TAKAŽOLIŲ (POLYGONUM AVICULARE L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

AUŠRA LIEPINYTĖ

TAKAŽOLIŲ (POLYGONUM AVICULARE L.) ŽOLĖS

FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas `

Darbo vadovas: Prof.dr.Valdas Jakštas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data

TAKAŽOLIŲ (POLYGONUM AVICULARE L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲIR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas `

Darbo vadovas: Prof.dr.Valdas Jakštas Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė Aušra Liepinytė Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 5

SANTRUMPOS ... 6

ĮVADAS ... 7

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

1.1. Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 9

1.2. Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) žolės fitocheminė sudėtis ... 9

1.3. Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) farmakologinis poveikis ir panaudojimas ... 10

1.4. Bendra fenolinių junginių – flavonoidų ir fenolinių rūgščių apžvalga ... 11

1.5. Flavonoidų nustatymo metodai ... 14

1.6. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir jų aktyvumo įvertinimo metodai ... 15

2. TYRIMO METODIKA ... 20

2.1. Tyrimo objektas ... 20

2.2. Naudoti reagentai ... 21

2.3. Naudota aparatūra ... 21

2.4. Tyrimo metodai ... 22

2.5. Rezultatų statistinis įvertinimas ... 28

3. TYRIMO REZULTATAI ... 29

3.1. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 29

3.2. Bendro flavonoidų kiekio tyrimas ... 30

3.3. Bendro fenolinių junginių kiekio tyrimas ... 32

3.4. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas ... 36

3.4.1. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas DPPH metodu ... 36

3.4.2. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ABTS metodu ... 39

3.4.3. Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu ... 41

3.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimo rezultatai ... 43

REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 45

IŠVADOS ... 47

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

LITERATŪROS SĄRAŠAS... 49

SANTRAUKA

A. Liepinytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. V. Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Pavadinimas: Takažolių (Polygonum aviculare L.) žolės fenolinių junginių ir

antioksidantinio aktyvumo tyrimas.

Raktiniai žodžiai: Polygonum, paprastoji takažolė, spektrofotometrija, flavonoidai, fenoliniai

junginiai, antioksidantinis aktyvumas, ABTS, DPPH, FRAP.

Tyrimo objektas: Skirtinguose Lietuvos regionuose surinkta P.aviculare L. vaistinė augalinė

žaliava.

Tyrimo metodai: Flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometriniu ir efektyviosios skysčių

chromatografijos metodais. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu. Antioksidantinis aktyvumas įvertintas spektrofotometriškai taikant ABTS, DPPH ir FRAP metodus.

Tikslas: Nustatyti paprastųjų takažolių žolės bendro flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio

bei antioksidantinio aktyvumo įvairavimo priklausomybę nuo geografinės augavietės padėties Lietuvos teritorijos ribose.

Uždaviniai: Nustatyti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį; įvertinti antioksidantinį

aktyvumą DPPH, ABTS ir FRAP metodais; palyginti gautų rezultatų įvairavimą tarp skirtingų Lietuvos regionų augaviečių; įvertinti flavonoidų kiekį efektyviosios skysčių chromatogafijos būdu; palyginti skirtingų gamintojų P. aviculare L. žolės arbatų cheminę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą.

Rezultatai: Bendras flavonoidų kiekis P. aviculare L. žaliavose iš skirtingų Lietuvos augaviečių įvairavo nuo 0,25 iki 0,81 proc. Bendras fenolinių junginių kiekis svyravo 23,27–45,61 mg/g. Antioksidantinis aktyvumas DPPH metodu - 26,05–59,61 proc., ABTS metodu – 192,86–381,31 μmol/g, FRAP – 117,72–290,64 μmol/g. Skirtingų arbatų gamintojų žaliavoje flavonoidų kiekis kinta nuo 0,58-0,98 proc., fenolinių junginių – 34,08-40,72 mg/g. Nustatytas antioksidantinis aktyvumas DPPH metodu - 35,76-54,35 proc., ABTS metodu – 253,68-535,8 μmol/g, FRAP metodu – 150,26-201,69 μmol/g.

Išvados: Didžiausiu bendru flavonoidų, fenolinių junginių kiekiu bei antioksidantiniu

aktyvumu pasižymėjo Lelių kaime, Klaipėdos raj. surinkta takažolių augalinė žaliava. Skirtingų arbatų gamintojų žaliavoje didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas „A2“ (1,5 g N 24), fenolinių junginių - „A3“ (100 g), stipriausias antioksidantinis aktyvumas - „A1“ (2 g N 25) gamintojų arbatų žaliavose.

SUMMARY

A. Liepinyte. Master thesis. Supervisor prof. dr. V. Jakstas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy. Department of Pharmacognosy. – Kaunas.

Title: The Investigation of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity in Herbal Samples of Knotgrass (Polygonum aviculare L.).

Key words: Polygonum, knotgrass, spectrophotometry, flavonoids, phenolic compounds,

antioxidant activity, ABTS, DPPH, FRAP.

The object of the research: The raw material of P. aviculare L. collected indifferent regions of Lithuania.

The methods of the research: Flavonoids determined by the methods of spectrophotometry

and high-performance liquid chromatography. The total amount of phenolic compounds determined by spectrophotometry. The antioxidant activity assessed by spectrophotometry using ABTS, DPPH and FRAP methods.

Aim: To determine how the level of flavonoids, phenolic compounds and antioxidant activity

in herbal samples of knotgrass (Polygonum aviculare L.) depends on different regions of Lithuania.

Objectives: To determine the quantity of flavonoids and phenolic compounds; to evaluate

antioxidant activity using ABTS, DPPH and FRAP methods; to compare the variation of the obtained result between different regions of Lithuania; to evaluate the amount of flavonoids by high-performance liquid chromatography; to compare the chemical composition and antioxidant activity of knotgrass herb teas made by different manufacturers.

Results: The total content of flavonoids in the raw P. aviculare L. material from different

growing site types in Lithuania ranged from 0,25 to 0,81 per cent. The total amount of phenolic compounds ranged from 23,27 to 45,61 mg/g. The antioxidant activity by the DPPH method ranged from 26,05 to 59,61 per cent., by the ABTS method – 192,86 to 381,31 μmol/g, by the FRAP method – 117,72 to 290,64 μmol/g. The total content of flavonoids in the the raw material of different tea manufacturers varies from 0,58 to 0,98 per cent. The antioxidant activity by the DPPH method ranged from 35,76 to 54,35 per cent., by the ABTS method - from 253,68 to 535,8 μmol/g , by the FRAP method - from 150,26 to 201,69μmol/g.

Conclusions: The research shows that the highest amount of flavonoids, phenolic compounds

SANTRUMPOS

ADP - adenozindifosfatas ATP – adenozintrifosfatas BHA - butilhidroksianizolis BHT - butilhidroksitoluenas

BMR – branduolių magnetinis rezonansas DNR - deoksiribonukleorūgštis

DPPH - 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. ferric reducing antioxidant power) GAE – galo rūgšties ekvivalentai

IR – infraraudonoji spinduliuotė n - imtis

ROS – reaktyvios deguonies formos (anglų k. ROS - reactive oxygen species) RNS – reaktyvios azoto formos (anglų k. RNS - reactive nitrogen species) SSN – santykinis standartinis nuokrypis

TEAC - trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (anglų k. -trolox equivalent antioxidant capacity) TPTZ - 2,4,6-tripiridil-s-triazinas

UV – ultravioletinė spinduliuotė

ĮVADAS

Paprastoji takažolė (Polygonum aviculare L.) – tai vienmetis rūgtinių (Polygonaceae L.) šeimai priklausantis augalas, plačiai paplitęs ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje. Vaistinė augalinė žaliava yra žydėjimo metu surinkta ir sudžiovinta P. aviculare L. žolė. Tradicinėje medicinoje dažniausiai vartojama kaip diuretiniu poveikiu pasižyminti priemonė šlapimo takų ir ankstyvai inkstų akmenligės stadijai gydyti bei viršutinių kvėpavimo takų uždegimui mažinti. Farmakologinį poveikį nulemia augalo cheminė sudėtis: fenoliniai junginiai (tarp jų flavonoidai - rutinas, hiperozidas, avikuliarinas), taninai, mineralinės medžiagos, vitaminai K ir C.

Atlikus išsamesnius P. aviculare L. sudėties tyrimus bei nustačius, jog augalo preparatai pasižymi antioksidantiniu aktyvumu, išsiplėtė augalo panaudojimo galimybės. Antioksidantinis aktyvumas siejamas su augalo sudėtyje esančių flavonoidų gebėjimu surišti laisvuosius radikalus. Laisvieji radikalai sukelia DNR, baltymų, angliavandenių, lipidų pažeidimus, sutrikdo normalią ląstelės veiklą bei iššaukia įvairius patologinius sutrikimus. Flavonoidai suriša laisvuosius radikalus, stabdo lipidų peroksidaciją, apsaugo organizmą nuo oksidacinio streso sukeliamų pažeidimų.

P. aviculare L. fitocheminė sudėtis ir antioksidantinis aktyvumas gali kisti priklausomai nuo

augavietės geografinės padėties ar agroklimatinių sąlygų. Pakitus sudėčiai galimi farmakologinio poveikio pokyčiai, todėl tikslinga atlikti skirtingose augavietese rinktų vaistinės augalinės žaliavos mėginių analizę, nustatyti bendrą fenolinių junginių, flavonoidų kiekį bei įvertinti antioksidantinį aktyvumą.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Nustatyti paprastųjų takažolių (Polygonum aviculare L.) žolės bendro flavonoidų ir

fenolinių junginių kiekio bei antioksidantinio aktyvumo įvairavimo priklausomybę nuo geografinės augavietės padėties.

Uždaviniai:

1. Įvertinti suminį fenolinių junginių kiekį ir suminį flavonoidų kiekį surinktoje skirtingų augaviečių paprastųjų takažolių žolėje.

2. Įvertinti laisvųjų radikalų surišimo gebą DPPH ir ABTS metodais bei redukcinį aktyvumą FRAP metodu surinktoje skirtingų augaviečių paprastųjų takažolių žolėje.

3. Nustatyti efektyviosios skysčių chromatogafijos metodu avikuliarino, hiperozido, rutino, galo ir elago rūgšties kiekio pasiskirstymą surinktoje skirtingų augaviečių paprastųjų takažolių žolėje. 4. Ištirti fenolinių junginių kiekybinę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą skirtingų gamintojų

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.)

morfologiniai požymiai ir paplitimas

Paprastoji takažolė (P. aviculare L.) tai vienmetis žolinis augalas, priklausantis rūgtinių (Polygonaceae L.) augalų šeimai. Augalo stiebai šakoti, gali būti statūs arba gulsti, neapaugę plaukeliais, turi bamblius, užauga iki 40 cm aukščio [1]. Šaknys šviesiai rudos spalvos, ilgos, smailėjančios, turi daug smulkių pridėtinių šaknelių. Lapai smulkūs, pražanginiai, lancetiški arba kiaušiniški, trumpakočiai. Makštys trumpos, smailėjančios, apie 8 mm ilgio, pilkšvos spalvos. Žiedai smulkūs, pavieniai arba susitelkę po kelis lapų pažastyse, vainiklapiai žalsvai baltos arba rausvos spalvos [1,2].

Augalas žydi nuo birželio iki spalio mėnesio, sėklas subrandina liepos – spalio mėnesiais. Augalas dauginasi sėklomis, vaisius - tribriaunis riešutėlis [1].

Vaistinė augalinė žaliava ruošiama vasaros pradžioje augalo žydėjimo metu, nupjaunant 30 cm ilgio viršūnines šakeles. Jeigu nenuvytę apatiniai lapai, augalas gali būti raunamas ir su šakinimis [2]. Surinkta augalinė žaliava džiovinama gerai vėdinamose patalpose arba džiovyklose, ne aukštesnėje kaip 45-50 C temperatūroje [1,2]. Išdžiūvusi vaistinė augalinė žaliava yra žalsvos spalvos, lapai nesutrupėję, natūralaus kvapo, švelniai sutraukiančio skonio. Tinkamai laikomą žaliavą galima vartoti iki 2 metų [1].

Paprastoji takažolė (P.aviculare L.) plačiai pasaulyje paplitęs augalas, randamas beveik visuose žemynuose vidutinio klimato zonose [3]. Lietuvoje šis augalas labai dažnas, paplitęs visoje respublikoje. Dažniausiai auga ant takų, kelių, pakelėse, dirbamuosiuose laukuose [1,2].

1.2. Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.)

žolės fitocheminė sudėtis

1.3. Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) farmakologinis poveikis ir

panaudojimas

Paprastųjų takažolių (P.aviculare L.) augalinei žaliavai būdingas įvairus biologinis poveikis. Sudėtyje esantis didelis flavonoidų, silicio rūgšties ir taninų kiekis sąlygoja augalo diuretinį poveikį, slopina šlapimo takų uždegiminius procesus, mažina konkrementų susidarymą šlapimo takuose, todėl augalas gali būti naudojamas šlapimo takų ir ankstyvai inkstų akmenligės stadijai gydyti. Taninai pasižymi sutraukiančiu poveikiu, stabdo silpną kraujavimą iš virškinamojo trakto, mažina kapiliarų pralaidumą, pasižymi virškinamojo trakto gleivinės uždegimines ligas gydančiu poveikiu [5].

Augalui būdingas priešuždegiminis poveikis, kuris siejamas su gebėjimu inhibuoti prostaglandinų aktyvumą [5]. Tyrimais nustatyta, jog po gydymo paprastųjų takažolių žolės ekstraku reikšmingai sumažėjo dantenų indeksas, todėl augalas gali būti naudojamas gingvito gydymui [8]. Augalui būdingas silpnas atsikosėjimą lengvinantis poveikis, todėl vartojamas kaip pagalbinė priemonė kvėpavimo takų ligoms gydyti. Atsikosėjimą skatinantis poveikis sustiprėja augalą vartojant derinyje kartu su anyžių vaisiais, pankolių vaisiais ar čiobrelių žole [5].

Takažolių (P. aviculare L.) preparatai pasižymi antioksidantinėmis savybėmis, neutralizuoja organizme susidariusius laisvuosius radikalus, stabdo lipidų peroksidacijos procesus, saugo ląstelės DNR ir ląsteles nuo pažeidimo, slopina aterosklerozės progresavimą, mažina vėžinių susirgimų riziką [8,9]. In vivo tyrimais su pelėmis įrodyta, jog paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) etanoliniai ekstraktai mažina nutukimą, pasižymu lipogenezę slopinančiu poveikiu. Tyrimais nustatyta, jog pelėms, kurių mitybos racioną papildė paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) žolės ekstraktas, nustatytas kūno svorio bei riebalinio audinio sumažėjimas, sumažėjęs adipocitų dydis bei trigliceridų, leptino ir malodialdehido kiekis kraujo serume [10]. Priešvėžinis P. aviculare poveikis siejamas ne tik su antioksidantiniu poveikiu, bet ir ekstraktų (300, 350 ir 400 ng/μl koncentracijos) gebėjimu stipriai inhibuoti krūties vėžio MCF-7 ląstelių proliferaciją ir sukelti šių ląstelių apoptozę [8].

Preparatai pasižymi antibakteriniu poveikiu, slopina Escherichia coli, Proteus mirabilis,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus bei kitus patogeninius

1.4. Bendra fenolinių junginių – flavonoidų ir fenolinių rūgščių apžvalga

Fenoliniai junginiai - tai antriniai augalų metabolitai. Jų gausu vaisiuose, daržovėse bei gėrimuose (kavoje, arbatoje, vyne). Šiuo metu yra žinoma daugiau nei 8000 fenolinės struktūros junginių. Fenoliniai junginiai apsaugo augalus nuo ultravioletinių spindulių, patogeninių mikroorganizmų, parazitų, plėšrūnų, taip pat suteikia augalams spalvą ir skonį [11].

Pagrindinis fenolinių junginių struktūros bruožas yra aromatinis žiedas, kuris prisijungęs vieną ar kelias hidroksilo grupes. Savo cheminės struktūros dėka fenoliniai junginiai gali surišti laisvuosius deguonies, hidroksilo, azoto radikalus, neutralizuoti vandenilio peroksido bei perchlorito rūgšties poveikį taip nutraukdami radikalų sukeliamas grandinines reakcijas [12,13]. Fenolinių junginių hidroksilo grupės yra geri vandenilio atomo donorai. Vandenilio atomai reaguodami su radikalais (ROO•) sudaro neradikalinius junginius (ROOH) bei santykinai nereakyvų fenoksilo radikalą (Ph•):

Fenolinis (OH) + ROO• → Fenoksilo radikalas (O•) + ROOH

Susidariusi fenolinio antioksidanto radikalinė forma (fenoksilo radikalas) pasižymi daug didesniu cheminiu stabilumu nei pradinis radikalas. Fenoksilo radikalas (Ph•) gali toliau reaguoti su kitu peroksilo radikalu (ROO•) sudarydamas neradikalinius produktus. Fenoliniai junginiai turintys daugiau nei vieną hidroksilo grupę gali sudaryti chelatinius junginius su metalų jonais, sukeliančiais laisvųjų radikalų susidarymą, ir sumažinti jų sukeliamą oksidantinį poveikį [12,13].

Priklausomai nuo hidroksilo grupių skaičiaus fenoliniai junginiai klasifikuojami į paprastus fenolinius ir polifenolius junginius [14]. Augaluose randamiems fenoliniams junginiams priskiriami paprasti fenoliniai junginiai, fenolinės rūgštis, kumarinai, flavonoidai, hidrolizuojami ir kondensuoti taninai, ligninai bei lignanai. Pagrindinėmis fenolinių junginių grupėmis laikomi flavonoidai ir fenolinės rūgtys [13,14].

Fenolinės rūgštys yra viena iš pagrindinių fenolinių junginių grupių. Dažniausiai augaluose egzistuoja esterių, glikozidų arba amidų formoje, rečiau - laisvoje formoje. Fenolinių rūgščių įvairovę nulemia hidroksi grupių skaičius ir prisijungimo vieta aromatiniame žiede. Išskiriamos dvi pagrindinės fenolinių rūgščių grupės: hidroksibenzoinės ir hidroksicinamo rūgštys (1 pav.). Hidroksibenzoinė rūgštis savo struktūroje turi septynis anglies atomus (C6-C1). Šios rūgšties dariniai yra paprasčiausios

struktūros fenolinės rūgštys randamos gamtoje, joms priklauso galo, elago, vanilino, siringo rūgtys [14,16]. Galo ir elago rūgštis pasižymi antioksidantiniu, priešuždegiminiu, antikancerogeniniu poveikiu [17,18]. Hidroksicinamo rūgštis sudaryta iš devynių anglies atomų (C6-C3). Šios rūgšties

metu apsaugodami ląstelės sienelę nuo stresinių veiksnių, kaip infekcijos, sužeidimai ir ultravioletinė spinduliuotė [14,16].

1 pav. Bendra fenolinių rūgščių struktūra [14]

Ne mažiau svarbi fenolinių junginių grupė yra flavonoidai. Tai polifenoliniai junginiai natūraliai randami vaisiuose ir daržovėse. Augaluose jie susiformuoja iš aromatinių aminorūgščių fenilalanino ir tirozino [14,20]. Visiems flavonoidams būdinga C6-C3-C6 molekulinė sandara, todėl jie laikomi benzo-γ-pirono dariniais [19,21]. Anglies atomai susitelkę dviejuose benzeno žieduose, paprastai žymimuose A ir B, sujungtuose per propaninį fragmentą (2 pav.) [22]. Flavonoidų struktūros pokyčiai atsiranda pagrindo molekulės hidroksilinimo, alkilinimo ir glikozilinimo reakcijų metu [14].

Flavonoidai gali egzistuoti aglikonų arba glikozidų pavidale, tačiau dažniausiai augaluose randami glikozido pavidale. Cukraus molekulės dažniausiai būna prisijungusios prie anglies atomo 3, 4, 7 padėtyse, rečiau - 5, 6, 8 padėtyse. Priklausomai nuo prisijungusių cukraus molekulių skaičiaus junginiai gali būti skirstomi į monosacharidus, disacharidus ir trisacharidus. Monosacharidai dažniausiai prijungti β-jungtimi prie aglikono hidroksigrupės. Glikozidai dar gali būti skirstomi į O-glikozidus, C-glikozidus ir O-C-glikozidus [21].

Priklausomai nuo hidroksilinimo laipsnio bei C2-C3 dvigubos jungties buvimo pirono žiede, flavonoidai skirstomi į 6 pagrindines klases:

 flavonolių (kvercetinas, mirecetinas, kemferolis, rutinas);

 flavan-3-olių (katechinas, proantocianidinas, epigalokatechinas);  flavonų (liuteolinas, apigeninas);

 izoflavonų (genisteinas);

 antocianidinų (cianidinas, pelargonidinas);  flavanonų (taksifolinas) [16,22].

Skirtingų klasių flavonoidai skiriasi C žiedo prisotinimo laipsniu, o individualūs junginiai šiose klasėse skiriasi pakaitais, esančiais A ir B žieduose, kurie daro įtaką stabilumui bei antioksidantinėmis savybėmis [23].

Dauguma flavonoidų žmogaus organizme veikia kaip antioksidantai. Jie geba surišti hidroksilo, peroksido ir superoksido radikalus, stabdo lipidų peroksidaciją, inaktyvuoja katališkai veikiančius metalus, sudarydami su jais kompleksinius junginius [24,25]. Kaip natūralūs chelatatoriai jie yra mažiau toksiški nei sintetiniai junginiai [12,22]. Taip pat flavonoidai pasižymi savybe inhibuoti fermentus lipooksigenazę ir ciklooksigenazę, dalyvaujančius uždegiminiuose procesuose, kurių metu susidaro laisvieji radikalai [12].

Bendruoju atveju laisvųjų radikalų surišimo geba priklauso nuo flavonoidų molekulinės struktūros ir hidroksilo grupių skaičiaus bei išsidėstymo. Fenolinės hidroksilo grupės turi būti pakankamai lengvai pasiekiamos, kad susidarytų stabilus fenoksilo radikalas susidarant vandeniliniams ryšiams arba pasikeičiant elektronų išsidėstymui [26].

Antioksidantiniam aktyvumui pasireikšti ypač svarbūs trys struktūriniai elementai:

a) orto - dihidroksi struktūra B žiede, kuri pasižymi elektronų donorinėmis savybėmis, padidina oksiduotų flavonoidų radikalų stabilumą per vandenilinius ryšius arba elektronų delokalizavimą;

b) dviguba jungtis tarp C2-C3 atomų, kuri konjuguota su 4-keto grupe, atsakinga už elektronų delokalizavimą iš B žiedo bei padidina radikalų sujungimo gebą;

c) 3-OH ir 5-OH grupių buvimas bei 4-keto grupė ir C2-C3 dvigubas ryšio buvimas leidžia suformuoti stabilią chinolinę struktūrą flavonoidų oksidacijos reakcijų metu (3 pav.).

Flavonoidai kaupiami įvairiuose augalų organuose, tačiau didžiausi kiekiai randami lapuose, vaisiuose ir žieduose. Šie junginiai augaluose atlieka įvairias funkcijas: apsaugo augalus nuo ultravioletinių spindulių, bakteriocidiškai arba bakteriostatiškai veikia patogeninius mikroorganizmus, virusų fermentus. Jie yra natūralūs augalų pigmentai, padeda pritraukti augalų apdulkintojus, pavyzdžiui antocianidinai suteikia augalams spalvą ir skonį [27].

Flavonoidai netoksiški žmogaus organizmui bei plačiai naudojami kaip sveikatinimo ar pagalbinė priemonė mažinanti ligų riziką. Tai mažos organinės molekulės gerai absorbuojamos žmogaus organizme net vartojant ilgą laiką bei vieni iš saugiausių neimunogeninių vaistų [27,28]. Flavonoidams būdingas įvairus farmakologinis poveikis: priešuždegimins, antioksidantinis, antibakterinis, antivirusinis, antispazminis, diuretinis, hepatoprotekcinis, imunomoduliacinis, kraujavimą stabdantis [28]. Dėl antioksidantinių savybių būdingas priešvėžinis poveikis, mažinama kardiovaskulinių, neurodegeneracinių ligų rizika [29].

1.5. Flavonoidų nustatymo metodai

Vaistinės augalinės žaliavos analizė pradedama nuo biologiškai aktyvių junginių išskyrimo iš šviežių, šaldytų ar džiovintų mėginių. Prieš ekstrakciją augalo mėginiai susmulkinami ir homogenizuojami [11].

Flavonoidams iš augalinės žaliavos ekstrahuoti gali būti naudojami įvairūs tirpikliai, kurių pasirinkimas priklauso nuo flavonoidų tipo. Mažiau poliniai flavonoidai (pvz., izoflavonai, flavanonai, metilinti flavonai, flavonoliai) ekstrahuojami organiniais tirpikliais, tokiais kaip trichlormetanas, dichlormetanas, dietileteris arba etilo acetatas. Poliniai aglikonai ir flavonoidų glikozidai ekstrahuojami alkoholiu arba alkoholio - vandens mišiniais [30]. Išgautų biologiškai aktyvių junginių kiekis priklauso nuo ekstrakcijos laiko, temperatūros, tirpiklių poliškumo, mėginio ir tirpiklio santykio [11]. Paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos išvalomos nuo balastinių ir lydinčiųjų medžiagų.

Išvalyti ekstraktai dažnai apdorojami vandenilio chlorido rūgštimi glikozidus hidrolizuojant iki aglikonų [14]. Kokybiškai flavonoidai gali būti nustatomi naudojant masių spektroskopiją, IR, UV arba BMR spektroskopiją, dujų chromatografiją ar efektyviąją skysčių chromatografiją. Kiekybiniam flavonoidų nustatymui gali būti taikoma taikoma plonasluoksnė chromaografija, efektyvioji skysčių chromatografija, kapiliarinė elektroforezė arba UV-Vis spekrofotometrija [30].

UV-Vis spektrofotometrija tai viena iš seniausiai naudojamų metodikų flavonoidų kiekybiniam įvertinimui. Visi flavonoidų aglikonai savo sudėtyje turi aromatinį žiedą, todėl geba sugerti ultravioletinius spindulius. Ultravioletiniam spektrui būdingi du absorbcijos maksimumai: pirmasis maksimumas 300 - 550 nm bangos ilgio intervale ir priklausantis nuo B žiedo bei konjugacijos su C žiedu ir antrasis maksimumas 240 - 285 nm intervale, priklausantis nuo A žiedo. Paprasti pakaitai tokie kaip metilo, metoksi ar nedisocijavusios hidroksilo grupės nežymiai įtakoja tirpalų absorbcijos maksimumą. Paveikus flavonoidus reagentais, pavyzdžiui aliuminio chloridu, susidaro kompleksas su hidroksi grupėmis ir sukeliamas absorbcijos poslinkis [19,21,30].

Efektyvioji skysčių chromatografija tai vienas iš dažniausiai naudojamų metodų kiekybiniam flavonoidų nustatymui. Dažniausiai flavonoidų nustatymui taikoma atvirkštinių fazių skysčių chromatografija, naudojant C18 kolonėles. Flavonoidų glikozidai iš kolonėlės išplaunami

anksčiau nei jų aglikonai, taip pat daugiau hidroksilo grupių turinys flavonoidai bus išplaunami anksčiau, nei turinys mažiau pakeistų hidroksi grupių. Eliuavimui naudojami įvairūs eliuentai, pavyzdžiui acetonitrilo - vandens arba metanolio - vandens mišiniai. Analizė įprastai atliekama kambario temperatūros aplinkoje. Flavonoidų nustatymui naudojami UV, fluorescenciniai ar diodų matricos detektoriai [19,30].

1.6. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir jų aktyvumo įvertinimo metodai

Laisvieji radikalai – tai molekulės, atomai arba jonai, turintys nesuporuotą elektronų skaičių. Neporinio elektronų skaičiaus buvimas lemia laisvųjų radikalų nestabilumą, didelį reaktyvumą bei gebėjimą atiduoti arba prisijungti kitų molekulių elektronus - tai yra geba elgtis kaip oksidatoriai arba reduktoriai [31,32].

Dauguma radikalų yra kilę iš reaktyvių deguonies formų (anglų k. ROS - reactive oxygen species) arba reaktyvių azoto formų (anglų k. RNS - reactive nitrogen species). Reaktyvioms deguoniems formoms priskiriami tokie radikalai, kaip superoksido (O2•), hidroksilo (OH•), hidroksiperoksilo (HO2•), alkoksilo (RO•), peroksilo (ROO•) bei neradikaliniai junginiai – vandenilio

peroksidas (H2O2), hipochloritinė rūgštis (HOCl), ozonas (O3). Reaktyvioms azoto formoms priklauso

(ONOOH), diazoto trioksidas (N2O3), nitritinė rūgštis (HNO2). Neradikaliniai dariniai priskiriami

oksidantamas kadangi lengvai sukelia įvairias laisvųjų radikalų reakcijas organizme [33,34].

Žmogaus organizme laisvieji radikalai natūraliai susidaro kiekvienoje gyvoje ląstelėje įvairių fiziologinių procesų metu. Radikalai gali susidaryti peroksisomose, fagocituose, mitochondrijose kaip šalutiniai produktai kvėpavimo reakcijų metu, arachidono rūgšties metabolizmo metu, uždegiminių procesų metu. Laisvųjų radikalų susidarymą organizme lemia ir išoriniai veiksniai kaip ultravioletinė spinduliuotė, radiacija, aplinkos tarša, cigarečių dūmai, stresas, pesticidai bei kitos cheminės medžiagos (organiniai tirpikliai, vaistai, toksinai), ozonas [31,33,34]. Nedideli endogeninių radikalų kiekiai organizme pasižymi teigiamomis savybėmis. Jie dalyvauja mitochondijose vykstančiose oksidacinio fosforilinimo reakcijose ir padeda susidaryti ATP molekulėmis iš ADP, veikiant citochromo P450 sistemai detoksikuoja ksenobiotikus, dalyvauja pažeistų ląstelių apoptozėje, imuninės sistemos ir uždegiminių reakcijų metu naudojami naikinant virusus ir bakterijas, pasižymi vazodilatacinėmis savybėmis, dalyvauja perduodant nervinius impulsus [29,31].

Didelis laisvųjų radikalų kiekis organizmui kenksmingas, gali sukelti įvairius DNR, baltymų, angliavandenių, lipidų pažeidimus [31]. Ypač laisvųjų radikalų poveikiui jautrūs lipidai, iš kurių sudarytos ląstelių membranos. Pažeistos ląstelės netenka savo funkcijos arba žūsta [33]. DNR pažeidimai lemia mutacijų ir vėžinių susirgimų atsiradimą, o baltymų ir fermentų struktūros pažeidimai sutrikdo normalią ląstelės veiklą bei iššaukia įvairius patologinius sutrikimus [35]. Manoma, kad oksidacinis stresas yra viena iš pagrindinių aterosklerozės, cukrinio diabeto, artrito, onkologinių susirgimų, autoimuninių ligų, Alzheimerio, Parkinsono bei daugelio kitų ligų priežasčių [35]. Siekiant sumažinti laisvųjų radikalų sukeliamą žalą organizmui reikalingos medžiagos, gebančios neutralizuoti laisvuosius radikalus.

Antioksidantai – tai medžiagos, kurios stabilizuoja ir inaktyvuoja laivuosius radikalus bei saugo organizmą nuo žalingo jų poveikio [32,36]. Antioksidantai veikia vienu iš keletos mechanizmų:

1) neutralizuoja peroksidaciją inicijuojančius veiksnius;

2) sudaro kompleksus su metalų jonais, neleisdami metalų jonams sudaryti reaktyvių dalelių arba suskaldyti lipidų peroksidus;

3) stabdo peroksidų susidarymą iš deguonies molekulių; 4) nutraukia grandinines reakcijas.

stabilizuojamas delokalizuojant elektronus iš aromatinio žiedo ir suformuojant chinolinę struktūrą [23].

Pagal kilmę antioksidantai skirstomi į endogeninius ir egzogeninius. Endogenius antioksidantus sintezuoja pats organizmas, o egzogeniniai gaunami kartu su maistu arba maisto papildais. Egzogeniniai antioksidantai ypač svarbūs tuomet, kai endogeninių antioksidantų poveikio nepakanka apsaugoti organizmą nuo nepalankių aplinkos veiksnių, skatinančių reaktyvių dalelių susidarymą [33,37].

Pagal prigimtį antioksidantai gali būti fermentiniai ir nefermentiniai. Fermentiniams antioksidantams priklauso žmogaus organizme egzistuojančios antioksidantinės sistemos kaip katalazė, superoksido dismutazė, glutationo peroksidazė [32,38]. Superoksido dismutazė superoksido radikalą paverčia į deguonį ir vandenilio peroksidą, o glutationo peroksidazė ir katalazė paverčia ląselėje esantį vandenilio peroksidą į vandenį ir deguonį [31]. Nefermentiniai antioksidantai yra mažos molekulės nutraukiančios grandinines reakcijas. Jiems priklauso vitaminas C, vitaminas E, vitaminas A, glutationas, melatoninas, šlapimo rūgštis, fenoliniai jungiai [31,32,38].

Pagal kilmę antioksidantai dar gali būti suskirstyti į natūralius ir sintetinius. Sintetiniai antioksidantai dažnai naudojami maisto pramonėje siekiant apsaugoti maisto produktus nuo laisvųjų radikalų poveikio, kurie sukelia greitą produktų gedimą, skonio ir kvapo pokyčius. Jiems priskiriami butilhidroksianizolis (BHA), butilhidroksitoluenas (BHT). Sintetiniai antioksidantai patekę į organizmą kaupiasi riebaliniame audinyje, slopina imuninę sistemą, gali sukelti vėžį, todėl daug saugiau vartoti natūralius antioksidantus [23]. Vienas iš svarbiausių natūralių antioksidantų šaltinių yra augalai. Manoma, kad natūralūs antioksidantai yra sveikesni bei saugesni už sintetinius antioksidantus. Augaluose esantiems antioksidantams priskiriama askorbo rūgštis, tokoferolis, karotinoidai bei kiti junginiai, kurių pagrindinę dalį sudaro fenoliniai junginiai [37].

Antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai. Augaluose esančių junginių

antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodikos skirstomos į dvi pagrindines grupes: a) remiasi vandenilio atomo perdavimo reakcijomis;

b) remiasi elektronų perdavimo reakcijomis.

ABTS radikalų – katijonų surišimo metodas. Tai plačiai taikomas paprastas ir pigus

antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas. ABTS•+ radikalas – katijonas tirpus vandeniniuose ir organiniuose tirpikliuose, todėl reaguoja su daugeliu tiek hidrofilinių, tiek hidrofobinių antioksidantų, jo neveikia joninės jėgos [40,41].

Taikant ABTS radikalų – katijonų surišimo metodą pirmiausiai sukuriamas ABTS radikalas – katijonas (ABTS•+). Jis gali būti sukuriamas fermentinių arba cheminių reakcijų metu. Cheminės reakcijos, kurių metu sukuriamas ABTS•+ radikalas – katijonas, trunka ilgiau nei fermentinės reakcijos (iki 16 valandų), tačiau metodas pigesnis, o susidaręs radikalas stabilesnis [42]. 2,2'-azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštį (ABTS reagentą) paveikus kalio arba natrio persulfatu reakcijos metu susidaro mėlynai – žalios spalvos ABTS•+ radikalas – katijonas, kuris absorbuoja 734 nm ilgio šviesos bangas (ABTS + K2S2O8 → ABTS•+) [43,44]. Tirpalo absorbija tiesiogiai priklauso

nuo ABTS•+ kiekio. Reakcijų su antioksidantais metu spalvotas ABTS•+ redukuojamas į neutralią bespalvę formą (ABTS•+

+ ArOH →ABTS + ArO• + H+). Tirpale sumažėja ABTS•+ radikalų – katijonų kiekis, o sumažėjusi tirpalo absorbcija išmatuojama spektrofotometriškai [45].

DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas. DPPH (2, 2-difenil-1-pikrilhidrazilo) laisvųjų

radikalų surišimo metodas yra paprastas, greitas bei vienas iš dažniausiai taikomų metodų antioksidantinio aktyvumo nustatymo tyrimuose. DPPH yra stabilus kambario temperatūroje, tamsiai violetinės spalvos organinis azoto radikalas, absorbuojantis 515 – 520 nm ilgio šviesos bangas [39,46]. DPPH radikalas tirpsta tik organiniuose tirpikliuose, ypač etanoliniuose, todėl jo naudojimas nustatyti hidrofiliams antioksidantams yra ribotas [42].

Violetinę spalvą ir stabilumą DPPH radikalui suteikia visoje molekulėje delokalizuotas laisvas elektronas. DPPH radikalui prisijungus vandenilio atomą susidaro stabilios gelsvos spalvos neradikalinės formos DPPH junginys (4 pav.) [39,45]:

4 pav. Vandenilio atomo perdavimo reakcija DPPH radikalui [47]

kiekybiškai gali būti išreiškiamas procentais arba efektyviąja koncentracija (EC50), kuri parodo

antioksidantų kiekį reikalingą sumažintį pradinį DPPH radikalų kiekį 50 procentų [46]. Gautiems rezultatams įtakos gali turėti reakcijos laikas, pH, reagentų koncentracija, mėginių koncentracija, naudojami standartai bei kiti veiksniai [39,48].

FRAP redukcinio aktyvumo nustatymo metodas. Geležies redukcinio aktyvumo nustatymo (FRAP) metodas yra paprastas, pigus ir nesudėtingas [42]. FRAP reagentas paruošiamas sumaišius acetatinio buferio, TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazino) ir geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalus santykiu 10:1:1. Susidariusiam Fe(TPTZ)23+ kompleksui sąveikaujant su antioksidantais rūgštinėje

terpėje (pH=3,6) įvyksta geležies redukcija. Fe3+

prisijungia antioksidanto elektroną ir redukuojasi į Fe2+, kuri su TPTZ reagentu sudaro mėlynos spalvos kompleksinį Fe(TPTZ)22+ junginį [45]:

Fe (TPTZ)23+ + ArOH → Fe (TPTZ)22+ + ArO• + H+

Fe(TPTZ)22+ absorbcija matuojama spektrofotometru, esant 593 nm bangos ilgiui [45].

Priešingai nei ABTS ir DPPH metodais, šiuo metodu negalima nustatyti vandenilį atiduodančių antioksidantų bei reikalinga rūgštinė terpė geležies junginių tirpumui palaikyti [42].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo metu buvo tirti paprastųjų takažolių (Polygonum aviculare L.) žolės mėginiai, surinkti žydėjimo metu iš 13 skirtingų Lietuvos regionų augaviečių liepos – rugpjūčio mėnesiais:

Augavietė Rinkimo

data

Augavietės koordinatės (laipsniai)

1) Vievis, Elektrėnų savivaldybė 2014-07-28 Šiaurės platuma: 54,761462

Rytų ilguma: 24,804565

2) Kauno apylinkės 2014-08-20 Šiaurės platuma: 54,922887

Rytų ilguma: 23,949383

3) Šakių apylinkės 2014-08-15 Šiaurės platuma: 54,964258

Rytų ilguma: 23,043274

4) Utenos apylinkės 2014-08-24 Šiaurės platuma: 55,498078

Rytų ilguma: 25,624843

5) Krepšiagalio kaimas, Anykščių rajonas 2014-08-05 Šiaurės platuma: 55,565838

Rytų ilguma: 25,033503

6) Ginučių kaimas, Ignalinos rajonas 2014-08-26 Šiaurės platuma: 55,373611

Rytų ilguma: 25,985

7) Stelmužės kaimas, Zarasų rajonas 2014-08-25 Šiaurės platuma: 55,826944

Rytų ilguma: 26,218056

8) Liudvinavas, Marijampolės rajonas 2014-07-02 Šiaurės platuma:54,489543

Rytų ilguma: 23,359532

9) Lelių kaimas, Klaipėdos rajonas 2014-07-28 Šiaurės platuma: 55,743282

Rytų ilguma: 21,244954

10) Rietavo apylinkės 2014-08-04 Šiaurės platuma: 55,721791

Rytų ilguma: 21,940732

11) Veisiejai, Alytaus rajonas 2014- 07-09 Šiaurės platuma:54,103799

Rytų ilguma: 23,689161

12) Panevėžio apylinkės 2014- 07- 18 Šiaurės platuma:55,748793

Rytų ilguma: 24,347358

13) Telšių apylinkės 2014-07-24 Šiaurės platuma:55,963575

Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, kambario temperatūroje paskleidus plonu sluoksniu ir dažnai vartant. Žaliava džiovinta ir laikyta saugant nuo tiesioginių saulės spindulių. Drėgmės kiekis žaliavoje įvertinamas nuodžiūvio aparatu.

Papildomai buvo tiriamos visuomenės vaistinėse įsigytos skirtingų gamintojų, dviejų skirtingų serijų, paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) arbatos (gamintojai nurodyti 1 priede):

1) Arbata „A1“ (Herba Polygoni aviculare 50 g) 2) Arbata „A1“ (Herba Polygoni aviculare 2 g N 25) 3) Arbata „A2“ (Herba Polygoni aviculare 40 g) 4) Arbata „A2“ (Herba Polygoni aviculare 1,5 g N 24) 5) Arbata „A3“ (Herba Polygoni aviculare 100 g) 6) Arbata „A4“ (Herba Polygoni aviculare 1,5 g N 20)

2.2. Naudoti reagentai

Išgrynintas vanduo ruošiamas naudojant „Millipore“ („Waters“, JAV) vandens distiliavimo sistemą Lietuvos sveikatos mokslų universitete. Etanolis 96,3 proc. V/V (UAB „Stumbras”, Lietuva), vandenilio chlorido rūgštis, aliuminio chlorido heksahidratas, galo rūgštis, natrio acetatas, natrio karbonatas, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH), geležies (III) chlorido heksahidratas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), heksametilentetraminas („Lachema“, Čekija), rutinas – („Carl Roth GmbH”, Vokietija), Folin–Ciocalteu reagentas („Sigma-Aldrich“, Šveicarija), troloksas („Sigma-Aldrich“, Danija), 2,2'-azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfoninė rūgštis (ABTS) („Sigma-Aldrich“, Kanada), ledinė acto rūgštis (UAB „Fasuotos cheminės medžiagos“, Lietuva), 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) („Alfa Aesar“, Vokietija).

2.3. Naudota aparatūra

Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) žaliavos ir reagentų svėrimui naudotos „Sartorius AG CP64-OCE“ (Vokietija) analitinės svarstyklės.

Žaliavos nuodžiūvis įvertintas „Precisa HA 300“ (Šveicarija) prietaisu.

Bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis ir laisvųjų radikalų surišimas įvertintas naudojant „Beckman DU - 70“ (JAV) spektrofotometrą.

Chromatografinė fitocheminių žymenų analizė atlikta naudojant „Waters 2695“ (JAV) chromatografą su „Waters 996 PDA“ (JAV) detektoriumi. Naudota „Sunfire“ C18 3,5 µm, 3,0 x 150 mm (Airija) kolonėlė. Duomenys apdoroti naudojant „Empower 2 Chromatography Data Software“ (JAV) programą.

2.4.

Tyrimo metodai

Nuodžiūvio įvertinimas. Paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) išdžiovinta vaistinė augalinė

žaliava susmulkinama iki miltelių elektriniu smulkintuvu. Žaliavos kokybė įvertinama nustatant augalinės žaliavos mėginių nuodžiūvį. Nuodžiūvis įvertintas „Precisa HA 300“ prietaisu atsvėrus 1 g smulkintos žaliavos miltelių. Nustatytas nuodžiūvis buvo mažesnis nei 10 proc., todėl atitiko Europos farmakopėjoje nustatytas ribas [49].

Tiriamojo ekstrakto paruošimas. Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,25 g (0,0001 g tikslumu)

sausos susmulkintos P. aviculare augalinės žaliavos miltelių. Ekstrakcija vykdoma su 20 ml 70 proc. V/V etanoliu ultragarso vonelėje 40oC temperatūroje 40 minučių. Gauti ekstraktai filtruojami į 25 ml matavimo kolbutes. Žaliava perplaunama 70 proc. V/V etanoliu, kol matavimo kolbutės prisipildo iki 25 ml žymos. Gauti ekstraktai laikomi tamsaus stiklo buteliukuose tamsioje vietoje.

Flavonoidų kiekio nustatymas. Bendras flavonoidų kiekis, esantis paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) augalinėje žaliavoje, nustatytas spektrofotometriniu metodu ir išreiškiamas rutino

ekvivalentu. Spektrofotometrinė analizė remiasi kompleksinių junginių tarp flavonoidų ir aliuminio chlorido susidarymu. Nustatytas tiriamųjų tirpalų absorbcijos dydis lyginamas su etaloninių tirpalų (rutino, kvercetino) absorbcijos dydžiu [50].

Tiriamasis tirpalas ruošiamas į mėgintuvėlį įpilant 1,2 ml pagaminto etanolinio takažolių žolės ekstrakto, 4 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,2 ml 30 proc. vandenilio chlorido rūgšties ir 0,6 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Tirpalai sumaišomi ir laikomi tamsioje vietoje. Po 30 min įpilama 0,8 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo, praskiedžiama 3,2 ml išgryninto vandens. Tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis išmatuojamas spektrofotometru nustačius 407 nm šviesos bangos ilgį.

Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 50 ml matavimo kolbutėje 0,0025 g rutino tirpinant 70 proc. V/V etanolyje. Rutino tiriamasis ir palyginamasis tirpalai ruošiami kaip ir tiriamieji tirpalai, tik 1,2 ml takažolių žolės ekstrakto pakeičiama į 1,2 ml etaloninio rutino tirpalo [51].

Bendras flavonoidų kiekis (proc.) išreikštas rutino ekvivalentais apskaičiuojamas pagal formulę:

m D(R)

Čia:

m(R) - rutino standarto masė (g) V – paruošto ekstrakto tūris (ml) D – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis m – vaistinės augalinės žaliavos masė (g) D(R) - etaloninio tirpalo absorbcijos dydis

Fenolinių junginių kiekio nustatymas. Bendras fenolinių junginių kiekis, esantis paprastųjų

takažolių (P. aviculare L.) žolėje, įvertinamas spektrofotometriniu metodu naudojant Folin–Ciocalteu reagentą.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas 0,5 ml takažolių žolės ekstrakto, praskiesto santykiu 1:5, sumaišant su 2,5 ml Folin–Ciocalteu reagento, praskiesto išgrynintu vandeniu santykiu 1:10. Po to įpilama 2 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Reakcijos mišinys sumaišomas ir laikomas 1 valandą tamsioje vietoje kambario temperatūroje.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat kaip ir tiriamasis tirpalas, tik 0,5 ml skiesto takažolių žolės ekstrakto pakeičiama į 0,5 ml 70 proc. V/V etanolio.

Pirminis galo rūgšties tirpalas ruošiamas 0,025 g galo rūgšties (arba 0,0276 g galo rūgšties monohidrato) ištirpinant 25 ml kolbutėje 70 proc. V/V etanolyje. Gautas 1 mg/ml koncentracijos tirpalas. Iš pagaminto pirminio galo rūgšties tirpalo ruošiami 0 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,075 mg/ml ir 0,1 mg/ml koncentracijos darbiniai tirpalai. Tiriamieji etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat, kaip ir tiriamieji tirpalai, į mėgintuvėlius vietoj takažolių žolės ekstrakto įpilant po 0,5 ml skirtingos koncentracijos darbinių galo rūgšties tirpalų. Palyginamasis tirpalas ruošiamas 0,5 ml darbinio galo rūgšties tirpalo pakeičiant 0,5 ml 70 proc. V/V etanolio [52].

Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas pagal galo rūgšties kalibracinės kreivės lygtį ir išreiškiamas mg/g, galo rūgšties ekvivalentu sausai žaliavai (5 pav.). Apskaičiuojama naudojant formulę:

GAE=c x V/m, mg/g

Čia:

c - galo rūgšties koncentracija (mg/ml) nustatyta naudojant kalibracinę kreivę V - takažolių ekstrakto tūris (ml)

m - tikslus žaliavos kiekis (g)

5 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė

Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas DPPH metodu. DPPH metodu įvertinamas

paprastųjų takažolių (P. aviculare L.) tiriamųjų ekstraktų gebėjimas surišti DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) laisvuosius radikalus.

Etaloninis DPPH tirpalas gaunamas ištirpinant 0,0024 g (tikslus svėrinys) DPPH radikalo miltelių 100 ml 70 proc. V/V etanolio. Tirpumui pagerinti naudojama ultragarso vonelė. Paruoštas etaloninis tirpalas laikomas tamsioje vietoje, kol nustatoma pastovi absorbcija.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas sumaišant 3 ml DPPH etaloninio tirpalo su 20 μl tiriamojo takažolių žolės ekstrakto. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 3 ml DPPH etaloninio tirpalo įpilant 20 μl 70 proc. V/V etanolio. Po 30 minučių spektrofotometru matuojama tirpalų absorbcija, esant 515 nm bangos ilgiui [53].

Tiriamųjų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH radikalo procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę:

y = 10,56x + 0,0189 R² = 0,9977 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Ab so rbci ja

Antioksidantinis aktyvumas (%) = ((A(P) - A(T))/ A(P))* 100 %

Čia:

A(P) – palyginamojo tirpalo absorbcija

A(T) – tiriamojo tirpalo absorbcija

Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas ABTS metodu. ABTS metodu įvertintas tiriamųjų

takažolių žolių ekstraktų gebėjimas surišti ABTS radikalus – katijonus.

Pradinis ABTS tirpalas ruošiamas tirpinant ABTS miltelius išgrynintame vandenyje tamsaus stiklo buteliukyje. Į gautą tirpalą suberiami kalio persulfato milteliai. Gautas tirpalas gerai sumaišomas ir laikomas kambario temperatūroje tamsioje vietoje 16 valandų.

Darbinis ABTS tirpalas gaunamas skiedžiant pradinį ABTS tirpalą išgrynintu vandeniu, kol gaunama 0,8000 tirpalo absorbcija. Absorbcija išmatuojama „Beckman DU – 70” spektrofotometru, esant 734 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.

Tiriamieji tirpalai ruošiamas į 3 ml darbinio ABTS tirpalo įpilant 20 μl 1:1 santykiu praskiesto tiriamojo takažolių žolės ekstrakto. Gauti tirpalai gerai sumaišomi ir laikomi kambario temperatūroje tamsioje vietoje. Po 60 minučių išmatuojamas tirpalų absorbcija spektrofotometru, esant 734 nm bangos ilgiui [45].

Tiriamųjų tirpalų antioksidantinis aktyvumas išreikštas trolokso ekvivalentais gramui žaliavos ir apskaičiuojamas pagal formulę:

TEACABTS = c x V/m, μmol/g

Čia:

c - pagal kalibracinę kreivę nustatyta trolokso koncentracija (μM) V- takažolių ekstrakto tūris (ml)

m - tikslus žaliavos kiekis (g)

Pirminis trolokso tirpalas ruošiamas 0,025 g trolokso ištirpinant 25 ml kolbutėje 70 proc. V/V etanolyje. Iš gauto motininio trolokso tirpalo ruošiami 0 μmol/l, 400 μmol/l ,800 μmol/l, 1200 μmol/l, 1600 μmol/l ir 2000 μmol/l koncentracijos darbiniai tirpalai.

6 pav. Trolokso kalibracinė kreivė (ABTS laisvųjų radikalų surišimo įvertinimo metodui)

Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu. Paprastųjų takažolių žolės etanolinių

ekstraktų redukcinis aktyvumas įvertinamas juos paveikus FRAP reagentu.

Darbinis FRAP reagentas ruošiamas sumaišius acetatinio buferio, TPTZ ir geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalus santykiu 10:1:1. Acetatinio buferio tirpalas gaminamas 1000 ml kolboje iš 3,1 g natrio acetato miltelių, 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiant išgrynintu vandeniu iki 1000 ml žymės. 10 mM koncentracijos TPTZ tirpalas ruošiamas į 10 ml kolbutę įpilant 0,034 ml koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties ir praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki žymės. Gautame tirpale ištirpinama 0,031 g TPTZ miltelių. Geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas ruošiamas 0,054 g geležies (III) chlorido heksahidrato miltelių ištirpinant distiliuotame vandenyje 10 ml kolboje [45].

Tiriamieji tirpalai ruošiamas į 3 ml darbinio FRAP tirpalo įpilant 20 μl tirimojo takažolių žolės ekstrakto. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, kaip ir tiriamasis tirpalas, tik vietoj žaliavos ekstrakto įpilama 20 μl 70 proc. V/V etanolio. Gauti tirpalai sumaišomi ir laikomi kambario temperatūroje tamsioje vietoje. Po 60 minučių inkubacijos spektrofotometru išmatuojamas tirpalų absorbcijos dydis, esant 593 nm bangos ilgiui.

Gauti duomenys palyginami su trolokso standartinių tirpalų kalibracine kreive. Tirpalų redukcinio aktyvumo galia išreiškiama trolokso ekvivalentais gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:

TEACFRAP c x V/m, μmol/g

Čia:

C - pagal kalibracinę kreivę nustatyta trolokso koncentracija (μM) V- takažolių ekstrakto tūris (ml)

m - tikslus žaliavos kiekis (g)

y = 0.0002x + 0.0144 R² = 0.9965 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 500 1000 1500 2000 2500 Abso rb ci ja

Pradinis trolokso tirpalas ruošiamas 0,025 g trolokso ištirpinant 25 ml kolbutėje 70 proc. V/V etanolyje. Iš gauto pradinio trolokso tirpalo ruošiami 0 μmol/l, 400 μmol/l, 800 μmol/l, 1200 μmol/l, 1600 μmol/l, 2000 μmol/l, 2400 μmol/l koncentracijos darbiniai tirpalai.

Trolokso kalibracinė kreivė sudaroma į mėgintuvėlius su 3 ml FRAP darbinio tirpalo pridėjus po 20 μl skirtingų koncentracijų trolokso darbinių tirpalų ir po 60 minučių inkubacijos kambario temperatūroje tamsioje vietoje išmatavus tirpalų absorbciją, esant 593 nm bangos ilgiui (7 pav.).

7 pav.Trolokso kalibracinė kreivė (FRAP redukcinio aktyvumo įvertinimo metodui)

Efektyvioji skysčių chromatografija. Flavonoidų kiekio nustatymui efektyviosios skysčių

chromatografijos būdu analičių išplovimui naudoti 2 tirpikliai: tirpiklis A – fosforo rūgšties vandeninis tirpalas, tirpiklis B – fosforo rūgštis acetonitrile. Injekcijos tūris 10 µl, eliuavimo greitis 0,6 – 0,8 ml/min. Analizei naudotas tiesinis gradiento kitimas. Procentinis judrios fazės kitimas skirtingais laiko momentais pavaizduotas 1 lentelėje. Absorbcija matuojama esant 200 – 600 nm bangos ilgiui.

1 lentelė. Judrios fazės tirpiklių gradientų kitimas

Laikas, min. Eliuavimo greitis Tirpiklis A, proc. V/V Tirpiklis B, proc V/V 0 0,6 84,0 16,0 12,0 0,6 84,0 16,0 18,0 0,6 47,0 53,0 18,10 0,6 3,0 97,0 19,0 0,8 3,0 97,0 29,0 0,8 3,0 97,0 30,0 0,6 84,0 16,0 30,1 0,6 90,0 10,0 31,1 0,6 90,0 10,0 32,1 0,6 84,0 16,0 y = 0.0003x - 0.0067 R² = 0.9972 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Abso rb ci ja

Junginių identifikavimas atliktas naudojantis etaloninėmis medžiagomis. Buvo lyginama tiriamųjų analičių bei standartinių tirpalų sulaikymo trukmė ir spektriniai duomenys. Standartinių junginių chromatogramos pavaizduotos 8 paveiksle. Kiekybinis įvertinimas atliktas naudojant

standartinių tirpalų kalibracines kreives. Standartinių tirpalų regresijos lygtys ir regresijos koeficientai (R2) : Galo rūgštis: y = 2,89∙104_x+1,41∙105 ; R2= 0,999185 Elago rūgštis: y = 1,08∙104x – 4,03∙104; R2= 0,999958 Hiperozidas: y = 5,28∙104x; R2= 0,999769 Avikuliarinas: y = 4,40∙104x; R2= 0,998574 Rutinas: y = 2,74∙104x; R2= 0,999889

8 pav. P.aviculare L. žolės mėginiui būdinga chromatograma (λ=360 nm)

2.5. Rezultatų statistinis įvertinimas

3.

TYRIMO REZULTATAI

3.1. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Veikliųjų junginių kiekiui mėginyje įtakos turi ekstrakcijos sąlygos, todėl mėginio paruošimo procesas turi būti optimizuotas. Tyrimų metu optimizuojant ekstrakcijos sąlygas buvo nustatyta ekstrakcijos trukmės bei ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos įtaka suminiam flavonoidų kiekiui ekstrakte. Ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje. Ultragarso bangų dėka pagerėja tirpiklio prasiskverbimas į gilesnius ląstelės sluoksnius, pagerėja masės pernaša iš ląstelių, sutrumpėja ekstrakcijos laikas bei galima ekstrahuoti termolabilius junginius [55].

Ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos parinkimas. Optimaliai ekstrakcijos tirpiklio koncentracijai nustatyti naudoti atsitiktiniai vaistinės augalinės žaliavos mėginiai. Susmulkintos augalinės žaliavos ekstrakcijai atlikti buvo naudojami skirtingos koncentracijos etanolio ir vandens mišiniai: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96 proc. V/V. Ekstrakcija vykdyta 25 minutes ultragarso vonelėje 40o

C temperatūroje. Didžiausias flavonoidų kiekis (0,71 ± 0,01 proc.) nustatyta naudojant 70 proc. V/V etanolį (9 pav.). Tolimesniems tyrimams vykdyti pasirinktas ekstrakcijos tirpiklis, kurį naudojant tirpaluose nustatytas didžiausias flavonoidų kiekis (70 proc. V/V etanolis).

9 pav. Bendras flavonoidų kiekis ekstrakcijos metu naudojant skirtingos koncentracijos etanolio tirpalus (n=3)

Ekstrakcijos trukmės parinkimas. Ekstrakcijos trukmei nustatyti naudoti atsitiktiniai vaistinės augalinės žaliavos bandiniai. Ekstraktai ruošiami iš susmulkintos augalinės žaliavos, ekstrakcijos tirpikliu naudojant 70 proc. V/V etanolį. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 40 oC temperatūroje skirtingais laiko intervalais: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minučių. Didžiausias

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 40 50 60 70 80 90 96.3 Ben dras flavonoid ų kiekis proc.

flavonoidų kiekis (0,82 ± 0,03 proc.) nustatytas 40 ekstrakcijos minutę (10 pav.). Nustatyta, jog ilgėjant ekstrakcijos laikui flavonoidų kiekis ekstraktuose mažėja iki 70 minutės. 80 – 90 minutę nustatytas nežymus flavonoidų kiekio padidėjimas, kuris galėtų būti dėl galimo sudėtingų kompleksinių junginių skilimo. Tolesniems tyrimams vykdyti pasirinktas 40 minučių ekstrakcijos laikas, kurį taikant nustatytas didžiausias flavonoidų kiekis. Ekstrakcijos laiko ilginti iki 80 - 90 minučių nerekomenduojama dėl galimo biologiškai aktyvių junginių skilimo.

10 pav. Bendras flavonoidų kiekis ekstrakciją vykdant skirtingais laiko tarpais (n=3)

3.2. Bendro flavonoidų kiekio tyrimas

Bendras flavonoidų kiekis buvo nustatytas paprastųjų takažolių (P.aviculare L.) žolėje, rinktoje skirtingų Lietuvos regionų augavietėse bei skirtingų gamintojų arbatų žaliavoje spektrofotometriniu metodu.

11 pav. Bendras flavonoidų kiekis (proc.) paprastųjų takažolių žolės mėginiuose, rinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose (n=3)

Gauti tyrimų rezultatai buvo palyginti su literatūroje pateiktais kitų tyrėjų duomenimis. Malinowskos P. (2013) atliktame spektrofotometriniame tyrime gauti priešingi rezultatai. Bendras flavonoidų kiekis etanoliniame takažolių ekstrakte sudarė 0,54 ± 0,01 mg/g (tai atitinka 0,054 proc.), tai yra 9,4 kartus mažesnis nei flavonoidų kiekio vidurkis skirtingų Lietuvos augaviečių mėginiuose [4]. Galima daryti prielaidą, jog skirtumus tarp rezultatų galėjo įtakoti skirtingas augalo genotipas, tyrimo metodikos, augalinės žaliavos geografinė augavietė, agroklimatinės sąlygos.

Analizuojant dvi skirtingų gamintojų paprastųjų takažolių žolės arbatų serijas nustatyta, jog pirmoje arbatų serijoje bendras flavonoidų kiekio vidurkis žaliavose buvo 0,79 ± 0,05 proc. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas „A3“ (100 g) gamintojo arbatos žaliavoje – 0,96 ± 0,02 proc. (SSN(%) = 2,06), mažiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas „A2“ (1,5 g N 24) gamintojo arbatos žaliavoje – 0,67 ± 0,07 proc. (SSN(%) = 10,8). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp didžiausios ir mažiausios bendro flavonoidų kiekio reikšmės (p<0,05).

Antrojoje arbatų serijoje žaliavų bendras flavonoidų kiekio vidurkis buvo 0,8 ± 0,05 proc. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas „A2“ (1,5 g N 24) gamintojo arbatos žaliavoje - 0,98 ± 0,08 proc. (SSN(%) = 8,92). Šiek tiek mažesnis kiekis nustatytas „A3“ (100 g) gamintojo arbatos žaliavoje (0,90 ± 0,04 proc., SSN(%) = 3,95), mažiausias - „A4“ (1,5 g N 20) gamintojo arbatos žaliavoje – 0,58 ± 0,05 proc. (SSN(%) = 8,05). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp didžiausios ir mažiausios bendro flavonoidų kiekio reikšmės (p<0,05).

Lyginant to paties gamintojo supakuotas ir nesupakuotas į pakelius arbatas nustatyta, jog pirmojoje arbatų serijoje „A1“ gamintojo arbatos žaliavoje didesnis flavonoidų kiekis nustatytas žaliavoje supakuotoje į pakelius, o gamintojo „A2“ – nesupakuotoje arbatos žaliavoje. Antrojoje arbatų serijoje nustatyti priešingi rezultatai - „A1“ arbatose didesnis flavonoidų kiekis nustatytas žaliavoje

nesupakuotoje į pakelius, o „A2“ arbatos žaliavoje supakuotoje į pakelius. Lyginant dviejų arbatų serijų bendro flavonoidų kiekio rezultatus nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp „A1“ (2 g N 25), „A2“ (1,5g N 24) ir „A4“ (1,5g N 20) gamintojų arbatų (p<0,05). „A1“ (50 g), „A2“ (40 g) ir „A3“ (100 g) gamintojų arbatose nustatytas bendras flavonoių kiekis tarp skirtingų serijų skyrėsi nereikšmingai. Rezultatai pateikti 12 paveiksle.

12 pav. Bendras flavonoidų kiekis (proc.) paprastųjų takažolių (P.aviculare L.) žolės arbatų žaliavose (n=3)

Skirtingų Lietuvos augaviečių mėginių bendras flavonoidų kiekio vidurkis (0,51 ± 0,04 proc.) reikšmingai skyrėsi nuo apskaičiuoto skirtingų arbatų serijų flavonoidų kiekio vidurkio (p<0,05). Vidurkis buvo 0,28 proc. mažesnis nei pirmosios (0,79 ± 0,05 proc) ir 0,29 proc. mažesnis nei antrosios (0,8 ± 0,05 proc.) arbatų serijų vidurkis. Bendro flavonoidų kiekio vidurkis tarp skirtingų serijų arbatų reikšmingai nesiskyrė.

3.3. Bendro fenolinių junginių kiekio tyrimas

Bendras fenolinių junginių kiekis paprastųjų takažolių (P.aviculare L.) augalinėje žaliavoje buvo nustatytas spektrofotometriniu būdu, naudojant fenolinį Folin – Ciocalteu reagentą. Fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentais grame sausos žaliavos ( GAE, mg/g).

Analizuojant takažolių (P. aviculare L.) žolės mėginius surinktus iš skirtingų Lietuvos regionų augaviečių nustatytas vidutiniškas fenolinių junginių kiekis buvo 29,43 ± 1,14 mg/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis - 45,61 ± 1,9 mg/g nustatytas Lelių kaime, Klaipėdos rajone surinktoje žaliavoje (SSN(%) = 4,15), mažiausias kiekis - 23,27 ± 1,09 mg/g žaliavoje, rinktoje Utenos rajone (SSN(%) = 4,66) (13 pav.). Skirtumas tarp nustatyto didžiausio ir mažiausio bendro

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

fenolinių junginių kiekio statistiškai reikšmingas (p<0,05). Įvertinus koreliacinio ryšio stiprumą tarp spektrofotometriniais tyrimais nustatyto bendro fenolinių jungių kiekio ir bendro flavonoidų kiekio nustatytas silpnas koreliacinis ryšys (koreliacijos koeficientas 0,5).

13 pav.Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) paprastųjų takažolių žolės mėginiuose, rinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose (n=3)

Bendro fenolinių junginių kiekio tyrimų rezultatai buvo palyginti su literatūroje pateiktais kitų tyrėjų duomenimis. Molan A. ir kt. (2012) atliko šiaurinėje Irako dalyje surinktų takažolių mėginių bendro fenolinių junginių kiekio nustatymą Folin-Ciocalteu spektrofotometriniu metodu. Nustatytas fenolinių junginių kiekio vidurkis buvo 29,8 ± 0,14 mg/g [56]. Derakhshani Z. ir kt. (2012) spektrofotometriniu būdu nustatė Irane surinktų P. aviculare mėginių bendrą fenolinių junginių kiekį. Nustatytas bendras fenolinių junginių kiekio vidurkis buvo 31,25 ± 1,56 mg/g [57]. Skirtingose

Lietuvos augavietėse surinktuose mėginiuose nustatytas bendras fenolinų junginių kiekio vidurkis (29,43

± 1,14 mg/g) buvo panašus į kitų autorių tyrimų duomenis. Panašus fenolinių junginių kiekis (31,29 ± 0,94 mg/g) nustatytas Miquel M. ir kitų (2014) atliktame Equisetum arvense L. žolės tyrime [58].

Sudaryta hierarchinės klasterinės analizės dendrograma parodo paprastųjų takažolių (P.aviculare L.) mėgininių fenolinių junginių kiekio priklausomybę nuo augavietės geografinės padėties (14 pav.). Sudarytoje dendrogramoje išskiriami du aukšto lygio klasteriai. Pirmąjį ir labiausiai išsiskiriantį klasterį sudaro 9 grupė, kurios žaliavos mėginys surinktas Lelių kaime, Klaipėdos rajone. Šiame klasteryje nustatytas didžiausias fenolinių junginių kiekis P.aviculare L. žaliavoje. Antrąjį aukšto lygio klasterį sudaro du žemesnio lygio klasteriai. Pirmasis žemesnio lygio klasteris suskirstytas į du pogrupius. Vieną iš pogrupių sudaro 4 grupės P.aviculare mėginys surinktas Utenos rajone, kuris išsiskiria mažiausiu fenolinių junginių kiekiu. Antrojo pogrupio klasteriui priklauso 2, 3, 5, 7, 8, 10 ir 13 grupės, kuriose fenolinių junginių kiekis didesnis nei 4 grupėje, bet mažesnis nei reikia norint

patekti į pirmąjį aukšto lygio klasterį. Fenolinių junginių kiekis tarp 2 ir 8 grupių skiriasi 0,05 mg/g, 10 ir 13 – 0,14 mg/g, 3 ir 5 – 0,64 mg/g. Antrajam žemesnio lygio klasteriui priklauso 6 grupės klasteris, kurio žaliavos mėginys surinktas Ginučių kaime, Ignalinos rajone. Šis klasteris išsiskiria didžiausiu fenolinių junginių kiekiu. Tarpusavyje susijusiais laikomi 1, 11 ir 12 grupių klasteriai. Fenolinių junginių kiekis tarp 11 ir 12 grupių klasteriuose skiriasi 0,41 mg/g, o 11 ir 12 grupių klasteriuose – 1 mg/g. Mėginiai rinkti liepos mėnesį skirtingose augavietėse: 1 – Vievyje, 11 - Veisiejuose, Lazdijų rajone, 12 - Panevėžio apylinkės.

14 pav. P. aviculare mėginių fenolinių junginių kiekio priklausomybės nuo augavietės dendrograma (1 - Vievis, 2 - Kauno apylinkės, 3 - Šakių apylinkės, 4 - Utenos apylinkės, 5 - Krepšiagalio kaimas, Anykščių rajonas, 6 - Ginučių kaimas, Ignalinos rajonas, 7 - Stelmužės kaimas,

Zarasų rajonas, 8 - Liudvinavas, Marijampolės rajonas, 9 - Lelių kaimas, Klaipėdos rajonas, 10 – Rietavo apylinkės, 11 - Veisiejai, Lazdijų rajonas, 12 - Panevėžio apylinkės, 13 - Telšių apylinkės)

Antrojoje arbatų serijoje žaliavų bendras fenolinių junginių kiekio vidurkis buvo 36,71 ± 0,81 mg/g. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas „A2“(1,5 g N 24) (38,79 ± 0,57 mg/g, SSN(%) = 1,48) ir „A3“ (100 g) (38,75 ± 0,85 mg/g, SSN(%) = 2,19) gamintojų arbatos žaliavose. Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekio vidurkis nustatytas „A1“ (50 g) (34,27 ± 0,23 mg/g, SSN(%) = 0,68) ir „A2“ (40 g) (34,81 ± 1,28 mg/g, SSN(%) = 3,69) gamintojų arbatos žaliavose. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp didžiausio ir mažiausio bendro fenolinių junginių kiekio (p<0,05).

Lyginant to paties gamintojo abiejų serijų supakuotas ir nesupakuotas į pakelius arbatas nustatyta, jog abiejoje serijose „A1“ ir „A2“ gamintojų arbatose didesnis fenolinių junginių kiekis nustatytas supakuotoje į pakelius žaliavoje (15 pav.). Lyginant dviejų arbatų serijų bendro fenolinių junginių kiekio rezultatus nustatyti statistiškai nereikšmingi skirtumai tarp to paties gamintojo arbatų, išskyrus „A4“ (1,5 g N 20) gamintojo arbatas. Šio gamintojo arbatose nustatytas bendras fenolinių kiekis tarp skirtingų serijų skyrėsi reikšmingai (p<0,05).

Bendras fenolinių junginių kiekio vidurkis nustatytas skirtingų Lietuvos augaviečių mėginiuose (29,43 ± 1,14 mg/g) buvo 7,41 mg/g mažesnis nei pirmosios (36,84 ± 1,19 mg/g) ir 7,28 mg/g mažesnis nei antrosios (36,71 ± 0,81 mg/g) arbatų serijose nustatytą vidutinį fenolinių junginių kiekį. Skirtingų Lietuvos augaviečių mėginių bendras fenolinių junginių kiekio vidurkis reikšmingai skyrėsi nuo skirtingų arbatų serijų vidurkių (p<0,05). Skirtingų arbatų serijų vidurkiai reikšmingai nesiskyrė.

15 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) paprastųjų takažolių arbatose (n=3)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

3.4. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas

Paprastųjų takažolių etanolinių ekstraktų antioksidantinis aktyvumas įvertintas naudojantis ABTS radikalų - katijonų surišimo, DPPH radikalų surišimo ir geležies redukcinės galios (FRAP) nustatymo metodais.

3.4.1. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas DPPH metodu

Analizuojant P.aviculare L. žolės mėginius iš skirtingų Lietuvos regionų augaviečių DPPH metodu nustatyta laisvųjų radikalų surišimo geba įvairavo nuo 26,05 ± 1,26 proc. iki 59,61 ± 2,56 proc. Didžiausiu DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumu (59,61 ± 2,56 proc., SSN(%) = 4,28) pasižymėjo Lelių kaime, Klaipėdos rajone surinktos žaliavos mėginiai, mažiausiu - Krepšiagalio kaime, Anykščių rajone (26,05 ± 1,26 proc, SSN(%) = 4,85) bei Utenos rajone ( 26,85 ± 0,34 proc., SSN(%) = 1,26) rinkos žaliavos mėginiai. Skirtumas tarp nustatyto didžiausio ir mažiausio DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumo statistiškai reikšmingas (p<0,05). DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumo vidurkis 34,69 ± 1,19 proc. Rezultatai pateikti 16 paveiksle.

16 pav. DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas (proc.) paprastųjų takažolių (P.aviculare L.) skirtingų augaviečių žolės mėginiuose (n=3)

Gauti tyrimų rezultatai skyrėsi nuo literatūroje pateikų kitų tyrėjų duomenų. Molan A. ir kt. (2012) atliktame šiaurinėje Irako dalyje surinktų P. aviculare mėginių tyrime nustatytas DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos vidurkis buvo 22,8 ± 1,1 proc. [56]. Tyrime nustatytas DPPH laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas buvo mažesnis už skirtingose Lietuvos augavietėse surinktuose