FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
KAROLINA VARNAITĖ
KAVOS RŪGŠTIES IR KAVOS RŪGŠTIES FENETILO ESTERIO
ANTIRADIKALINIŲ IR REDUKCINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas___________________ Parašas _________
Data ___________
KAVOS RŪGŠTIES IR KAVOS RŪGŠTIES FENETILO ESTERIO ANTIRADIKALINIŲ IR REDUKCINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė
Parašas __________
Data ____________
Recenzentas: __________________________
Parašas _________
Data ____________
Darbą atliko: Magistrantas Karolina Varnaitė
Parašas _________
Data ____________
Kaunas, 2017
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY...6
SANTRUMPOS ... 7
1. ĮVADAS...8
1.1. Darbo naujumas, aktualumas ir teorinė reikšmė ... 9
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
3.1. Tiriamųjų junginių apžvalga ... 11
3.1.1. Kavos rūgštis, struktūra ir jos biologinis poveikis ... 11
3.1.2. Kavos rūgšties fenetilo esteris, struktūra ir jo biologinis poveikis ... 14
3.2. Oksidacinis stresas ... 17
3.3. Aktyviosios deguonies formos... 17
3.4. Antioksidantų veikimo mechanizmas ... 19
3.5. Mitochondrijos, citochromas c ir jo vaidmuo apoptozėje ... 20
3.6. Flavonoidų antioksidantinės savybės ... 23
4. TYRIMO METODIKA ... 25
4.1. Tyrimo objektas ... 25
4.2. Naudoti reagentai ... 25
4.3. Naudota aparatūra ... 25
4.4. Tyrimo metodai ... 26
4.4.1. Citochromo c redukcijos tyrimas spektrofotometriniu metodu ... 26
4.4.2. Antiradikalinio aktyvumo tyrimas įvertinamas ABTS metodu ... 27
4.4.3. Antiradikalinis aktyvumas įvertintas DPPH metodu ... 28
4.4.4. Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu ... 28
4.5. Statistinė analizė ... 29
5. TYRIMO REZULTATAI ... 30
5.1. Kavos rūgšties poveikis citochromo c redukcijai ... 30
5.2. CAFE poveikis citochromo c redukcijai ... 31
5.3. Kavos rūgšties ir CAFE gebėjimo redukuoti citochromą c palyginimas ... 34
5.4. Kavos rūgšties ir CAFE antiradikalinio aktyvumo įvertinimas DPPH metodu ... 38
5.5. Kavos rūgšties ir CAFE antiradikalinio aktyvumo įvertinimas ABTS metodu ... 39
6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 41
7. IŠVADOS ... 43
8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45
SANTRAUKA
Karolina Varnaitė. Kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio antiradikalinių ir redukcinių savybių tyrimas: magistro baigiamasis darbas/ Mokslinė vadovė Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto medicinos akademija, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas, 2017.
Tikslas: Ištirti ir palyginti kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio antiradikalines ir redukcines savybes.
Uždaviniai:
1) Ištirti kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio gebėjimą redukuoti citochromą c. 2) Ištirti kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio redukcines savybes naudojantis FRAP metodu.
3) Ištirti kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio antiradikalines savybes (ABTS ir DPPH metodais).
Tyrimo metodai: Tyrimu siekta nustatyti 5 µM, 10 µM and 15 µM kavos rūgšties fenetilo esterio (CAFE) ir kavos rūgšties koncentracijų aktyvumą redukuojant citochromą c in vitro. Pasirinktas spektrofotometrinis metodas, absorbcija matuojama 500 – 600 nm bangų ilgių intervale. Citochromo c redukcijos maksimumai fiksuojami ties 550 nm ilgio banga. Bandymo metu rezultatai užrašomi 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 ir 21 minutę. Ditionitas pasirinktas kaip standartinis reduktorius, kurio redukuoto citochromo c kiekis tolesniuose skaičiavimuose prilyginamas 100 %. Antioksidantinis aktyvumas įvertintas spektrofotometriškai taikant ABTS, DPPH ir FRAP metodus.
Rezultatai: Spektrofotometriniu metodu nustatytas CAFE ir kavos rūgšties gebėjimas redukuoti citochromą c. Esant CAFE (5 μM) citochromą c redukavo 52% ±3%, tuo tarpu kavos rūgštis (5 μM) tik 44% ±2%, prie 10 μM CAFE redukavo 69% ±6% citochromo c, o kavos rūgštis – 45% ±3%, esant 15 μM koncentracijai CAFE redukcinė geba siekė 68% ± 4%, o kavos rūgšties tik 39% ±1%. Nustatytas antioksidantinis aktyvumas: DPPH metodu – CAFE - 76,7% ±0,1%, kavos rūgštis - 58,3% ±3%; ABTS metodu: CAFE - 81,7% ±0,3%, kavos rūgštis - 68,6% ±0,3%; FRAP metodu: CAFE - 0,074 TE mol/l, o kavos rūgštis 0,057 TE mol/l.
Išvados: Kavos rūgšties fenetilo esteris redukavo citochromą c 52-69% priklausomai nuo koncentracijos, o kavos rūgštis tik 39-45% t.y. 13-24% silpniau. Didesne redukcine ir antiradikaline galia pasižymėjo CAFE, ištyrus FRAP (29%), DPPH (19%) ir ABTS (14%) metodais. Taigi fenetilo radikalas nulemia stipresnias CAFE redukcines ir antiradikalines savybes.
SUMMARY
Karolina Varnaitė. Antiradical and reducing activity of caffeic acid and caffeic acid phenetyl ester: master's thesis/ Scientific leader Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical ACADEMY, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas, 2016.
Aim: to investigate and compare antiradical and reducing abilities of caffeic acid and caffeic acid phenetyl ester.
Tasks: 1) To evaluate CAPE and caffeic acid ability to reduce cytochrome c. 2) To evaluate CAFE and caffeic acid reducing abilities using FRAP method. 3) To evaluate CAFE and caffeic acid antiradical abilities in ABTS and DPPH methods.
Research methods: This assay evaluated 5 µM, 10 µM and 15 µM concentrations of CAPE and caffeic acid on cytochrome c redox status in vitro studies. The spectrophotometry method was used and the wave length interval was chosen 500 – 600 nm. The maximal value of the cytochrome c absorption was observed at the 550nm wave length. The results were recorded at the 0 min, 3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min and 21 min. Dithionite was used as a standart reducer, because its reduced cytochrome c amount was considered as a 100% in calculations. The antioxidant activity assessed by spectrophotometry using ABTS, DPPH and FRAP methods.
Results: The following results were obtained regarding ability of CAPE and caffeic acid to reduce cytochrome C at the level of 5 μM: CAPE - 52% ±3%, caffeic acid - 44% ±2%; 10 μM: CAPE - 69% ±6%, caffeic acid - 45% ±3%; 15 μM: CAPE - 68% ± 4%, caffeic acid - 39% ±1%. The antioxidant activity of CAPE by the DPPH method was 76,7% ±0,1%, by caffeic acid - 58,3% ±3%, by the ABTS method – CAPE - 81,7% ±0,3%, caffeic acid - 68,6% ±0,3%, by the FRAP method – CAPE - 0,074 TE mol/l, caffeic acid - 0,057 TE mol/l.
Conclusion: The highest antioxidant (antiradical and reducing) activity was refered to CAPE, rather than caffeic acid, it was observed using ABTS, DPPH and FRAP methods. Stronger cytochrome c reducing power distinguished CAPE (52-69%), whereas caffeic acid just 39-45%. Increased reducing power was related to the presence of phenetyl radical in CAFE structure.
SANTRUMPOS
ABTS - 2,2' - azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis CAFE - kavos rūgšties fenetilo esteris
Cyt c - Citochromas c
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
FRAP - Geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl.- ferric reducing antioxidant power) ROS - Aktyviosios deguonies formos
1. ĮVADAS
Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas naujų, perspektyvių, lipofilinėmis savybėmis pasižyminčių junginių paieškai tikslu apsaugoti ląsteles ir jų membranas nuo oksidacinio streso sukeltos pažaidos. Antioksidantai - tai junginiai, kurie apsaugo įvairių organizmų ląsteles nuo žalojančio laisvųjų radikalų poveikio [1].
Kavos rūgštis ir kavos rūgšties fenetilo esteris (CAFE) yra bioaktyvūs junginiai [2], randami propolyje, kurį pagamina bitės [3], surinkdamos nuo lipnių medžių pumpurų sakus ir sumaišydamos su seilėmis, fermentais ir vašku [4]. Propolis buvo naudojamas dar senovės liaudies medicinoje dėl įvarių biologinių savybių, tokių kaip – antibakterinės, priešvirusinės, antiuždegiminės, imunomoduliacinės ir antioksidantines savybės [5]. CAFE yra žinoma kaip stipri antioksidantinė medžiaga, kuri slopina ksantino oksidazę ir aktyviąsias deguonies formas (ROS) žmogaus neutrofiluose [6] [7]. Antioksidantai yra apibrėžiami kaip junginiai, kurie gali atidėti, slopinti arba užkirsti kelią oksidacijai, surišant laisvuosius radikalus ir sumažinant oksidacinį stresą [1]. Oksidacinis stresas gali sukelti ląstelių ir audinių apoptozę.
Antioksidantai reikalingi apsaugoti DNR struktūrą, išlaikyti nesutrikdytą baltymų ar lipidų apykaitą. Jų trūkumas gali atsirasti dėl nevisavertės mitybos (pvz.: veganizmo), prastos mitybos (pvz.: dietos, badavimo), todėl gali pasireikšti neigiamas (ROS) poveikis organizmui [8]. Daugelis degeneracinių ligų susijusių su žmogaus organizmo senėjimu (vėžys, kardiovaskulinės ligos, katarakta, diabetas) yra oksidacinio streso rezultatas, kurį sukelia laisvieji radikalai. Junginiai sukeliantys tokias reakcijas yra nestabilūs ir labai aktyvūs, nes dažniausiai turi vieną ar kelis nesuporuotus elektronus [9]. Fenoliniai junginiai yra svarbūs antioksidantai, slopinantys uždegimo mediatorių išsiskyrimą [10]. Laisvosios aktyviosios deguonies formos gali turėti įtakos apoptozės vyksmui dėl savo oksidacinių savybių. Jos, kaip oksidacinės medžiagos gali oksiduoti citochromą c, taip skatindamos apoptosomos formavimąsi ir inicijuoti apoptozę [11].
Apoptozė gali būti sąlygota įvarių dirgiklių, kurie sukelia citochromo c išėjimą iš mitochondrijų į citoplazmą, sąlygodami apoptosomos komplekso formąvimasi ir pačios apoptozės vyksmą. Kadangi egzistuoja dvi citochromo c redokso formos: redukuota (Fe2+) ir oksiduota (Fe3+), jos
svarbios ląstlės žūčiai. Oksiduota forma skatina apoptozę, o redukuota – yra inertiška ir nesudaro apoptosomos komplekso [8].
Ryšys tarp kavos rūgšties ir CAFE cheminių struktūrų ir redukcinio poveikio ypatumų nėra pakankamai ištirtas. Tyrimų apie CAFE ir kavos rūgšties gebėjimą redukuoti citochromą c nėra. Keičiant citochromo c redokso būseną galima būtų reguliuoti ląstelės žūties procesus.
Taigi, ištyrus biologiškai aktyvių junginių gebėjimą redukuoti citochromą c ir antioksidantines savybes, atrinkti junginiai gali būti naudojami tolimesniems in vivo tyrimams, siekiant apsaugoti ląsteles, nuo oksidacinio streso sukeltos pažaidos.
1.1 . Darbo naujumas, aktualumas ir teorinė reikšmė
Šiame darbe palygintas CAFE ir kavos rūgšties gebėjimas redukuoti citochromą c ir jų antioksidantinės savybės. Mokslinių tyrimų, kur būtų išanalizuotos ir palygintos CAFE ir kavos rūgšties savybės redukuoti citochromą c nerasta. Tokie tyrimai yra svarbūs, nes nuo citochromo c redokso būsenos, priklauso ląstelės žūties reguliavimas. Tai ypač reikšminga išemijos metu, kai stebimas apoptozės aktyvavimas. Kadangi tiriamosios medžiagos randamos bičių produkte (propolyje), o šiuo metu daugelis žmonių noriai grįžta prie ,,natūraliosios medicinos“, todėl yra moksliškai svarbu ištirti jame esančių biologiškai aktyvių junginių – CAFE ir kavos rūgšties, antioksidantines ir redukcines savybes.
Nustatyta, kad CAFE redukuoja citochromą c ~12-24% efektyviau (52-69%) priklausomai nuo koncentracijos, nei kavos rūgštis (39-45%). Vertinant antioksidantines savybes FRAP metodu, didesne redukcine galia pasižymėjo kavos rūgšties fenetilo esteris (~29%) lyginant su kavos rūgštimi. Antiradikalinis aktyvumas DPPH (19%), ABTS (14%) metodais yra didesnis CAFE, nei kavos rūgšties. Todėl galima teigti, jog CAFE turi stipresnias redukcines savybes, kurios siejamos su fenetilo radikalo prisijungimu prie pagrindinės kavos rūgšties formulės.
Remiantis gautais rezultatais, bus atliekami tolimesni in vivo tyrimai, siekiant apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso sukeltos pažaidos ir apoptozės, išemijos in vivo modeliuose.
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti kavos rūgšties fenetilo esterio ir kavos rūgšties redukcines savybes ir antiradikalinį aktyvumą.
Uždaviniai:
1. Ištirti CAFE ir kavos rūgšties gebėjimą redukuoti citochromą c.
2. Ištirti CAFE ir kavos rūgšties redukcines savybes, naudojantis FRAP metodu. 3. Ištirti CAFE ir kavos rūgšties antiradikalines savybes (ABTS ir DPPH metodais).
2. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1.Tiriamųjų junginių apžvalga
3.1.1.Kavos rūgštis, struktūra ir jos biologinis poveikis
Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas gamtinės kilmės junginiams, kurie galėtų padėti organizmui kovojant su audinių pažeidimais, su tais, kuriuos sukelia oksidacinis stresas. Polifenoliniai junginiai yra biologiškai aktyvių medžiagų grupė, pasižymintys priešuždegiminėmis, priešvėžinėmis, priešvirusinėmis savybėmis [12]. Polifenolinė rūgštis retai randama laisvoje formoje, tačiau išgryninta pasižymi dideliu antioksidantiniu aktyvumu [13]. Išsiaiškinta, jog fenoliniai junginiai augaluose dalyvauja baltymų sintezėje, fermentų aktyvacijoje, fotosintezėje, įeina į struktūrinių komponentų sudėtį [14]. Kavos rūgštis (1 pav.), priklauso fenolinių junginių pogrupiui - hidroksicinamono rūgštims, kurios struktūroje yra aromatinė grupė. Kavos rūgštis – 3,4-dihidroksicinamono rūgštis. Struktūrą sudaro (1 pav.) nesoti karboksirūgštis su benzeno žiedu alifatinėje grandinėje – cinamono rūgštis, prie benzeno žiedo prisijungus hidroksi- grupėm orto-, meta- padėtyse – susidaro kavos rūgštis. Pastaraisiais metais ypač susidomėta aktyviais polifenoliniais junginiais – kavos rūgšties fenetilo esteriu ir jo metabolitu kavos rūgštimi, randamais bičių pikyje (propolyje). Atlikti tyrimai rodo, kad kavos rūgštis efektyviau reaguoja su peroksilo radikalu (peroksilo radikalas dalyvauja lipidų peroksidacijoje ir yra žalingas ląstelių membranoms), lyginant su standartiniu reduktoriumi – troloksu, kuris yra naudojamas oksidacinio streso metu [15].
1 pav. Kavos rūgšties (C9H8O4)cheminė struktūra [13].
Didelis antioksidantinis aktyvumas priskiriamas delokalizuotiems nesuporuotiems elektronams esantiems konjuguotoje šoninėje grandinėje. Junginio struktūros stabilumą padidina papildomas
vandenilinis ryšys, atsirandantis suardžius orto- padėtyje esančio hidroksi radikalo O – H ryšį [16]. Hidroksicinamono rūgščių antioksidantinių savybių in vitro tyrimas, turi svarbią reikšmę tolesnei in vivo analizei. Sustiprintas kavos rūgšties antioksidantinis veikimas siejamas su hidroksi- grupių (orto-, meta- padėtys), gebėjimu sudaryti o – chinoną, kuris pasižymi dideliu reaktyvumu [17]. Nustatyta, kad 3-hidroksilo grupės pakeitimas metoksi grupe kavos rūgšties molekulėje padidina antioksidantinį efektyvumą [18]. Didžiausias kavos rūgšties aktyvumas yra pasiekiamas kai prie pastarojo junginio prisitvirtina prolinas, histidinas ir NH2 grupė :
2 pav. Kavos rūgštis-Pro-His-NH2 cheminė ir molekulinė struktūros [19].
Šiame komplekse prolinas suteikia palankesnes sąlygas histidinui stabilizuoti kavos rūgšties hidroksilo grupes, toks sinergistinis ryšys sukuria stipresnį antioksidantinį veikimą, nei atskirai veikiant kavos rūgščiai [19]. Atlikus tyrimus su limfocitais, kuriuose buvo skirtinga kavos rūgšties koncentracija, veikiant UV spinduliais, pasireiškė apsauginis kavos rūgšties poveikis, t.y. sumažėjo lipidų peroksidacija ir DNR pažeidimo laipsnis [20]. Indijos mokslininkai tirdami kavos rūgštį nustatė, jog pastaroji efektyviai veikė prieš oksidacinį stresą, kurį sukėlė priešvėžinis junginys cisplatina (cisplatina - gali pakeisti daugelio antioksidantų fermentų veiksmingumą), kuria buvo gydomos labaratorinės žiurkės [21]. Taigi, kavos rūgštis pasižymi daugeliu savybių, tokių kaip: antiuždegiminės, imunomoduliacinės, neuroprotekcinės, priešvėžines savybės, tačiau šiame darbe labiausiai atsižvelgiama į kavos rūgšties gebėjimą stabdyti ląstelių apoptozę [13]. Fotoprotekcinis kavos rūgšties poveikis pasireiškia surišant glutationo (γ-L-glutamil-L-cisteinilglicino) metabolizmo metu susidaračius laisvus ir aktyvius radikalus [22]. Tiriant fenolinių rūgščių antioksidantinį potencialą lipofilinėje sistemoje, rezultatai parodė, jog polifenolinės rūgštys aktyvesnės už monofenolines rūgštis. Nustatyta kad, įvedus hidroksilo grupę į orto- ar para- padėtis padidėja antioksidantinis aktyvumas lipidinėje sistemoje [23].
3 pav. Hidroksicinamono rūgščių struktūrinė formulė [18].
Hidroksicinamono rūgštims (3 pav.) didesnį antioksidantinį potencialą suteikia mažiausiai dvi arba geriau trys, šalia viena kitos esančios fenolinės hidroksilo grupės ir karbonilo grupė (gali būti aromatinis esteris o-laktonas ir t.t.). Prie orto- padėties prisijungusios elektronų donorės alkilo ar metoksi grupės padidina ariloksilo radikalo stabilumą, tuo pačiu didindamos antioksidantinį efektyvumą. Difenolinės rūgštys, iš jų ir kavos rūgštis, turi didesnį potencialą prisijungti laisvą radikalą nei monofenolinė rūgštis. Efektyviausi antioksidantai yra tie junginiai, kurie turi vieną laisvą, o kitą alkilintą hidroksilo grupę, dažniausiai metoksi grupę arba polifenoliai su orto- ir para- padėtyse esančiais hidroksilo radikalais. Polifenolių veikimo mechanizmas aiškinamas, jog pastarieji slopina ląstelės citozolyje esančių fermentų aktyvumą ir tokiu būdu stabdo aktyviųjų deguonies formų (ROS) susidarymą, taip pat gali sinergistiškai veikti su kitais antioksidantais, didindami jų antioksidantinį efektyvumą [23]. Fenoliniams junginiams veikiant kaip antioksidantams, tiesiogiai blokuojamas hidroperoksido susidarymas. Blokavimas siejamas su fenolinės grupės savybe lengvai atiduoti vandenilio atomą. Hidroksicinamono rūgštyse esanti -CH=CH-COOH grandinė, užtikrina vandenilio atomo atskilimą nuo hidroksilo grupės ir vėlesnį molekulės stabilizavimą susijungus su fenolio grupe [18]. Atlikti in vitro tyrimai su kavos rūgštimi, norint sužinoti pastarosios įtaką mažo tankio lipidų peroksidacijai, kuri buvo pasirinkta kaip modelis, tirti hidroksicinamono rūgščių darinių apsauginę funkciją ir laisvųjų radikalų sukeltą pažaidą biologinių membranų lygyje. Mažo tankio lipidų peroksidacija yra aterosklerozės rizikos faktorius, kurią gali sukelti oksiduoti laisvieji radikalai. Antiokidantų, galinčių surišti laisvuosius radikalus geba, priklauso nuo junginio molekulės struktūros. Pavyzdžiui, lyginat dvi hidroksicinamono rūgštis su įvairiu skaičiumi hidroksilo radikalų, aktyvesnė bus ta, kurioje bus daugiau OH- radikalų, nes tai rūgščiai leis sudaryti junginį orto-chinoną, kuris yra labai reaktyvus (žr. 4 pav) [24]. Taip pat pastebėta, kad hidroksicinaminių rūgščių darinių antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo molekulės elektrocheminės būsenos t.y. prie skirtingų pH skirsis ir junginio gebėjimas redukuoti [25] .
4 pav. Kavos rūgšties vaidmuo lipidų peroksidacijos slopinimo mechanizme [24].
Vykstant lipidų peroksidacijai (4 pav.) susidaro laisvas radikalas LOO•, kuris reaguoja su OH radikalu, prisijungusiu prie kavos rūgšties, kodensuoto benzeno žiedo dalies. Nuo deguonies atskėlęs vandenilį tampa riebalų rūgščių hidroperoksidu (LOOH). Reakcija vyksta prie tų hidroksilo radikalų, prie kurių šalia susidariusios nesočiosios jungtys. Atskilus abiems OH radikalo vandeniliams, jų vietoje lieka du nesuporuoti pavieniai elektronai, kurie suformuoja dvigubas π jungtis su nesočiuoju benzeno žiedu t.y. susidaro orto-chinonas – nepatvarus tačiau, labai reaktyvus antioksidantinis junginys [24].
3.1.2. Kavos rūgšties fenetilo esteris, struktūra ir jo biologinis poveikis
Kavos rūgšties fenetilo esteris (CAFE) yra biologiškai aktyvus junginys, kaip ir jo metabolitas – kavos rūgštis, yra randami bičių surinktame propolyje. Bičių produkte galima rasti daugiau kaip 300 junginių, tokių kaip: flavonoidai, polifenoliniai esteriai, terpenai, steroidai, amino rūgštys, kavos rūgštys ir jų esteriai ir neorgninės medžiagos. Alžyre buvo atliekami antioksidantiniai tyrimai su tose vietose surinktu propoliu, redukcijos galią mokslininkai matavo junginių gebėjimu redukuoti kalio ferocianidą t.y. Fe+3 redukuoti iki Fe+2. Buvo lyginama iš propolio gaunamų junginių - flavonoidų ir fenolinių medžiagų redukcinės savybės. Gauti rezultatai parodė, jog didesnė redukcinė galia pasižymėjo fenolinių junginų dariniai, nei vien flavonoidų. Taigi, galima teigti, kad propolio antioksidantinis aktyvumas
labiau priklauso nuo kitų fenolinių junginių nei nuo flavonoidų kiekio [26]. Kavos rūgšties fenetilo esteris be antioksidantinių savybių pasižymi priešvirusinėmis, priešuždegiminėmis ir priešvėžinėmis savybėmis [27]. Atlikti tyrimai įrodo, jog CAFE blokuoja laisvųjų radikalų susidarymą neutrofiluose ir ksantino oksidazės sistemoje ir efektyviai naudojamas apsaugoti audinius, slopinant ROS susidarymą audinių ląstelėse. Kavos rūgšties fenetilo esteris (CAFE), priklauso hidroksicinamono rūgščių kategorijai ir sudarytas iš kavos rūgšties bei fenetilo alkoholio [28].
5 pav. Kavos rūgšties fenetilo esterio struktūrinė formulė [29].
Atlikti tyrimai su etanoliniu propolio ekstraktu, imti keli mėginiai su nevienodu kiekiu CAFE juose parodė, jog tirtieji propolio junginiai, kad ir su mažiausia CAFE koncentracija, antioksidantiniu požiūriu buvo daug aktyvesni nei tie, kuriuose veikliosios medžiagos nebuvo. Buvo padaryta išvada, kad laisvųjų radikalų surišimas ir fermento ksantino oksidazės aktyvumas priklauso nuo CAFE koncentracijos ekstraktuose [30]. Kaip antioksidantas, kavos rūgšties fenetilo esteris gali būti naudojamas apsaugai, nuo išemijos/reperfuzijos sąlygotų organų pažeidimų, stabdydamas ląstelėse vykstantį oksidacinį stresą. Mokslininkai pasitelkdami žiurkių išemijos/reperfuzijos modelį (reperfuzija truko 120 minučių, o išemija buvo vykdoma 30 minučių, užspaudus kairiąją vainikinę arteriją) įrodė, jog paskiriant nedidelį kiekį (5 μl) CAFE parentaliai į veną, galima sumažinti miokardo infarkto dydį (atitinkamai 23 ± 3% ir 9 ± 4%) ir rizikos zonos išplitimo zoną (atitinkamai 50 ± 4% and 32 ± 6%) [31]. Kiti bandymai, atliekami norint nustatyti CAFE ir tuo pačiu jo metabolito – kavos rūgšties efektyvumą, slopinant ROS susidarymą neutrofiluose, tuo pačiu ir ksantino oksidazės aktyvumą, nes iš pastarosios ir susidaro aktyviosios deguonies formos (ROS). Tyrime, neutrofilus išskyrė iš šviežio donorų kraujo, kuriuose buvo tirta skirtingos CAFE ir kavos rūgšties koncentracijos (5, 10, 15, 20, 25, 30 μmol/1kg) poveikis, ROS aktyvumas, buvo vertinamas stebint luminescencijos pokyčius. Nustatyta, kad CAFE efektyviausia, kai jos koncentracija siekia 5 μmol/1kg, o kavos rūgštis 30 μmol/1kg [32].
Analizuota, jog antioksidantinis CAFE aktyvumas priklauso nuo molekulės gebėjimo sudaryti katecholo žiedo konfiguraciją. Vykstant oksidacijos reakcijai (6 pav.), susiformuoja reaktyvi vieta benzeno žiede, kuri aktyviai reaguoja su kitais junginiais [33].
6 pav. Molekulės turinčios katecholo fragmentą oksidacija [33].
Mokslininkai norėdami pagrįsti CAFE priešvėžines savybes, atliko tyrimus su fermentu 5-lipoksigenaze. Vykstant 5-lipoksigenazės oksidacijai, susidaro arachidono rūgšties metabolitai - aktyvūs mediatoriai, išsiskiriantys organizme atsiradus uždegimui ar navikiniam dariniui. Tirta CAFE, kavos rūgšties galimybė slopinti 5-lipoksigenazės susidarymą [34].
7 pav. Kavos rūgšties ir CAFE poveikis slopinant 5 – lipoksigenazę [34].
Rezultatai parodė, jog 5-lipooksigenzės slopinimas priklauso nuo junginio koncentracijos. Efektyvesnis buvo kavos rūgšties fenetilo esteris t.y. 50μM CAFE užslopino iki 95% 5-lipoksigenzės aktyvumo, tuo tarpu kavos rūgštis tik 50%. Taigi iš pastarųjų tyrimų galima daryti išvadą, jog CAFE aktyvesnė už kavos rūgštį [34].
Kiti atlikti in vitro tyrmai su CAFE, kavos ir ferulo rūgštimis, norint surinkti informaciją apie su struktūra susijusį biologinį junginio aktyvumą. Tirtas veikliųjų medžiagų gebėjimas surišti laisvuosius radikalus. Naudotas DPPH radikalų surišimo metodas, matuota geba surišti galvinoksilo radikalus ir superoksido anijonus O2-, taip pat ir lipidų peroksidacijos slopinimas. Rezultatai
molekulėje. Taip pat mokslininkai pastebėjo, kad antioksidantinis aktyvumas priklauso ne tik nuo molekulės struktūros, bet ir nuo jos poliškumo ir hidrofobiškumo. CAFE buvo aktyviausia iš visų trijų tirtų junginių [35].
3.2. Oksidacinis stresas
Oksidacinis stresas yra žalingas procesas, kuris atsiranda kai padidėja ROS koncentracija ląstelėje, tuo pačiu matomas sumažėjęs antioksidantų kiekis. ROS gamyba ypač padidėja esant uždegimui, tada citokinai išskiriami į audinius – tokį procesą gali sustabdyti antioksidantai, augaliniai ir fitocheminiai junginiai [36]. Oksidacinio streso priežastys, gali būti fizinis ar cheminis audinių pažeidimas, kurių metu atsiranda įvarios organizmo patologijos. Dažniausiai ląstelę pažeidžiantys laisvieji radikalai, savo sudėtyje turi deguonies ar azoto, taip pat jie gali susidaryti mitochondrijose ar endoplazminiame tinkle įvairių reakcijų metu. Mokslininkai nustatė, jog augalinės kilmės antioksidantai, turintys savybę surišti laisvuosius radikalus, gali turėti didelę reikšmę gydant ligas, kurias sukelia oksidacinis stresas [14]. Aktyviosios deguonies formos dalyvauja daugelyje biologinių procesų – apoptozėje, transkripcijos faktoriaus ir signalinių baltymų aktyvacijoje. Tačiau, kai išsiskiria per daug ROS, vyksta atvirkščias procesas – oksidacinis stresas. Pastarasis siejamas su įvairiais nervų sistemos sutrikimais (depresija, psichozė) ir gali prisidėti ar skatinti smegenų struktūros pažeidimus. Mokslininkai, tyrę ROS in vivo, susidūrė su sunkumais, norėdami išmatuoti jų kiekį, dėl didelio reaktyvumo ir trumpo gyvavimo laiko. Alternatyvai jie pasirinko stebėti oksidacinio streso paveiktus lipidus ar DNR [37].
Taigi norint išvengti didelių svyravimų tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų, terapiniais tikslais galima naudoti iš augalų išgaunamus antioksidantus, tačiau reikia detaliai ištirti naudojamo antioksidanto veikimo mechanizmą ir poveikį, oksidacinio streso sukeltiems audinių pažeidimams [38].
3.3. Aktyviosios deguonies formos
Aktyvios deguonies formos (ROS) – šalutinės toksiškos medžiagos atsirandančios aerobinio metabolizmo metu. Tai laisvi radikalai ir chemiškai reaktyvūs deguonies ir azoto junginiai - superoksido radikalas (O2•), hidroksilo radikalas (OH•), azoto oksido radikalas (NO•), lipidų peroksidų radikalai
(LOO•), taip pat vandenilio peroksidas (H2O2). Neigiamos pasekmės dažniausiai pasireiškia DNR,
baltymų ir lipidų pažeidimais. Pažeidžiant genetinę informaciją gali įtrūkti polinukleotidinė grandinė, gali atsirasti pagrindinių bazių pakitimai ar suskaidyti pentozę [39]. ROS perteklius baltymus gali
oksiduoti negrįžtamai, lipiduose vykstanti peroksidacija leidžia laisviesiems radikalams prisijungti prie nesočiųjų lipidų, susidaro daug metabolitų, kurie suardo lipidus ir sukelia ląstelių apoptozę [40][41].
Visi laisvieji radikalai turi nesuporuotų elektronų, kurie padaro junginį reaktyvų. O2 vadinamas
laisvuoju radikalu, nes savo išorinėje orbitoje jis turi du nesuporuotus elektronus, kurie dar labiau sustiprina jo reaktyvumą. Superoksidas O2•– turi vienu elektronu daugiau nei O2. Kadangi superoksidas
turi jau tik vieną nesuporuotą elektroną jam lengviau prisijungti ir reakcija vyksta kur kas greičiau. Tačiau už superoksidą aktyvesnis yra H+, nes pastarasis superoksidą (O
2•) gali redukuoti iki H2O2 arba
oksiduoti iki O2. Vykstant metabolizmui mitochondrijose normaliomis sąlygomis nuo mitochondrijų
kvėpavimo grandinės nuteka keli elektronai, kurie prisijungia prie O2 ir tampa superoksido laisvaisiais
radikalais O2•-. Esant sepsiui, išemijai/reperfuzijai, audinių citozolyje esantis fermentas - ksantino
oksidazė, kuris paprastai veikia kaip dehidrogenazė ir perduoda elektronus NAD+, esant sutrikimams,
fermentas pradeda veikti kaip oksidazė ir gaminti žalingą O2•- [42].
Vienas pagrindiniu toksinių ROS požymių, yra ląstelių membranos pažeidimai, vykstant lipidų peroksidacijai. Laisvieji radikalai OH•, OH2•-, ir OONO-, išskyrus O2•-, atskelia vandenilio atomą nuo
metileno radikalo (=CH2), sukurdami anglies radikalą (-•CH). Pastarasis radikalas prisijungdamas prie
lipidų molekulėse esančių (-CH2-) grupių, sukelia įvarių grandininių reakcijų, kurios pakeičia
membranos formą ir takumą. Toks pažeidimas sutrikdo kalcio pusiausvyrą, kuri būtina intraląsteliniam signalui – perduoti informaciją apie padarytą žalą. Lipidų peroksidacija gali pažeisti DNR ir baltymus. Baltymuose vykstanti oksidacija sutrikdo receptorių veiklą, fermentų funkcijas ir signalinių mediatorių perdavimo kelius. Tačiau jei baltymus paveikė oksidacija, tai dar nereiškia, kad šis prarado savo funkciją ir biologinę reikšmę, tai reikia įrodyti organizmo funkcijų pakitimais. Potencialiai svarbiausios baltymuose vietose oksidacijai yra –SH grupės, nes –S-S- ryšys, esantis tarp skirtingų baltymų gijų arba dalių, gali sukelti baltymų konformacijų pokyčius, o tai jau reiškia baltymo funkcijos pakitimą [42].
H2O2 susiformuoja iš superoksido, susidariusiam mitochondrijose arba veikiant NADPH
oksidazei. Superoksidas susidaro iš deguonies (O2) prisijungus dar vienam elektronui. Ląstelės viduje
laisvasis radikalas konvertuojamas į H2O2 superoksido dismutazių (SOD) 1 ir 2. SOD 1 randama ląstelės
citozolyje ir mitochondrijų vidinėje membranoje, tuo tarpu SOD 2 – mitochondrijų matrikse. Superoksido dismutazės apsaugo nuo O2•- kaupimosi, kurio perteklius gali pažeisti ir inaktyvuoti
baltymus [43].
Hidroksilo radikalas (OH•), labai reaktyvi ROS forma, kuri beatodairiškai oksiduoja lipidus, baltymus ir genetinę informaciją, sukeldama negrįžtamus pažeidimus arba organizmo genomo nestabilumą. Įprastai hidroksilo radikalas yra Fentono reakcijos produktas - H2O2 reaguoja su geležies
jonais, susidarant OH•. Tačiau ląstelės turi apsisaugoti nuo toksinių hidroksilo radikalų susidarymo, vienas iš apsaugos mechanizmo pavyzdžių - geležies homeostazės palaikymas [43].
Svarbu paminėti, kad padidėjęs ROS kiekis gali būti apibūdinamas kaip signalinės molekulės, kurios parodo sutrikdytą redokso biologiją, kuris padeda išlaikyti fiziologines funkcijas (gali pasireikšti hormezė). Aktyviosios deguonies formos taip pat dalyvauja tiroksino gamyboje, be to vienas iš junginių – superoksidas, gali būti panaudotas naikinant mikroorganizmus [43].
3.4. Antioksidantų veikimo mechanizmas
Antioksidantai, medžiagos kurios apsaugo organizmo ląsteles nuo laisvųjų radikalų sukeltos audinių pažaidos slopindamos laisvųjų radikalų susidarymą, surišdamos juos arba skatindamos irimą [35]. Organizmo ląstelės turi dvejopą antioksidantinę apsaugos sistemą: endogeninę ir egzogeninę. Vykstant endogeninei apsaugai veikia fermentai katalazė, superoksido dismutazė (SOD), glutationo peroksidazė ar reduktazė, o iš išorės ląstelę apsaugo nefermentiniai junginiai: vitaminai C, E taip pat karotinoidai – prisijungiantys laisvąsias deguonies formas(ROS) [44]. Visi antioksidantai gali veikti skirtingais būdais:
1. Inhibuoti peroksidacijos metu susidariusius laisvuosius radikalus – vyksta laisvųjų radikalų neautralizacija, kai prie pastarųjų prisijungia veikiančio antioksidanto elektronas arba vandenilis, taip mažindamas laisvųjų radikalų kiekį ir stabdydamas oksidacinį stresą. Fenoliniuose junginiuose elektroną arba vandenilį labiausiai linkusi atiduoti yra hidroksilo grupė [44];
2. Sudaryti chelatinius junginius su metalais: organizmo ląstelėse vykstant peroksidacijai, kai reakcijas katalizuoja metalai (Fe2+, Cu2+) gali susidaryti reaktyvus junginys. Antioksidantai sumažina reakcijos greitį, sudarydami junginius su metalais ir taip slopindami oksidacinį stresą [44];
3. Redukuoti α – tokoferolio radikalus - α – tokoferolis vienas pagrindinių antioksidantų, kuris apsaugo mažo tankio lipoproteinus ir ląsteles nuo juose vykstančio oksidacinio streso. Prie kondensuoto žiedo prisijungusios OH grupės atiduoda savo vandenilio atomą α – tokoferolio radikalui, taip stabdydamos ląstelių apoptozę [44];
4. Padidinti endogeninių fermentų katalazių, superoksido dismutazių (SOD), glutationo peroksidazių ar reduktazių kiekį [44];
5. Didinti egzogeninių fermentų vitaminų, glutationų kiekį [44].
Tačiau esant patologijai t.y. uždegimui, organizme natūraliųjų antioksidantų apsauga prieš ROS susilpnėja. Todėl labai svarbu kompensuoti žalingas pasekmes. Mokslininkai siūlo
tirti polifenolius, kurie pasižymi dideliu antioksidanciniu aktyvumu. Tiriami junginiai, kurie kaip ir natūralieji antioksidantai gali sutrikdyti laisvųjų radikalų reakcijos grandinę, reguliuoti laisvųjų radikalų susidarymą ir sudaryti chelatus su metalo jonais, kurie katalizuoja vykstančias reakcijas. Norint ištirti laisvųjų deguonies radikalų jungimosi stiprumą, naudojamas superoksidų jonų surišimo gebos tyrimas, kuris apibūdina, laisvųjų deguonies formų – peroksilo, hidroksilo ir superoksido radikalų, likusį nesureaguotą kiekį. Redukcinės polifenolių savybės įvertinamos tiriant jų efektyvumą trasformuoti Fe3+
iki Fe2+, naudojamas tiriamasis FRAP metodas [45].
3.5. Mitochondrijos, citochromas c ir jo vaidmuo apoptozėje
Mitochondrijos yra ląstelės organelės, kurių pagrindinė funkcija yra ATP sintezė, vykstanti oksidacijos – fosforilinimo proceso metu. Mitochondrijos taip pat kontroliuoja ląstelės žūties ciklą [46]. Mitochondrijos dalyvauja jonų homeostazėje, metabolizmo reakcijose, redokso būsenos reguliavime ir kt..
8 pav. Citochromo c vaidmuo mitochondrijose ir ląstelėje [47].
Ląstelės citozolyje esančios laisvosios ribosomos gamina citochromo c prekursorių, kuris spontaniškai gali įsiterpti į mitochondrijos išorinę membraną, pro kurią patenka į mitochondrijos tarpmembraninę erdvę. Joje aktyvus citochromas c jungiasi su citochromo oksidaze t.y. mitochondrijos elektronų pernešimo grandinėje, citochromas c perneša elektronus iš III komplekso (citochromo c oksireduktazės) į IV kompleksą (citochromo oksidazę)(8 pav.) [48].
Citochromas c, apibūdinamas kaip mažos molekulinės masės baltymas, randamas mitochondrijose, kurio pagrindinė funkcija – nešiklis, t.y. perneša elektonus mitochondrijų kvėpavimo grandinėje ( 9 pav.) [49].
9 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai [50].
Kvėpavimo grandinė yra vidinėje mitochondrijų membranoje, ją sudaro oksidacijos – redukcijos sistema, kuri perneša elektronus. Pagrindinė kvėpavimo grandinės funkcija – palaipsniui atpalaiduoti energiją iš substratų (NADH ir FADH2). Kvėpavimo grandinėje dalyvauja keturi
kompleksai, tarp kurių elektronus perneša kofermentas Q ir citochromas c, tačiau pastarieji į kompleksų sudėtį neįeina. I – asis kompleksas perneša elektronus iš NADH į kofermentą Q. II kompleksas elektronus perneša nuo FADH2 į kofermentą Q. III kompleksas gauna elektronus iš kofermento Q
(CoQH2) ir perduoda juos citochromui c. IV komplekse vyksta deguonies redukcijos reakcija, kurios metu susidaro vanduo (½ O2 + 2e- + 2H+ → H2O) [51].
Citochromas C egzistuoja dvejomis formomis: redukuotas ir oksiduotas (žr. 10 pav.):
Nors stuktūros gali pasirodyti panašios abiejų formų, bet yra ryškių skirtumų, tokių kaip fizikinės savybės: stabilumas, tirpumas, lankstumas, branduolio spindulio sukimasis ir kt. Redukuota citochromo c forma sunkiau jungiasi prie neigiamų jonų ir silpniau tvirtinasi prie neigiamo krūvio membranos dalių [49].
Kai iš mitochondrijų išskiriamas aktyvus citochromas c, mitochondrijų membranos depolirizuojasi – jei apoptosomos formavimasis stabdomas (su citochromo c reduktazėmis), membrana grįžta į repoliarizacijos stovį. Per vykstančią depoliarizaciją citochromas c yra oksiduojamas ir pasiruošęs sudaryti apoptosomos kompleksą [49].
Skirtingos citochromo c formos susidarančią apoptosomą veikia dvejopai. Tik išėjęs citochromas c iš mitochondrijų dalyvauja apoptosomos komplekso susidaryme. Išanalizuota, jog komplekso susidarymui reikalingi baltymai (Apaf-1), citochromas c, pro-kaspazė-9 ir ATP. Apaf-1 yra inertiškas baltymas lokalizuotas citozolyje, tačiau jis tampa aktyvus, kai išsiskiria oksiduotos formos citochromas c. Tačiau, jei citochromas c išsiskiria redukuota forma - mažiau reaktyvia, nevyksta jungimasis su apoptosomos komplekso dalimis ir apoptozė yra slopinama [49].
Atlikti tyrimai parodė, jog junginiai, kurie palaiko kaspazių redukuotą, neaktyvią formą taip pat veikia ir citochromą c. Pavyzdžiui reduktoriai gali būti ditiotreitolis (DTT) ar redukuotas glutationas, o oksidatoriai – H2O2, ferocianidas. Įrodyta, kad citochromo c reduktazės visiškai blokuoja oksiduotą
citochromą c, sumažindamos apoptozės aktyvumą. Kiti mokslininkai išsiaiškino, jog redukuota ir oksiduota citochromo c forma sudaro ryšius su apoptosoma, tačiau tai priklauso nuo jungimosi laiko ir apoptosomos komplekso dalių koncentracijų, tuo metu esančių citozolyje. Redukuotas citochromas c jungiasi prie baltymo Apaf-1, tačiau juos jungia daug silpnesnė trauka, nei su oksiduota forma. Manoma, kad ši ihibicija gali sumažėti arba tapti aktyvi padidinus citochromo c koncentraciją – tačiau tam reikia tolesnių apoptosomos kinetinių tyrimų [49]. Citozolyje esantys fermentai P450s, P450 reduktazės, b5, b5 reduktazės ir neuroglobinas gali redukuoti iš mitochondrijų atsipalaidavusį citochromą c. Neuroglobinas – neseniai atrastas globinų šeimos baltymas. Pastarojo funkcija dar nėra visiškai ištirta, tačiau žinoma, jog baltymas apsaugo neuronus nuo hipoksijos ar išeminio pažeidimo. Mokslininkai ištyrė, jog neuroglobinas gali greitai redukuoti citochromą c ir tokiu būdu apsaugoti neuronus nuo apoptozės, kuri vyksta išemijos ir hipoksijos metu [52].
Išskirti trys citochromo c redokso būklės mechanizmai, kurie gali turėti įtakos apoptosomos aktyvavimui:
i. Redukuotos ir oksiduotos formos citochromo c struktūros turi skirtingą jungimosi gebą prie Apaf-1 baltymo [49];
ii. Jau po prisijungimo redukuotas ir oksiduotas citochromas c gali skirtingai veikti Apaf-1 baltymą. Susijungus molekulėms vyksta hidrolizė, keičiamasi nukleotidais. Redukuotas citochromas c gali prisijungti prie Apaf-1 monomero, tada nevyks nei hidrolizė, nei keitimasis nukleotidais, ko pasekoje, nevyks ir apoptozė [49];
iii. Redukuotos formos citochromas c neaktyvuos apoptosomos, nes išskirtas į citozolį teiks pirmenybę jungimuisi su kitais baltymais, membranomis ar DNR. Neaktyvus citochromas c turi teigiamą krūvį, todėl jungiasi prie DNR, neigiamai įkrautų membranų ir įvairių citozolyje esančių baltymų(citochromas b5 ir IP3 receptorių). Taip pat gali prisijungti prie ATP ir inhibuoti Apaf-1 aktyvaciją [49].
Taigi apoptosomos komplekso formavimosi blokavimas yra labai svabus apoptozės vyksmui – ląstelės žūčiai. Sugebant reguliuoti apoptozę, galima stabdyti ar net išgydyti organizmo patologinius procesus. Tai ypač svarbu pacientams, sergantiems išemine liga, onkologinėmis ligomis [53] .
3.6. Flavonoidų antioksidantinės savybės
Mokslininkai intensyviai tyrę fenolinių junginių antioksidantines savybes, ypač tų, kurie randami ir gaunami iš augalų, pavyzdžiui flavonoidai. Flavonoidai - antriniai metabolitai, kurie randami įvariose formose: flavonai, flavonoliai, izoflavonai, flavononai. Flavonoidai pasižymi citotoksinėmis, antimikrobinėmis savybėmis, tačiau mums reikšmingiausias yra antioksidacinis aktyvumas, kuris pasireiškia apsaugant organizmą nuo laisvųjų radikalų. Šių junginių antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo molekulės struktūros, t.y. hidroksilo grupių prisijungimo vietos, bei glikozidinės dalies, kuri gali slopinti aktyvumą. Kvercetinas – vienas iš stipriausių antioksidantų, nes turi reikiamą molekulės struktūrą, norint surišti laisvuosius radikalus. Pastarieji radikalai gali paveikti baltymus ir lipidus, taip sukeldami organizmo pažeidimą, kuris gali išsivystyti į ligą ar apsinuodijimą [54]. LSMU mokslinės grupė analizavusi įvairias flavonoidų grupes, išsiaiškino, jog flavonai ir katechinai, labiausiai apsaugo organizmą nuo aktyviųjų deguonies formų poveikio [55]. Universitete atlikta įvairių flavonoidų (kvercetino, miricetino, kemferolio ir kt.) analizė parodė, jog hidroksilo grupių skaičius turi įtakos flavonoidams redukuojant citochromą c t.y. kuo daugiau flavonoidų struktūros B žiede yra hidroksilo grupių, tuo junginys pasireiškia stipresnėmis savybėmis redukuoti citochromą c. Taip pat, nustatyta, kad cukrinė dalis, kuri prijungta prie flavonoido aglikono, silpnina junginio redukcines savybes. Iš visų tirtų flavonoidinių junginių, aktyviausias buvo miricetinas, redukuodamas citochromą c net 74 – 80 procentų [56].
Antocianai, kita flavonoidų grupė išskiriama iš augalų, pasižyminti citochromą c redukuojančiomis savybėmis. LSMU mokslininkai tyrė pastarųjų junginių gebėjimą redukuoti citochromą c. Iš visų tirtųjų junginių, aktyviausias buvo delfinidino 3 - O – gliukozidas (78 ± 2%), o mažiausiai citochromo c redukavo - pelargonidin 3 - O –gliukozidas (12 ± 0.7%). Padaryta išvada, jog redukcinės savybės priklauso nuo molekulės struktūroje esančių hidroksilo grupių (11 pav.): kuo daugiau OH grupių molekulės struktūroje, tuo junginys geresnis reduktorius [46].
11 pav. Redukcinį aktyvumą lemiančios struktūros antocianuose [46]. A - delfinidino 3 - O – gliukozidas, B - pelargonidin 3 - O –gliukozidas.
Išsiaiškinta, jog tokie junginiai kaip tetrametilfenilenodiaminas (TMPD), redukuotas glutationas (GSH), redukuojantys fermentai (P450, neuroglobinas) gali redukuoti citochromą c, sustabdyti jo jungimąsi prie apoptosomos komplekso ląstelėje ir užkirsti kelią apoptozei [49].
Taigi, atsiradus gamtinių medžiagų reikalingumui, jais pakeičiant cheminius junginius, mokslininkai turi pasiūlyti žmonėms alternatyvų, norint vartoti profilaktiškai ar gydyti jau padarytą tam tikrą organizmo patologiją, tačiau reikalingesni tolimesni in vivo tyrimai, kad junginiai būtų pripažinti efektyviais ir nežalingais organizmui.
4.TYRIMO METODIKA
4.1. Tyrimo objektas
Tyrimams buvo naudojama kavos rūgštis ir kavos rūgšties fenetilo esterio etanoliniai tirpalai. Reagentai gauti iš firmos ,,Sigma-Aldrich“, Vokietija. Tyrimams paruošta [0,002M] junginių konc., kurios skiestos iki reikiamos koncentracijos su 96,3 % etanoliu - V/V (UAB „Stumbras”, Lietuva).
4.2. Naudoti reagentai
Visiems tyrimo metodams buvo naudojamas išgrynintas vanduo ruošiamas naudojant „Millipore“ („Waters“, JAV) vandens distiliavimo sistemą, 96,3 proc. etanolis - V/V (UAB „Stumbras”, Lietuva), citochromas c ir ditionitas (,,Sigma-Aldrich“, Vokietija), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH) („SigmaAldrich“, Vokietija), 2,2'-azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfoninė rūgštis (ABTS) („Sigma-Aldrich“, Kanada), ledinė acto rūgštis, natrio acetatas (UAB „Fasuotos cheminės medžiagos“, Lietuva), 2,4,6-tripyridyl-s-triazinas (TPTZ) („Alfa Aesar“, Vokietija), trolokso reagentas („Sigma-Aldrich“, Danija), kavos rūgštis („SigmaAldrich“, Vokietija), kavos rūgšties fenetilo esteris („SigmaAldrich“, Vokietija).
4.3. Naudota aparatūra
Prietaisai:
• Spektrofotometriniam metodui naudotas spektrofotometras „IMPLEN NanoPhotometer“. • ABTS, FRAP ir DPPH metodams naudotasi spektrofotometru Beckman DU – 70, JAV. Programinė įranga:
• Spektrofotometro reikiami rezultatai į kompiuterį perkeliami naudojantis „PVC Report Viewer“ programa, gauti duomenys išsaugomi Microsoft Excel bylos pavidalu.
• automatinė pipetės: „Eppendorf research 1000“; „Eppendorf research 5000“, „Eppendorf research 5000“,
• mikrošvirkštai „Hamilton microliter“ 25µl ir 50 µl talpos.
4.4. Tyrimo metodai
4.4.1. Citochromo c redukcijos tyrimas spektrofotometriniu metodu
Tiramiesiems – kavos rūgščiai ir kavos rūgšties fenetilo esterio gebėjimui redukuoti citochromą c in vitro ištirti buvo naudojamas spektrofotometrinis metodas. Citochromo c absorcijos spektras pasirinktas 500-600 nm bangos ilgių intervale, citochromo c maksimumas fiksuotas 550 nm bangos ilgyje. Duomenys fiksuoti 0-21 min. laiko intervale kas 3 minutes.
12 pav. Citochromo c redukcijos kreivė laiko intervale.
Paruošiamas tiriamasis tirpalas: į kiuvetę įpilamas 1 ml išgryninto vandens kiekis, įdedama 10 μM citochromo c ir išmatuojamas absorbcijos spektras. Pridedamas tiriamasis junginys: kavos rūgštis ar kavos rūgšties fenetilo esteris - 5 μM, 10 μM ir 15 μM koncentracijomis. Bandymai kartojami po 3 kartus (n=3). Absorbcija užrašoma iškart įdėjus medžiagą – 0 min, vėliau po 3, 6, 9, 12, 15, 18 ir 21 minutės. Po paskutinės minutės išmatavimo pridedama standartinio reduktoriaus ditionito, kuris pilnai redukuoja citochromą c (tai atitinka 100 proc. citochromo c redukciją). Išmatuojama maksimali
absorbcija fiksuojant duomenis ties 550 nm bangos ilgiu. Tirtų junginių redukcija (%), lyginama su standartinio citochromo c reduktoriaus ditionito (100%) redukcijos aktyvumu.
4.4.2. Antiradikalinio aktyvumo tyrimas įvertinamas ABTS metodu
ABTS metodas remiasi junginių, turinčių redukcinių savybių, geba surišti susidariusius ABTS•+ radikalus-katijonus. Šiuo metodu buvo matuojamas CAFE ir kavos rūgšties gebėjimas surišti
ABTS radikalus [57]. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas H2O, rezultatas
spektrofotometre fiksuojamas esant 734 nm bangos ilgiui. Paruoštas motinins ABTS tirpalas įpilamas į kiuvetę ir užrašoma absorcija (A~0,8). Vėliau ruošiami tiriamieji tirpalai (kavos rūgštis ir CAFE). Į 18 mėgintuvėlių įpilama po 3 ml motininio ABTS tirpalo: į 9 mėgintuvėlius įvedama 3 μl kavos rūgšties (konc. 2 μM), į kitus devynis 3 μl CAFE (konc. 2 μM). Išmatuojamos visų tirpalų absorbcijos, duomenys fiksuojami. Kadangi fenoliniams junginiams pasiekti pusiausvyros tašką pasiekti reikalingas ilgesnis laiko tarpas, ilgiau nei 10 min., adsorbcija matuojame po 30 minučių, kartojant tris kartus (n=3). Kadangi ABTS radikalų-katijonų surišimo aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEAC /g), apskaičiuojame pagal formulę (a):
(a) TEAC (𝐴𝐵𝑇𝑆) =𝑐 ×𝑉
𝑚 ; 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑔
Kur c yra trolokso koncentracija (μmol/l – nustatytas iš kalibracinės kreivės), V – tirpalo tūris (l), m – atsvertas trolokso kiekis (g). Sudaroma kalibracinė kreivė (13 pav.), ABTS•+ surišimui naudojamas standartinis antioksidantas – troloksas. Kalibracijoje pažymimas koreliacijos koficientas ir tiesinė regresijos lygtis.
13 pav. Trolokso kalibracinė kreivė.
y = 3E-05x + 0.0627 R² = 0.988 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 5000 10000 15000 20000 A b so rb ci jo s p o kyt is
4.4.3. Antiradikalinis aktyvumas įvertintas DPPH metodu
DPPH metodu įvertinamas antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčių junginių – kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio gebėjimas surišti DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazilo) radikalus [57]. Tiriamųjų aktyvumas matuojamas spektrofotometru, nustačius 517 nm bangos ilgį. Lyginamasis tirpalas - 96,3 proc. etanolis. Į kolbą įsipilame pasirinktą kiekį etanolio (50 ml), įdedame kelis grūdelius DPPH grūdelių, ištirpiname ir leidžiame pastovėti tamsoje, kad matuojant absorbcija būtų pastovi. Išmatuojame absorbciją A~0,8. Ruošiant tiriamąjį, į mėgintuvėlį įpilame 3 μl kavos rūgšties (konc. 2 μM) ir 3 ml DPPH etaloninio tirpalo, viską sumaišome. Matuojama spektrofotometru ir rezultatai užrašomi. Tokiais pačiais kiekiais ruošiamas tiriamasis su CAFE (konc. 2 μM). Kaip ir minėta fenoliniams junginiams pasiekti pusiausvyros tašką pasiekti reikia daugiau laiko, todėl tiriamųjų junginių (CAFE ir kavos rūgšties) absorbciją matuojame po 30 minučių. Kaip ir ABTS metodu, absorbcijos pokyčio reikšmės naudojamos standartinio antioksidanto (trolokso) kalibracinės kreivės sudarymui ir tiriamų junginių DPPH radikalų surišimo aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TEAC /g) [57], apskaičiuojame pagal formulę (a). Sudarome kalibracinį grafiką, pažymime koreliacijos koficientas ir tiesinė regresijos lygtis.
4.4.4. Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu
Kavos rūgšties fenetilo esterio ir kavos rūgšties redukcinis aktyvumas įvertinamas FRAP metodu. Šis metodas remiasi antioksantinių savybių turinčių junginių gebėjimu, redukuoti geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ kompleksą į [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ kompleksą. Žalsva spalva keičiasi į ryškią mėlyną spalvą. Absorbcija matuojama spektrofotometru 593 nm ilgio bangoje, lyginamasis tirpalas pasirenkamas pirminis FRAP tirpalas t.y. 30 ml natrio acetatas + 3 ml FeCl3 + 3ml TPTZ (10:1:1). Į 18 mėgintuvėlių įpilama po 3 ml paruošto pradinio tirpalo: į 9 mėgintuvėlius įvedama 3 μl kavos rūgšties (konc. 2 μM), į kitus devynis 3 μl CAFE (konc. 2 μM),. Išmatuojamos visų tirpalų absorbcijos, duomenys fiksuojami. Įrodyta, kad FRAP metode fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo reakcijos laiko [58], todėl absorbcijos matavimus kartojame po 30 min. Kaip ir prieš tai aprašytuose metoduose, absorbcijos pokyčio reikšmės naudojamos standartinio antioksidanto (trolokso) kalibracinės kreivės sudarymui (14 pav.) ir tiriamų junginių trivalentės geležies (Fe(III)) redukavimas iki dvivalentės geležies (Fe(II)) išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TEAC /g), apskaičiuojame pagal ankščiau išreikštą formulę (a). Kalibracijos grafike užrašomas koreliacijos koficientas ir tiesinė regresijos lygtis.
14 pav. Trolokso kalibracinė kreivė.
4.5. Statistinė analizė
Visi eksperimentai kartoti po 3 kartus (n=3), norint gauti tikslesnius duomenis. Rezultatuose pateikiami rodmenų vidurkiai su standartiniais nuokrypiais. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SigmaPlot 11.0 programą, duomenys susisteminti naudojant Microsoft Office Excel programą. Duomenų vidurkiai statistiškai palyginti – Student t-test, pastariejųjų skirtumų vidurkiai yra statistiškai reikšmingi, jei p<0,05. y = 8E-06x + 0.0962 R² = 0.9832 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 50000 100000 150000 A b so rb ci jo s p o kyt is
5. TYRIMO REZULTATAI
5.1.Kavos rūgšties poveikis citochromo c redukcijai
Propolyje randami fenoliniai junginiai pasižymi antiradikaliniu, redukciniu efektyvumu, todėl juos galima prilyginti natūraliems antioksidantams. Mokslininkai ištyrė, jog hidroksicinamono rūgščių dariniai yra gerokai aktyvesni, už tuose pačiuose augaluose randamus flavonoidus, kurie taip pat pasižymi citochromą c redukuojančiomis savybėmis [38]. Kavos rūgštis – junginys priklausantis fenolinių junginių grupei ir kavos rūgšties fenetilo esterio metabolitas, todėl pirmiausia buvo pasirinkta ištirti jos skirtingų koncentracijų įtaką citochromo c redokso būsenai. Tyrimui naudota 5 μM, 10 μM, 15 μM kavos rūgšties koncentracijos, rezultatai fiksuoti 0-21 minutę (n=3). Citochromo c redukcijos kreivė pavaizduota 15 pav. Gauti duomenys (21 min.) parodė (16 pav.), jog kavos rūgštis redukuoja 44% ±2% citochromo c (esant 5 μM konc.), 46% ±2% (esant 10 μM koc.), 41% ±2% esant 15 μM kavos rūgšties koncentracijai.
15 pav. Kavos rūgšties (5 μM, 10 μM, 15 μM) gebėjimas redukuoti citochromą c.
Pastebėta, jog laiko bėgyje (0 – 21 min.) kavos rūgšties gebėjimas redukuoti citochromą c palaipsniui didėjo (15 pav.).
16 pav. Kavos rūgšties tirtų koncentracijų aktyvumas redukuojant citochromą c.
* p<0,05 lyginant 10 μM ir 15 μM kavos rūgšties koncentracijas, tuo pačiu laiko momentu;
# p<0,05 lyginant tos pačios koncentracijos kavos rūgštį – 0 minutę su 21 minute.
Tačiau pastebėta, jog 12 minutę 15 μM kavos rūgšties koncentracija redukavo ~40% citochromo c ir toliau ilgėjant redukcijos laikui, reikšmės statistiškai jau nebesiskyrė (p>0,05): 12 min. – 38,9% ±1%, 15 min. – 39,5% ±1,5%, 18 min. – 40,3% ±2%, 21 min. – 40,5% ±1,8%. Panašiai buvo stebima ir su 5 μM ir 10 μM kavos rūgšties koncentracijomis: 12 minutę 5 μM kavos rūgštis redukavo 42,2% ±1% citochromo c, o 21 minutę: 44% ±1,5%; 10 μM kavos rūgštis atitinkamai 12 minutę redukavo 43,8% ±2%, o 21 minutę 46% ±2,2%. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp 12 min. ir 21 min. nebuvo nustatyta.
5.2. CAFE poveikis citochromo c redukcijai
Kavos rūgšties fenetilo esteris yra hidroksicinamono rūgščių atstovas, tačiau jo stuktūroje prie karboksi grupės prisijungęs fenetilo alkoholio radikalas. Kadangi kavos rūgštis yra CAFE metabolitas t.y. mokslininkai ištyrė, jog CAFE hidrolizuojama karboksilesterazės tiek in vitro, tiek in vivo (su labaratoriniais gyvūnais). Nustatyta, kad žmogaus organizme ši reakcija nevyksta [31], todėl reikšminga ištirti ne tik kavos rūgštį, bet ir CAFE redukcinę gebą ir įvertinti ar kavos rūgšties fenetilo esteris turi
didesnį redukcinį aktyvumą, nei jo metabolitas. Tirtos koncentracijos tokios pat kaip kavos rūgšties t.y. - 5 μM, 10 μM, 15 μM (17 pav.), kad vėliau galima būtų palyginti rezultatus.
17 pav. CAFE (5 μM, 10 μM, 15 μM) gebėjimas redukuoti citochromą c.
Lyginant skirtingų koncentracijų CAFE gebėjimą redukuoti citochromą c laike, 5 μM koncentracija nuo 0 min. iki 21 min. padidėjo ~ 12 %, prie 10 μl padidėjo ~ 33,9 %, o esant 15 μl - ~ 27,51 % (17 pav.). Kaip ir su kavos rūgštimi, taip ir kavos rūgšties fenetilo esterio, didžiausias pokytis užfiksuotas, bandymus atliekant su 10 μl CAFE koncentracija.
Pirmiausia ištirtas 5 μM CAFE koncentracijos gebėjimas redukuoti citochromą c (18 pav.), kur jau 6 minutę buvo pasiektas redukcijos maksimumas (47% ±1,5%), kuris iki 21 minutės nežymiai kito (52% ±2,5%), duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05). Pastebėtas dėsningumas tiriant 10 μM CAFE koncentraciją. Redukuoto citochromo c kiekis kilo tolygiai ir 18 minutę pasiekė 68,6% ±6%, kuris toliau statistiškai reikšmingai nebesiskyrė (21 minutę – 69,3% ±6%). Išanalizavus CAFE efektyvumą redukuoti citochromą c pastebėta (18 pav.), kad didžiausia tirta CAFE koncentracija (15 μM) jau 12 minutę redukavo 67.9% ±3.6% citochromo c, kuris laiko bėgyje praktiškai nedidėjo (statistiškai reikšmingai nesiskyrė, p>0,05) - 15 min. - 65% ±6,5%, 18 min – 63,7% ±6%, 21 minutę – 64,5% ±6,4%. Taigi, CAFE efektyviau redukavo citochromą c, nei kavos rūgštis.
18 pav. CAFE tirtų koncentracijų aktyvumas redukuojant citochromą c.
* p<0,05 lyginant skirtingas CAFE koncentracijas, tuo pačiu laiko momentu;
# p<0,05 lyginant tos pačios koncentracijos CAFE – 0 minutę su 21 minute; ^ p<0,05 lyginant 15 μM CAFE koncentracija 0 min. su 3 min.
Nustatyta, kad 12 minutę 5 μM CAFE koncentracija citochromą c redukavo 49,7% ±2%, 10 μM - 65% ±5%, pastarųjų duomenys statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,05), efektyviausiai citochromą c redukavo 15 μM CAFE: 67,8% ±3,6%. Mažiausia kavos rūgšties fenetilo esterio koncentracija (5 μM), pasižymėjo silpniausiu redukciniu efektyvumu – 21 minutę citochromo c redukcija siekė tik 52% ±2,5%, o 10 μM - 69,3% ±6%, 15 μM - 64,5% ±6,4%. Palyginus trijų tirtų koncentracijų redukcinį efektyvumą 21 minutę, galima teigti, jog skirtumas tarp 10 μM ir 15 μM koncentracijų redukuoti citochromą c nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05), o 5 μM CAFE citochromo c redukavo ženkliai mažiau 64,5% ±6,4%. Pastebėta, jog 15 μM kavos rūgšties redukuoto citochromo c kiekis nuo 0 min. (28% ±2%) iki 3 min. (61% ±6,2%) staigiai padidėjo, skirtumas nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05). Pasiekus praktiškai maksimalią redukciją, toliau redukuoto citochromo c kiekis laike nežymiai skyrėsi. Lyginant tos pačios koncentracijos 0 min. su 21 minutės duomenimis, redukuoto citochromo c kiekio skirtumai nustatyti statistiškai reikšmingi (p<0,05): 5 μM CAFE 0 min. - 40% ±1,4%, o 21 min. - 52% ±2,5%; 10 μM 0 min. – 35,4% ±3,6%, 21 min. – 69,3% ±6,3%; 15 μM 0 min. - 28% ±2%, o 21 min. – 64,5% ±6,4%. Rezultatai rodo, jog CAFE intensyviausiai
redukuoja pirmąsias 3 – 6 minutes (18 pav.), tuo tarpu kavos rūgštis tokiu intensyviu šuoliu pirmosiomis minutėmis nepasižymėjo (16 pav.).
5.3. Kavos rūgšties ir CAFE gebėjimo redukuoti citochromą c palyginimas
Lyginome tiriamųjų medžiagų – kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio gebėjimą redukuoti citochromą c, norėdami sužinoti, kuris junginys aktyvesnis, kokios koncentracijos optimaliausios ir kokia trukmė reikalinga visiškai redukuoti citochromą c.
19 pav. Tiriamųjų junginių (5 μM) aktyvumas redukuoti citchromą c tyrimo laike. *p<0,05 lyginant su 5 μM kavos rūgštimi.
Analizuojant 5 μM koncentracijos abiejų tiriamųjų junginių rezultatus (19 pav.) pastebėta kad, visą tyrimo laiką CAFE buvo daug aktyvesnė nei kavos rūgštis, duomenys statistiškai reikšmingi (p<0,05). Pavyzdžiui 21 minutę CAFE maksimali redukcijos galia siekė 52% ±2,5%, o kavos rūgštis buvo redukavusi tik 44% ±1,5% citochromo c, t.y. 8% mažiau. Tačiau tik prasidėjus reakcijai (0 min.), nepastebėta didelio skirtumo t.y. kavos rūgšties aktyvumas buvo 39% ±0,5%, o CAFE panašus – 39,9% ±1,4%, rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Nuo 3 min. tarp kavos rūgšties ir CAFE redukcinės gebos nustatytos statistiškai reikšmingos (p<0,05), t.y. CAFE 5% iki 8% efektyviau redukavo citochromą c. Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp kavos rūgšties ir CAFE išliko iki pat reakcijos pabaigos.
Tiriant didesnę, 10 μM kavos rūgšties ir CAFE redukcinę gebą, nustatyta, kad abu junginiai didžiausią redukcinę gebą pasiekė 21 minutę t.y. kavos rūgštis redukavo 46% ±2,2% citochromo c, o CAFE – 69,3% ±6,3%, t.y. 13% labiau. Panašus skirtumas gautas ir visą tyrimo laikotarpį: jau nuo 6 minutės koncentracijų skirtumai nustatyti statistiškai reikšmingais (p<0,05): 6 minutę kavos rūgštis redukavo 40,4% ±1% citochromo c, o CAFE – 47,3% ±1,5%, 9 minutę kavos rūgštis redukavo 41,5% ±0,8% citochromo c, o CAFE – 48,7% ±1,8%, 12 minutę kavos rūgštis - 42,2% ±1%, o CAFE – 49,7% ±2%, 15 min. kavos rūgšties redukcinė geba siekė 42,8% ±1%, o CAFE – 50,4% ±2,2%, 18 minutę kavos rūgštis redukavo 43,4% ±1,2% citochromo c, o CAFE – 51,5% ±2,7%.
20 pav. Kavos rūgšties ir CAFE (10 μM) efektyvumas redukuoti citochromą c. *p<0,05 lyginant su 10 μM kavos rūgštimi.
Iš sudaryto grafiko (20 pav.) aiškiai matyti, jog CAFE redukcinė geba ženkliai didesnė (~24%), nei kavos rūgšties, tačiau kaip ir pirmu atveju (esant 5 μM koncentracijai) reakcijos pradžioje, taip ir esant 10 μM, abiejų junginių citochromo c redukuotas kiekis 0 minutę buvo panašus: CAFE – 35,4% ±3,6%, o kavos rūgšties - 37,8% ±0,5%, duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi (p<0,05). Praėjus 6 minutėms CAFE aktyvumas siekė 57,3% ±4%, o kavos rūgšties - 41,5% ±1,4%, t.y. ~16% mažiau. Reakcijai vykstant toliau redukuoto citochromo c kiekis tolygiai didėjo, (lyginant tiriamųjų junginių rezultatus prie to paties laiko), skirtumas buvo statistiškai reikšmingas t.y. p<0,05.
21 pav. Tiriamųjų junginių 15 μM koncentracijų aktyvumas redukuoti citchromą c tyrimo laike. *p<0,05 lyginant su 15 μM kavos rūgštimi.
Ištyrus 15 μM kiekio abiejų junginių redukcines savybes (21 pav.), aiškų pranašumą parodė CAFE. Jau nuo 3 min. buvo redukuota 61% ±6,2% citochromo c, o kavos rūgštis tik 36% ±6,2%, t.y. 24% mažiau. Tokia situacija išliko tolygi iki pat reakcijos pabaigos t.y. iki 21 minutės kavos rūgštis buvo redukavusi 40,5% ±2%, o CAFE – 64,5% ±6,4%, t.y. 24% daugiau. Nustatyti skirtumai buvo statistiškai reikšmingi (p<0,05). Be to, rezultatai parodė, kad jau 6 minutę pastebimas maksimalus CAFE redukcijos lygis (66% ±5,5% ), kuris išliko panašus iki reakcijos pabaigos (21 min.) 64,5% ±6,4%. Panašiai buvo stebima ir su kavos rūgštimi (6 minutę – 37,1% ±0,2%, 21 min. – 40,5% ±2%). Taigi, tarp 6 ir 21 minučių statistiškai reikšmingų skirtumų nepastebėta (p>0,05).
Palyginus visų tirtų koncentracijų duomenis 21 minutę (22 pav.) įsitikinta, kad didžiausiu redukciniu efektyvumu pasižymėjo 10 μM ir 15 μM CAFE ir kavos rūgšties koncentracijos.
22 pav. CAFE ir kavos rūgšties poveikis citochromo c redukcijai.
*p<0,05 lyginant su tokios pačios koncentracijos kavos rūgštimi. Matavimai atlikti 21 minutę. Kadangi iš visų gautų duomenų išsiaiškinta, jog didžiausias redukcinis aktyvumas nustatytas naudojant 10 μM (23 pav.) ir 15 μM (24 pav.) CAFE ir kavos rūgšties koncentracijas (palyginti abiejų medžiagų redukcijos gebėjimai visa tyrimo laiką). Iš grafikų ryškiai matyti skirtumas tarp CAFE ir kavos rūgšties gebėjimo redukuoti citochromą c.
*p<0,05 lyginant su kavos rūgštimi, atitinkamu laiko momentu.
Jau nuo 6 minutės (10 μM) kavos rūgšties ir CAFE redukuoto citochromo c kiekio skirtumai buvo statistiškai reikšmingi (p<0,05), nuo 16% iki 23% (23 pav.).
24 pav. Tiriamųjų junginių (15 μM koncentracijos) gebėjimas redukuoti citochromą c. *p<0,05 lyginant su kavos rūgštimi, atitinkamu laiko momentu.
Palyginus kavos rūgšties ir CAFE (15 μM) gebėjimą redukuoti citochromą c (%), skirtumai buvo statistiškai reikšmingai didesni nuo 24% iki 29% (p<0,05), jau nuo pat reakcijos pradžios (0 min.) iki reakcijos matavimo laiko pabaigos (21 min.).
5.4. Kavos rūgšties ir CAFE antiradikalinio aktyvumo įvertinimas DPPH metodu
Kavos rūgšties ir CAFE antiradikaliniam aktyvumui nustatyti buvo naudojamasi DPPH radikalų surišimo metodu (25 pav.). Nustatyta, kad CAFE inaktyvuoja DPPH radikalą 19% efektyviau nei kavos rūgštis. Kavos rūgštis suriša 58% ±3% DPPH radikalų, tuo tarpu CAFE – 76,7% ±0,1%. Maksimalus efektyvumas pasiektas po 30 minučių.
25 pav. CAFE ir kavos rūgšties antiradikalinis aktyvumas DPPH metodu.
*p<0,05 lyginant su kavos rūgštimi.
5.5. Kavos rūgšties ir CAFE antiradikalinio aktyvumo įvertinimas ABTS metodu
ABTS radikalų - katijonų surišimo metodas buvo naudojamas kavos rūgšties fenetilo esterio ir kavos rūgšties antiradikaliniam aktyvumui nustatyti. Kadangi tiriamosios medžiagos priklauso fenoliniams junginiams, bandymai atlikti iš karto ir pakartoti po 30 minučių, nes tokiems junginiams reikia didesnio laiko tarpo įsivyrauti pusiausvyrai. Nustatyta, kad kavos rūgšties gebėjimas inaktyvuoti ABTS radikalus siekė 68,6% ±0,3%, o CAFE 81% ±0,3% t.y. CAFE surišo ABTS radikalus ~14% efektyviau nei kavos rūgštis.
26 pav. CAFE ir kavos rūgšties antiradikalinis aktyvumas ABTS metodu.
5.6. Kavos rūgšties ir CAFE redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu
Redukcinio efektyvumo įvertinimui naudotasi FRAP metodu, analizuotas kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio gebėjimas redukuoti trivalentę geležį į dvivalentę. Kavos rūgšties redukcinis aktyvumas siekė 0,057 mol/l TE, o CAFE 0,074 mol/l TE t.y. CAFE buvo ~29% aktyvesnė nei kavos rūgštis. Nustatytas tarp tirtų junginių redukcinės galios statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05).
27 pav. CAFE ir kavos rūgšties redukcinio aktyvumo tyrimas, atliktas FRAP metodu.
6. REZULTATŲ APTARIMAS
Pastaruoju metu suintensyvėjo tyrimai ieškant perspektyvių augalinės kilmės junginių, galinčių apsaugoti ląsteles ir jų membranas nuo oksidacinio streso sukeltos pažaidos. Tai ypač aktualu išemijos/reperfuzinio pažeidimo metu.
Citochromo c redokso būsena turi didelę įtaką ląstelėje vykstančiai apoptozei. Apoptozė gali būti sąlygota įvarių dirgiklių, kurie sukelia citochromo c išėjimą iš mitochondrijų į citoplazmą, sąlygodami apoptosomos komplekso formąvimasi ir pačios apoptozės vyksmą. Kadangi egzistuoja dvi citochromo c redokso formos: oksiduota forma skatina apoptozę, o redukuota – yra inertiška ir nesudaro apoptosomos komplekso [8]. Junginiai, kaip kavos rūgštis ir kavos rūgšties fenetilo esteris, redukuojantys citochromą c, gali turėti įtakos tolimesniems in vivo tyrmams, norint apsaugoti ląstelę nuo oksidacinio streso sukeltos ląstelių apoptzės.
Šio darbo tikslas buvo ištirti ir palyginti kavos rūgšties fenetilo esterio ir jo metabolito – kavos rūgšties redukcinį ir antiradikalinį aktyvumą. Lyginant pastarųjų medžiagų gebėjimą redukuoti citochromą c, pastebėta, jog visos tirtos CAFE koncentracijos efektyviau redukavo citochromą c, nei kavos rūgštis.
Taigi, ištyrus skirtingų koncentracijų (5, 10 ir 15 µM) CAFE ir kavos rūgšties gebėjimą redukuoti citochromą c, nustatyta, kad 5 μM CAFE citochromą c redukavo 52% ±3%, tuo tarpu kavos rūgštis tik 44% ±2%, t.y. 8% silpniau, skirtumas statistiškai reikšmingas (p< 0,05). Analizuojant 10 μM CAFE poveikį citochromo c redukcijai, efektyvesnė taip pat buvo CAFE (redukavo 69% ±6% citochromo c) , o kavos rūgštis – 45% ±3%, t.y. 24% efektyviau (p<0,05). Atlikus bandymus su 15 μM CAFE, maksimali redukcija pasiekta jau 12 minutę (68% ± 4%), o kavos rūgštis - tik 39% ±1% t.y. 29% silpniau, duomenys nustatyti statitiškai reikšmingais (p<0,05). Taigi efektyviausiai (10 µM - 16% iki 23%, 15 µM – nuo 24% iki 29%) citochromą c redukavo didesnės kavos rūgšties fenetilo esterio koncentracijos (10 µM ir 15 µM), nors tarp abiejų koncentracijų statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo (p>0,05).
Mokslininkų atlikti bandymai rodo, jog pakaitalai prie fenolio žiedo keičia junginio redukcines savybes. Galima teigti, kad fenolis, neturintis prisijungusių grupių, sunkiau atiduoda vandenilio atomus, nei fenolio žiedas su vienu ar keliais prisijungusiais radikalais. Jei prie fenolio žiedo yra prisijungusi karbonilo grupė (karboksi rūgštis, esteris), tai stiprėja redukcinės savybės, jos ypač sustiprėja jei karbonilo grupė prie fenolio žiedo yra prisijungusi netiesiogiai, pavyzdžiui per etilo grupę. Taigi galima teigti, jog prie CAFE didesnė redukcinė galia siejama su fenetilo radikalo prisijungimu prie kavos rūgšties [59].
