraujyje, bei skatinant šlapimo išsiskyrimą [15,32–34].
1.4.
Antioksidantinis aktyvumas ir jo įvertinimo metodai
Medžiagos, kurios veiksmingai redukuoja laisvuosius radikalus - prooksidantus, sudarydamos netoksiškus ar mažai toksiškus junginius, yra vadinamos antioksidantais. Šios medžiagos sumažina arba panaikina laisvųjų radikalų sąlygojamą ląstelių pažeidimą ir tokiu būdu apsaugo biologinius taikinius. Biochemijoje ir medicinoje antioksidantai suprantami kaip fermentai ar kitos organinės medžiagos, tokios kaip vitaminas E, beta-karotenas, gebančios neutralizuoti oksidacijos poveikį gyvūnų audiniams [35].
Tiriamajame darbe pasirinkti, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) radikalų, ABTS (2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) radikalų-katijonų surišimo įvertinimo, FRAP geležies jonų redukcijos antioksidantinės galios, antioksidantiniai tyrimai, kurie yra pagrįsti elektronų perdavimo geba ir skiriasi savo reakcijos mechanizmais, sąlygomis bei taikiniais [35]. Metodai gali būti skirstomi pagal dominuojantį mechanizmą: vandenilio atomo pernešimo ar elektronų perdavimo reakcijos [36]. Pastarosios reakcijos gali vykti tuo pačiu metu ir priklausomai nuo antioksidanto struktūros, savybių ir terpės vyrauja reikalingas mechanizmas [37]. Daugumoje tyrimų, paremtų vandenilio perdavimo reakcijomis, taikoma konkurencinės reakcijos schema, kuomet antioksidantas ir oksidantas konkuruoja dėl termiškai susidariusių peroksilinių radikalų [37]. Plačiausiai taikomi antioksidantinio aktyvumo nustatymo tyrimai yra paremti vandenilio atomo perdavimo reakcijomis ir skirstomi į indukuotos mažo tankio lipoproteinų oksidacijos slopinimą, deguonies radikalų absorbcijos galią (angl. oxygen radical
absorbance capacity ORAC)), antioksidanto bendrą sugautų radikalų nustatymą (angl. total radical trapping antioxidant parameter (TRAP)) ir kroscino blukinimo tyrimą. Šiuose metoduose nustatoma
Elektronų perdavimo reakcijomis nustatomas antioksidanto pajėgumas atiduoti vieną elektroną ir redukuoti oksidantą. Elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstais antioksidantiniais metodais tiriamo junginio reaktyvumas priklauso nuo jo reaktyvių funkcinių grupių jonizacijos potencialo ir deprotonizacijos, kuri daugiausia vyksta didėjant terpės pH reikšmei. Esant rūgštinei terpei antioksidanto redukcinė galia mažėja, priešingai nei esant bazinei terpei [37]. Nepaisant daugybės tyrimų, nėra vieno bendro, patikimo metodo, kuris tiktų įvairiapusiškam tiriamojo mėginio antioksidantiniam poveikiui įvertinti, todėl siekiant gauti tikslesnius ir informatyvesnius rezultatus, turi būti atliekami keli skirtingi antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai [38].
Tyrime taikoma spektrofotometrinė regimosios šviesos absorbcijos pokyčio detekcija, kuri yra lengvai atliekama ir taikoma ekstraktuose esančių junginių bendram antioksidantiam aktyvumui įvertinti.
DPPH radikalų surišimo metodas
Metodas atliekamas in vitro ir jam būdinga elektronų perdavimo reakcija. DPPH yra stabilus organinis azoto radikalų šaltinis, kuris kristalų pavidale yra tamsiai violetinės spalvos (3 pav.). DPPH kristalai yra tirpūs tik organiniuose tirpikliuose, todėl sudėtinga nustatyti hidrofilinius radikalus [37]. Šiam elektronų perdavimu pagrįstam metodui būdingas spalvos pokytis, kuomet ryškiai violetinės spalvos DPPH radikalai yra redukuojami junginių, pasižyminčių antioksidantiniu veikimu, į šviesiai geltonos spalvos (1,1-difenil-2-pikrilo) hidraziną [36]. Spalvos pokyčio laipsnis tiesiogiai koreliuoja su antioksidanto koncentracija mėginyje [39]. Reakcijos eiga lengvai stebima naudojant spektrofotometrinę regimosios šviesos absorbcijos pokyčio detekciją. DPPH azoto radikalo inaktyvinimas organinėje terpėje ir šviesos absorbcijos maksimumas stebimas bangos ilgio 515 – 528 nm intervale [35]. DPPH absorbciją veikia šviesa, deguonis ir mėginio reakcijos pH [40]. Naudojant absorbcijos pokyčio reikšmes nubraižoma standartinio antioksidanto (trolokso) kalibracinė kreivė. Tiriamojo mėginio antiradikalinis aktyvumas, surišant DPPH azoto radikalus, išreiškiamas kaip standartiniam antioksidantui ekvivalentiška koncentracija [35,37].
3 pav. DPPH radikalas [35]
ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas
Tyrimuose naudojamas ABTS reagentas (2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis). ABTS.+ radikalas-katijonas yra stabilus, tirpus tiek vandenyje tiek organiniuose tirpikliuose, todėl yra
lengvai pritaikomas hidrofilinių ir lipofilinių junginių antioksidantiniam aktyvumo nustatymui. Priešingai nei DPPH radikalai, ABTS katijonai pirmiausia turi būti pagaminti. ABTS radikalai-katijonai gali būti gaminami cheminių reagentų, fermentinių reakcijų arba elektrocheminės reakcijos pagalba [37]. Chemine reakcija vykstanti ABTS radikalų-katijonų generacija yra lėtas procesas (naudojant oksidatorių - kalio persulfatą reakcija vyksta 16 valandų, kol tirpalas tampa tamsiai mėlynos spalvos). Reakcijos metu tirpalas laikomas kambario temperatūroje, tamsoje [35]. Po sąveikos tarp susidariusių ABTS radikalų-katijonų ir antioksidanto (praėjus 30 min. ar mažiau) matuojama absorbcija, esant 734 nm bangos ilgiui (4 pav.). Pagrindinis šio metodo privalumas yra eksperimentinių sąlygų paprastumas [41]. Troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) kaip analogas vitaminui E, yra naudojamas kaip antioksidanto standartas ir jo ekvivalentu išreiškiamas ABTS radikalų-katijonų surišimo aktyvumas [42].
4 pav. ABTS radikalo-katijono sąveika su antioksidantu [35]
FRAP geležies jonų redukcijos antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas
Geležies jonų redukcijos antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas (FRAP) taip pat yra pagrįstas elektronų perdavimo reakcija ir padeda įvertinti antioksidanto aktyvumą redukuojant trivalentę geležį. Metodas remiasi geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ komplekso redukcija į [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ kompleksą (5 pav.) [42].
5 pav. [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ komplekso redukcija į [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ kompleksą, veikiant antioksidantui [35]
Trivalentės geležies druska savo redokso potencialu yra panaši į ABTS.-. FRAP tyrimas
atliekamas esant rūgštinėmis (pH=3,6) sąlygomis [35]. Redukcija stebima matuojant absorbcijos pokytį, esant 593 nm bangos ilgiui, naudojant spektrofotometrą. Absorbcija matuojama po paruošto FRAP reagento ir tiriamo mėginio sąveikos praėjus 30 min [42]. Šio metodo privalumas yra eksperimentinių sąlygų paprastumas [35].
1.5.
Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Literatūroje rašoma, kad vaistinė augalinė žaliava yra dirvinių asiūklių žolė (Equisetum
arvense L. herba) ir vadovaujantis Europos Farmakopėja yra naudojami sveiki arba supjaustyti,
sudžiovinti vegetatyviniai dirvinių asiūklių stiebai, kurie yra renkami visą vasarą.
Dirvinių asiūklių žolėje gausu sterolių, fenolinių rūgščių, polieninių rūgščių, flavonoidų, fenolinių petrosinų, triterpenoidų, fitosterolių. Dirvinių asiūklių žaliavai ir jo preparatams būdingas biologinis aktyvumas - pasižymi diuretiniu, anksiolitiniu, prieštraukuliniu, antimikrobiniu, antibakteriniu, priešgrybeliniu, antiproliferaciniu, citotoksiniu, hepatoprotekciniu bei glikemiją mažinančiu poveikiu.
DPPH radikalų, ABTS radikalų - katijonų surišimo įvertinimo, FRAP geležies jonų redukcijos antioksidantinės galios antioksidantiniai tyrimai yra plačiai taikomi ir pagrįsti elektronų perdavimo geba.
2. TYRIMO METODIKA
2.1.
Tyrimų objektas
Tyrimų objektas - Lietuvos klimato sąlygomis augančių asiūklių žolės ėminiai, rinkti iš įvairių Lietuvos augaviečių (n=8), 2016 m. rugpjūčio mėnesį (1 lentelė).
6 pav. Tyrimuose naudotų asiūklių žolės ėminių augavietės (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:LithuaniaForWeather.png)
Surinkti dviejų rūšių – dirvinių ir miškinių asiūklių žolės ėminiai. Penki dirvinių asiūklių (E.
arvense L.) žolės ėminiai surinkti skirtingose augavietėse (6 pav.), esančiose Šilutės, Plungės, Prienų,
Šalčininkų ir Biržų rajonuose. Trys miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolės ėminiai rinkti Biržų, Anykščių ir Kauno rajonų augavietėse.
2.2.
Naudoti reagentai
Tyrimams naudoti reagentai, atitinkantys analitinį švarumą: Folin-Ciocalteu („Sigma – Aldrich“, Vokietija) reagentas, natrio karbonatas („ROTH“, Vokietija), etanolis (96 proc. V/V) (UAB „Stumbras“, Lietuva), acto rūgštis (100 proc.) (UAB „Fasuotos cheminės medžiagos“, Lietuva) , aliuminio chloridas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), urotropinas (heksametilentetraminas) („Lachema“,
Čekija), vandenilio chlorido rūgštis („Sigma – Aldrich“ Vokietija), natrio molibdatas („Sigma – Aldrich“ Vokietija), natrio nitritas („Sigma – Aldrich“ Vokietija), natrio šarmas („Sigma – Aldrich“ Vokietija), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) (95 proc.) radikalas („Sigma – Aldrich“ Vokietija), ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono)) rūgštis („Alfa Aesar“, Vokietija), išgrynintas vanduo, kalio persulfatas („Alfa Aesar“, Vokietija), natrio acetato buferis („Sigma – Aldrich“, Vokietija), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) („Alfa Aesar“, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas („Alfa Aesar“, Vokietija), galo rūgšties monohidratas („Sigma – Aldrich“ Vokietija), kvercetinas, chlorogeno rūgštis („Sigma – Aldrich“ Šveicarija), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksi rūgštis) („Sigma – Aldrich“ Vokietija).
2.3.
Naudota aparatūra
Asiūklių žolės ėminiai smulkinti naudojantis elektriniu malūnu IKA (Vokietija) ir reagentai atsverti analitinėmis svarstyklėmis Sartorius Lab Instruments GmbH &Co. KG, 37070 goettingen, Germany. Siekiant optimizuoti mėginių ekstrakcijos sąlygas ir atlikti mėginių ekstrakciją, naudota ultragarso vonelė - Elmasonic P 120 H (Vokietija). Naudota centrifuga ThermoFisher scientific "Biofuge stratops" (Vokietija). Spektrofotometriniai metodai, skirti nustatyti mėginių bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidantinį aktyvumą, atlikti naudojantis spektrofotometru Spectronic Camspec M550 (Vokietija). Chromatografinė analizė atlikta su Waters e2695 Alliance ( „Waters“, Milfordas, MA, JAV) sistema su diodų matricos detektoriumi Waters 2998. Skirstymui atlikti naudota ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) kolonėlė (150 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 3 μm) su ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) prieškolone (dalelių dydis 3 μm).
2.4.
Tiriamojo mėginio paruošimas
Dirvinių ir miškinių asiūklių žolė džiovinta kambario temperatūroje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių ir laikant sausoje vietoje, paskleidus plonu sluoksniu ir periodiškai vartant. Išdžiovinta žaliava susmulkinta elektriniu smulkintuvu.
Ekstraktams paruošti imama po 0,1 g susmulkintos žaliavos ir užpilama 10 ml 55 proc. V/V etanolio. Ekstrakcija atliekama ultragarso vonelėje 60 min. Visi paruošti mėginiai ekstrahuojami ultragarso vonelės galiai esant 70 proc. Gauti ekstraktai 5 min centrifuguojami esant 1000 rpm, ir filtruojami per membraninį filtrą, kurio poros dydis 0,2 μm. Gauti skaidrūs ekstraktai supilstomi į rudo
stiklo buteliukus, sandariai uždaromi ir laikomi tamsioje vietoje, esant kambario temperatūrai. Iš kiekvieno žaliavos mėginio paruošta po 3 ekstraktus.
2.5.
Tyrimų metodai
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras fenolinių junginių kiekis asiūklių žolės ekstraktuose nustatytas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu.
100 µl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 2000 µl darbinio Folin-Ciocalteu reagento (motininis Folin-Ciocalteu tirpalas skiestas distiliuotu vandeniu 10 kartų) ir 1600 µl 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo. Gerai sumaišytas mėginys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Palyginamasis tirpalas ruošiamas analogiškomis sąlygomis, tik vietoje asiūklių žolės ekstrakto naudotas 100 µl 55 proc. V/V etanolis, kuris sumaišomas su 2000 µl darbinio Folin-Ciocalteu reagentu ir 1600 µl 7,5 proc. Na2CO3 tirpalu. Po valandos spektrofotometru matuojama tiriamųjų mėginių absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui [43].
Bendras fenolinių junginių kiekis asiūklių augalinėje žaliavoje išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui sausos žaliavos (mg/g), naudojantis galo rūgšties kalibracinės kreivės tiesine regresijos lygtimi (y = 0,3503x + 0,0091; R2 = 0,9992; p<0,05).
Apskaičiuojama pagal formulę:
GRE = C ∙V ∙am ; mg/g
C – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);
a – skiedimo faktorius;
m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g)
Galo rūgšties kalibracinė kreivė formuojama ruošiant etaloninius galo rūgšties tirpalus 96 proc. (V/V) etanolyje.
2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras flavonoidų kiekis asiūklių žolės ekstraktuose nustatytas naudojant aliuminio chlorido reagentą.
Į 5 ml matavimo kolbutę pilama 800 µl augalinės žaliavos ekstrakto, 2000 µl 96 proc. V/V etanolio, 100 µl 30 proc. acto rūgšties tirpalo ir 300 µl 10 proc. aliuminio chloride tirpalo. Mišinys laikomas tamsoje. Po 30 minučių pilama 400 µl 5 proc. urotropino (heksametilentetramino) tirpalo ir skiedžiama vandeniu iki 5 ml. Palyginamasis tirpalas ruošiamas analogiškai tiriamajam mėginiui, tačiau nepilamas aliuminio chloridas ir urotropinas, vandeniu skiedžiama iki 5 ml. Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 407 nm šviesos bangos ilgiui [44–46].
Bendras flavonoidų kiekis asiūklių augalinėje žaliavoje išreikštas rutino ekvivalentais gramui absoliučiai sausos žaliavos (mg/g), pagal rutino kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtį (y = 0,2733x – 0,0049; R2 = 0,9983;p<0,05). Apskaičiuojama pagal formulę:
C (mg/g) = C ∙V ∙am
C – rutino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);
a – skiedimo faktorius;
m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g)
2.5.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis asiūklių žolės ekstraktuose nustatytas naudojant farmakopėjinį metodą su Arnow reagentu [14,47].
Kiekvieno tiriamojo ekstrakto analizei paruošti du mėginiai – tiriamasis ir palyginamasis. Ruošiant tiriamąjį mėginį imamas 1 ml tiriamojo ekstrakto ir į jį pridedama 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml Arnow reagento (mišinys sudarytas iš 10 proc. natrio molibdato tirpalo ir 10 proc. praskiesto natrio nitrito tirpalo santykiu 1:1), 2 ml praskiesto natrio hidroksido tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Ruošiant palyginamąjį tirpalą į 1 ml tiriamojo ekstrakto pridedami 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml praskiesto natrio hidroksido tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml.
Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis išreikštas chlorogeno rūgšties ekvivalentais gramui absoliučiai sausos žaliavos (mg/g), pagal chlorogeno rūgšties kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtį (y = 0,5636x + 0,017; R2 = 0,9978;p<0,05). Apskaičiuojama pagal formulę:
C (mg/g) = C ∙V ∙am
C – chlorogeno rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);
a – skiedimo faktorius;
m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g)
2.5.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika asiūklių žolės ėminių fenolinių junginių kokybinei ir kiekinei sudėčiai nustatyti
Judrioji fazė sudaryta iš dviejų eliuentų (A ir B). Eliuentas A – 0,05 proc. trifluoracto rūgštis, eliuentas B – acetonitrilas. Naudotas gradiento kitimas: 0 – 5 min. 12 proc. B, 5–50 min. 12–30 proc. B, 50–51 min. 30–90 proc. B, 51–56 min. 90 proc. B, 57 min. 12 proc. B. Eliuentų tėkmės greitis buvo 0,5 ml/min., injekcijos tūris – 10 µl. Palaikoma 25°C temperatūra. Smailės atskiriamos nuo lydinčių junginių, o jų grynumas įvertinamas pagal UV absorbcijos spektrą (200-400 nm). Atsižvelgiant į analičių bei etaloninių junginių sulaikymo laikus bei lyginant analičių ir etaloninių junginių UV absorbcijos spektrus sudaromos ir identifikuojamos chromatografinės smailės. Kiekinis analičių įvertinimas buvo atliktas remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale. Rutino, izokvercitrino, kvercetino 3-O-(6''-O-malonil)-gliukozido, astragalino kiekiai asiūklių žolės etanoliniuose ekstraktuose skaičiuoti bangos ilgiui esant 350 nm, neochlorogeno rūgšties ir chlorogeno rūgšties – 325 nm.
2.5.5. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas DPPH radikalų surišimo gebos metodu
Darbinis DPPH tirpalas ruošiamas 60 µM DPPH tirpalo skiedžiant 96,3 proc. (V/V) etanoliu, kol matuojant šviesos absorbciją prie 515 nm šviesos bangos ilgio, nustatoma stabili 0,8 ± 0,005 absorbcija.
Tiriamasis tirpalas gaminamas į mėgintuvėlį pilant 3 ml darbinio DPPH tirpalo ir 0,03 ml tiriamojo ekstrakto. Tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas tamsoje, kambario temperatūroje.
Tiriamojo mėginio šviesos absorbcijos sumažėjimas matuojamas po 30 minučių, esant 515 nm šviesos bangos ilgiui.
Antioksidantinis aktyvumas apskaičiuojamas pagal standartinio antioksidanto trolokso kalibracijos lygtį (y = -1,0014x + 0,7639, R2 = 0,9972; p<0,05) ir išreiškiamas mg TE/ml. Sausos tiriamosios žaliavos antioksidantinis aktyvumas apskaičiuojamas, naudojantis formule:
x = c ∙V m
(
mg TE/ml)c – antioksidantinis aktyvumas (mg TE/g);
V – ekstrahento, naudoto ekstrakto gamybai, tūris (ml); m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g)
2.5.6. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas ABTS katijonų – radikalų surišimo gebos metodu
Pradinis ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke, 2mM ABTS miltelių ištirpinus 50
ml distiliuoto vandens. Vėliau pridedama 0,7 mM kalio persulfato miltelių. Gautas tirpalas gerai sumaišomas ir laikomas 16 – 17 valandų nuo šviesos apsaugotoje vietoje, kambario temperatūroje. Pradinis ABTS tirpalas, laikant tinkamose sąlygose, stabilus gali išlikti ilgiau nei dvi paras.
Darbinis ABTS tirpalas gautas praskiedus pradinį tirpalą distiliuotu vandeniu, kol tirpalo šviesos absorbcija, matuojant prie 734 nm bangos ilgio, pasiekia 0,8 ± 0,005 absorbcijos vienetų. Palyginamasis tirpalas - distiliuotas vanduo.
Tiriamasis tirpalas gaminamas į 3 ml darbinio ABTS tirpalo pridedant 0,01 ml tiriamojo asiūklių žolės ekstrakto. Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo. Paruoštas tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandai. Spektrofotometru, esant 734 nm bangos ilgiui, matuojama tirpalo šviesos absorbcija.
Pagal standartinio antioksidanto trolokso kalibracinę regresijos lygtį (y = -2,0327x + 1,5801; R2 = 0,9901; p<0,05) nustatomas asiūklių žolės antioksidantinis aktyvumas surišant radikalus ir išreiškiamas trolokso ekvivalentais mg TE/ml.
Sausos tiriamosios žaliavos antioksidantinis aktyvumas apskaičiuojamas remiantis nurodyta formule:
c – antioksidantinis aktyvumas (mg TE/g);
V – ekstahento, naudoto tiriamojo ekstrakto gamybai, tūris (ml); m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g)
2.5.7. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas FRAP (geležies jonų redukcijos antioksidantinės galios) metodu
Darbinis FRAP tirpalas gaminamas santykiu 10:1:1 , iš 300 mM natrio acetato (CH3COONa) buferinio tirpalo, 10 mM TPTZ tirpalo 40 Mm druskos rūgštyje ir 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato vandeninio tirpalo.
Tiriamasis tirpalas gaminamas į 3 ml FRAP reagento pridedant 10 μl asiūklių žolės ekstrakto ir gerai išmaišant. Tirpalas laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Palyginamasis tirpalas ruošiamas analogiškai, tik vietoje asiūklių žolės ekstrakto pridedama 10 µl distiliuoto vandens. Paruošti tirpalai laikomi 1 valandą. Spektrofotometru, prie 593 nm bangos ilgio, išmatuota tirpalo absorbcija.
Pagal trolokso kalibracinę lygtį (y = 1,6506x + 0,0035; R2 = 0,9981; p<0,05) nustatomas asiūklių žolės antioksidantinis aktyvumas, išreiškiamas mg TE/g.
Antioksidantinis aktyvumas asiūklių žolėje apskaičiuojamas taikant formulę:
x = c ∙V m
c – antioksidantinis aktyvumas (mg TE/g);
V – ekstrahento, naudoto tiriamojo ekstrakto gamybai, tūris (ml); m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g)
2.6.
Duomenų analizės metodai
Gautų duomenų statistinis apdorojimas atliktas naudojant kompiuterinę programą Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, JAV). Dirvinių ir miškinių asiūklių augalinių žaliavų kiekybinės analizės duomenys pateikti įvertinus gautų tyrimų rezultatų vidurkius ir standartinius nuokrypius. Determinacijos koeficientas R2 apskaičiuotas siekiant įvertinti tiesinės regresijos modelio tinkamumą. Kiekybinių duomenų vidurkiai lyginti taikant ANOVA analizę. Koreliaciniai ryšiai įvertinti taikant Pirsono tiesinės regresijos koeficientą. Reikšmingumo lygmeniu pasirinktas a=0,05 ir rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, kuomet p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1.
Dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ir miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.)
augalinių žaliavų ekstrakcijos sąlygų optimizavimas
Augalinėse žaliavose esančios biologiškai aktyvios medžiagos išekstrahuojamos pritaikant tam tikras ekstrakcijos sąlygas. Siekiant pagaminti kokybiškus ekstraktus, kuriuose būtų daugiausiai veikliųjų medžiagų, reikalinga nustatyti optimalias ekstrakcijos sąlygas.
Ekstrakcijos laikui, etanolio koncentracijai ir ultragarso vonelės galiai nustatyti naudojama paviršiaus atsako metodika. Paviršiaus atsako metodologijos dizainas sukurtas naudojant „Design-Expert 11.0.5.0“ programą. Šis dizainas pritaikytas nustatyti tyrime atliekamos ekstrakcijos optimalias sąlygas: ekstrakcijos laiką, etanolio koncentraciją ir ultragarso vonelės galią. Pasirinkti trys nepriklausomi kintamieji: etanolio koncentracija - A (30–70 proc.) ekstrakcijos laikas - B (20-60 min) ir ultragarso vonelės galia - C (25-75 proc.). Paviršiaus atsako metodikos pagalba įvertinta kintamųjų įtaka bendrai fenolinių junginių išeigai (TFC). Pagal kvadratinio modelio nurodytas sąlygas (ekstrakcijos laiką, etanolio koncentraciją ir ultragarso vonelės galią) buvo ruošiami dirvinių ir miškinių asiūklių ekstraktai.
Remiantis eksperimentinių duomenų regresine analize, bendro fenolinių junginių kiekio (TFC) priklausomybė nuo ekstrakcijos laiko, etanolio koncentracijos ir ultragarso vonelės galios išreikšta kvadratine daugianare lygtimi (koduotų verčių forma):
Y (TFC) = 14,60 + 1,10*A + 0,7160*B + 0,3385*C + 0,1238 *AB + 0,0578*AC + 0,1882*BC – 1,51*A2 – 0,0467*B2 + 0,1475*C2
Tinkamam modeliui gauti, R2 vertė turi būti didesnė nei 0,80 [49]. Šiame tyrime R2 vertė atsako kintamiesiems buvo tinkama patikimam modeliui gauti (R2 = 0,9688) . Ekstrakcijos sąlygų poveikis, fenolinių junginių išeigai, vaizduojamas sudarant paviršiaus atsako modelio grafiką. Trimatis paviršiaus atsako modelis yra grafinis regresijos lygties vaizdas, kuris yra naudingas vertinant santykių reikšmingumą tarp nepriklausomų ir priklausomų kintamųjų. Trijų kintamųjų - ekstrakcijos laiko, etanolio koncentracijos ir ultragarso vonelės galios, įtaka, fenolinių junginių išeigai, pavaizduota trimačiame grafike su 3D paviršiaus plotu (7-9 pav.).
7 pav. Paviršiaus atsako plotas vaizduojantis etanolio koncentracijos (A) ir ekstrakcijos laiko (B) poveikį fenolinių junginių išeigai. C (ultragarso vonelės galia) = 70 proc.
8 pav. Paviršiaus atsako plotas vaizduojantis etanolio koncentracijos (A) ir ultragarso vonelės galios (C) poveikį fenolinių junginių išeigai. B (ekstrakcijos laikas) = 60 min.
9 pav. Paviršiaus atsako plotas vaizduojantis ekstrakcijos laiko (B) ir ultragarso vonelės galios (C) poveikį fenolinių junginių išeigai. A (etanolio koncentracija) = 55 proc.
Didėjant etanolio koncentracijai fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga didėja, tačiau etanolio koncentracijai pasiekus 60 proc. fenolinių junginių ekstracijos išeiga ima mažėti (7-8 pav.). Ilgėjant ekstrakcijos laikui iki 60 minučių fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga tolygiai didėja (7, 9 pav.). Tolimesniuose tyrimuose ekstrakcijai atlikti buvo pasirinkta 60 min. laiko trukmė. Didėjant ultragarso vonelės galiai iki 75 proc., fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga nežymiai didėja (8-9 pav.).
Bendras fenolinių junginių kiekis asiūklių žolėje varijavo nuo 7,79 mg GAE/g iki 15,75 mg GAE/g, priklausomai nuo tiriamų parametrų.
Taikant paviršiaus atsako metodą ir remiantis gautais tyrimo rezultatais parinktos optimalios ekstrakcijos sąlygos: etanolio koncentracija 55 proc., ekstrakcijos laikas 60 min., bei ultragarso vonelės galia 70 proc.
3.2.
Bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir hidroksicinamono rūgšties darinių
kiekio nustatymas E. arvense L. ir E. sylvaticum L. žolės ėminių
ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas augalinėje žaliavoje yra labai svarbus rodiklis vertinant asiūklių augalinės žaliavos kokybę. Esant didesniam fenolinių junginių kiekiui, galima tikėtis, kad augalinė žaliava pasižymės didesniu antioksidantiniu aktyvumu. Fenolinių junginių kiekinės
sudėties analizė yra aktuali asiūklių žaliavą naudojant medicininiais tikslais bei kuriant naujas panaudojimo galimybes. Fenolinių junginių kiekis gali varijuoti priklausomai nuo augalinės žaliavos augimo sąlygų [48], todėl svarbu ištirti skirtingų asiūklių žolės, rinktos įvairiose Lietuvos augavietėse, ekstraktų fenolinių junginių kiekio varijavimą.
Bendras fenolinių junginių kiekis asiūklių žolės ekstraktuose nustatytas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. Fenolinių junginių kiekio tyrimo rezultatai pateikti 10 paveikslėlyje.
Bendras fenolinių junginių kiekis skirtinguose asiūklių žolės mėginiuose įvairavo nuo 3,934 ± 0,882 mg/g iki 35,964 ± 3,693 mg/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis (35,964 ± 3,693 mg/g) nustatytas miškinių asiūklių žolėje, surinktoje Biržų rajone, Spalviškių kaime (p<0,05). Mažiausiai fenolinių junginių (3,934 ± 0,882 mg/g) nustatyta dirvinių asiūklių žolėje, surinktos Glaudžių k. Plungės rajone (p<0,05). Šio tyrimo metu nustatyta, kad didžiausius fenolinių kiekius kaupia miškiniai asiūkliai augantys Spalviškių k. Biržų rajone bei dirviniai asiūkliai augantys Šiškrantės k. Šilutės rajone, Kaniūkų k. Šalčininkų rajone bei Anglininkų k. Biržų rajone.
10 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas dirvinių ir miškinių asiūklių žolės mėginiuose
Serbijoje (J. Brunet, 2009) ir Bosnijoje ir Hercegovinoje (Z. Kukrić, 2013) atlikti fenolinių junginių kiekį dirvinių asiūklių žolėje įvertinantys tyrimai. Serbijoje atlikto tyrimo metu nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis dirvinių asiūklių žolėje varijuoja nuo 15,4 ± 0,76 mg/g iki 96,4 ± 4,81 mg/g [22], oBosnijoje ir Hercegovinoje atliktame tyrime nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis dirvinių asiūklių žaliavoje yra 355,80 ± 17,8 mg/g [4]. Lyginant pastarųjų tyrimų duomenis su šiuo tyrimu, kurio metu dirvinių asiūklių ėminių ekstraktuose nustatytas fenolinių junginių kiekis varijuoja
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Šiškrantės k., Šilutės r. Glaudžių k., Plungės r. Papilvio k., Prienų r. Kaniūkų k., Šalčininkų r. Anglininkų k., Biržų r. Spalviškių k., Biržų r. Keblonių k., Anykščių r. Leonavo k., Kauno r. K ieki s (m g/g) Asiūklių augavietės E. arvense L. E. sylvaticum L.
nuo 3,934 ± 0,882 mg/g iki 18,544 ± 0,436 mg/g, galima teigti, kad augimo sąlygos Lietuvoje nėra optimalios asiūkliams kaupti fenolinius junginius. Neatmetama galimybė, kad įtakos fenolinių junginių kiekiui gali turėti naudojamos skirtingos ekstrakcijos sąlygos.
Flavonoidai yra bene labiausiai paplitusios, biologiškai aktyvios medžiagos aptinkamos augaliniuose maisto produktuose. Atlikta daugybė tyrimų, kuriuose nustatomas flavonoidų antioksidantinis aktyvumas. Tyrimu metu nustatyta, kad flavonoidai yra biologiškai aktyvios medžiagos, pasižyminčios įvairiu teigiamu poveikiu žmogaus organizmui ir jų vartojimas pagrįstas antiopiniu, priešuždegiminiu, citotoksiniu, priešvėžiniu, antispazminiu, antidepresiniu bei antioksidantiniu veikimu [49,50]. Flavonoidų kiekis augalinės žaliavos mėginyje siejamas su augalinės žaliavos kokybe [46].
Bendras flavonoidų kiekis asiūklių žolės ekstraktuose nustatytas naudojant aliuminio chlorido reagentą ir rutiną kaip standartinį flavonoidą. Šis metodas paremtas komplekso susiformavimu tarp flavonoido ir aliuminio [44]. Flavonoidų kiekio tyrimo rezultatai pateikti 11 paveikslėlyje.
Tyrimo metu flavonoidų kiekis asiūklių žolės mėginiuose įvairavo nuo 0,791 ± 0,291 mg/g iki 14,765 ± 0,161 mg/g. Didžiausias kiekis flavonoidų nustatytas Equisetum arvense L. žolėje (14,765 ± 0,161 mg/g), kuri surinkta Šiškrantės k., Šilutės rajone (p<0,05). Tiriant miškinių asiūklių žolės ėminius, nustatyta, kad didžiausią flavonoidų kiekį (9,473 ± 1,220 mg/g) kaupia Keblonių k. Anykščių rajone surinkta augalinė žaliava, mažiausiai – Spalviškių k. Biržų rajone rinkta žaliava (1,839 ± 0,256 mg/g) (p<0,05). Dirvinių asiūklių žolės ėminiuose mažiausią flavonoidų kiekį kaupia augalinė žaliava (0,791 ± 0,291 mg/g), surinkta Glaudžių k. Plungės rajone.
Didžiausi kiekiai flavonoidų nustatyti dirvinių asiūklių ėminiuose, kurių augavietės yra Šiškrantės k. Šilutės rajonas, Kaniūkų k. Šalčininkų rajonas bei miškinių asiūklių ėminyje, surinktame Keblonių k. Anykščių rajone.
11 pav. Bendro flavonoidų kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių ir miškinių asiūklių žolės mėginiuose
Serbijoje atlikto tyrimo metu nustatytas bendras flavonoidų kiekis Equisetum arvense L. žolėje varijuoja nuo 4,89 mg/g (H2O ekstraktas) iki 135,01 mg/g (n-BuOH ekstraktas). Etilo acetato ekstrakte nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis 17,47 mg/g [16]. Šiame tyrime tirta dirvinių asiūklių žolė surinkta gegužės mėnesį Fruska Gora kalnuose, Serbijos provincijoje. Analizuojant literatūrą, galima pastebėti, kad tyrimuose, kuriuose asiūklių žolė rinka anksčiau - gegužės ar birželio mėnesiais, nustatytas flavonoidų kiekis žaliavoje yra ženkliai didesnis [51].
Flavonoidų kiekis varijuoja priklausomai nuo žaliavos rinkimo laikotarpio, todėl pastebima, jog dirvinių asiūklių žolė vegetacijos pradžioje – gegužės ir birželio mėnesiais, kaupia didesnį kiekį flavonoidų, lyginant su šiame tyrime tirta augaline žaliava, surinkta rugpjūčio mėnesį.
Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis asiūklių (E. arvense L. ir E. sylvaticum L.) žolės ėminiuose nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant Arnow reagentą.
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Šiškrantės k., Šilutės r. Glaudžių k., Plungės r. Papilvio k., Prienų r. Kaniūkų k., Šalčininkų r. Anglininkų k., Biržų r. Spalviškių k., Biržų r. Keblonių k., Anykščių r. Leonavo k., Kauno r. K ieki s (m g/g) Asiūklių augavietės E. arvense L. E. sylvaticum L.
12 pav. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (mg/g) įvairavimas dirvinių ir miškinių asiūklių žolės ėminiuose
Skirtinguose asiūklių žolės ėminių ekstraktų mėginiuose bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis varijuoja nuo 5,399 ± 0,835 mg/g iki 20,505 ± 1,093 mg/g (12 pav.). Didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatytas miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolėje (20,505 ± 1,093 mg/g), kuri surinkta Spalviškių k., Biržų rajone (p<0,05). Mažiausias kiekis hidroksicinamono rūgšties darinių nustatytas miškinių asiūklių žaliavoje (5,399 ± 0,835 mg/g), kurios augavietė yra Leonavo k., Kauno rajonas (p<0,05). Dirvinių asiūklių žolės ėminių ekstraktuose hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis įvairavo nuo 5,963 ± 0,837 mg/g iki 20,302 ± 1,164 mg/g. Dirvinių asiūklių augalinė žaliava, surinkta Šiškrantės k. Šilutės rajone kaupia didžiausią kiekį hidroksicinamo rūgšties darinių (20,302 ± 1,164 mg/g) (p<0,05).
3.3.
Antioksidantinio aktyvumo nustatymas E. arvense L. ir E. sylvaticum L.
žolėje DPPH, ABTS, FRAP metodais
Asiūklių (E. arvense L. ir E. sylvaticum L.) žolės ėminių ekstraktų antioksidantinis aktyvumas nustatytas ABTS, DPPH ir FRAP spektrofotometriniais metodais.
DPPH metodu nustatytas dirvinių ir miškinių asiūklių antioksidantinis aktyvumas varijuoja nuo 6,249 ± 0,199 (mg TE/g) iki 41,624 ± 2,822 (mg TE/g) (13 pav.). Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu
0 5 10 15 20 25 Šiškrantės k., Šilutės r. Glaudžių k., Plungės r. Papilvio k., Prienų r. Kaniūkų k., Šalčininkų r. Anglininkų k., Biržų r. Spalviškių k., Biržų r. Keblonių k., Anykščių r. Leonavo k., Kauno r. K ieki s (m g/g) Asiūklių augavietės E. arvense L. E. sylvaticum L.
(p<0,05) pasižymi miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolė (41,624 ± 2,822 mg TE/g), surinkta Spalviškių k. Biržų rajone. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas dirvinių asiūklių (E. arvense L.) žolėje (6,249 ± 0,199 mg TE/g), kurios augavietė yra Glaudžių k. Plungės rajonas.
13 pav. Dirvinių ir miškinių asiūklių žolės ėminių antioksidantinio aktyvumo, įvertinto spektrofotometriniu DPPH metodu, įvairavimas
Brunet et al. (2009) atliktame tyrime antioksidantinis aktyvumas DPPH metodu nustatytas dirvinių asiūklių žolės skirtingos koncentracijos etilo acetato, butanolio ir vandeniniuose ekstraktuose. Nustatyta, jog visuose ekstraktuose antiradikalinis aktyvumas priklauso nuo ekstrakto koncentracijos. Butanolio ekstrakte, koncentracijai esant 1,5 mg/ml, nustatytas didžiausias antiradikalinis aktyvumas (100 proc.). Etilo acetato ekstraktas ir vandeninis ekstraktas esant tokiai pačiai koncentracijai (1,5 mg/ml) DPPH radikalų surišo ženkliai mažiau - atitinkamai 43,5 proc. ir 31,6 proc. Tačiau, esant didesnei etilo acetato ir vandeninio ekstrakto koncentracijai (2,50 mg/ml), nustatytas reikšmingas antiradikalinis aktyvumas [22].
Šiame tyrime ABTS metodu nustatytas dirvinių ir miškinių asiūklių antioksidantinis aktyvumas varijuoja nuo 16,848 ± 1,944 (mg TE/g) iki 78,628 ± 13,102 (mg TE/g) (14 pav.). Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu (p<0,05) pasižymi miškinių asiūklių (E. sylvaticum L.) žolė (78,628 ± 13,102 mg TE/g), surinkta Spalviškių k. Biržų rajone. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas (p<0,05) nustatytas dirvinių asiūklių (E. arvense L.) žolėje (16,848 ± 1,944 mg TE/g), kurios augavietė yra Glaudžių k. Plungės rajone.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Šiškrantės k., Šilutės r. Glaudžių k., Plungės r. Papilvio k., Prienų r. Kaniūkų k., Šalčininkų r. Anglininkų k., Biržų r. Spalviškių k., Biržų r. Keblonių k., Anykščių r. Leonavo k., Kauno r. K ieki s (m g T E /g ) Asiūklių augavietės E. arvense L. E. sylvaticum L.
