FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
EVALDAS BUDRYS
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
LIETUVOJE AUGINAMŲ OBELŲ VEISLIŲ SKIRTINGŲ
POSKIEPIŲ IR KULTIVAVIMO SISTEMŲ OBUOLIUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof.habil.dr. Valdimaras Janulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
LIETUVOJE AUGINAMŲ OBELŲ VEISLIŲ SKIRTINGŲ
POSKIEPIŲ IR KULTIVAVIMO SISTEMŲ OBUOLIUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof.habil.dr. Valdimaras Janulis
Recenzentas
Darbą atliko
Magistrantas
Evaldas Budrys
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
SANTRAUKA ... 7
SUMMARY ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
Darbo tikslas...10
Darbo uţdaviniai...10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1 Obelų (Malus × domestica Borkh.) genties augalų charakteristika ... 11
1.2 Obelų vaisių cheminė sudėtis ... 11
1.3 Flavonoidų struktūros ypatumai ... 12
1.4 Fenolinių junginių analizės metodai ... 15
1.5 Flavonoidų svarba augalams ... 17
1.6 Flavonoidų poveikis ţmogaus organizmui ... 18
2. TYRIMŲ METODIKA ... 23
2.1 Tyrimų objektas ... 23
2.2 Naudotos medţiagos ir reagentai ... 23
2.3 Naudota aparatūra ... 24
2.4 Tyrimų metodai ... 24
2.4.1 Tiriamojo pavyzdţio paruošimas... 24
2.4.3 Spektrofotometrinis suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas... 26 2.4.4 Spektrofotometrinio DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodika. 26
2.4.5 Spektrofotometrinio FRAP redukcinio aktyvumo nustatymo metodika. ... 27
2.4.6 Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas ... 28 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1 Fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 29
3.2 Fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 31
3.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 33
3.4 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 36
3.5 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu DPPH metodu ... 38
3.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu DPPH metodu ... 41
3.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu FRAP metodu ... 42
3.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu FRAP metodu ... 45
IŠVADOS ... 47 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 49
SANTRUMPOS
ABS absorbcija;
ABTS 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); ApoB100 apolipoproteinas B100;
DC dujų chromatografija (angl. gas chromatography); DNR deoksiribonukleorūgštis;
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;
DSPC didelės spartos priešpriešinė chromatografija (angl. high-speed
counter-current chromatography);
ESC efektyvioji skysčių chromatografija (angl. high-performance liquid
chromatography);
FRAP trivalentės geleţies jonų redukcijos jėga (angl. ferric reducing
antioxidant power);
H5N1 gripo virusas;
HP-SEC aukšto slėgio dydţio išskyrimo chromatografija (angl. high pressure size
exclusion chromatography);
HSV-1 herpes virusas 1 (angl. Herpes simplex virus 1); HSV-2 herpes virusas 2 (angl. Herpes simplex virus 2); LOPL lėtinė obstrukcinė plaučių liga;
MALLS daugiakampis šviesą lauţiantis lazerinis detektorius (angl. multi-angle
laser light scattering detector);
MonoHER flavonoidas 7-mono-O-(β-hidroksietil)-rutozidas;
MS Masių spektrofotometrija (angl. mass spectrophotometry); MTL maţo tankio lipoproteinai;
PI-3 gripo virusas (angl. parainfluenza-3); RNR ribonukleorūgštis;
SC skysčių chromatografija (angl. liquid chromatography); TAPP A tipo procianidinai (angl. type-A procyanidine polyphenols);
TEAC trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (angl. trolox equivalent
antioxidant capacity);
SANTRAUKA
E.Budrys. Magistro baigiamasis darbas, vadovas prof., habil. dr. V. Janulis; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Farmakognozijos katedra. Kaunas.
Darbo pavadinimas: Fenolinių junginių kiekinės sudėties tyrimas Lietuvoje
auginamų obelų veislių skirtingų poskiepių ir kultivavimo sistemų obuoliuose.
Raktiniai ţodţiai: Malus, obuoliai, flavonoidai, fenoliniai junginiai, antioksidantinis
aktyvumas, spektrofotometrija.
Tyrimo objektas ir metodai: Malus Borkh. genties augalų vaisių ţaliavų tyrimas.
Flavonoidų ir fenolinių junginių kiekinės sudėties, antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas FRAP, DPPH spektrofotometriniais metodais.
Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje auginamų obelų veislių skirtingų poskiepių ir
kultivavimo sistemų obuolių fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairovę bei įvertinti antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uţdaviniai: 1. Nustatyti fenolinių junginių kiekį skirtingų veislių kultivavimo
sistemų obuolių ėminiuose. 2. Nustatyti fenolinių junginių kiekį skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminiuose. 3. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose. 4. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminiuose. 5. Nustatyti antioksidantinį aktyvumą skirtingų veislių poskiepių ir kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose.
Išvados: Siekiant optimalių sąlygų obelų vaisių ekstraktams išgauti, ekstrakcija buvo
vykdoma ultragarso vonelėje 20 min esant 40˚C temperatūrai, ultragarso intensyvumas 480 W (100 proc.), parinktas ekstrahentas – 70 proc. V/V etanolis. Tyrimų metu Folino metodu kiekybiškai nustatyta, jog didţiausias (61,20±3,06 mg/g) fenolinių junginių kiekis esti „Auksis“ P22. Didţiausia (1,78±0,09 mg/g) bendra flavonoidų koncentracija, naudojant aliumino trichloridą, nustatyta „Rajka“ ŠP. Nustatinėjant antioksidacinį aktyvumą FRAP ir DPPH metodais rezultatai neţymiai išsiskyrė. Išrinkti trys poskiepiai, kurių rodikliai buvo didţiausi: „Lodel“ PS (282,79±14,14 µmol/g ir 66,85±3,34 µmol/g), „Lodel“ EKO (241,78±12,09 µmol/g ir 63,85±3,19 µmol/g), „Lodel“ PP (240,31±12,02 µmol/g ir 68,73±3,44 µmol/g).
SUMMARY
Title: Study of quantitative composition of phenolic compounds in Lithuania grown
apples from different rootstocks and cultivation systems.
Key words: Malus, apples, flavonoids, phenolic compounds, antioxidant activity,
spectrophotometry.
Object and methods: Analysis of Malus Borkh. fruit genus plants. Quantitative
analysis of flavonoids and phenolic compounds and analysis of antioxidant activity. Antioxidant activity was determined using FRAP, DPPH spectrophotometric methods.
Aim: To evaluate quantitative composition and antioxidant activity of phenolic
compounds in Lithuania grown apples from different rootstocks and cultivation systems.
Objective: 1. To determine quantity of phenolic compounds in different cultivation
systems apple samples 2. To determine quantity of phenolic compounds in different rootstocks apple samples. 3. To determine quantity of total flavonoids in different cultivation systems apple samples. 4. To determine quantity of total flavonoids in different rootstocks apple samples. 5. To determine the antioxidant activity in different rootstocks and cultivaion systems apple samples.
Results: For optimum conditions for extracts of apple fruits to obtain, extraction was
carried out in an ultrasonic bath for 20 mins at 40˚C temperature, the ultrasonic intensity of 480 W (100 pct.), 70 pct. V/V ethanol was chosen as an extrahent. Investigation under Folin method quantitatively determined that the maximum (61,20±3,06 mg/g) amount of phenolic compounds was found in „Auksis“ P22. The highest concentration (1,78±0,09 mg/g) of total flavonoids, using aluminum trichloride, was detected in „Rajka“ ŠP. While determining antioxidant activity under FRAP and DPPH methods, results slightly differed. Selected three stocks with highest rates:
„Lodel“ PS (282,79±14,14 µmol/g ir 66,85±3,34 µmol/g), „Lodel“ EKO (241,78±12,09 µmol/g ir
ĮVADAS
Vaistinių augalų medicina, dar kitaip vadinama botanine ar fitomedicina, kuri gydymo tikslais naudoja sėklas, uogas, šaknis, lapus, ţievę, ţiedus ar kitas augalų dalis. Tradicinė indų ir tradicinė kiniečių medicina – vienos seniausių iki šiol gyvuojančių tradicijų, kurios kelia didelį susidomėjimą mūsų amţiuje ir skatina vykdyti stebėjimus bei plėtoti tyrimus su augaliniais preparatais. Dėl analizės ir kokybės kontrolės bei klinikinių tyrimų tobulėjimo ji tampa vis plačiau naudojama gydant ir uţkertant kelią ligoms. Mokslininkai pastebėjo, kad ţmonės iš skirtingų pasaulio šalių yra linkę vartoti tapačius arba panašius augalus tais pačiais gydymo tikslais. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) nustatė, kad apie 80 proc. ţmonių visame pasaulyje savo pirminę sveikatos prieţiūrą patiki fitomedicinai. Per pastaruosius 20 metų amerikiečių nusivylimas per didelėmis receptinių vaistų kainomis lėmė didėjantį fitopreparatų naudojimą [30, 48].
Obuoliai - vieni iš daţniausiai vartojamų vaisių ir yra labai svarbi ţmogaus mitybos dalis, nes juose gausu monosacharidų, mineralų, maistinių skaidulų ir įvairių biologiškai aktyvių junginių, tokių kaip vitaminas C [41]. Obuoliai yra puikus fenolinių junginių šaltinis ir taip pat pasiţymi geru antioksidaciniu aktyvumu [22]. Fenolinių junginių kiekis augaluose skiriasi priklausomai nuo augalo rūšies, veislės, fiziologinės stadijos, klimato sąlygų [21].
Flavonoidai yra viena iš svarbiausių fenolinių junginių grupių [6]. Pagrindinės obuoliuose nustatomos flavonoidų klasės yra flavonoliai (kvercetino glikozidai), flavanoliai (katechinas, epikatechinas ir procianidinas), dihidrochalkonai (floridzinas) ir antocianai (cianidino glikozidai) [14]. Antocianai lemia obuolių raudoną spalvą, jie paprastai randami ţievelėje ir sudaro iki 8 proc. visų fenolinių junginių [22]. Paprastai flavonoidai yra identifikuojami glikozidų pavidale, išskyrus katechino tipą, kuris daţniausiai esti laisvoje formoje [6]. Kvercetinas yra gausiausiai nustatomas flavonolių tipo atstovas obuoliuose ir yra stiprus antioksidantas. Kiti daţniausiai pasitaikantys šio tipo flavonoidai yra katechinas, epikatechinas, epikatechino galatas, epigalokatechinas ir epigalokatechino galatas [33].
Daug epidemiologinių tyrimų įrodė, kad obuolių vartojimas yra susijęs su lėtinių ligų, tokių kaip: širdies ir kraujagyslių ligos, įvairių formų vėţys, astma - rizikos maţėjimu. In vitro ir tyrimai su gyvūnais pagrindţia obuolių antioksidantinį aktyvumą, jų galimybę slopinti vėţinių ląstelių proliferaciją, lipidų oksidaciją, maţinti cholesterolio kiekį kraujyje. Fenoliniai junginiai, flavonoidai gali vaidinti svarbų vaidmenį lėtinių ligų prevencijoje, todėl svarbu tęsti fitocheminius tyrimus siekiant geriau suprasti ir maksimaliai išnaudoti fitopreparatų naudą sveikatai [9].
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas
Ištirti Lietuvoje auginamų obelų veislių skirtingų poskiepių ir kultivavimo sistemų obuolių fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairovę bei įvertinti antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uţdaviniai
1. Nustatyti fenolinių junginių kiekį skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose.
2. Nustatyti fenolinių junginių kiekį skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminiuose. 3. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose.
4. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminiuose. 5. Nustatyti antioksidantinį aktyvumą skirtingų veislių poskiepių ir kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Obelų (Malus × domestica Borkh.) genties augalų charakteristika
Obelis priklauso erškėtinių (lot. Rosaceae) šeimos Malus genčiai. Augalas yra kilęs iš centrinės Azijos. Tai neaukštas, paprastai būna nuo 2 iki 5-6 metrų aukščio, lapuotis medis. Lapai ţalios arba tamsiai ţalios spalvos, simetriniai, ištisiniais kraštais, dantyti, lygiakraščiai arba smulkiai pjūkliški. Lapalakščio forma elipsiška, tinkliškas gyslotumas. Lapai prie stiebo prisitvirtinę pentimis [4].
Obelis vaisius subrandina rudenį. Obuolys – ovalios formos, sultingas vaisius, daţniausiai būna ţalios, raudonos ar mišrios spalvos. Sudarytas iš egzokarpio, mezokarpio ir endokarpio: iš išorės apgaubtas blizgia, vaškine odele – egzokarpiu, obuolio mėsingiausia dalis - mezokarpis, o viduryje paprastai 5 lizduose – endokarpyje – yra po 2-3 sėklas (1 pav.) [3, 4].
1 pav. Malus Borkh. genties augalas, vaisiai, sėklos ir jų skersiniai pjūviai
1.2 Obelų vaisių cheminė sudėtis
Atlikti tyrimai su skirtingų obelų veislių obuolių bandiniais siekiant išsiaiškinti cukraus, vandens, baltymų kiekį, rūgštingumą, vitamino C kiekį ir mineralų pasiskirstymą. Didţiausią obuolio dalį sudaro vanduo. Bandymų metu nustatyta, jog obuoliuose vandens kiekis yra 76,69-88,37 proc., vidutiniškai 83,75 proc. Cukraus kiekis svyruoja nuo 9,53 iki 12,34 proc., vidutiniškai 10,62 proc. Duomenų pasiskirstymas yra tiesiogiai priimtinas, nes obuolių cheminė sudėtis priklauso nuo įvairių faktorių: oro sąlygų, veislės, vaisiaus ekspozicijos, kultivavimo
technologijų. Didelis cukraus kiekis konkrečiai priklauso nuo: aukštos oro temperatūros ir didelio maistinių elementų kiekio dirvoţemyje. Bendras rūgštingumas – nuo 0,127 iki 0,345 proc., vidutiniškai 0,2 proc. Vitamino C pasiskirstymas – 7,19-7,89 mg/100 g, o vidutiniškai 7,51 mg/100 g. Azotas apsprendţia cukaus kaupimąsi ir derlingumą, todėl bendras azoto kiekis turėtų būti 0,40-0,80 proc. Tirtuose bandiniuose nustatytas bendras azoto kiekis 0,466-0,837 proc. Fosforas (P2O5
formoje) kartu su azotu apsprendţia gerą vaisių kokybę, vaisiuose nustatytas fosforo kiekis – 0,351-0,526 proc. Kalio (K2O) rodiklis turėtų būti apie 1,20 proc. Bandiniuose nustatytas ţemesnis, nei
tikėtasi kalio kiekis, kuris gali būti siejamas su ilgomis obuolių laikymo sąlygomis (0,48-0,90 proc.). Kalcis (CaO) ir geleţis (FeO) turi įtakos švieţių vaisių kokybei, jų nustatyta atitinkamai 0,140-0,280 proc. ir 0,1996-2,752 proc.. Atmosfera ir dirvoţemis, kurioje augo eksperimentui naudoti obuoliai, nebuvo uţteršti. Gautos obuolių cheminės sudėties vertės rodo gerą obuolių kokybę, todėl obuolius galima naudoti mitybos tikslams išvengiant ligos rizikos veiksnių [10, 43].
1.3 Flavonoidų struktūros ypatumai
Didţiausią obuoliuose randamą polifenolinių junginių grupę sudaro flavonoidai. Flavonoidų grupės pagrindas - du aromatiniai A ir B benzolo ţiedai sujungti per C3 grandinę, kuri sudaro heterociklą – pirano darinį. Bendrąją flavonoidų struktūrą sudaro 15 anglies atomų, sujungtų į C6-C3-C6 sistemą (2 pav.).
2 pav. Flavonoidų aglikono bendra struktūrinė formulė
Flavonoidai gali būti aptinkami tiek laisvoje formoje – aglikonų pavidale, tiek ir glikozilinti. Daţniau sutinkama O-glikozilintų nei C-glikozilintų flavonoidų. Flavonoidai gali skirtis pakaitų tipu, prisijungimo vieta, jų skaičiumi.
Pagal propaninio fragmento oksidacijos laipsnį ir bendrą cheminę junginių sandarą, flavonoidai savo ruoţtu yra skirstomi į dar smulkesnes grupes. Labiausiai paplitusios yra šios flavonoidų grupės: flavonai (flavonas, luteolinas, apigeninas, viteksinas) – tarp C2 ir C3 turi dvigubą jungtį, 4 padėtyje keto grupę, hidroksi grupę A ţiedo 5 padėtyje, taip pat galimas hidroksilinimas 7, 3„ ir 4„ pozicijose, priklausomai nuo konkretaus junginio, glikozilinimas paprastai vyksta prie 5 ir 7 pozicijų; flavonoliai (flavonolis, kvercetinas, kemferolis) – skirtingai nei flavonai, C ţiedo 3 pozicijoje turi hidroksi grupę (3 pav.);
3 pav. Flavonų ir flavonolių struktūrinių formulių pavyzdžiai
flavanonai (flavanonas, likviritigeninas, likviritinas, naringinas, hesperidinas) – dar vadinami dihidroflavonais, skiriasi nuo flavonų tuo, kad C ţiedas yra prisotintas, todėl dvigubos jungities tarp C2 ir C3 nėra; flavan-3-oliai (katechinas, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas) – dvigubos jungties tarp C2 ir C3 nėra, 3,3‟,4‟,5 ir 7 padėtyse išsidėsčiusios hidroksi grupės, svarbus poţymis, jog 4 pozicijoje nėra keto grupės, izomerai epikatechinas ir katechinas atitinkamai yra cis ir trans konfigūracijų (4 pav.);
leukoantocianidinai (leukoantocianidinas, leukopianidinas) – prisotintas C ţiedas, 3 padėtyje hidroksi grupė ir vietoje keto grupės 4 padėtyje dar viena hidroksi grupė, leukoantocianidinai dar kitaip vadinami flavan-3,4-dioliais; antocianidinai (antocianas, malvidinas, cianidinas) – katijonai, paprastai būna chlorido druskos pavidale, hidroksi grupių lokalizacija priklauso nuo konkretaus junginio, glikozilinti antocianidinai vadinami antocianinais. Cukrūs daţniausiai jungiasi per C3 (monoglikozidai) arba per C3 ir C5 (diglikozidai), glikozilinimas taip pat galima ir per C3‟, C5‟ C7 (5 pav.);
5 pav. Leukoantocianidinų ir antocianidinų struktūrinių formulių pavyzdžiai chalkonai (chalkonas, izolikviritinas, 3,4-dihidroksichalkonas) – turi atvirą struktūrą ir yra klasifikuojami kaip flavonoidai dėl panašaus sintezės kelio; auronai (auronas, 3‟,4‟-dihidoksiauronas) – šešianaris C ţiedas pakeistas penkianariu heterociklu, kuris sudaro furano tipą; izoflavonoidai (izoflavonas, ononinas, genistinas) – priešingai nei visi kiti flavonoidai, izoflavonoidai B ţiedą prie bendros struktūros yra prisijungę per C3, dėl savo panašios struktūros į estrogenus (estradiolį) dar vadinami fitoestrogenais (6 pav.) [2, 31, 32, 44, 47].
6 pav. Chalkonų, auronų ir izoflavonoidų struktūrinių formulių pavyzdžiai
1.4 Fenolinių junginių analizės metodai
Fenoliniams junginiams nustatyti augaluose galima naudoti daug įvairių metodų. Plačiai taikomi optiniai metodai fenolinių junginių analizei atlikti yra molekuliniai absorbciniai. Pagal šviesos absorbcijos matavimą jie smulkiau yra skirstomi į kolorimetrinius, fotokolorimetrinius ir spektrofotometrinius.
Kolorimetrija pagrįsta regimosios šviesos absorbcijos matavimu. Kolorimetras – prietaisas, kuriuo nustatoma tirpalų koncentracija analizuojant tiriamojo tirpalo spalvos intensyvumą, todėl svarbu, kad tiriamieji tirpalai būtų spalvoti. Metodas nėra tikslus, nes tirpalo koncentracija nustatoma tik apytiksliai ir priklauso nuo individualaus ţmogaus regėjimo ypatybių.
Mokslo sričiai tobulėjant atrastas uţ kolorimetrinį pranašesnis fotokolorimetrinis metodas. Fotokolorimetruose naudojami fotoelementai, kurie ant jų patekusį elektromagnetinės spinduliuotės srautą paverčia fotosrove, į kurią reaguoja prietaisuose esantis mikroampermetras.
Spektrofotometrija – uţ fotokolorimetrinį tikslesnis analizės metodas ir skirtingai nei fotokolorimetriniu metodu, atliekant spektrofotometrinę analizę naudojama monochromatinė šviesa. Tiriamieji tirpalai nebūtinai turi būti spalvoti, galima tirti ir bespalvius tirpalus. Spektrofotometrinis metodas turi daug modifikacijų, kurios taikomos skirtingiems augaluose esantiems junginiams nustatyti.
Bendras fenolinių junginių kiekis ţaliavoje yra nustatomas ekstraktą veikiant Folin-Ciocalteu ir natrio karbonato tirpalais [45]. Folino-Folin-Ciocalteu spektrofotometrinis metodas turbūt yra
plačiausiai naudojamas metodas siekiant nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį [19]. Folin-Ciocalteu reagentas reaguodamas su fenoliais suformuoja chromogenus, kurių absorbcijos dydis išmatuojamas spektrofotometru [45]. Absorbcija matuojama prie 765 nm bangos ilgio, pasirenkant galo rūgštį kaip standartą ir bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu mg/g [22].
Vienas iš kiekybinio flavonoidų nustatymo metodų yra spektrofotometrija, atlikus rūgštinę hidrolizę flavonoidai sudaro kompleksus su aliuminio chloridu. Tačiau šiuo metodu negalima išskirti C-glikozilintų flavonoidų, nes jie atsparūs rūgštinei hidrolizei [27]. Matuojamas bandymui imtų pavyzdţių optinis tankis, o rutinas naudojamas kaip standartas kalibracijos kreivei nubraiţyti. Flavonoidų kiekis apskaičiuojamas naudojant tiesinę lygtį [19]. Kiti klasikiniai flavonoidų atskyrimo ir identifikavimo metodai yra kombinuotas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) ir masių spektrometrijos (MS) bei didelės spartos priešpriešinė chromatografija (DSPC) ir magnetinio branduolių rezonanso spektroskopija. Pastarasis metodas yra greitas bei patikimas ir pastaruosius metus buvo plačiai naudojamas dėl jo ţemos nustatymo ribos [11].
Nors analizuojant fenolinius junginius optiniai analizės metodai yra vieni populiariausių, juos taip pat galima nustatyti ir kitokiais būdais. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – skirtingų tirpiklių ekstraktai injekuojami į ESC kolonėlę, naudojama atvirkštinių fazių C18 kolonėlė. Tirpiklis A – 2 proc. (v/v) vandeninė acto rūgštis, tirpiklis B – 0,5 proc. (v/v) acto rūgštis vandenyje/acetonitrile (1:1, v/v). Duomenys registruojami iš anksto nustatytais laiko intervalais. Tėkmės greitis 1 ml/min. Šviesos diodų matricos detekcija atliekama prie 220 nm ir 350 nm bangos ilgio. Flavonoidai identifikuojami pagal jų sulaikymo trukmes [25].
Masių spektrofotometrija. MS esmė – cheminių junginių jonizacija, kurios metu molekulės ar jų fragmentai įgauna krūvį ir skaičiuojamas jų masės-krūvio santykis. Pagrindiniai MS privalumai: didelis jautrumas, kuris leidţia analizuoti medţiagas esant maţiausiams jos kiekiams (µg), ir didelis specifiškumas - galima atskirti tokios pat molekulinės masės molekules turinčias skirtingą atomų išsidėstymą ar net diferencijuoti stereoizomerinius junginius. Metodas lengvai kombinuojamas su skysčių (SC) ar dujų chromatografijomis (DC). Didţioji dalis flavonoidų yra nelakūs ir termolabilūs junginiai, todėl siekiant flavonoidų glikozidų ir kitų junginių atskyrimo ir identifikacijos MS ir SC metodai buvo sujungti. Per pastaruosius dešimt metų MS stipriai paţengė į priekį – MS-SC sistemos tapo automatizuotos ir plačiai taikomos flavonoidų glikozidų atrankai iš augalų audinių ar biologinių skysčių [32, 36].
1.5 Flavonoidų svarba augalams
Kadaise buvo manyta, jog flavonoidai tėra į vakuolę išmetami metabolitai. Tačiau šiandien yra aiškus jų teigiamas poveikis: apsaugo augalus nuo UV spinduliuotės, veikia kaip pigmentai – suteikia ţiedlapiams spalvą, taip priviliodami vabzdţius apdulkinti augalus bei sugebėjimas veikti antimikrobiškai – inhibuoja mikroorganizmus, kurie sukelia įvairias augalų ligas [12, 13].
Vabzdţių pritraukimas apdulkinimui. Apdulkinimo metu ţiedadulkes nuo kuokelių
vabzdţiai perneša ant piestelių purkų (bitės, vapsvos, musės ir kt.). Tokie augalai būna nudaţyti įvairių pigmentų. Įrodyta, kad flavonoidai veikia kaip apdulkinimo masalas [17]. Antocianinai daugiausiai prisideda prie gėlių spalvos, nors nustatytas ir kitų flavonoidų indelis. Pavyzdţiui chalkonai ir auronai teikia geltoną spalvą. Geltoną spalvą taip pat gali teikti ir flavonoliai, kurie būna metilinti, glikozilinti ar turintys A ţiedo hidroksilintų formų. Įvairūs flavonoliai ir flavonai veikia kaip papildomi pigmentai antocianinams, kurie suintensyvina spalvą. Flavonai ir flavonoliai būna ne tik geltonos, raudonos, violetinės ar mėlynos spalvos gėlėse, bet taip pat ir baltose. Todėl ţiedlapiai būna purvinos baltos ar kreminės spalvos [5].
Apsauga nuo mikroorganizmų. Mikroorganizmų infekcijos metu augalai išskiria
tam tikras chemines medţiagas, vadinamas fitoaleksinais, kurios padeda apsisaugoti augalui nuo organizmų sukeliamų ligų. Flavonoidai minimi kaip vieni iš daugelio fitoaleksinų. (Ingham 1972) apţvelgė fitoaleksinus ir kitus produktus, įskaitant flavonoidus kaip augalų ligų atsparumo faktorius. Iš paprastosios vyšnios (lot. Prunus cerasus) išskirti šeši flavonai ir izoflavonai, iš kurių naringeninas ir sakuranetinas parodė teigiamą rezistentinį poveikį prieš grybelius Cystospora
persoonii (Geibel 1995) [17]. Izoflavonoidai pasiţymi itin dideliu toksiškumu prieš grybelinius
patogenus [5].
Stipriausiai kaip fitoaleksinai veikia izoflavonoidai, kurių daugiausiai randama pupinių (lot. Leguminosae) šeimoje. Izoflavonoidai išgauti iš baltaţiedţio lubino (lot. Lupinus
albus) ir giminingų augalų rūšių šaknų ir lapų yra inhibitoriai prieš Cladosporium herbarum
(Harborne et al., 1976; Ingham et al., 1983). Iš japoniškųjų azuki pupelių (lot. Vigna angularis) išskirti flavonoidai pasiţymi priešgrybeliniu poveikiu Cephalosporium gregatum, kuris lemia šeimininko augalo stiebo puvimą [17].
Apsauga nuo ultravioletinių (UV) saulės spindulių. Daţnai minimas antocianų
apsauginis vaidmuo nuo UV saulės spindulių. Jų UV spinduliuotės sugeriamumo intervalas 270-290 nm. Acetilinti antocianinai yra stiprūs UV-B absorbentai. Išaugintose rugiagėlės (lot.
Centaurea cyanus) ląstelėse esantis cianidin-3-O-(6-O-malonil) glikozidas pastebimai sumaţino
DNR ţalą, sukeltą UV-B ar UV-C švitinimo. Iš raudonos obuolių luobelės išskirtas antocianinais turtingas ekstraktas apsaugo plazmidės DNR nuo UV-B paţaidos. Nors apsauga nuo saulės UV spindulių ir nėra antocianinų pagrindinė funkcija, tačiau atlikti tyrimai šią savybę leidţia vertinti teigiamai. Pagrindinė Himalajų kalnų rabarbaro (lot. Rheum nobile) UV apsauga yra 5 kvercetino glikozidai: 3-O-glikozidas, 3-O-galaktozidas, 3-O-rutinozidas, 3-O-arabinopiranozidas ir acilintas 3-O-glikozidas. [5; 17].
1.6 Flavonoidų poveikis ţmogaus organizmui
Obuoliai yra vienas iš pagrindinių fitocheminių bei antioksidacinių ţmogaus mitybos šaltinių [34]. Juose gausu antioksidantų, kurie gali būti svarbūs norint sumaţinti įvairių ligų riziką, kurios atsiranda dėl oksidacinio streso, pavyzdţiui: vainikinės ligos, imuninės sistemos ţala, astma, diabetas [20]. Patys fitochemikalai neatlieka konkrečios esminės funkcijos, tačiau turi tam tikrų sveikatą stiprinančių savybių, kurios gali nulemti polifenolių antioksidacinį poveikį [42].
Fenoliai aptinkami maiste susilaukė didelio susidomėjimo dėl jų antioksidacinių savybių bei įrodyto biologinio aktyvumo taikant vėţinių susirgimų, širdies ir kraujagyslių ligų gydyme [21]. Manoma, kad obuoliuose yra keletas fitochemikalų, kurie gali būti atsakingi uţ apsaugą nuo vėţio – karotinoidai, flavonoidai, izoflavonoidai, fenolinės rūgštys ir lignanai [26]. Atlikus bandymus su pelėmis buvo nustatytas obuolių polifenolių antihepatotoksinis poveikis prieš CCl4 sukeltą ūminį kepenų paţeidimą [18].
Antimikrobinis poveikis. Dėl sugebėjimo veikti prieš bakterijas, virusus ir grybus
flavonoidai gali būti plačiai naudojami sveikatos, mitybos srityse, gali būti vykdomi tyrinėjimai mikrobiologijos srityje. Dauguma flavonoidų (kvercetinas, naringinas, apigeninas, hesperidinas, katechinas ir kt.) daro įtaką RNR ir DNR virusų replikacijai, todėl yra naudojami virusinėms infekcijoms gydyti [46]. Daug atliktų tyrimų įrodė platų flavonoidų poveikį prieš Gram-teigiamas bakterijas ir grybelius. Flavonoidai sudaro kompleksus su ląstelės sienelės komponentais taip
uţkirsdami kelią mikrobų augimui. Manoma, kad tai ir gali būti pagrindinis mechanizmas, kuris inhibuoja mikrobų veikimą [23].
Ištirta, jog kvercetino glikozidai ir dihidrochalkonai geba inhibuoti HSV-1 ir HSV-2 replikaciją. 1000 µg/ml obuolių išspaudų acetoninio ekstrakto visiškai apsaugojo HSV-1 ir HSV-2 dirbtinai paveiktas ląsteles, o 1200 µg/ml metanolinio ekstrakto 90 proc. sumaţino citopatinį efektą ląstelėse. [37]. Grupė flavonoidų ( (1) dimetoksiflavanon-4„-O-β-D-gliukopiranozidas, (2) 5,7-
dimetoksiflavanon-4„-O-[2„„-O-(5„„„-O-trans-cinnamoyl)-β-D-apiofuranozil]-β-D-gliukopiranozidas, (3) 5,7,3„-trihidroksi-flavanon-4„-O-β-D-dimetoksiflavanon-4„-O-[2„„-O-(5„„„-O-trans-cinnamoyl)-β-D-apiofuranozil]-β-D-gliukopiranozidas, (4) naringenin-7-O-β-D-gliukopiranozidas, (5) rutinas ir (6) nikotiflorinas) po atliktų testų parodė stiprų antimikrobinį ir priešgrybelinį aktyvumą prieš P.aeruginosa, A.baumanni, S.aureus ir C.krusei. Be to, 5, 1 ir 3 flavonoidai pasiţymėjo aktyvumu prieš gripo virusą (PI-3), o 2 veiksmingai slopino HSV-1 ir E.faecalis [29].
Kitų tyrimų metu apigeninas, baikaleinas, biochaninas A, kemferolis, luteolinas ir naringeninas parodė teigiamą poveikį maţindami H5N1 nukleoproteinų ekspresiją plaučių epitelio ląstelėse. Baikaleinas ir biochaninas A buvo pasirinkti tolimesniems tyrimams. Ankstesnių tyrimų duomenimis (Xu et al., 2010; Chen et al., 2011) įrodyta, jog baikaleinas slopina sezoninio A gripo viruso replikaciją ląstelių kultūrose ir pelėse, taip pat didina priešvirusinį ribavirino poveikį, o biochaninas A šia kryptimi nebuvo tirtas. Tačiau plėtojant tyrimus tiek baikaleinas, tiek biochaninas A slopino dviejų padermių (A/Thailand/1(Kan-1)04 bei A/Vietnam/1203/04) H5N1 virusus [35].
Ištyrus penkių augalų poveikį prieš gram-teigiamas ir gram-neigiamas bakterijas paaiškėjo, kad keturi iš penkių augalų turėjo skirtingo dydţio antimikrobinį aktyvumą praktiškai prieš visus bandytus mikroorganizmus. Tyrime naudoti mikroorganizmai: gram-neigiamos lazdelės:
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoneae, Salmonela enteriditis, Shigella sp; gram-teigiamos sporas sudarančios lazdelės: Bacillus subtilis; gram-teigiami kokai: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes. Dideliu aktyvumu
prieš gram-teigiamus ir gram-neigiamus mikroorganizmus pasiţymėjo L. turbinata (Verbenaceae) ir S.parvifoliata (Labiatae). V.officinalis (Verbenaceae) parodė maţesnį aktyvumą prieš abejas mikroorganizmų grupes. S.peruviana (Caprifoliaceae) buvo aktyvus prieš gram-teigiamas bakterijas, o Ch.graveolens (Chenopodiaceae) neparodė jokio aktyvumo prieš ligas sukeliančius mikroorganizmus. Pagrindiniai augaluose aptikti junginiai – glikozilintos mono- ar di-hidroksilintų B ţiedo flavonoidų formos. Tyrimais įrodyta, kad šių augalų poţeminių dalių naudojimas liaudies
medicinoje yra saugus ir naudingas gydymo būdas siekiant uţkirsti kelią mikroorganizmų sukeliamoms ligoms [15].
Antioksidacinis potencialas. Antioksidantai – junginiai apsaugantys ląsteles nuo
laisvųjų radikalų poveikio. Esant oksidaciniam stresui, t.y. disbalansui tarp antioksidantų ir laisvųjų radikalų, vyksta ląstelių paţaidos, galimos nepageidautinos komplikacijos: širdies ir kraujagyslių ligos, cukrinis diabetas, vėţys, neurodegeneraciniai sutrikimai, senėjimas [46].
Antioksidantai sąveikauja su radikalus produkuojančiomis sistemomis ir pagerina endogeninių antioksidantų funkciją bei apsaugo ląsteles nuo laisvųjų radikalų poveikio [46]. MonoHER molekulė reaguodama su sukurtais radikalais tampa donoru ir atiduoda elektroną ar vandenilio atomą radikalui. Dėl šios reakcijos radikalas virsta stabilia molekule, o monoHER perima reaktyvumą. Tačiau organizme yra antioksidantų tinklas, kuriame reaktyvi tapusi monoHER molekulė yra veikiama ir praranda savo reaktyvumą, taip atsistato pusiausvyra ir atsinaujina antioksidantų tinklas. Esminiai trys šio mechanizmo etapai: antioksidantas atlieka katalizatoriaus vaidmenį ir neutralizuoja radikalus, radikalo reaktyvumas perkeliamas į endogeninį antioksidantų tinklą, tinkle vykdomas perdirbimas ir atstatoma pusiausvyra [24].
Kvercetinas – flavonoidas, kurio antioksidacinės savybės yra plačiai tiriamos, o gauti tyrimų rezultatai susilaukia didelio dėmesio. Jis pasiţymi stipriomis protekcinėmis savybėmis prieš organizmo reaktyvias deguonies formas [46]. Iš M.hupehensis lapų išskirtų trijų biflavonoidų glikozidų ir dvylikos flavonoidų – kvercetinas parodė didţiausią priešradikalinį aktyvumą tiek pagal DPPH, tiek ir pagal ABTS metodiką [40].
Flavonoidų antioksidaciniam aktyvumui didelę reikšmę turi molekulės struktūra. Svarbi hidroksilo grupė prie C3 atomo, taip pat dviguba jungtis jungianti C2 ir C3, karbonilo grupė prie C4 bei A ir B aromatinių ţiedų polihidroksilinimas [46].
Poveikis į širdies ir kraujagyslių sistemą. Buvo įrodyta, kad obuolių vartojimas
sumaţina širdies ir kraujagyslių ligų pavojų [20]. Flavonoidai turi galimybę padėti išvengti širdies ir kraujagyslių ligų įvairiais keliais: gerinant endotelio funkciją, maţinant kraujo spaudimą, slopinant lipoproteinų oksidaciją, maţinant apoB100 turinčių lipoproteinų koncentraciją plazmoje [28]. Vaisiuose ir darţovėse aptinkami flavonoidai kartu su nitratais gali veikti prevenciškai prieš kardiovaskuliarinės sistemos ligas. Flavonoidai ir nitratai sugeba padidinti azoto oksido kiekį, kuris gali pagerinti endotelio funkciją ir sumaţinti kraujo spaudimą. Yra įrodyta, kad flavonoidai kvercetinas ir (-)-epikatechinas didina azoto oksido kiekį [8]. Būtent azoto oksido stygius minimas
kaip endotelio disfunkcijos prieţastis, kadangi jis yra pagrindinis faktorius atpalaiduojantis kraujagysles. Tokiu atveju skatinama aterosklerozė. Aterozklerozė formuojasi, kai maţo tankio lipoproteinų (MTL) molekulės perneša didelį kiekį riebalų molekulių ant arterijų sienelių. Azoto oksidas stabdo MTL oksidaciją, taip slopindamas aterosklerotinių plokštelių formavimąsi [1]. Buvo atlikti tyrimai su pelėmis, kurioms buvo duodama granatmedţio vaisių sulčių, kurios savo sudėtyje turi antocianidinų ir proantocianidinų. Tris mėnesius pelėms duodant šių sulčių pasiekti reikšmingi rezultatai - net 44 proc. pavyko sumaţinti aterosklerozę [28].
Atlikti tyrimai su gyvūnais ir ţmonėmis ir gauti rezultatai: obuolių vartojimas ryškiai sumaţina plazmos cholesterolio, MTL cholesterolio ir trigliceridų koncentraciją. Pagrindiniai komponentai atsakingi uţ šį poveikį yra skaidulinės medţiagos ir polifenoliai [34]. Širdies smūgio rizika sumaţėjo 49 proc. ţmonėms, kurie vartojo 110 g obuolių per parą, lyginant su tais, kurie vartojo 18 g per parą [20].
Didelį kiekį flavonoidų turinčių obuolių vartojimas sąlygojo maţesnį sistolinį kraujo spaudimą bei pulsą [8]. Epidemiologiniai tyrimai įrodė sąryšį tarp flavonoidų ir širdies ir kraujagyslių sistemos ligų. Flavonoidų suvartojimas buvo susietas su maţesne širdies ligų bei insulto rizika. Tirtos septynios mišrios grupės (n=105 000) ir nustatyti 2087 išeminiai širdies sutrikimų atvejai. Lyginama po tris asmenis gavusius daugiausiai flavonoidų su trimis gavusiais maţiausiai. Rezultatai parodė, kad didesnis flavonoidų suvartojimas net 20 proc. sumaţino išeminės širdies ligos rizikos faktorius [16].
Priešuţdegiminis poveikis. Manoma, kad uţdegimas atlieka svarbų vaidmenį
inicijuojant kraujagyslių ligas ir joms progresuojant. Uţdegimas gali būti priklausomas nuo daugelio faktorių: citokinų, eikonazoidų, azoto monoksido. Jie moduliuoja ląstelinius signalus, ląstelių augimą ir diferenciaciją. In vitro tyrimai atskleidė, jog flavonoidų vartojimas turi poveikį į uţdegimo mediatorius, susijusius su priešuţdegiminiu poveikiu [16].
Yra duomenų, kad procianidinai (flavonoidams priklausantys proantocianidinų grupės nariai) turi imunomoduliacinį ir priešuţdegiminį poveikį in vitro. Bandymo metu buvo siekiama išsiaiškinti ar A tipo procianidinai (TAPP) pasiţymi priešuţdegiminiu poveikiu ir ar yra teigiamas poveikis reumatoidiniu artritu sergančioms ţiurkėms. Išanalizavus gautus duomenis buvo nustatytas reikšmingas TAPP priešuţdegiminis poveikis esant 4, 8 ir 25 mg/kg dozei, tačiau esant 2 mg/kg dozei, reikšmingo poveikio neuţfiksuota. Tyrimų eigoje pasirinkta vidutinė 8 mg/kg dozė ir bandyta išsiaiškinti priešartritinį aktyvumą. TAPP gydymas leido pasiekti teigiamų rezultatų – reikšmingai sumaţėjęs artritas, kulkšnies diametras, C reaktyviojo baltymo koncentracija serume [38].
Kitų tyrimų su pelėmis metu buvo siekiama nustatyti ar vartojant obuolius įmanoma apsisaugoti nuo cigarečių dūmų sukeltos lėtinės obstrukcinės plaučių ligos (LOPL). LOPL tai sudėtinga lėtinė uţdegiminės kilmės kvėpavimo takų liga, kurios pagrindinis rizikos veiksnys yra rūkymas. Bandymui parinktos pelės buvo veikiamos cigarečių dūmais 4 dienas, didinant ekspoziciją iki 6 valandų per dieną. Likus valandai iki dūmų poveikio pradţios pelės paveiktos obuolių polifenoliais per zondą. Tyrimai atlikti 18 valandų po paskutinės cigarečių dūmų ekspozicijos. Obuolių polifenoliniai ekstraktai priklausomai nuo jų dydţio turėjo reikšmingų rezultatų: sumaţinta cigarečių dūmų sukelta uţdegiminių ląstelių akumuliacija, gerokai pasikeitė oksidacinis stresas plaučiuose. Taigi bandymas patvirtina faktą, kad obuoliai gali būti naudojami kaip potencialus maisto papildas siekiant pagerinti LOPL sergančių ţmonių gyvenimo kokybę [7].
2. TYRIMŲ METODIKA
2.1 Tyrimų objektas
Tirti 2 „Aldas“ kultivavimo sistemų, 6 „Lodel“ kultivavimo sistemų, 6 „Rajka“ kultivavimo sistemų, 12 „Auksis“ veislių bei 11 „Ligol“ veislių poskiepių obuolių etanoliniai ekstraktai – iš viso 37 rūšių skirtingi ekstraktai. Ţaliavas teikė Lietuvos sodininkystės ir darţininkystės institutas (LSDI) įsikuręs Babtuose, Kauno rajone. Tyrimams naudoti obuoliai buvo liofilizuoti ir sumalti.
„Aldas“ veislės prierašai Eko arba I nurodo kokia kultivavimo sistema buvo taikoma auginant augalą. Eko – buvo taikoma ekologinė kultivavimo sistema, I – intensyvi (naudojamos trąšos).
Auginant „Lodel“ ir „Rajka“ veislių obelis buvo taikomos skirtingos kultivavimo sistemos. Dvi raidės po veislės pavadinimo nurodo kokios sistemos buvo taikytos: P – purenimas, Š – šienavimas, S – sideratai (ţaliosios trąšos), prie pavadinimo nesant šių raidţių derinio, reiškia, kad kultivavimo sistemos nebuvo taikytos. „Lodel“ PŠ pavadinimas nurodo, kad kultivuojant buvo taikoma purenimo-šienavimo sistema.
„Ligol“ ir „Auksis“ veislių pavadinimai turi prierašus susidedančius iš raidţių ir skaičių derinio – taip identifikuojami poskiepiai. Raidės nurodo kokioje šalyje poskiepis buvo sukurtas: B – Rusija, M – Didţioji Britanija, P – Lenkija, PB – Baltarusija, Pure – Latvija. Skaičius po raidės nurodo poskiepio augumą. M26 – pusiau ţemaūgis, P22, P51, P61 ir PB4 yra nykštukiniai poskiepiai, visi kiti – ţemaūgiai. M26 yra pats augiausias iš visų šiame bandyme naudotų poskiepių.
2.2 Naudotos medţiagos ir reagentai
Naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai yra analitinio švarumo. Analizei naudotas distiliuotas vanduo. Etanolis (96,3 proc. V/V) įsigytas iš „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva), natrio karbonatas iš „Carl Roth GmbH + Co. KG“ (Karlsruhe, Vokietija), vandeninis aliuminio (III)
chloridas, ledinė acto rūgštis iš „Fluka“ (Seelze, Vokietija), vandeninis heksametilentetraminas iš „Lachema“ (Neratovice, Čekija), natrio acetatas, Folin-Ciocalteu reagentas iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija), TPTZ, DPPH iš „Alfa Aesar“ (Karlsruhe, Vokietija), geleţies (III) clorido heksahidratas iš „Mecobenzon“ (Copenhagen, Danija).
2.3 Naudota aparatūra
Etanolinės ištraukos ekstrahuotos ultragarso vonelėje „Snorex Digital 10P Bandelin“ (Berlin, Vokietija). Flavonoidų, fenolinių junginių kiekis, antioksidantinis aktyvumas nustatytas naudojant spektrofotometrą „Beckman DU-70 Spectrophotometer“ (JAV). Medţiagos dţiovinimui naudota vakuuminė dţiovinimo spinta „SPT.200 Vacuum Drier“ (Krakow, Lenkija). Bandymo metu buvo naudojamos analitinės svarstyklės „Sartorius CP64-0CE” (Vokietija). Filtracija atlikta vakuuminiu siurbliu “2511 Dry Vacuum Pump/Compressor WELCH“ (Skokie, JAV), naudojami filtriniai popierėliai „Filtrak GmbH“ (Niederschlag, Vokietija), pipetės „Eppendorf Research“ (JAV).
2.4 Tyrimų metodai
2.4.1 Tiriamojo pavyzdţio paruošimas.
Liofilizuoti obuoliai homogenizuojami elektriniu smulkintuvu. Atsveriama 2,5 g (tiksli masė) paruoštų obuolių miltelių, dedame į 50 ml talpos kolbutę ir uţpilame 30 ml 70 proc. V/V etanoliu. Ekstrahuojama ultragarso vonelėje 20 min 40˚C temperatūroje, ultragarso intensyvumas 480 W (100 proc.). Gautas ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą 2 kartus po 10 ml 70 proc. V/V etanoliu, kol gaunama 50 ml.
2.4.2 Spektrofotometrinis suminio flavonoidų kiekio nustatymas.
Bendras flavonoidų kiekis (atitinkantis rutino kiekį) nustatomas su aliuminio (III) chloridu rūgščioje aplinkoje. Tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis lyginamas su etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydţiu.
Tiriamasis obuolių etanolinio ekstrakto tirpalas ruošiamas į 25 ml kolbutę. Pilama 1 ml ekstrakto, 1,1 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. vandeninio acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. vandeninio aliumino (III) chlorido, 2 ml distiliuoto vandens ir 0,4 ml vandeninio heksametilentetramino tirpalo.
Palyginamasis obuolių etanolinio ekstrakto tirpalas ruošiamas į 25 ml kolbutę įpilant 1 ml ekstrakto, 1,1 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. vandeninės acto rūgšties, 2,7 ml distiliuoto vandens. Prieš matuojant tiriamojo ir etaloninio tirpalų absorbcijos dydţius, jie laikomi 30 min. Absorbcijos dydis matuojamas prie 407 nm bangos ilgio 10 mm storio kiuvetėje.
Flavonoidų kiekis ţialiavoje, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas procentais (X), apskaičiuotas naudojant formulę:
50 100
D
m
D
V
m
R VAŽ VAŽ VAŽ R X ;čia:
m
R- rutino standarto masė gramais, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui paruošti.V
VAŽ – visas paruošto ekstrakto tūris mililitrais.D
VAŽ – ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis.m
VAŽ – ekstraktui ruošti sunaudota ţaliavos masė gramais.D
R – etaloninio rutino tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis.2.4.3 Spektrofotometrinis suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas.
Bendras fenolinių junginių kiekis (atitinkantis galo rūgšties kiekį) nustatomas Folino metodu arba kitaip vadinamu galo rūgšties ekvivalentiniu metodu. Tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis lyginamas su etaloninio galo rūgšties tirpalo absorbcijos dydţiu.
Folino reagentas. Į 100 ml kolbą pilame 10 ml Folino reagento ir praskiedţiame distiliuotu vandeniu iki ţymės.
Natrio karbonato reagentas. Į 1000 ml kolbą beriame 75 g natrio karbonato, tirpiname distiliuotu vandeniu ir skiedţiame iki ţymės.
Tirpalas A. 0,2 ml mėginio sumaišoma su 4 ml 96 proc. V/V etanoliu. Paruošiama po du mėgintuvėlius šio tirpalo kiekvienam bandiniui ir vieną tuščią (nulinį) bandinį.
Tuščias bandinys gaminamas sumaišant 1 ml distiliuoto vandens su 5 ml Folino reagento.
Tirpalas B. 1 ml tirpalo A sumaišomas su 5 ml Folino reagento.
Į tuščią bandinį ir į paruoštus tirpalus B pilame po 4 ml natrio karbonato. Gerai sumaišoma pradedant nuo tuščio bandinio siekiant jo neuţteršti fenoliniais junginiais. Paruoštus tirpalus laikome 1 valandą tamsoje.
2.4.4 Spektrofotometrinio DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymo
metodika.
Antioksidacinis aktyvumas nustatomas obuolių etanolinį ekstraktą veikiant DPPH tirpalu.
10 µl tiriamojo tirpalo ekstrakto sumaišoma su 3 ml standartizuotu (ABS=0,8) DPPH tirpalu 96,3 proc. V/V etanolyje ir įleidţiama į kiuvetę. Spektrofotometu matuojamas mėginio šviesos absorbcijos sumaţėjimas prie 517 nm bangos ilgio, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (po 30 min).
y 0,0002x + 0,0012; R2 = 0,9998;
čia: x – Trolokso standartinių tirpalų koncentracija, µmol/l; y – absorbcijos dydis.
TEAC reikšmė (µmol/g) apskaičiuojama naudojant formulę:
1000 0002 , 0 25 ) 0012 , 0 ( m V A X ;
čia: A – mėginio šviesos absorbcijos dydis;
V – ekstrakto tūris mililitrais, sunaudotas tiriamajam tirpalui ruošti; m –ţaliavos kiekis gramais, sunaudotas ekstraktui ruošti.
2.4.5 Spektrofotometrinio FRAP redukcinio aktyvumo nustatymo metodika.
Redukcinis aktyvumas nustatomas tiriamąjį tirpalą veikiant FRAP tirpalu.Reagentas A (acetatinis buferis). Gaminamas 300 mM acetatinis buferis: atsveriama 3,1 g natrio acetato, suberiama į 1000 ml kolbą, įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedţiama distiliuotu vandeniu iki ţymės (pH=3,6).
Reagentas B (TPTZ tirpalas). 50 ml distiliuoto vandens sumaišoma su 0,1695 ml koncentruotos chloro rūgšties. Gautame 40 mM vandenilio rūgšties tirpale tirpinama 0,1562 g TPTZ miltelių. Gaunamas 10 mM TPTZ tirpalas (2,4,6–Tri(2–Pyridyl)1,3,5–triazine 98 proc.).
Reagentas C (geleţies trichlorido heksahidrato tirpalas). Atsveriama 0,2703 g geleţies (III) chlorido heksahidrato ir ištirpinama 50 ml distiliuoto vandens. Gaunamas 20 mM geleţies (III) chlorido heksahidrato tirpalas.
Darbinis FRAP reagentas ruošiamas sumaišant A, B ir C reagentus santykiu 10:1:1. Imame 3 ml FRAP reagento ir pridedame 10 µl tiriamojo ekstrakto. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 90 min. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos dydis
esant 593 nm bangos ilgiui (palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj ekstrakto dedame tirpiklio).
Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama pagal Trolokso kalibracinės kreivės lygtį:
y 0,0001x + 0,0086; R2 = 0,9996;
čia: x – Trolokso standartinių tirpalų koncentracija, µmol/l; y – absorbcijos dydis.
TEAC reikšmė (µmol/g) apskaičiuojama naudojant formulę:
1000 0001 , 0 25 ) 0086 , 0 ( m V A X ;
čia: A – mėginio šviesos absorbcijos dydis;
V – ekstrakto tūris mililitrais, sunaudotas tiriamajam tirpalui ruošti; m –ţaliavos kiekis gramais, sunaudotas ekstraktui ruošti.
2.4.6 Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas
Statistinis duomenų įvertinimas atliktas „Microsoft Office Excel 2007“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20.0“ (IBM, JAV) statistiniu paketu. Duomenys statistiškai įvertinti, apskaičiuojant eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį ir standartinę paklaidą. Skirtumai laikyti statistiškai reikšmingais, kai 𝑃 < 0.05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų
obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
Fenolinių junginių kiekiui nustatyti tinkama taikyti UV ir regimojo spektro absorbcinė spektrinė analizė. Spektrofotometrija yra vienas iš naudingiausių kiekybinės analizės metodų, pasiţymi dideliu atrankumu, tai pakankamai spartus metodas. Metodas paremtas nustatomų medţiagų sugebėjimu absorbuoti tam tikro bangos ilgio šviesos srautą.
Atlikti tyriai su „Aldas“ veislės obelų vaisiais, kurie augo taikant skirtingas kultivavimo sistemas: EKO – ekologinė kultivavimo sistema ir I – intensyvi kultivavimo sistema.
7 pav. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas „Aldas“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose
Atlikus tyrimus nustatyta, kad didesnis fenolinių junginių kiekis (36,30±1,81 mg/g) nustatytas „Aldas“ EKO nei (26,16±1,31 mg/g) „Aldas“ I (7 pav.). Tokius skirtumus galėjo sąlygoti „Aldas“ EKO taikoma ekologinė kultivavimo sistema. Iš gautų rezultatų galima daryti prielaidą, jog ekologinė kultivavimo sistema yra pranašesnė uţ intensyvią kultivavimo sistemą, siekiant didesnio fenolinių junginių kiekio „Aldas“ veislės obuoliuose.
Tirti „Lodel“ veislės obuoliai, kuriems augant buvo taikytos skirtingos kultivavimo sistemos.
8 pav. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas „Lodel“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose
Atlikus „Lodel” veislės skirtingų kultivavimo sistemų obuolių ėminių analizę didţiausias fenolinių junginių kiekis (39,23±1,96 mg/g) nustatytas „Lodel“ PŠ, o maţiausias (15,13±0,76 mg/g) „Lodel”. Maţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas „Lodel“ veislėje be kodų reiškia, jog nebuvo taikomos jokios kultivavimo sistemos. Eksperimento duomenys rodo, kad taikant bet kokią kultivavimo sistemą, fenolinių junginių kiekis nustatytas pastebimai didesnis (maţiausias (30,22±1,51 mg/g) „Lodel“ ŠŠ) nei netaikant jokios kultivavimo sistemos. Geriausi rezultatai gauti taikant purenimo-šienavimo sistemą, taip pat aukšti rezultatai (34,80±1,74 mg/g) taikant ekologinę sistemą (8 pav.).
Atlikti bandymai su „Rajka“ veislės obuolių ėminių ekstraktais. „Rajka“ veislei taikomos kultivavimo sistemos tokiu pat principu kaip ir „Lodel“ veislės obelims.
9 pav. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas „Rajka“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose
Atlikus „Rajka” veislės skirtingų kultivavimo sistemų obuolių ėminių analizę didţiausias fenolinių junginių kiekis (28,98±1,45 mg/g) nustatytas „Rajka“ ŠP, o maţiausias (15,47±0,77 mg/g) „Rajka” PP (9 pav.). Didţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas taip pat kaip ir „Lodel“ veislės – taikant purenimo-šienavimo sistemą. Gauti duomenys leidţia daryti prielaidą, jog taikoma purenimo-šienavimo sistema yra tinkamiausia siekiant gauti didţiausių fenolinių junginių kiekių obuoliuose.
3.2 Fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių
ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
10 pav. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas „Auksis“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose
Atlikus „Auksis“ veislės poskiepių obuolių ėminių analizę didţiausias fenolinių junginių kiekis (61,20±3,06 mg/g) nustatytas „Auksis“ P22, o maţiausias (12,27±0,61 mg/g)
„Auksis” PB4. Remiantis gautais duomenimis, nykštukinių obelų vaisiuose, kurių kilmės šalis
Lenkija - „Auksis“ P22, „Auksis“ P61, „Auksis“ P59 – nustatytas didţiausias fenolinių junginių kiekis (atitinkamai 61,20±3,06 mg/g, 46,13±2,31 mg/g, 45,80±2,29 mg/g), o visų kitų ţemaūgių obelų vaisiuose ir „Auksis“ M26 pusiau ţemaūgės obels, nustatytas pastebimai maţesnis fenolinių junginių kiekis (10 pav.).
Atlikti fenolinių junginių kiekinės sudėties tyrimai su „Ligol“ veislės obelų poskiepių vaisių ėminiais.
11 pav. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas „Ligol“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose
Obuolių ėminių ekstraktuose didţiausias fenolinių junginių kiekis (32,13±1,61 mg/g) nustatytas „Ligol“ M26, o maţiausias (11,08±0,55 mg/g) „Ligol” P22, (14,90±0,74 mg/g) „Ligol“
P59 (11 pav.). „Ligol“ M26 (kilmės šalis D. Britanija) – yra pusiau ţemaūgis ir pats augiausias
atliktame tyrime, šio poskiepio obuolių ėminiuose nustatytas didţiausias fenolinių junginių kiekis.
3.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų
obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
Tyrimai atlikti su skirtingas kultivavimo sistemas auginant taikytais „Aldas“ veislės obuoliais.
12 pav. Flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas „Aldas“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose
Didesnis bendras flavonoidų (1,37±0,07 mg/g) kaip ir fenolinių junginių kiekis nustatytas „Aldas“ EKO nei (0,87±0,04 mg/g) „Aldas“ I (12 pav.). Pastebimas pastovumas, kad „Aldas“ EKO taikoma ekologinė kultivavimo sistema yra pranašesnė ir fenolinių junginių, ir bendru flavonoidų kiekiu uţ „Aldas“ I – intensyvią kultivavimo sistemą.
Atlikti bandymai su „Lodel“ veislės obuolių ėminių ekstraktais. Auginant „Lodel“ veislę buvo taikytos penkios skirtingos kultivavimo sistemos ir vienas pavyzdys, kuriam nebuvo taikoma jokia kultivavimo sistema.
13 pav. Flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas „Lodel“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose
Lyginant „Lodel“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminius didţiausias bendras flavonoidų kiekis (0,93±0,04 mg/g) nustatytas „Lodel“ PŠ, o maţiausias (0,54±0,03 mg/g)
„Lodel” PP (13 pav.). Purenimo-šienavimo sistema parodė geriausius rezultatus lyginant su
kitomis kultivavimo sistemomis. Gauti duomenys įrodo, jog netaikant jokios kultivavimo sistemos „Lodel“ veislei obuolių ėminiuose nustatomi maţi ir bendro flavonoidų, ir fenolinių junginių kiekiai.
Tyrimai atlikti su „Rajka“ veislės obuolių ėminiais. Šiai veislei taikomos tapačios kultivavimo sistemos kaip ir „Lodel“ veislei.
14 pav. Flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas „Rajka“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose
Naudojant purenimo-šienavimo kultivavimo sistemą auginant „Rajka“ veislės obelis nustatyta, kad šios kultivavimo sistemos obuolių ėminiai turi didţiausią bendrą flavonoidų kiekį (1,78±0,09 mg/g) „Rajka“ ŠP, o maţiausią (0,57±0,03 mg/g) „Rajka” PP (14 pav.). Atliktų tyrimų rezultatai leidţia teigti, kad taikoma purenimo-šienavimo sistema yra tinkamiausia siekiant nustatyti didţiausius flavonoidų ir fenolinių junginių kiekius tiek „Lodel“, tiek ir „Rajka“ veislėse.
3.4 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių
ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
15 pav. Flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas „Auksis“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose
Lyginant skirtingų „Auksis“ veislės poskiepių vaisių ėminius didţiausias bendras flavonoidų kiekis (1,28±0,06 mg/g) nustatytas „Auksis“ Pure 1, o maţiausias (0,58±0,03 mg/g)
„Auksis” M26. Nykštukiniai P59, P22, P61 poskiepiai parodė turintys taip pat pakankamai didelį
bendrą flavonoidų kiekį kaip ir fenolinių junginių (atitinkamai 1,19±0,06 mg/g, 0,93±0,05 mg/g ir 0,85±0,04 mg/g), o M26 poskiepis išsiskyrė tuo, kad jame nustatyti vieni maţiausių bendro flavonoidų ir fenolinių junginių kiekiai (15 pav.).
16 pav. Flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas „Ligol“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose
Didţiausias (1,09±0,05 mg/g) bendras flavonoidų kiekis nustatytas „Ligol“ M26, o maţiausias P59 (0,58±0,03 mg/g) (16 pav.). Vienintelio pusiau ţemaūgio šiame tyrime „Ligol“ veislės poskiepio M26 obuolių ėminiai išsiskyrė didţiausiu fenolinių junginių ir bendru flavonoidų kiekiu.
3.5 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų
obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu DPPH metodu
Tirti „Aldas“ veislės obuolių ėminiai. Obelys kultivuotos taikant ekologinę kultivavimo sistemą ir intensyvią kultivavimo sistemą.
17 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Aldas“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose naudojant DPPH metodą
Lyginant „Aldas“ veislės skirtingomis kultivavimo sistemomis augintų obuolių ėminius didesnis antioksidacinis aktyvumas (58,72± 2,94 µmol/g) pagal DPPH nustatytas „Aldas“
I nei (56,40± 2,82 µmol/g) „Aldas” EKO (17 pav.) obuolių etanoliniuose ekstraktų ėminiuose.
18 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Lodel“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose naudojant DPPH metodą
Lyginant „Lodel“ veislės skirtingų kultivavimo sistemų vaisių ėminius didţiausias antioksidacinis aktyvumas (68,73±3,44 µmol/g) naudojant DPPH metodą nustatytas „Lodel“ PP, o maţiausias (30,42±1,52 µmol/g) „Lodel” (18 pav.).
Tirti „Rajka“ veislės obelų vaisių ėminių ekstraktai, kuriems auginti buvo taikomos tokio paties principo kultivavimo sistemos kaip ir „Lodel“ veislei.
19 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Rajka“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose naudojant DPPH metodą
Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (43,83±2,19 µmol/g) taikant DPPH metodą nustatytas „Rajka“ ŠŠ, o maţiausias (29,82±1,49 µmol/g) „Rajka” ŠP (19 pav.).
3.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių
ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu DPPH metodu
Atlikti bandymai su „Auksis“ veislės obuolių ėminių ekstraktais.
20 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Auksis“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose naudojant DPPH metodą
DPPH metodu nustatyta, kad iš skirtingų „Auksis“ veislės poskiepių obuolių ėminių didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu (53,12± 2,66 µmol/g) pasiţymi „Auksis“ PB4, o maţiausiu (29,30±1,46 µmol/g) „Auksis” B396 (20 pav.). „Auksis“ PB4 – ţemaūgė obelis, kurios poskiepis sukurtas Baltarusijoje, „Auksis“ B396 – tai taip pat ţemaūgė obelis, poskiepis sukurtas Rusijoje. Skirtumus tarp poskiepių galėjo lemti poskiepių sukurimas skirtingomis klimato sąlygomis – Rusijoje klimatas atšiauresnis lyginant su Baltarusija.
Tirti „Ligol“ veislės poskiepių obuolių ėminių ekstraktai.
21 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Ligol“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose naudojant DPPH metodą
Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (57,64±2,88 µmol/g) naudojant DPPH metodą nustatytas „Ligol“ M9“, o maţiausias (27,53±1,38 µmol/g) „Ligol” B396 (21 pav.).
3.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių kultivavimo sistemų
obuolių ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu FRAP metodu
Tirtas „Aldas“ veislės obuolių ėminių antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu. Gauti duomenys skyrėsi nuo gautųjų DPPH metodu.
22 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Aldas“ veislės obuolių ėminiuose naudojant FRAP metodą
Atlikus „Aldas“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminių analizę didesnis antioksidacinis aktyvumas (217,34±10,87 µmol/g) taikant FRAP metodą nustatytas „Aldas“ EKO nei (192,63±9,63 µmol/g) „Aldas” I (22 pav.). Kadangi DPPH metodu didesnis antioksidacinis aktyvumas nustatytas „Aldas“ I, o FRAP metodu – „Aldas“ EKO, duomenys reikalauja išsamesnio „Aldas“ veislės antioksidacinio aktyvumo tyrimo.
23 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Lodel“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose naudojant FRAP metodą
Lyginant „Lodel“ veislės kultivavimo sistemų vaisių ėminius didţiausias antioksidacinis aktyvumas (282,79±14,14 µmol/g) taikant FRAP metodą nustatytas „Lodel“ PS, o maţiausias (135,98±6,80 µmol/g) „Lodel” (23 pav.).
Tirti „Rajka“ veislės skirtingų kultivavimo sistemų obelų vaisių ėminiai, kuriems auginti buvo taikomos tokio paties principo kultivavimo sistemos kaip ir „Lodel“.
24 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Rajka“ veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose naudojant FRAP metodą
Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (230,33±11,52 µmol/g) taikant FRAP metodą nustatytas „Rajka“ SŠ, o maţiausias (114,54±5,73 µmol/g) „Rajka” ŠP (24 pav.). „Rajka“ ŠP pasirodė maţiausiai antioksidaciškai aktyvus poskiepis atliekant bandymus abejais metodais.
3.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas skirtingų veislių poskiepių obuolių
ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu FRAP metodu
Atlikti tyrimai su „Auksis“ veislės obuolių poskiepių etanolinių ėminių ekstraktais.
25 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Auksis“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose naudojant FRAP metodą
Didţiausias antioksidacinis aktyvumas (238,47±11,92 µmol/g) FRAP metodu nustatytas „Auksis“ PB4, o maţiausias (144,08±7,20 µmol/g) „Auksis” P62 (25 pav.). Taikant ir DPPH, ir FRAP metodą didţiausias antioksidacinis aktyvumas iš visų „Auksis“ poskiepių obuolių ėminių nustatytas „Auksis“ PB4.
Tirti „Ligol“ veislės poskiepių obelų vaisių ėminiai.
26 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas „Ligol“ veislės poskiepių obuolių ėminiuose naudojant FRAP metodą
Atlikus eksperimentus su „Ligol“ veislės poskiepių obuolių ėminių ekstraktais nustatyta, kad didţiausias antioksidacinis aktyvumas (205,30±10,26 µmol/g) taikant FRAP metodą nustatytas „Ligol” P66, o maţiausias (113,17±5,66 µmol/g) „Ligol” PB4 (26 pav.). Duomenys gauti atlikus tyrimus abejais metodais neleidţia daryti vieningos išvados apie konkretaus poskiepio vaisius kaip geriausią antioksidantų šaltinį. Norint gauti tikslesnius duomenis rekomenduotina atlikti papildomus tyrimus.
IŠVADOS
1. Atlikta fenolinių junginių kiekinės sudėties analizė skirtingų veislių kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose. Nustatytas didţiausias (39,23±1,96 mg/g) fenolinių junginių kiekis „Lodel“ PŠ ir maţiausias (15,13±0,76 mg/g) „Lodel“ veislės ėminiuose
2. Atlikta fenolinių junginių kiekio analizė skirtingų veislių poskiepių obuolių ėminiuose. Nustatytas didţiausias (61,20±3,06 mg/g) fenolinių junginių kiekis
„Auksis“ P22, o maţiausias (11,08±0,55 mg/g) fenolinių junginių kiekis „Ligol“ P22 ėminiuose.
3. Atlikta bendro flavonoidų kiekio sudėties analizė skirtingų veislės kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose. Nustatytas didţiausias (1,78±0,09 mg/g) bendras flavonoidų kiekis „Rajka“ ŠP, o maţiausias (0,54±0,03 mg/g) „Lodel“ PP obuolių ėminiuose
4. Atlikta bendro flavonoidų kiekio sudėties analizė skirtingų veislės poskiepių obuolių ėminiuose. Nustatytas didţiausias (1,28±0,06 mg/g) bendras flavonoidų kiekis „Auksis“ Pure 1, o maţiausias (0,58±0,03 mg/g) „Auksis“ M26 ir „Ligol“
P59 obuolių ėminiuose.
5. Atlikti skirtingų obuolių veislių kultivavimo sistemų auginamų Lietuvoje obuolių ėminių ekstraktų antioksidantiniai tyrimai DPPH ir FRAP metodais. Didţiausias antioksidantinis aktyvumas DPPH metodu nustatytas (68,73±3,44 µmol/g)
„Lodel“ PP, o maţiausias (29,82±1,49 µmol/g) „Rajka“ ŠP kultivavimo sistemų
obuolių ėminiuose. Taikant FRAP metodą didţiausias antioksidantinis aktyvumas (282,79±14,14 µmol/g) kultivavimo sistemų obuolių ėminiuose nustatytas
„Lodel“ PS, o maţiausias (114,54±5,73 µmol/g) „Rajka“ ŠP.
6. DPPH metodu didţiausias antioksidantinis aktyvumas (57,64±2,88 µmol/g) iš poskiepių obuolių ėminių nustatytas „Ligol” M9, o maţiausias (27,53±1,38 µmol/g) „Ligol“ B396. Taikant FRAP metodą didţiausias antioksidantinis
aktyvumas (238,47±11,92 µmol/g) nustatytas „Auksis“ PB4, o maţiausias (113,17±5,66 µmol/g) „Ligol“ PB4 poskiepių obuolių ėminiuose.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Garalienė V. Endotelis ir azoto oksidas. Medicina (Kaunas) 2008; 44(7). 2. Janulis V., Puodţiūnienė G., et al. Fitocheminė analizė. Kaunas: KMU, 2008. 3. Purvinas E., Skirgailaitė V. Botanika. Vilnius: Mintis, 1975, p. 256.
4. Savickienė N., Ragaţinskienė O., Janulis V., Barsteigienė Z. Augalų anatomijos ir morfologijos paveikslų rinkinys. Kaunas: KMU, 2008, p. 35-40.
5. Andersen O.M., Markham K.R. Flavonoid Functions in Plants. Flavonoids:
Chemistry, Biochemistry and Applications. JAV: Taylor & Francis Group, 2006, p.
397-425.
6. Awad M.A., Jager A.D., Dekker M., Jongen W.M.F. Formation of flavonoids and chlorogenic acid in apples as affected by crop load. Scientia Horticulturae 91 (2001)
227-237.
7. Bao. M-J., et al. Apple polyphenol protects against cigarette smoke-induced acute lung injury. Nutrition 29 (2013) 235-243.
8. Bondonno C.P., et al. Flavonoid-rich apples and nitrate-rich spinach augment nitric oxide status and improve endothelial function in healthy men and women: a randomized controlled trial. Free Radical Biology & Medicine 52 (2012) 95-102. 9. Boyer J., Hai Liu R. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition
Journal 2004, 3:5.
10. Campeanu G., et al. Chemical Composition of the Fruits of Several Apple Cultivars Growth as Biological Crop. Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj 37 (2) 2009,
161-164.
11. Chen S., Wu B.-H., Fang J.-B., Liu Y.-L., Zhang H.-H., Fang L.-C., Guan L., Li
S.-H. Analysis of flavonoids from lotus (Nelumbo nucifera) leaves using high
performance liquid chromatography/photodiode array detector tandem electrospray ionization mass spectrometry and an extraction method optimized by orthogonal design. Journal of Chromatography A. 1227 (2012) 145-153.
