FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
MIGLĖ BALTRUKONYTĖ
JUODAVAISIŲ ARONIJŲ (ARONIA MELANOCARPA (MICHX.)
ELLIOTT) VAISIŲ IR LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR
KIEKINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Dr. Kristina Zymonė 2017 m. Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis 2018 m. – 2019 m.
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
JUODAVAISIŲ ARONIJŲ (ARONIA MELANOCARPA (MICHX.)
ELLIOTT) VAISIŲ IR LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR
KIEKINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Kristina Zymonė 2017 m.
Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis 2018 m. – 2019 m.
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė
Data Miglė Baltrukonytė Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Aronijų (Aronia Medik) genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir morfologiniai požymiai . ... 10
1.2. Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai ... 11
1.3. Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) kaupiamų biologiškai aktyvių junginių metabolizmas ir poveikio tyrimai ... 14
1.4. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ... 20
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ... 21
2.4. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių ištraukų paruošimas ... 21
2.5. Tyrimo metodai ... 22
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 22
2.5.2. Bendro antocianinų kiekio nustatymas ... 22
2.5.3. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas ... 23
2.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu FRAP metodu ... 23
2.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu ABTS metodu ... 24
2.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu CuPRAC metodu ... 25
2.9. Antioksidacinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas ... 25
2.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 25
2.11. Tyrimo duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymas .. ... 27
3.2. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvertinimas juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminiuose ... 29
3.3. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro
nustatymas ... 33
3.4. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas ESC metodu ... 36
3.5. Juodavaisių aronijų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 42
3.6. Rezultatų apibendrinimas ... 44
4. IŠVADOS ... 45
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 48
M. Baltrukonytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Kristina Gaivelytė 2017 m., prof. habil. dr. Valdimaras Janulis 2018 m. – 2019 m.; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas. Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų fenolinių
junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimas.
Darbo tikslas. Ištirti Lietuvoje augančių juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių
kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Uždaviniai. Ištirti bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą skirtingose Lietuvos vietovėse augančių
juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminiuose, taikant spektrofotometrinį metodą. Ištirti bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimą juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminiuose, taikant spektrofotometrinį metodą. Nustatyti juodavaisių aronijų vaisių ėminių antocianinų kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą. Nustatyti juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių ištraukų antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu. Ištirti juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, taikant ESC metodą.
Tyrimo objektas ir metodai. Tirti Lietuvos klimato sąlygomis augančių juodavaisių aronijų surinktų iš
10 skirtingų vietovių vaisių ir lapų ėminiai. Bendras fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių, antocianinų ir antioksidacinis aktyvumas in vitro nustatytas UV/VIS spektrofotometriniu analizės metodu. Fenolinių junginių sudėties analizė atlikta taikant ESC metodą.
Tyrimo rezultatai ir išvados. Didžiausias bendras fenolinių junginių ir bendras hidroksicinamono
rūgšties darinių kiekis nustatytas surinktose Ėriškių k. (Panevėžio raj.) juodavaisių aronijų vaisių žaliavose (atitinkamai 47,89±1,36 mg GRE/g, 21,9±0,95 mg CRE/g (p<0,05). Didžiausias bendras antocianinų kiekis – Paįstrio k. (Panevėžio raj.) (6,67±0,95 mg CGE/g (p<0,05)) rinktose vaisių žaliavose. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis juodavaisių aronijų lapų ėminiuose nustatytas Kulių k. (Klaipėdos raj.) (99,01±4,72 mg GRE/g), Birikių k. (Telšių raj.) (95,88±4,69 mg GRE/g) ir Sudervės k. (Vilniaus raj.) (92,74±3,21 mg GRE/g) (p<0,05) rinktose žaliavose. Didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis – Staniūnų k. (Panevėžio raj.) (37,64±0,61 mg CRE/g) ir Kulių k. (Klaipėdos raj.) (34,35±1,22 mg CRE/g) (p<0,05) rinktuose aronijų lapų ėminiuose. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Šepetos k. (Kupiškio raj.) (617,43±25,56 µmol TE/g) rinktų vaisių ėminių ir Birikių k. (Telšių raj.) (1388±32,23 µmol TE/g) (p<0,05) rinktų lapų ėminių ištraukos. Atlikus juodavaisių aronijų augalinių žaliavų analizę ESC metodu nustatyti šie junginiai: cianidin-3-O-galaktozidas, cianidin-3-O-gliukozidas, cianidin-3-O-arabinozidas, peonidin-3-O-arabinozidas, chlorogeno rūgštis, neochlorogeno rūgštis, kriptochlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, rutinas, hiperozidas, astragalinas, izokvercitrinas, kvercetinas.
SUMMARY
The title of the master thesis. Qualitative and quantitative composition variability of phenolic
compounds in fruits and leaves of black chokeberry (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott).
The aim of the research. To determine the variation of qualitative and quantitative composition of
phenolic compounds of fruits and leaves of black chokeberry growing in Lithuania and evaluate the antioxidant activity in vitro of their extracts.
The objectives of the research. To investigate the variation of total phenolic compounds in samples of
black chokeberry (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) growing in different areas of Lithuania using spectrophotometric method. To examine the variation of the total amount of hydroxycinnamic acid derivatives in samples of black chokeberry fruits and leaves using the spectrophotometric method. To determine the quantitative composition of the anthocyanins of black chokeberry using the spectrophotometric method. To determine the antioxidative activity of the extracts of black chokeberry fruits and leaves by using the spectrophotometric method. To investigate qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of black chokeberry fruits and leaves using the HPLC method.
The object and methods of the research. Samples of fruits and leaves of black chokeberry, growing
in the Lithuanian climate, collected from 10 different areas was examined. Total amount of phenolic compounds, hydroxycinnamic acid derivatives, anthocyanins and antioxidant activity in in vitro samples were examined by UV/VIS spectrophotometric analysis method. Phenolic compound analysis was performed using the HPLC method.
The results and conclusions of the research. The highest amount of total phenolic compounds and
total hydroxycinnamic acid derivatives was determined in the collected fruits samples in Eriškės (Panevėžys distr.) (47.89±1.36 mg GRE/g, 21.9±0.95 mg CRE/g) (p <0.05) respectively. The highest total amount of anthocyanin was found in the fruit samples of Paįstrys (Panevėžys distr.) (6.67±0.95 mg CGE/g) (p<0.05). The highest amount of phenolic compounds in the samples of black chokeberry leaves were found in Kuliai (Klaipėda distr.) (99, 01±4.72 mg GRE/g), Birikiai (Telšiai distr.) (95.8 ±4.69 mg GRE/g), and in Sudervė (Vilnius distr.) (92.74±3.21 mg GRE/g) (p <0.05). The highest amount of hydroxycinnamic acid derivatives were found in the black chokeberry leaf samples collected in Staniūnai (Panevėžys distr.) (37.64±0.61 mg CRE/g), and Kuliai (Klaipėda distr.) (34.35±1.22 mg CRE/g) (p<0.05). The strongest antioxidant activity was found in fruit samples in Šepeta (Kupiškis distr.) (617.43±25.56 µmol TE/g), and leaf samples collected in Birikiai village (Telšiai distr.) (1388±32.23 µmol TE/g) (p <0.05). Phenolic compounds: galactoside, cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-arabinoside, peonidin-3-O-arabinoside, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, coffee acid, rutin, hyperoside, astragalin, isoquercitrin, quercetin were identified and quantified by HPLC method.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); CGE – cianidin-3-O-gliukozido ekvivalentas;
CYP – citochromas P;
CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas;
CuPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Cupric Ion Reducing Antioxidant
Capacity);
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Ferric Reducing Antioxidant
Power);
GRE – galo rūgšties ekvivalentas; IL–6 – interleukinai–6;
IL–8 – interleukinai–8 ; KE – katechino ekvivalentas; TE – trolokso ekvivalentas;
TNF– – navikų nekrozės veiksnys alfa; TPTZ – 2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazinas;
ĮVADAS
Keičiantis žmonių gyvenimo būdui ir suvokimui, didėja poreikis vartoti natūralius augalinius preparatus. Didėjanti paklausa skatina vis naujų augalinių žaliavų įsitraukimą į rinką. Norint rasti gydymo cheminiais vaistiniais preparatais alternatyvą, reikia atlikti augalinių žaliavų kokybinius ir kiekybinius tyrimus, įvertinti farmakologinį poveikį ir praktinį panaudojimą. Viena iš plačiausiai tyrinėjamų biologiškai aktyvių junginių grupių – fenoliniai junginiai, kurie pasižymi antioksidacinėmis, uždegimo slopinančiomis, antibakterinėmis, priešvirusinėmis ir priešvėžinėmis savybėmis [1].
Juodavaisė aronija – erškėtinių šeimos augalas, ypatingai vertinamas dėl kaupiamų fenolinių junginių žaliavose [2]. Vaisiai kaupia fenolinius junginius (flavan-3-olius, antocianinus, fenolines rūgštis, flavonolius), vitaminus (askorbo rūgštis, karotenoidus, tokoferolius), raugus, pektinus, mikro ir makro elementus (kalį, natrį, kalcį, magnį, geležį), baltymus, angliavandenius (gliukozę, sorbitolį, fruktozę), organines rūgštis (chino rūgštis, obuolių rūgštis, šikimo rūgštis, citrinų rūgštis, oksalo rūgštis ir gintaro rūgštis) [3, 4]. Antocianinai yra vieni svarbiausių ir didžiausiais kiekiais kaupiamų biologiškai aktyvių junginių aronijų vaisiuose [5]. Aronijų kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos gali turėti antioksidacinį [6], uždegimo slopinamąjį [7], priešbakterinį [8], priešdiabetinį [9], antimutageninį poveikį [10], teigiamą poveikį virškinimo traktui [11], širdies bei kraujagyslių ligų prevencijai ir papildomam gydymui [12], gali būti panaudojamos kosmetikos gamyboje [13].
Mokslinio darbo naujumas. Juodavaisių aronijų fitocheminės sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų juodavaisių aronijų vaisių ir lapų kokybinę ir kiekinę sudėtį ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro šiuolaikiniais analizės metodais. Gauti rezultatai pateiks naujų aspektų apie Lietuvos klimato sąlygomis auginamų juodavaisių aronijų vaisių ir lapų sudėties įvairavimą, leis iš mokslinės pusės pažvelgti į aronijų žaliavų panaudojimą praktinės medicinos poreikiams, įvairių ligų prevencijai ar papildomam gydymui. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, bus galima formuluoti išvadas apie tolesnių tyrimų būtinybę ir individualių biologiniu poveikiu pasižyminčių junginių išskyrimą maisto papildų ar kitų produktų gamybai, perspektyvas farmacijos rinkoje.
Šio mokslinio darbo tikslas – ištirti Lietuvoje augančių juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: ištirti Lietuvoje augančių juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott)
vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Uždaviniai:
1. Ištirti bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą skirtingose Lietuvos vietovėse augančių juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų ėminiuose, taikant spektrofotometrinį metodą.
2. Ištirti bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimą skirtingose Lietuvos vietovėse augančių juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų ėminiuose, pritaikius spektrofotometrinį metodą.
3. Nustatyti juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ėminių antocianinų kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį analizės metodą.
4. Nustatyti juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų ėminių ištraukų antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu.
5. Ištirti juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Aronijų (Aronia Medik) genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir
morfologiniai požymiai
Karalystė: Augalai (Plantae)
Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Erškėčiažiedžiai (Rosidae) Eilė: Erškėtiečiai (Rosales)
Šeima: Erškėtiniai (Rosaceae) Juss
Pošeimis: Obeliniai (Maloideae) C. Weber (Pomoideae Juss.) Gentis: Aronija (Aronia) (Medik) [11].
Aronijų gentis apima tris šio augalo rūšis: juodavaisę aroniją arba juodąją aroniją (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot) ir raudonvaisę aroniją arba raudonąją aroniją (Aronia arbutifolia (L.) Elliot). Šios aronijų rūšys kryžminasi tarpusavyje ir jų hibridas vadinamas – slyvalape aronija (Aronia prunifolia (Marsh) [14]. Plačiau nagrinėjama literatūroje bei didesnis mokslininkų dėmesys, dėl ypatingai didelio antocianinų kiekio, skiriamas juodavaisei aronijai (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot) [2].
Juodavaisės aronijos (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) augalas yra 2 m aukščio ir 3 m pločio daugiametis, erškėtinių šeimos atstovas, kurio kultivavimo ištakos prasidėjo Šiaurės Amerikos rytuose [15]. Mėgsta augti šviesioje vietoje, atsparus šalčiui, nėra ypatingų kultivavimo sąlygų [14]. Lapai paprasti, ištisiniai, ovalūs arba atvirkščiai kiaušiniški, 4–8 cm ilgio, 2–4 cm pločio, smailiaviršūniai, pjūkliški, apskritu arba plačiai pleistišku pamatu, pliki [16]. Lapų viršus ryškiai žalios spalvos, žvilgantis, apačia šviesiai žalia. Lapkotis yra apie 1 cm ilgio. Žiedai – balti, 1,5 cm skersmens, sukrauti po 12–35 viršūniniuose plikuose skėtiškuose žiedynuose [16]. Vaisiai – obuolėliai, rutuliški, 0,6–1,2 cm skersmens, juodi arba tamsiai purpuriniai, padengti vaško sluoksniu, žvilgantys, turi 8 tamsiai rudas raukšlėtas sėklas [11, 17]. Juodavaisės aronijos krūmas žydi gegužę–birželį, o vaisiai subręsta rugpjūtį–rugsėjį [14]. Dauginamas sėklomis, atlankomis, gyvašakėmis, krūmo dalijimu, skiepijimu [14].
Prasidedant 20 – ajam amžiui juodavaisės aronijos sėklos buvo perkeltos į Rusijos botanikos sodus, kur ėmė plisti europinėje šalies dalyje [18]. Augalinės žaliavos gydomosios savybės greitai pastebėtos, todėl plantacijų plotai ėmė plisti centrinėje ir rytinėje Europoje. Šiuo metu šis augalas paplitęs visame pasaulyje, tačiau didžiausia populiacija – rytinėje, centrinėje ir pietinėje Europos dalyse,
kur obuolėliai auginami daugiausiai pramoniniais tikslais [19]. Lietuvoje dažnai auginama sodybose, rečiau dekoratyviniuose želdynuose, kartais vaiskrūmių plantacijose [14].
Veislės faktorius turi reikšmingos įtakos aronijų vaisių kokybei ir cheminei sudėčiai. Europoje kultyvuojamos 6 veislės: 'Nero', 'Galicjanka', 'Viking', 'Fertödi', 'Hugin', ir 'Aron'. Šios veislės viena nuo kitos nedaug skiriasi chemine sudėtimi: flavonolių, antocianinų, proantocianidinų kiekine sudėtimi, antioksidaciniu aktyvumu in vitro. Skiriasi vaisių masė ir skersmuo [1, 20]. 'Galicjanka' veislė priskiriama prie didžiausius vaisius išauginančių aronijų veislių, vidutinė masė – 111,7 mg ir jų skersmuo 12,9–16,44 mm, 'Nero' veislė priskiriama prie smulkiausius vaisius išauginančių aronijų, vidutinė masė – 32,0 mg ir jų skersmuo svyruoja 6,1–7,2 mm [1].
1.2. Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų
cheminės sudėties tyrimai
Juodavaisių aronijų vaisiai ir lapai, dėl kaupiamų fenolinių junginių yra ypatingai vertinamos žaliavos [21]. Vaisių ir lapų cheminė sudėtis ir kokybė priklauso nuo daugelio veiksnių: auginimo vietos, klimato sąlygų, drėgmės kiekio, derliaus rinkimo laiko [17]. Skelbiama nemažai mokslinių publikacijų apie cheminės sudėties tyrimus ir biologinio poveikio daromą įtaką sveikatai.
Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisiuose nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, analizuojant skirtingų mokslininkų darbus, skiriasi. Jakobek ir kt., (2007) nustatė, jog bendras fenolinių junginių kiekis siekė 1063,7 mg/GRE 100 g šviežių vaisių [22]. Rugina ir kt., (2012) nurodo, kad juodavaisių aronijų vaisių ėminiuose nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis įvairavo nuo 1565 mg/GRE 100g iki 2059,5 mg/GRE 100 g šviežių vaisių [20]. Denev ir kt., (2018) metais atlikę juodavaisių aronijų vaisių tyrimą, bendrą fenolinių junginių kiekį nustatė nuo 1022 mg/GRE 100 g iki 1795 mg/GRE 100 g šviežių vaisių [23]. Skirtingiems rezultatams įtakos turi daug veiksnių, tokių kaip: ekstrakcijos metodas, analitinės, technologinės procedūros, laikymo sąlygos, genetinės aplinkybės, klimato ir kiti veiksniai. Daugiausiai fenolinių junginių nustatyta 'Hugin' veislės aronijų vaisiuose – 23,4 mg/GRE/g [3], mažiausiai fenolinių junginių nustatyta 'Aron' veislės aronijų vaisių ėminiuose – 15,86 mg/GRE/g šviežios vaisių masės [20].
Literatūros duomenimis, proantocianidinai yra vyraujanti fenolinių junginių grupė, kuri sudaro 66 proc. visų fenolinių junginių juodavaisių aronijų vaisiuose. Proantocianidinai yra oligomeriniai ir polimeriniai (epi) katechinai, kurie yra sudaryti iš kelių susijungusių monomerų: kai molekulė sudaryta iš 2-10 monomero vienetų – (epi) katechino oligomerai, o kai iš daugiau nei 10 – (epi) katechino polimerai. Procianidinai skiriasi monomerinų ryšių padėtimis ir konfigūracija [1]. Aronijų vaisių sudėtyje yra B tipo procianidinai, su (-)-epikatechinu sujungti C4'C8 ir/arba C4'C6 ryšiais [1]. Nustatyta,
kad procianidinų monomerai sudaro – 0,87 proc., dimerai – 1,88 proc., trimerai – 1,55 proc., 4–6-merai – 6,07 proc., 7–10 – merai – 7,96 proc. ir polimerai – 81,72 proc [3]. Remiantis skirtingų mokslininkų atliktais tyrimais, kurie įvertino proantocianidinų kiekį juodavaisių aronijų vaisių ėminiuose, rezultatai skyrėsi tarpusavyje. Hwang ir kt., (2014) ištyrė bendrą proantocianidinų kiekį juodavaisių aronijų vaisių ėminiuose – 107 mg/KE 100 g. [24]. Denev ir kt., (2018) tyrimo metu nustatė – 522 mg/KE 100 g – 1002 mg/KE 100 g šviežių vaisių žaliavoje [23]. Wu ir kt. nurodo skirtingus rezultatus, nustatytas kiekis skyresi daugiau nei tris kartus – bendras proantocianidinų kiekis varijavo nuo 664 mg/KE 100g iki 2120 mg/KE 100 g [25].
Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisiai kaupia antocianinus, kurie sudaro net 25 proc. visų fenolinių junginių nustatytų šio augalo žaliavose. Antocianinai turi stiprų antioksidacinį aktyvumą, jie randasi išorinėje vaisiaus luobelėje ir suteikia tamsiai violetinę spalvą [26, 27]. Juodavaisių aronijų vaisiuose nustatyti cianidino glikozidai: O-arabinozidas, cianidin-3-O-galaktozidas, cianidin-3-O-gliukozidas, cianidin-3-O-ksilozidas. Didžiausią dalį sudaro glikozidai cianidin-3-O-arabinozidas (27,5 proc.) ir cianidin-3-O-galaktozidas (68,9 proc.) [23]. Ištyrus skirtingas juodavaisių aronijų veisles antocianinų kiekiai varijavo. Rugina ir kt., (2012) ištyrus juodavaisių aronijų vaisių ėminius, naudojant diferiancinį pH metodą, nustatė bendrą antocianinų kiekį, kuris varijavo nuo 176 mg/100 g iki 366 mg/100 g šviežių uogų žaliavoje [20]. Denev ir kt., (2018) metais bendrą antocianinų kiekį nustatė nuo 284 mg/100 g iki 686 mg/100 g šviežių vaisių žaliavoje [23]. Kiekybinis skirtumas galėtų būti paaiškinamas remiantis skirtingu šviesos intensyvumu, dirvožemio cheminės sudėties, temperatūros pokyčiu bei skirtingu maistinių medžiagų kiekiu [23]. Įrodyta, jog pesticidų vartojimas dirvoje, mažina antocianinų kiekį aronijų vaistinėje žaliavoje, todėl šių vartojimas turėtų būti ribojamas, norint išauginti kokybišką žaliavą [1].
Juodavaisių aronijų vaisiai kaupia didelį kiekį fenolinių rūgščių. Nustatyta, kad hidroksicinamono rūgštys yra trečia pagal kiekį fenolinių junginių grupė juodavaisių aronijų vaisiuose. Denev ir kt., (2018) metais atlikto tyrimo metu [23], nustatytė, kad chlorogeno rūgšties kiekis – 187,9 mg/100 g šviežių vaisių, o neochlorogeno rūgšties – 214,5 mg/100 g šviežių vaisių žaliavoje. Rop ir kt., (2015) metais tyrinėję juodavaisių aronijų vaisius įvertinę rezultatus nustatė, kadchlorogeno rūgšties kiekis varijavo nuo 61 mg/100 g iki 193 mg/100 g šviežių vaisių, o neochlorogeno rūgšties – nuo 85 mg/100 g iki 123 mg/100 g šviežių vaisių žaliavoje [28].
Lyginant flavonolių kiekį su kitais fenolinių junginių kiekiais aronijose, flavonoliai sudaro labai mažą kiekį – 1,3 proc. visų aronijose esančių fenolinių junginių. Nustatyti flavonolių (kvercetino) dariniai aronijų vaisiuose: kvercetin-3-O-6′-α-ramnozil-βgliukozidas, kvercetin-3-O-β-galaktozidas ir kvercetin-3-O-β-gliukozidas [29]. Vidutiniškai suminis šių junginių kiekis – 71 mg/100 g šviežių vaisių žaliavos [29].
Organinių rūgščių bei cukrų koncentracija apsprendžia juodavaisių aronijų vaisių organoleptines savybes. Angliavandeniai sudaro nuo 10 proc. iki 18 proc. visos vaisiaus masės [17]. Sorbitolis yra pagrindinis angliavandenis, kuris sudaro nuo 61 proc. iki 68 proc. visų angliavandenių aronijų vaisiuose [23]. Jo kiekis varijuoja nuo 6,3 g/100g iki 13 g/100 g šviežių vaisių ėminiuose. Antras pagal kiekį cukrus nustatytas aronijose yra fruktozė, o po jos gliukozė. Jų kiekiai atitinkamai pasiskirstę – 2,86 g/100 g ir 2,0 g/100 g vaisių. Sacharozė nustatyta 20 iš tirtų 23 mėginių, ir kiekis neviršijo 0,34 proc. [23]. Juodavaisių aronijų vaisiuose identifikuotos organinės rūgštys: chino rūgštis, obuolių rūgštis, askorbo rūgštis, šikimo rūgštis, citrinų rūgštis, oksalo rūgštis ir gintaro rūgštis. Remiantis literatūros duomenimis, suminis visų organinių rūgščių kiekis svyruoja nuo 712,6 mg/100 g iki 1028,9 mg/100 g šviežių vaisių augalinėje žaliavoje [23].
Aronijų vaisiuose nustatyti ir kiti biologiškai aktyvūs junginiai: vitaminai, raugai, pektinai, mikro ir makro elementai, baltymai, tačiau kiekiai yra žymiai mažesni, nei fenolinių junginių [30]. Iš visų minėtų, svarbiausi yra stipriu antioksidaciniu aktyvumu pasižymintys vitaminai – askorbo rūgštis, tokoferoliai ir karotenoidai, mineralinės medžiagos – jodas, kalis, kalcis ir magnis. Askorbo rūgšties kiekis aronijų vaisiuose, literatūroje, varijuoja nuo 7,4 mg/100 g iki 8,3 mg/100 g., tokoferolio kiekis – 0,8–3,1 mg/100 g, bendras karotenoidų kiekis – 1,4–4,9 mg/100 g, raugų – 0,5–0,6 proc. vaisiaus masės [17]. Be išvardintų organizmui būtinų junginių, aronijų vaisiuose nustatyta ir kitų vitaminų: tiamino ir riboflavino – po 0,02 mg/100 g, piridoksino – 0,03 mg/100 g, folio rūgšties – 0,02 mg/100 g, niacino 0,3 mg/100 g, pantoteno rūgšties – 0,28 mg/100 g, taip pat vitamino K – 0,02 mg/100g [30]. Juodavaisių aronijų vaisiuose nustatyta makro ir mikro elementų: kalio – 218 mg/100 g, natrio – 2,6 mg/100 g, kalcio – 32,2 mg/100 g, magnio 16,2 mg/100 g, mažesnis kiekis nustatytas geležies – 0,93 mg/100 g [17]. Šviežiuose vaisiuose yra apie 5,6 g/100 g maistinių skaidulų, nustatyta nuo 0,5 proc. iki 0,6 proc. pektinų ir 0,7 proc. baltymų [17].
Literatūros duomenimis, bendras fenolinių junginių kiekis aronijų lapų ėminiuose varijuoja nuo 6,95 g/GRE 100 g iki 25,1 g/GRE 100 g [24]. Tian ir kt., (2017) metais tyrinėję juodavaisių aronijų lapų žaliavas, vidutinį bendro fenolinių junginių kiekį nustatė esantį 7,81 g GRE/100 g [31]. Fenolinių junginių kiekio įvairavimą lemia įvairūs faktoriai: skirtingos kultivavimo sąlygos, dirvožemio cheminė sudėtis, genetinės ypatybės [24]. Juodavaisių aronijų lapai kaupia didelį kiekį proantocianidinų, nustatytas kiekis – 4,13 g/100 g šviežių lapų [32]. Juodavaisių aronijų lapuose nustatyta fenolinių rūgščių: chlorogeno, neochlorogeno, kavos rūgšties ir jos darinių. Fenolinių rūgščių junginiai sudaro daugiau nei 20 proc. visų fenolinių junginių aronijų lapuose. Juodavaisių aronijų lapų ėminiuose nustatytas suminis fenolinių rūgščių kiekis – 1,80 g/100 g. Artimą kiekį sudaro ir flavonoliai, kurių kiekį ištyrus nustatyta 1,85 g/100 g [24]. Lyginant flavan-3-olių kiekį su kitų fenolinių junginių kiekiais, flavan-3-oliai sudaro gana mažą dalį – 26,06 mg/KE 100 g šviežių lapų žaliavos [31].
Juodavaisių aronijų lapai kaupia chlorofilą, kurio kiekis, mokslinės literatūros duomenimis, varijuoja nuo 58,4 mg/g iki 66,32 mg/g sausų lapų [24]. Nustatyti karotenoidų kiekiai (nuo 9,36 mg/g iki 9,88 mg/g) [31]. Chlorofilo ir karotenoidų kiekiai priklauso nuo biotinių veiksnių (veislės, kultivavimo sąlygų, brandos) ir abiotinių veiksnių: šviesos, temperatūros, dirvožemio sudėties [20].
1.3. Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) kaupiamų
biologiškai aktyvių junginių metabolizmas ir poveikio tyrimai
Metabolizmas. Antocianinai, kaip vieni pagrindinių fenolinių junginių juodavaisių aronijų
vaisiuose, silpnai absorbuojami skrandyje ir žarnyne. Remiantis atliktais tyrimais su žiurkėmis, cianidin-3-O-gliukozidas absorbuojasi 22,4 proc., o cianidin-3-O-galaktozidas – 13,6 proc. [33]. Po absorbcijos, antocianinai kartu su krauju transportuojami į audinius ir organus, didžiausia koncentracija aptinkama kepenyse, širdyje, prostatoje, sėklidėse, smegenyse ir riebaliniame audinyje [34, 35]. Kirakosyan ir kt., (2015) pastebėjo, jog antocianinai labiausiai organizme pasiskirsto šlapimo takuose ir inkstuose [35]. Antocianinai metabolizuojami konjugacijos ir metilinimo būdais, konjugacijos metu vyksta gliukuronidų susidarymas, jungiantis su gliukurono rūgštimi [33, 36, 37]. Pagrindinis antocianinų eliminacijos būdas – per inkstus su šlapimu [37, 38]. Cianidin-3-O-gliukozidas ir jo konjuguoti ir metilinti metabolitai susidarę kepenyse iš organizmo gali būti eliminuojami per tulžį [33] su išmatomis [36].
Flavan-3-olių junginiai absorbuojami pasyviosios pernašos būdu. Didesnės nei tetramerų molekulės į kraujotaką nepatenka [39]. Dauguma absorbuotų monomerų, dimerų, trimerų ir tetramerų molekulių po mikrobinio skaidymo virsta į fenilvalerolaktonus ir fenolines rūgštis, patenka į kepenis, iš kepenų – pasiskirsto kraujotakoje. Konjugatai nustatomi kraujyje, audiniuose, tulžyje. Šalinama pro inkstus su šlapimu arba su išmatomis [39].
Iš juodavaisių aronijų vaisių ėminių išskirti hidroksicinamono rūgščių dariniai pirmiausia pradedami hidrolizuoti skrandyje [40], o tuomet žarnyno bakterijų padermių – Bifidobacterium ir Lactobacillus – pagalba skaidomos žarnyne iki biologiškai aktyvių hidroksicinamono rūgšties darinių [41]. Chlorogeno rūgštis, metabolizuota virškinamajame trakte iki chino rūgšties ir kavos rūgšties, toliau absorbuojama plonojoje žarnoje ir iš ten transportuojama į kraują [42]. Chlorogeno rūgšties metabolitai (dimetoksicinamono rūgštis, gliukuronido derivatai ir sulfatuoti kavos rūgšties derivatai) ekskretuojami per inkstus su šlapimu ir mažais kiekiais patenka į tulžį ir pasišalina su išmatomis [42].
Nepageidaujamas poveikis. Apie skelbiamą nepageidaujamą poveikį, vartojant juodavaisių
aronijų vaisių preparatus, daug įrodymų nėra. Viename in vivo tyrime, su virškinimo trakto problemomis – padidėjusiu skrandžio jautrumu, vidurių užkietėjimu ir viduriavimu – susidūrė 13,8 proc. tyrime
dalyvavusių pacientų. Remiantis literatūros duomenimis, tam tikri fenoliniai junginiai, esantys juodavaisių aronijų vaisių ar lapų sudėtyje, vartojant labai dideliais kiekiais gali būti žalingi sveikatai. Pavyzdžiui, Dunnick ir kt. nustatė, jog didelėmis dozėmis žiurkėms duodant kvercetino (maždaug 1900 mg/kg) kasdien, po 2 metų jos susirgo nefropatija, išsivystė inkstų kanalėlio epitelio hiperplazija [43]. Žinoma, suvartoti juodavaisių aronijų vaisių sulčių ar ištraukos, gaunant toksiškus kiekius kvercetino žmogui yra praktiškai neįmanoma.
Sąveikos. Manoma, kad juodavaisių aronijų vartojimas kartu su trombocitų agregaciją
veikiančiais vaistais, gali padidinti kraujavimo riziką. Ekstraktai laikinai inhibuoja trombocitų agregaciją ir mažina krešulių formavimasi [44]. Vartojant kartu su antidiabetiniais vaistais, reikėtų nuolat stebėti gliukozės kiekį kraujyje, nes juodavaisių aronijų ekstraktas mažina gliukozės koncentraciją kraujyje, o tai gali adityviškai sąveikauti su antidiabetiniais vaistais [45]. Procianidinai, (procianidinas B5), ir antocianinai (cianidin-3-O-arabinozidas) yra CYP3A4 fermentų, atsakingų už tam tikrų vaistų (pavyzdžiui, midazolamą) metabolizmą, inhibitoriai [46]. Svarbiausia, kol nėra atlikta daugiau mokslinių tyrimų, norint išvengti nepageidaujamų sąveikų tarp juodavaisių aronijų vaisių ar lapų ėminiuose esančių fenolinių junginių ir tam tikrų vartojamų vaistų, yra siūloma nevartoti derinių kartu.
Juodavaisių aronijų vaisiai dėl savo kartoko, sutraukiančio skonio retai yra valgomi neapdoroti. Dažniau iš jų gaminamos ištraukos, sultys, vynas, spiritiniai gėrimai, uogienės, marmeladai, žėlė ir ektraktai [47]. Žaliavų kaupiamų junginių atlikti in vitro ir in vivo poveikio tyrimai apsprendžia plataus spektro biologines juodavaisių aronijų savybes.
Antioksidacinės savybės. Juodavaisių aronijų vaisiai yra apibūdinami kaip turintys stiprias
antioksidacines savybes, kurias apsprendžia didelis kiekis fenolinių junginių, ypač antocianinų [5]. Antioksidacinėmis savybėmis pasižymi ir juodavaisių aronijų vaisiuose kaupiama askorbo rūgštis ir tokoferoliai, β – karotenas ir mineralinės medžiagos. Fenoliniai junginiai veikia ne tik kaip laisvus radikalus surišantys junginiai, bet atlikti tyrimai su pavieniais fenoliniais junginiais išskirtais iš aronijų vaisių parodo ir prooksidacinių fermentų – ksantino oksidazės ir 15 – lipooksigenazės sumažėjimą [6]. Fenoliniai junginiai veikia vitamino C ir E regeneraciją [48, 49]. Antocianinai išskirti iš aronijų vaisių (cianidin-3-O-galaktozidas ir cianidin-3-O-arabinozidas) yra efektyvesni antioksidantai nei fenoliniai junginiai, esantys juoduosiuose serbentuose, ar vitaminas C [49]. Cianidin-3-O-arabinozidas turi stipriausią radikalus surišantį poveikį iš visų antocianinų, nustatytų aronijose, taip pat jis yra stiprus prooksiduojančių fermentų (lipooksigenazės ir ksantino oksidazės) inhibitorius [8]. In vitro atlikti tyrimai įrodė, jog aronijų vaisiuose kaupiami fenoliniai junginiai, ypač antocianinai apsaugo granuliocitus nuo jonizuojančios radiacijos. Antocianinai ir kiti iš juodavaisių aronijų vaisių išskirti fenoliniai junginiai gali būti tinkami naudojimui profilaktikai po radiologinio gydymo [50].
Juodavaisių aronijų vaisių antioksidacinės savybės buvo patvirtintos atlikus tyrimus su sveikais žmonėmis ir sergančiais neužkrečiamosiomis ligomis [51–53]. Mokslininkai nurodo, jog kasdien suvartojant 150 ml juodavaisių aronijų sulčių ir sportuojant per mėnesį laiko sumažėjo oksidacinis stresas raudonuosiuose kraujo kūneliuose. Lenkijoje, organizuotame eksperimente, 12 savaičių kasdien suvartojant 150 ml juodavaisių aronijų sulčių, antioksidacinis potencialas buvo stebimas plazmoje – sumažėjo lipidų peroksidacijos žymens fermento – tiobarbiturinės rūgšties kiekis ir tai padidino fermento, atsakingo už antioksidacines savybes – paraokonazės – 1 koncentraciją. [53]. Juodavaisių aronijų vaisiai, pasižymintys stipriu antioksidaciniu poveikiu, galėtų būti vartojami įvairių ligų (pavyzdžiui, cukrinis diabetas, įvairūs vėžiniai susirgimai ir kt.), sukeliamų oksidacinio streso profilaktikai ir papildomam gydymui [8].
Uždegimo slopinamasis poveikis. Juodavaisių aronijų ekstraktai ir sultys turi uždegimą
slopinamąjį poveikį, kuris susįjęs su uždegiminių citokinų – interleukino IL-6, interleukino IL-8 ir naviko nekrozės faktoriaus TNF-α – sumažėjimu [7]. Uždegiminiai procesai turi įtakos įvairių ligų vystymuisi, įskaitant diabetą [54, 55], širdies ir kraujagyslių [56–58], odos [59], akių ligas [18] ir imuninės sistemos sutrikimus [7, 60]. Literatūroje nurodoma, jog aronijų vaisių produktai gali apsaugoti nuo išvardytų ligų vystymosi, sumažindami uždegiminių procesų tolimesnį vystymąsi [61].
Priešbakterinis poveikis. Juodavaisių aronijų vaisiai pasižymi priešbakteriniu poveikiu, kuris
veikia Escherichia coli [8], Bacillus cereus [8, 62] Staphylococcus aureus ir Pseudomonas aeruginosa bakterijų padermes [62]. Atlikti tyrimai, kurių metu 236 žmonės, turintys šlapimo takų infekciją, 3 mėnesius kasdien po 156 ml vartojo aronijų sultis. Tyrimo rezultatai atskleidžia, jog šių sulčių vartojimas 55 proc. sumažino šlapimo takų infekcijos riziką [63]. Nustatyta, jog aronijų sultys turi bakteriostatinį poveikį, tačiau neveikia grybų padermių [8].
Priešdiabetinis poveikis. 2017 m. Lietuvos Higienos Instituto duomenimis, cukriniu diabetu
serga daugiau nei 107 tūkst. mūsų šalies gyventojų ir skaičius kasmet vis didėja [64]. Cukrinio diabeto sukeltos komplikacijos, tokios kaip insultas bei širdies ir kraujagyslių ligos, tampa vienos dažniausių mirties priežasčių [9]. Diabetą sukelia labai daug veiksnių, vieni iš tokių būtų valgymo įpročiai, judėjimo stoka ir stresas. Jeigu diabetu sergama ilgai ir jis nėra gydomas tinkamai, gliukozė kraujyje nėra verčiama į atsargas, sutrinka visų maisto medžiagų metabolizmas, todėl didėja komplikacijų rizika [54]. Dieta, sportas ir vaistų terapija – trys pagrindiniai būdai gydyti diabetą [9]. Vaistų terapija turi labai daug šalutinių reiškinių (hipoglikemija, hepatotoksiškumas, masės prieaugis, pilvo pūtimas ir viduriavimas), kurie pasireiškia pradėjus vartoti vaistus, todėl antidiabetinių vaistų vartojimas gali būti ribotas. Tai yra svariausia priežastis, kodėl mokslininkai ieško fitoterapinių būdų papildomam diabeto gydymui. Vienas iš jų – juodavaisių aronijų vaisių preparatų vartojimas. Oksidacinis stresas ir uždegiminiai procesai yra metabolinio sindromo vystymosi dalis, kartu ir cukrinio diabeto patogenezės dalis [58]. Gydymui ir terapijai įtakos turi fenolinių junginių uždegimo slopinamos ir antioksidacinės savybės [1,44,46]. Yra
įrodyta, jog įtraukus aronijų vaisius į mitybos racioną, mažėja gliukozės koncentracija kraujyje. [55, 66, 67]. Cianidin-3-O-arabinozidas inhibuoja fermentų, atsakingų už angliavandenių metabolizmą – α-gliukozidazės ir α-amilazės – aktyvumą, taip sulėtindamas angliavandenių absorbciją [8]. Klinikiniai in vivo tyrimų duomenys rodo, jog augalinės žaliavos, kaupiančios fenolinius junginius reguliuoja angliavandenių metabolizmą skirtingais mechanizmais, pavyzdžiui, atkuriant kasos beta ląstelių vientisumą ir fiziologiją, o dėl to didėja insulino išsiskyrimas [68].
Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Remiantis Lietuvos higienos instituto duomenimis,
2017 metais nuo kraujotakos sistemos ligų Lietuvoje mirė 56,1 proc. (22 511) visų mirusiųjų [64]. Širdies ir kraujagyslių ligų prevencija yra susįjusi su aronijų vaisiuose esančių junginių antioksidacinėmis ir uždegimo slopinančiomis savybėmis. Juodavaisių aronijų vaisių produktų (ekstraktų, ištraukų, sulčių) vartojimas sumažina oksidacinį stresą ir uždegiminius procesus kraujo kūneliuose, kurie prisideda prie tolimesnių širdies sutrikimų [6, 36, 61]. Atliekant in vivo tyrimus gyvūnų modeliuose pastebėta, jog aronijų vaisių sulčių vartojimas sunormalizuoja kraujo spaudimą [5, 31, 45] ir mažina riebalų peroksidaciją, taip apsaugodami širdies vainikines arterijas ir miokardą nuo oksidacinio streso [27, 60]. Epidemiologiniai tyrimai parodo, jog vartojant maisto produktus, turinčius antocianinų, mažėja rizika susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis, įskaitant miokardo infarktą [12, 74, 75]. Iš juodavaisių aronijų vaisių išskirtų antocianinų biologinis poveikis stebėtas tiriant pacientų kraujo tyrimų rezultatus. Pacientams, kuriems nustatyta lengva hipercholesterolemija ir nebuvo taikomas joks farmakologinis gydymas, reguliariai į mitybos racioną įtraukus juodavaisių aronijų vaisių preparatus, stebetas reikšmingas bendro cholesterolio, mažo tankio lipoproteinų kiekio, trigliceridų koncentracijos sumažėjimas, ir didelio tankio lipoproteinų koncentracijos padidėjimas [66]. Tyrimais mokslininkai įvertino potencialų juodavaisių aronijų vaisių poveikį metabolinio sindromo mažinimui.
Antimutageninis poveikis. Fenoliniai junginiai, esantys juodavaisių aronijų vaisiuose, turi
priešvėžinį aktyvumą [10]. Antocianinai, pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, todėl gali neutralizuoti laisvuosius radikalus, taip apsaugodami sveikas ląsteles nuo oksidacinio streso pasekmių bei slopinti fermentus, kurie yra atsakingi už promutageninį aktyvumą [20, 50]. Juodavaisių aronijų sultys taip pat pasižymi pro-apoptotiniu aktyvumu ir tai susįję su fenolinių junginių gebėjimu inhibuoti ląstelių proliferaciją, aktyvinant kaspazės-3 fermentą, blokuojant ląstelėse G2 fazę [76]. Buvo nustatyta, jog fenoliniai junginiai – hidroksicinamono rūgščių dariniai, antocianinai bei kvercetino derivatai – aktyvūs prieš limfoblastines ląsteles ir gali sukelti apoptozės – ląstelių žūties – pasireiškimą [26].
Poveikis virškinimo traktui. Mokslinėje literatūroje yra duomenų, jog juodavaisių aronijų
produktai (sultys, ištraukos, ekstraktai) gali būti vartojami kaip priemonė virškinimo trakto apsaugai [44]. Apsauginė funkcija tiesiogiai yra susįjusi su antioksidacinėmis aronijų vaisių savybėmis. Kaip vienas iš pavyzdžių – suriebėjusių kepenų liga, kuri yra gan dažnai pasitaikantis sutrikimas [8, 77]. In vitro atliktame tyrime tirtos kepenų ląstelės paveikus jas aronijų vaisių ištrauka. Gauti rezultatai parodė
reikšmingą trigliceridų kiekio sumažėjimą [77]. Tai galima paaiškinti, remiantis cianidin-3-O-gliukozido chemine struktūra, dėl orto padėtyje esančios OH grupės B žiede, kuri gali jungtis su trigliceridų molekulėmis, mažinant jų kumuliaciją kepenų ląstelėse [77].
Moksliniuose straipsniuose nurodoma, kad juodavaisių aronijų sultys mažina skrandžio opų riziką [66]. Sultys mažina malondialdehido – lipidų peroksidacijos žymens – koncentraciją plazmoje, taip sumažindamos skrandžio opų atsiradimo riziką ir jų plitimą [71]. Į žiurkių mitybos racioną įtraukus juodavaisių aronijų sulčių, po keturių savaičių stebėtas skrandžio pH padidėjimas, o tai apsaugo skrandį nuo opų vystymosi, sumažina trigliceridų ir bendrojo cholesterolio kiekį ir gali mažinti kepenų cirozės vystymąsi [77].
Poveikis kitoms sveikatos problemoms. Juodavaisių aronijų vaisiai gali būti naudojami
peršalimų, odos ligų, sukeltų uždegiminių procesų, reprodukcinės ir nervų sistemos sutrikimų gydymui [73, 78]. Žaliavų poveikis nervų sistemai gali būti aiškinamas, fenolinių junginių geba pereiti hematoencefalinį barjerą ir taip apsaugoti smegenų ląsteles nuo oksidacinio streso vystymosi [66]. Anksčiau, iki aronijoms atkeliaujant į Europą, vietinių amerikiečių buvo naudojamos peršalimui gydyti [68, 78]. Poveikis įrodomas remiantis atliktais in vivo tyrimais su žiurkėmis, jog fenoliniai junginiai padidina kūno temperatūrą, išskiriant daugiau hormono noradrenalino [16].
Juodavaisių aronijų vaisių ėminių ištraukos dėl savo antioksidacinių savybių, gali būti vartojamos nevaisingumo prevencijai. Oksidacinis stresas gali būti pagrindinis veiksnys, kuris gali pakeisti spermos kokybę taip mažindamas spermatozoidų kiekį. Vyrų, patiriančių oligospermiją, papildomas gydymas pasitelkiant aronijų vaisių ištraukas, sumažino oksidacinį stresą jų kraujyje, padidino fruktozės koncentraciją (sėklidžių funkcijos žymuo) spermoje [79].
Panaudojimas kosmetikoje. Remiantis in vitro ir in vivo tyrimų rezultatais, galima teigti, jog
aronijų vaisiai yra tinkama sudedamoji dalis kosmetikos gamyboje [13, 59]. Fenoliniai junginiai, esantys aronijų vaisiuose, yra absorbuojami pro odą, kur jie turi priešlaikinį senėjimą stabdančių ir antialerginių savybių, kurios susįjusios su uždegimą slopinančiomis bei antioksidacinėmis savybėmis. Young ir kt., (2017) įrodė, jog į odą geriau skverbiasi nano dalelėmis pagamintos aronijų ištraukos, pagamintos su lecitinu, nei normalaus dydžio dalelės [59]. Juodavaisių aronijų vaisių ištraukos pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, dėl kurių inhibuoja hialuronidazės aktyvumą žmogaus dermoje [80].
Yutani ir kt., (2014) įrodė, jog chlorogeno rūgštis išskirta iš aronijų ekstrakto, labai gerai pasiskirsto epidermyje [81]. Marti-mestres ir kt., (2007) teigia, jog chlorogeno rūgštis kartu su kavos rūgštimi pasiskirsto po visus odos sluoksnius [80]. Minėti tyrimai įrodo, jog aronijų vaisių ištraukose esantys fenoliniai junginiai gali absorbuotis pro odą, kur atpalaiduojamos veikliosios medžiagos.
Juodavaisių aronijų vaisių ištraukos pasižymi uždegimą slopinančiu poveikiu odos dermos ląstelėms [13, 59, 73]. Fenoliniai junginiai, esantys aronijose, gali apsaugoti odą nuo UV spinduliuotės [82, 83]. Galima teigti, jog aronijos gali būti panaudojamos sudėtyje nuo UV apsaugančių preparatų.
Atlikti tyrimai su gyvūnais, leidžia įsitikinti, jog fenoliniai junginiai apsaugo odą nuo oksidacinio streso pažeidimų, uždegiminių procesų, tolesnio odos vėžio vystymosi sukelto dėl UV spinduliuotės [83]. Remiantis moksliniais tyrimais, buvo įrodyta, jog aronijų vaisiai ir lapai gali būti vieni iš pagrindinių komponentų, priemonių celiulito gydymui gamybai [13]. Atlikti tyrimai, kurių metu 29 moterys, su antro laipsnio celiulitu, 90 dienų kasdien vartojo po 100 ml aronijų sulčių, bandymo rezultatai tokie, jog 97 proc. sumažėjo poodinių audinių storis [13].
Juodavaisių aronijų vaisiai yra labai vertinga, neapdorota medžiaga kosmetikos gamyboje, efektyviai mažinanti odos raudonumą ir eritemą, dėl didelio kiekio antocianinų savo sudėtyje.
1.4. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Juodavaisių aronijų (A. melanocarpa (Michx.) Elliot) fenolinių junginių sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių kokybinę ir kiekinę sudėtį. Prieš atliekant eksperimentinę analizę, plačiau išnagrinėti paskelbti užsienio mokslininkų tyrimai. Remiantis literatūros duomenimis, antocianinai, flavan-3-oliai ir fenolinių rūgščių dariniai yra vyraujantys fenoliniai junginiai vaisių ėminiuose. Lapų ėminiuose – fenolinės rūgštys, flavonoliai ir flavan-3-oliai – pagrindiniai fenoliniai junginiai. Plačiau nagrinėjamos vaisių ir lapų antioksidacinės, uždegimo slopinančios ir antibakterinės savybės, kurios gali būti panaudojamos širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto, virškinamojo trakto sutrikimų papildomam gydymui. In vitro tyrimai įrodo ir antimutageninį veikimą, tačiau visapusiškam įrodymui reikėtų atlikti in vivo tyrimus. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ištraukos ar sultys gali būti panaudojamos peršalimo ligoms, odos ir nervų sutrikimams ar reprodukcinės sistemos papildomam gydymui. Saugiam fitoterapinio augalo vartojimui reikėtų neviršyti rekomenduojamų dozių ir dėl CYP3A4 fermentus inhibuojančių fenolinių junginių savybių vengti kartu su iš augalinių žaliavų pagamintais preparatais vartoti tam tikrus vaistus, kuriuos metabolizuoja CYP3A4 fermentai.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo metu tirti juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott) vaisių ir lapų ėminiai. Lietuvos klimato sąlygomis auginamų juodavaisių aronijų vaisiai surinkti iš skirtingų vietovių: Naujųjų Elmininkų (Anykščių raj.) (55°32′49″š. pl. 25°09′00″r. ilg.), Eigirdžių k. (56°00′29″š. pl. 22°22′08″r. ilg.) (Telšių raj.) , Paįstrio k. (Panevėžio raj.) (55°50′31″š. pl. 24°20′10″r. ilg.), Daukšių k. (Marijampolės raj.) (54°29′49″š. pl. 23°35′10″r. ilg.), Ėriškių k. (Panevėžio raj.) (55°34′41″š. pl. 24°15′29″r. ilg.), Šepetos k. (Kupiškio raj.) (55°48′22″š. pl. 25°02′10″r. ilg.), Sudervės k. (Vilniaus raj.) (54°40′40″ š. pl. 25°17′30″ r. ilg.) ir Kulių k. (Klaipėdos raj.) (55°48′00″š. pl. 21°39′11″r. ilg.). Juodavaisių aronijų lapų ėminiai surinkti iš: Staniūnų k. (Panevėžio raj.) (55°42′50″š. pl. 24°24′00″r. ilg.), Kulių k. (Klaipėdos raj.) (55°48′00″š. pl. 21°39′11″r. ilg.), Birikių k. (Telšių raj.) (56°00′04″š. pl. 22°21′29″r. ilg.) ir Sudervės k. (Vilniaus raj.) (54°40′40″ š. pl. 25°17′30″ r. ilg.). Lapų rinkimo laikas: 2017 metų liepos mėn, vaisių rinkimo laikas: 2017 metų rugsėjo mėn.
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai
Tyrimo metu naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo ir atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus. Tyrimo metu naudota: etanolis 96 proc. (v/v) (gamintojas AB „Vilniaus Degtinė, Vilnius, Lietuva), Folin–Ciocalteu reagentas, natrio karbonatas, galo rūgštis, natrio hidroksidas (gamintojas „Chempur“, Tarnovske Gurai, Lenkija), natrio acetatas (gamintojas „Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija), TPTZ (gamintojas „Carl Roth“, Karlsrūjė, Vokietija), ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis), troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis), vario (II) chloridas, amonio acetatas, neokuproinas, geležies (III) chloridas heksahidratas (gamintojas „Vaseline-Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija), sieros rūgštis, trifluoracto rūgštis, acetonitrilas (gamintojas „Sigma-aldrich“, Steinheimas, Vokietija), metano rūgštis, acto rūgštis (gamintojas „Lachner“, Neratovicas, Čekijos Respublika); (+)- katechinas, (-)-epikatechinas, rutinas, izokvercitrinas, chlorogeno rūgštis, natrio molibdatas, natrio nitritas, vandenilio chlorido rūgštis (gamintojas „Sigma-Aldrich“, Šteinheimas, Vokietija).
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra
Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių smulkinimas atliktas elektriniu malūnu „IKA A11 basic“ („Ika-Werke GmbH & Co., Vokietija). Svėrimai atlikti elektrinėmis analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius CP64- 0CE“ („Sartorius AG“, Vokietija). Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje „Elmasonic P 120 H“ („Elma-Hans Schmidbauer GmbH & Co “, Vokietija). Mėginiai centrifuguoti naudojant centrifugą „Heraeus Biofuge Stratos“ („Heraeus Holding GmbH“, Vokietija), nuodžiūvis tirtas naudojant drėgnomatį „Precisa 310 M“ („Precisa“, Dietikonas, Šveicarija). Spektrofotometriniai ištraukų analizei atlikti naudotas UV–regimosios šviesos spektrofotometras „M550“ („Spectronic CamSpec“, Jungtinė Karalystė). Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties analizė atlikta naudojant skysčių chomatografą „Waters 2695 Alliance“ („Waters“, Milfordas, Ma, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998.
2.4. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių ištraukų paruošimas
Žaliavos paruošimas. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminiai, surinkti iš skirtingų Lietuvos
vietovių, džiovinti tamsioje, vėdinamoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje aplinkoje. Laikomi sausoje, tamsioje vietoje. Vaisiai ir lapai smulkinami elektriniu malūnu „IKA A11 basic“ („Ika-Werke GmbH & Co., Vokietija).
Nuodžiūvio nustatymas. Visų tiriamųjų mėginių nuodžiūvis nustatytas drėgnomačiu.
Matuojant nuodžiūvį ant prietaise įrengtų svarstyklių atsveriama 1 g žaliavos (tikslus svėrinys). Svėrimas kiekvienam mėginiui kartotas tris kartus ir išvestas vidurkis. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai vaisių ir lapų ėminių žaliavai.
Etanolinių ištraukų paruošimas. Atsveriama juodavaisių aronijų vaisių miltelių – 2,5 g
(tikslus svėrinys) ir lapų miltelių – 0,25 g (tikslus svėrinys). Milteliai tamsaus stiklo buteliukuose užpilami 60 proc. (v/v) etanoliu, sandariai uždaromi ir dedami į ultragarso vonelę. Juodavaisių aronijų vaisių ėminiai ekstrahuojami 40 min., o lapai – 20 min. Ultragarso bangų dažnis 80 kHz, galia – 1100 W. Po ekstrakcijos etanolinės ištraukos centrifuguojamos 3 min. 8000 rpm, kambario temperatūroje. Supernatantas nupilamas nuo nuosėdų, matavimo kolbutėje praskiedžiamas iki 25 ml ir supilamas į tamsaus stiklo buteliukus, kurie iki analizės laikomi 4ºC temperatūroje šaldytuve. Prieš atliekant chromatografinę analizę, etanolinės ištraukos filtruojamos per membraninius filtrus, kurių porų dydis 0,22 μm („Carl Roth Gmbh“, Karlsrujė, Vokietija).
2.5. Tyrimo metodai
Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometru, remiantis Tolic ir kt., (2017) straipsnyje aprašoma metodika [84], naudojant Folin-Ciocalteu reagentą.
Tiriamojo tirpalo paruošimas. 20 μl juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ištraukos kolbutėje
sumaišomos su 2,5 ml 10 proc. Folin-Ciocalteu reagento ir 2 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo.
Lyginamojo tirpalo paruošimas. 20 μl 60 proc. (v/v) etanolio kolbutėje sumaišoma su 2,5 ml
10 proc. Folin-Ciocalteu reagento ir 2 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo.
Visi tiriamieji mėginiai 60 min. laikyti tamsioje vietoje kambario temperatūroje. Po to spektrofotometru, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį:
y = 0,3044x + 0,0281; R2 = 0,9987
Galo rūgšties koncentracijų intervalas 0,03125 – 2 mg/ml. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal formulę:
𝐶 =𝑥 × 𝑉 𝑚 C – bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g;
X – fenolinių junginių kiekis, nustatytas pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g
Bendro antocianinų kiekio nustatymas
Bendras antocianinų kiekis juodavaisių aronijų vaisių ėminiuose buvo nustatytas pagal Europos farmakopėjoje nurodytą metodiką bendram antocianinų kiekiui mėlynių vaisių ėminiuose nustatyti (Ph. Eur. 01/2008:1602).
Tiriamojo tirpalo paruošimas. 1 ml pagamintos juodavaisių aronijų ištraukos matavimo kolbutėje praskiedžiama 24 ml 60 proc. (v/v) etanolio, turinčio 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties.
Lyginamasis tirpalas - 60 proc. (v/v) etanolis, turintis 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties. Bendras antocianinų kiekis išreiškiamas cianidin-3-O-gliukozido chloridu procentais:
𝑋 =𝐴 × 1250 718 × 𝑚
718 – specifinė cianidin-3-O-gliukozido chlorido absorbcija, kai bangos ilgis yra 528 nm; A – absorbcijos dydis, kai bangos ilgis yra 528 nm;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Mėginys gaminamas 10 ml matavimo kolbutėje. Kolbutėje 0,1 ml etanolinės ištraukos skiedžiama 0,9 ml 60 proc. (v/v) etanoliu, pridedama 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml Arnow reagento (10 proc. natrio molibdato vandeninis tirpalas ir 10 proc. natrio nitrito vandeninis tirpalas sumaišyti santykiu 1:1), 2 ml 8,5 proc. NaOH. Turinys kolbutėje praskiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki brūkšnio.
Lyginamojo tirpalo paruošimas. Į 10 ml matavimo kolbutę įpilama 0,1 ml etanolinės ištraukos, 0,9 ml 60 proc. (v/v) etanolio, 2 ml 0,5 M HCl, 2 ml NaOH ir praskiedžiama išgrynintuoju vandeniu iki brūkšnio.
Spektrofotometru, esant 525 nm šviesos bangos ilgiui, išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis.
Kalibravimo grafikas (𝑦 = 1,3584𝑥 − 0,0616; R2 = 0,9973) sudarytas, naudojant 0,0625−1
mg/ml koncentracijos etaloninius chlorogeno rūgšties tirpalus.
Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis apskaičiuotas pagal formulę: 𝐶 =𝑥 × 𝑉
𝑚
C – bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, mg CRE/g;
X – chlorogeno rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos žaliavos masė, g.
2.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu FRAP metodu
Naudota Teleszko ir Wojdylo straipsnyje aprašyta ištraukų redukcinio aktyvumo nustatymo FRAP metodika [32].
FRAP reagento paruošimas. Reagentas ruošiamas prieš pat darbą. FRAP susideda iš: 300 mM (pH=3,6) natrio acetato buferinio tirpalo, 10 mM 2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazino (TPTZ) tirpalo, 20 mM geležies chlorido heksahidrato tirpalo, tirpalai maišomi santykiu 10:1:1.
Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į 10 μl tiriamosios ištraukos įpilama 3 ml FRAP reagento ir sumaišoma.
Lyginamojo tirpalo paruošimas. Į 10 μl distiliuoto vandens įpilama 3 ml FRAP reagento ir sumaišoma.
Paruoštas tiriamasis tirpalas paliekamas 60 min. ir po to matuojama 593 nm bangos ilgio šviesos absorbcija.
Kalibravimo grafikas (y = 0,0000007x + 0,0034; R2 = 0,9995) sudarytas, naudojant 0-1600 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
2.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu ABTS metodu
Naudota Kapci ir kt., (2013) straipsnyje aprašyta ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymo ABTS metodika [85].
Motininio ABTS radikalo tirpalo gamyba. 2 mM ABTS (2,2 -azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis) ištirpinama 50 ml distiliuotame vandenyje ir pridedama 0,7 mM kalio persulfato. Gautas tirpalas laikomas 16-17 val. tamsoje, kambario temperatūroje, kol vyksta oksidacijos−redukcijos reakcija, kurios metu susidaro ABTS•+. Laikant motininis ABTS•+ tirpalas išlieka stabilus daugiau nei 2 paras (kambario temperatūroje, apsaugotas nuo šviesos).
Darbinio tirpalo gamyba. Tirpalas skiedžiamas distiliuotu vandeniu, kol matuojant spektrofotometru 734 nm bangos ilgio šviesos absorbciją pasiekiami 0,9±0,03 absorbcijos vienetai.
Tiriamojo tirpalo gamyba. Į 10 μl etanolinės ištraukos įpilama 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir sumaišoma.
Lyginamasis tirpalas - distiliuotas vanduo.
Pagaminus tiriamąjį tirpalą paliekama 60 min tamsioje vietoje ir matuojamas spektrofotometru jo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 734 nm bangos ilgiui.
Kalibravimo grafikas (y = 0,00004x + 0,0272; R² = 0,9988) sudarytas, naudojant 0-1600 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
2.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu CuPRAC
metodu
Naudota Apak ir kt., (2004) straipsnyje aprašyta ištraukų redukcinio aktyvumo nustatymo CuPRAC metodika [86].
CuPRAC reagento paruošimas. Darbinis CuPRAC tirpalas gaunamas sumaišius A, B ir C tirpalus santykiu 1:1:1: A tirpalas – 10 mmol/l CuCl2 tirpalas, B tirpalas – 1 mmol/l CH3COONH4
buferinis tirpalas (pH=7), C tirpalas – 7,5 mmol/l neokuproino etanolinis tirpalas.
Tiriamojo tirpalo gamyba. Į 10 μl etanolinės ištraukos įpilama 3 ml darbinio CuPRAC tirpalo ir sumaišoma.
Lyginamasis tirpalas – darbinis CuPRAC tirpalas, nepridėjus etanolinės ištraukos.
Paruoštas tiriamasis tirpalas paliekamas 30 min. ir po to, esant 450 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuojami 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis.
Kalibravimo grafikas (𝑦 = 0,00004𝑥 − 0,0214; R² = 0,9995) sudarytas, naudojant 0-1600 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
2.9. Antioksidacinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas
Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių antioksidacinis aktyvumas in vitro apskaičiuotas pagal trolokso kalibravimo grafikus ir išreikštas trolokso ekvivalentu (µmol TE/g) absoliučiai sausai žaliavai, apskaičiuojamas pagal formulę:
𝑇𝐸 = 𝐴 + 𝑏 𝑎 × 1000×
𝑉 𝑏𝑎𝑛𝑑. (𝑚𝑙) 𝑚 𝑏𝑎𝑛𝑑. (𝑔)
A – bandinio šviesos absorbcijos dydis (ABTS – absorbcijos pokytis); a – nuolydis (angl. slope) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b – nuokrypis (angl. intercept) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; Vband. – tiriamos augalinės žaliavos ištraukos bandinio tūris (ml); mband. – tiriamos augalinės žaliavos atsvertas (tikslus) kiekis (g).
2.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Antocianinų kiekinė analizė atlikta ESC metodu chromatografine Waters 2695 Alliance sistema („Waters“, Milfordas, MA, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998. Skirstymas
atliktas naudojant ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) kolonėlę (250 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 5 μm). Judri fazė sudaryta iš eliuentų: A (metano rūgštis) ir B (metano rūgštis, acetonitrilas, metanolis ir vanduo, santykiu atitinkamai 8,5:22,5:22,5:41,5 v/v/v/v). Naudotas gradiento kitimas: 0–35 min. – 7– 25 proc. B, 35–45 min. – 25–65 proc. B, 45–46 min. – 65–100 proc. B, 46–50 min. – 100 proc. B, 51 min. – 7 proc. B. Eliuentų tėkmės greitis – 1 ml/min. ir injekcijos tūris – 10 µl. Kolonėlė termostatuojama, palaikant 25°C temperatūrą.
Fenolinių rūgščių ir flavonolių kiekinė analizė atlikta ESC metodu chromatografine Waters
2695 Alliance sistema („Waters“, Milfordas, MA, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998. Skirstymas atliktas naudojant ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) kolonėlę (150 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 3 μm) su ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) prieškolone (dalelių dydis 3 μm). Judri fazė sudaryta iš eliuentų: A (0,05 proc. trifluoracto rūgštis) ir B (acetonitrilas). Naudotas gradiento kitimas: 0–5 min. 12 proc. B, 5–50 min. – 12–30 proc. B, 50–51 min. – 30– 90 proc. B, 51–56 min. 90 proc. B, 57 min. 12 proc. B. Eliuentų tėkmės greitis – 0,5 ml/min. ir injekcijos tūris – 10 µl. Kolonėlė termostatuojama, palaikant 25°C temperatūrą.
Smailės atskirtos nuo lydinčių junginių. Smailių grynumas įvertintas remiantis UV/VIS absorbcijos spektru 200–600 nm srityje. Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką ir lyginant diodų matricos detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių UV/VIS absorbcijos spektrus. Kiekinis analičių įvertinimas atliktas remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale. Sudaryti juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių ištraukose identifikuotų junginių kalibravimo grafikai, kuriais naudojantis atliktas kiekinis nustatymas. Neochlorogeno, chlorogeno, kriptochlorogeno ir kavos rūgščių kiekiai skaičiuoti bangos ilgiui esant 325 nm, rutino, hiperozido, izokvercitrino ir astragalino – 350 nm, kvercetino – 370 nm, antocianinų – 535 nm.
2.11. Tyrimo duomenų analizė
Atlikto tyrimo duomenų analizė atlikta naudojant „Microsoft Excel 2016“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 21“ („IBM“, JAV) kompiuterines programas. Tyrimo metu apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirtingomis Lietuvos klimato sąlygomis auginamų juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių nustatyti pritaikius vienfaktorinę dispersinę analizę – ANOVA ir daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Skirtumai reikšmingi esant p<0,05 reikšmei. Duomenų koreliacijai įvertinti nustatytas Spirmano koreliacijos koeficientas.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių fenolinių junginių ekstrakcijos
sąlygų nustatymas
Atlikus mokslinės literatūros analizę pastebėta, kad dažniausiai juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminiams ekstrahuoti taikoma ekstrakcija ultragarsu. Šis metodas paprastas, lengvai ir greitai atliekamas laboratorinėmis sąlygomis, nereikalinga brangi aparatūra, galima išvengti aukštos temperatūros [87]. Šio metodo privalumai: sumažėja ekstrakcijos trukmė, naudojamas mažesnis kiekis ekstrahento ir gaunama didesnė produkto išeiga [59]. Mokslinėje literatūroje yra duomenų, kad acetono ir alkoholiniai tirpikliai (etanolis ir metanolis) dažniausiai naudojami ekstrahentai. Yra įvertinamas acetono ir metanolio didesnis toksiškumas dirbant su jais, todėl daugelis mokslininkų ekstrakcijai renkasi etanolį [87, 88]. Dėl šių priežasčių juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminių ekstrakcijai ultragarsu buvo pasirinktas etanolis. Tiriant juodavaisių aronijų vaisių ir lapų ėminius buvo taikomas empirinis fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų nustatymas. Sąlygos nustatomos atsižvelgiant į etanolio koncentraciją ir ekstrakcijos trukmę. Nustatyti šiuos parametrus yra labai svarbu, norint sumažinti energijos kaštus ir pasiekti didžiausią išeigą.
Pirmajame ekstrakcijos sąlygų nustatymo etape, atliktas etanolio koncentracijos parinkimas. Juodavaisių aronijų vaisių ėminiai ekstrahuoti skirtingų koncentracijų (30 – 90 proc.) etanoliu, ekstrakcijos trukmė – 20 min., ultragarso vonelės galia – 1130 W, dažnis – 80 kHz. Statistiškai reikšmingai didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis vaisiuose (21,10±0,70 mg GRE/g, p<0,05) (1 pav.) nustatytas ekstrakcijai naudojant 60 proc. etanolį, todėl šios koncentracijos etanolis parenkamas tolesniems tyrimams.
1 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaisių ėminiuose, naudojant skirtingų koncentracijų ekstrahentą etanolį; raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro fenolinių junginių
kiekio skirtumus, ekstrahuojant juodavaisių aronijų vaisių ėminius skirtingos koncentracijos etanoliu (p<0,05) F D B A C E G 0 5 10 15 20 25
30 proc. 40 proc 50 proc 60 proc 70 proc 80 proc 90 proc
B endr as f enol ini ų jungi ni ų ki eki s, m g G R E/g Etanolio koncentracija (v/v)
Juodavaisių aronijų lapų ėminiai ekstrahuoti skirtingų koncentracijų (30 – 90 proc.) etanoliu, ekstrakcijos trukmė – 20 min., ultragarso vonelės galia – 1130 W, dažnis – 80 kHz. Statistiškai reikšmingai didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (89,08±0,70 mg GRE/g, p<0,05) (2 pav.) nustatytas ekstrakcijai naudojant 60 proc. etanolį, todėl šios koncentracijos etanolis parenkamas tolesniems tyrimams.
Kitame ekstrakcijos sąlygų parinkimo etape buvo vertinama ekstrakcijos trukmės įtaka. Per ilga trukmė, gali paskatinti biologiškai aktyvių junginių skilimą, todėl būtina nustatyti optimalią ekstrakcijos trukmę [89]. Tyrimo metu buvo taikoma įvairi ekstrakcijos trukmė (10 – 60 min.). Sonifikacija atlikta naudojant 60 proc. (v/v) etanolį, ultragarso vonelės galia – 1130 W, dažnis – 80 kHz. Statistiškai reikšmingai didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis (38,59±0,26 mg GRE/g, p<0,05) (3 pav.) nustatytas juodavaisių aronijų vaisių ėminius ekstrahavus 40 min. Ilginant ekstrakcijos trukmę, bendras fenolinių junginių kiekis statistiškai mažėjo, todėl šis laikas (40 min.) pasirinktas tolesniems tyrimams atlikti.
3 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaisių ėminiuose, skirtingais laiko intervalais; raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro fenolinių junginių kiekio skirtumus, ekstrahuojant
juodavaisių aronijų vaisių ėminius skirtingais laiko intervalais (p<0,05)
C B B A C B D 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
30 proc. 40 proc 50 proc 60 proc 70 proc 80 proc 90 proc
B endr as fe nolinių jung inių kiekis, m g GRE/g Etanolio koncentracija (v/v) E D D A B C 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
10 min 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min
B endra s fe noli nių jung ini ų kiekis, m g GRE/g
Ekstrakcijos trukmė, min
2 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas lapų ėminiuose, naudojant skirtingų koncentracijų ekstrahentą etanolį; raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro fenolinių junginių
kiekio skirtumus, ekstrahuojant juodavaisių aronijų lapų ėminius skirtingos koncentracijos etanoliu (p<0,05)
